Karakterisering van tumor-geïnduceerde ataxie in een vestibulair schwannoom-muismodel

Samenvatting

We ontwikkelden een panel van gedragstests om tumor-geïnduceerde ataxie te bestuderen en therapieën te evalueren die neurologische functies behouden in een muismodel van vestibulaire schwannoom.

Samenvatting

NF2-gerelateerde schwannomatose (NF2-SWN) is een autosomaal dominant tumorpredispositiesyndroom veroorzaakt door kiemlijnmutaties in het NF2 tumorsuppressorgen. De ziekte wordt gekenmerkt door de ontwikkeling van bilaterale vestibulaire schwannomen (VS's), die geleidelijk groter worden en leiden tot gehoorverlies, onevenwichtigheden en ataxie-symptomen die de kwaliteit van leven van patiënten diepgaand beïnvloeden. Er zijn momenteel geen door de FDA goedgekeurde farmacologische behandelingen beschikbaar. Onder de neurologische tekorten blijft ataxie een bijzonder invaliderende maar onderbelichte manifestatie, grotendeels door het ontbreken van robuuste preklinische modellen voor de evaluatie. In deze studie ontwikkelden we een reeks gedragstests om systematisch tumor-geïnduceerde ataxie te beoordelen in een orthotope muismodel van VS-geassocieerd gehoorverlies en ataxie. Deze tests maken kwantitatieve metingen mogelijk van balans- en motorische coördinatietekorten die voortkomen uit tumorlast. Dit experimentele platform maakt mechanistische studies mogelijk van door tumoren veroorzaakte cerebellaire disfunctie en biedt een waardevol hulpmiddel voor preklinische evaluatie van therapeutische strategieën. Door gedragsbeoordelingen te integreren met tumorbiologie- en gehoortests, faciliteert deze aanpak de karakterisering van zowel tumorsuppressieve als neuroprotectieve behandelingseffecten. Uiteindelijk bieden deze assays een veelzijdig kader dat ook kan worden toegepast op andere neurologische aandoeningen die door ataxie worden gekenmerkt, waardoor hun bruikbaarheid verder gaat dan NF2-SWN.

Inleiding

NF2-gerelateerde schwannomatose (NF2-SWN) is een zeldzaam, overwegend erfelijk tumorpredispositiesyndroom veroorzaakt door mutaties in het NF2-tumorsuppressorgen , dat codeert voor het cytoskeletale eiwit merlin¹. Verlies van merlinefunctie verstoort de signaalroutes die celproliferatie, adhesie en overleving reguleren, waardoor getroffen personen vatbaar zijn voor de ontwikkeling van meerdere goedaardige tumoren van het zenuwstelsel. Het kenmerk van NF2-SWN is de vorming van bilaterale vestibulaire schwannomen (VS's) - niet-maligne tumoren afgeleid van Schwann-cellen die ontstaan langs de vestibulocochleaire zenuwen. Deze tumoren vergroten geleidelijk, comprimeren aangrenzende neurale structuren en leiden tot sensorineuraal gehoorverlies, tinnitus en gezichtszenuwstoornissen².

Patiënten met bilaterale VS's ondervinden vaak progressieve schade aan de vestibulaire zenuw en het vestibulaire apparaat van het binnenoor, wat resulteert in slopende vestibulaire disfunctie die zich uitte in chronische disbalans, ataxie en instabiliteit in de gang, wat de mobiliteit en de kwaliteit^{van leven ernstig} aantast. De mate van vestibulaire disfunctie correleert vaak met tumorbelasting en zenuwbetrokkenheid. Deze symptomen blijven vaak bestaan, zelfs na tumorbestrijding of gehoorbehoud, wat wijst op complexe neurobiologische mechanismen buiten mechanische compressie ^4,5. Hoewel klinische instrumenten zoals inventarissen van duizeligheidshandicaps, ganganalyse, vestibulo-oculaire reflex (VOR) testen en posturografie worden gebruikt om vestibulaire beperkingen te kwantificeren, blijven de onderliggende mechanismen van tumor-geïnduceerde ataxie slecht begrepen³. Ondanks vooruitgang in moleculair begrip en de introductie van gerichte therapieën zoals bevacizumab, is er nog steeds geen door de FDA goedgekeurde behandeling die zowel gehoor als evenwichtsfunctie bij patiënten met NF2-SWN betrouwbaar behoudt. De behandeling van vestibulaire symptomen blijft grotendeels ondersteunend, wat een grote onvervulde klinische behoefte benadrukt.

Een grote belemmering voor het verbeteren van de klinische behandeling van VS-geassocieerde ataxie is het ontbreken van preklinische modellen die de vestibulaire en motorische coördinatietekorten die bij patiënten worden waargenomen, nauwkeurig reproduceren. De meeste bestaande VS-diermodellen richten zich op tumorgroei of gehoorverlies, zonder de kenmerkende balans- en coördinatieproblemen te herhalen. Bovendien zijn gestandaardiseerde gedragstests om ataxie en vestibulaire disfunctie objectief te beoordelen in preklinische omgevingen niet goed onderwezen. Deze kloof belemmert mechanistisch onderzoek en beperkt de evaluatie van kandidaattherapieën die gericht zijn op het behouden van vestibulaire functie.

Hier rapporteren we de ontwikkeling van een VS-muismodel dat meetbare ataxie-fenotypes vertoont, samen met een panel van gedragstests die specifiek zijn ontworpen om tumor-geïnduceerde ataxie te kwantificeren. Dit model biedt een broodnodig platform voor het onderzoeken van de mechanismen achter VS-geassocieerde vestibulaire disfunctie en voor het evalueren van de effectiviteit van therapeutische interventies gericht op het herstellen van balans, coördinatie en algehele neurologische functie bij patiënten met NF2-SWN.

Protocol

Dierproeven werden uitgevoerd volgens het protocol dat was goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van Massachusetts General Brigham (MGB).

1. Diermodel

1. Inoculeer Nf2^-/- cellen (muis Nf2^-/- Schwann-cellen die Gaussia luciferase-reportergen, Gluc) in immunocompetente C57/FVB-muizen. Met behulp van een stereotactisch injectieapparaat (Figuur 1A) injecteert elke muis 1 μL van 2.500 tumorcellen in het CPA-gebied van de rechterhersenhelft ^4,6.
2. Gebruik zowel mannelijke als vrouwelijke muizen (1:1 verhouding) van 8-12 weken oud om voldoende statistische kracht te garanderen en eventuele geslachtsgerelateerde verschillen te onderzoeken. Huismuizen in groepen van 4 per kooi onder een 12-uur licht/donker cyclus, met voedsel en water beschikbaar ad libitum.
   OPMERKING: Aangezien schwannomen zich ontwikkelen in de vestibulaire zenuwen van patiënten, hebben we het cerebellopontine hoek (CPA) model toegepast. Het CPA-model herhaalt de intracraniële micro-omgeving van VS's.
3. Sham-groep: Om de effecten van dierchirurgie en tumorcelimplantatie op ataxie te evalueren, omvat een Sham-chirurgiegroep, waarbij muizen een schijnoperatie ondergingen en zoutoplossing in het CPA-gebied werden geïnjecteerd.
4. Neem een groep muizen zonder tumoren op als controlegroep.
5. Om de tumorprogressie te monitoren, gebruik je Nf2^-/- cellen die Gaussia luciferase reporter gene (Gluc) expressie geven, en meet je plasmagluc elke 3 dagen na implantatie.
6. Kort gezegd, verzamel 13 μL bloed in de EDTA-buizen om stolling te voorkomen. Breng het bloedmonster over naar een 96-well plaat en meet de glucactiviteit zoals eerder beschreven 6,7,8,9.

2. Ataxietests

1. Voer de vier gedragstests in een vaste volgorde uit om variabiliteit tussen dieren te minimaliseren. Voer de tests uit in de volgende volgorde: (1) achterpoot-klemtest, (2) randtest, (3) loopbeoordeling en (4) kyfose-beoordeling. Sta een minimaal rustinterval van 2-5 minuten in tussen de tests door de muis terug te brengen naar zijn thuiskooi. Houd het dier in de gaten tijdens rustperiodes en ga pas door naar de volgende test wanneer normaal verkennend gedrag weer wordt hersteld. Stop met testen als er tekenen van overmatige stress of vermoeidheid worden waargenomen. Voltooi de volledige set van vier ataxie-assays voor een cohort van 10 muizen binnen ongeveer 45-60 minuten, inclusief rustintervallen tussen de tests.
2. Achterpoot-klemtest
   OPMERKING: De test voor het klemmen van achterpoten evalueert neuromusculaire coördinatie, motorische toon en houdingscontrole bij muizen. Muizen met ataxie vertonen achterpootretractie of het grijpen naar de buik, wat een verminderde motorische coördinatie en regulatie van spiertonus^{weerspiegelt 5}.
   1. Pak de muis voorzichtig bij de basis van de staart, zodat je hem stevig maar licht vasthoudt om ongemak te voorkomen. Steun het dier kort op het deksel of de hand van de kooi voordat je het optilt om de schrikreactie te verminderen.
   2. Til de muis langzaam op zodat hij in de lucht zweeft met zijn lichaam volledig uitgestrekt en vrij van obstakels. Houd de muis minstens 10 cm boven de kooi of het testoppervlak.
   3. Houd de hangende houding ongeveer 10 seconden aan en observeer de positie van de achterpoten en staart zonder het dier te draaien of te zwaaien.
   4. Beoordeel de houding van de achterpoten zoals hieronder beschreven.
      1. Identificeer een normale houding wanneer beide achterpoten naar buiten en van de buik af steken.
      2. Identificeer een abnormale houding wanneer één of beide ledematen zich terugtrekken naar de buik of elkaar kruisen, wat wijst op het vastklemmen van de achterpooten die geassocieerd worden met ataxie of neurologische beperking.
   5. Neem het gedrag op met een vooraf gedefinieerd scoresysteem of maak een korte video voor een geblindeerde post-hoc analyse.
      OPMERKING: Beperk elke test tot ≤10 s om stress te minimaliseren.
3. Richeltest
   OPMERKING: De richeltest beoordeelt balans, coördinatie en fijnmotoriek bij muizen. Het meet het vermogen van het dier om langs een smalle richel te lopen en veilig af te dalen naar de kooi zonder het evenwicht te verliezen. Muizen met cerebellaire disfunctie of vestibulaire ataxie vertonen meestal uitglijdingen, vallen of een onstabiele houding tijdens deze taak⁵.
   1. Plaats de kooi op een stabiel, vlak oppervlak op bankhoogte (~1 m).
   2. Verbind één uiteinde van de testkooi (Figuur 1C) met de behuizing (Figuur 1D), zodat er geen verticale opening of obstructie tussen de kooien is, zodat de muis soepel en natuurlijk in haar thuiskooi kan afdalen (Figuur 1B) zonder te springen of te vallen.
   3. Plaats een videocamera op een statief dat naar de richel gericht is onder een hoek van 30°-45° om zowel zijwaartse beweging als daling vast te leggen.
   4. Pas de verlichting aan om schittering te minimaliseren en zorgt voor een goed zicht op de ledematen en staart van de muis.
   5. Til de muis voorzichtig op bij de basis van de staart en ondersteun het lichaam met je andere hand. Plaats de muis in het midden van de richel zodat alle vier de poten op het oppervlak staan. Laat de staart alleen los wanneer de muis in balans en alert lijkt.
   6. Laat de muis vrij over de richel lopen zonder externe aansporing. Neem de muis minstens 10 seconden op of totdat hij in de kooi is neergedaald.
   7. Let op zijn vermogen om op de richel te balanceren zonder uit te glijden en om langs de richel naar de kooi of platform te lopen.
   8. Voer drie onafhankelijke proeven per muis uit, met een rustinterval van ~2 minuten tussen de proeven. Maak het randoppervlak tussen de dieren schoon met 70% ethanol om geursignalen te verwijderen.
   9. Voer alle tests uit in een rustige omgeving met constante verlichting en minimale achtergrondgeluid of trillingen. Vermijd het te vaak herhalen van de test op dezelfde dag, want vermoeidheid en leereffecten kunnen de prestaties beïnvloeden.
4. Gangbeoordeling
   OPMERKING: De looptest beoordeelt de coördinatie van de beweging, het paspatroon en de houdingsstabiliteit bij vrij bewegende muizen. Muizen met ataxie vertonen vaak een kortere paslengte, onregelmatige bewegingen en onregelmatige pootplaats, wat wijst op tekorten in coördinatie en evenwichtscontrole⁵.
   1. Lijn een rechte, vlakke startbaan uit met wit kopieerpapier (8,5 × 11 inch). Plaats de huiskooi aan het uiteinde van het papier om de muis aan te moedigen over het papier te lopen.
   2. Bedek de voorpoten en achterpoten licht met twee contrasterende kleuren (bijv. blauw voor voorpoten, rood voor achterpoten) met een niet-giftig inktkussen (Figuur 1E).
   3. Plaats de muis aan het beginpunt van de startbaan en laat hem vrij over het papier lopen zonder externe aansporing.
   4. Let op en meet de volgende parameters:
      Paslengte: de afstand tussen opeenvolgende plaatsingen van dezelfde poot.
      Basisbreedte: de laterale afstand tussen de linker- en rechterachtervoetafdrukken.
   5. Voer twee tot drie keer per muis uit, zodat je rust tussen de tests doorlaat.
      OPMERKING: Gebruik niet-giftige, sneldrogende inkt en zorg ervoor dat alleen de potenkussens bedekt zijn. Vervang het papier na elke proef om uitsmeren te voorkomen. Breng de inkt spaarzaam aan om te voorkomen dat voetafdrukken vervagen, omdat te veel inkt de nauwkeurigheid van de tree-metingen vermindert.
5. Evaluatie van kyfose
   OPMERKING: De kyfose-beoordeling evalueert de uitlijning van de wervelkolom en houdingsafwijkingen tijdens natuurlijke voortbeweging. Muizen met neurologische of spierproblemen vertonen vaak een aanhoudende dorsale kromming of kromming van de wervelkolom^.
   1. Plaats de muis op een oppervlak en laat hem enkele seconden vrij lopen of verkennen. Vermijd het schrikken van het dier, want plotselinge bewegingen kunnen de houding tijdelijk veranderen.
   2. Neem een korte video op vanuit het zijbeeld om de kromming van de kofferbak vast te leggen.
   3. Let op de houding van de muis tijdens het lopen, met de nadruk op de uitlijning van de wervelkolom en de kromming zoals hieronder beschreven.
      1. Identificeer een normale houding wanneer de muis een rechte of licht gebogen rug aanhoudt met soepele lichaamsbewegingen.
      2. Identificeer een abnormale houding wanneer de muis kyfose vertoont, gekenmerkt door een abnormaal gebogen of gebogen wervelkolom, een stijve romp en verminderde flexibiliteit tijdens het lopen.

3. Ataxie-testanalyse

OPMERKING: Voer alle gedragsbeoordeling uit door een waarnemer die blind is voor experimentele groepstoewijzing om waarnemersbias te minimaliseren.

1. Scores van richeltesten
   1. Ken een score van 3 toe als de muis soepel over de richel loopt, het evenwicht behoudt en zonder uit te glijden in de kooi afdaalt.
   2. Ken een score van 2 toe als de muis lichte beperking vertoont, zoals aarzeling of een lichte pootslip, maar herstelt en veilig afdaalt.
   3. Ken een score van 1 toe als de muis matige beperkingen vertoont, waaronder frequente uitglijden, een gehurkte houding, overmatig gebruik van de staart voor balans of een vertraagde daling.
   4. Ken een score van 0 toe als de muis ernstige beperkingen vertoont, niet kan balanceren, van de richel valt of weigert te bewegen.
2. Achterpoten klamptest score
   1. Ken een score van 3 toe als de muis consequent naar buiten gespreide achterpoten vertoont zonder bewijs van een klamp.
   2. Ken een score van 2 toe als de muis lichte beperking vertoont, zoals intermitterende terugtrekking van één achterpoot.
   3. Ken een score van 1 toe als de muis matige beperking vertoont, gekenmerkt door gedeeltelijke terugtrekking van beide achterpoten die nabij het achterlijf worden gehouden.
   4. Ken een score van 0 toe als de muis ernstige beperking vertoont, waarbij beide achterpoten het grootste deel van de observatieperiode stevig tegen de buik geklemd zijn.
3. Gangscore
   1. Ken een score van 3 toe als de muis met een gelijkmatige, gecoördineerde gang loopt en in rechte lijnen beweegt.
   2. Ken een score van 2 toe als de muis lichte beperking vertoont, zoals langzaam lopen met lichte onzekerheid of zijwaartse afwijking, mank naar één zij, of brede, cirkelende paden lopen.
   3. Ken een score van 1 toe als de muis matige beperking vertoont, waaronder duidelijke loopverstoring, lopen met slechts twee of drie poten, het slepen van een deel van het lichaam of het bewegen in strakke cirkels.
   4. Ken een score van 0 toe als de muis ernstige beperking vertoont, niet effectief kan bewegen, stil blijft staan of ongecontroleerde rollende bewegingen naar de zijkant vertoont.
4. Kyphosis scoring
   1. Ken een score van 3 toe als de muis plat blijft staan, recht naar achteren tijdens zowel rust als wandelen.
   2. Ken een score van 2 toe als de muis lichte beperking vertoont, met een lichte kromming van de rug in rust die tijdens beweging recht wordt.
   3. Ken een score van 1 toe als de muis matige beperking vertoont, met een matig gebogen rug in rust die tijdens het lopen gebogen blijft.
   4. Ken een score van 0 toe als de muis ernstige beperking vertoont, met een sterk gebogen rug gedurende de observatieperiode die de normale beweging beperkt.

4. Inter-rater betrouwbaarheidsbeoordeling

1. Train waarnemers met representatieve voorbeeldvideo's voorafgaand aan de formele beoordeling om de interpretatie van de beoordelingscriteria te standaardiseren.
2. Om waarnemersbias te minimaliseren, score je alle gedragstests onafhankelijk door twee getrainde waarnemers die blind zijn voor behandelgroep en experimenteel tijdstip.
3. Kwantificeer de betrouwbaarheid van inter-raters voor elke gedragstest met behulp van Cohen's kappa-coëfficiënt. Interpreteer kappa-waarden als volgt: <0,40, slechte overeenkomst; 0,40-0,60, matige instemming; 0,60-0,80, substantiële overeenkomst; en >0,80, bijna perfecte overeenkomst.
4. Los eventuele scoreverschillen op door gezamenlijke beoordeling van de opgenomen video's te beoordelen en bereik een consensusscore^{van 5}.

Resultaten

CPA-tumorgroei veroorzaakt ataxie in het VS-muismodel

Om tumor-geïnduceerde ataxie te evalueren, hebben we twee experimentele cohorten opgericht. Ten eerste, om de effecten van dierchirurgie en tumorcelimplantatie op ataxie te evalueren, ondergingen muizen schijnchirurgie en injectie van zoutoplossing in het CPA-gebied. Ataxie-symptomen bij de schijngroepmuizen werden vergeleken met die bij niet-geopereerde controlemuizen. In de tweede cohort ...

Discussie

De hier beschreven gedragstests bieden een robuust en kwantitatief kader voor het beoordelen van ataxie en motorische coördinatietekorten in muismodellen van VS en gerelateerde vestibulaire aandoeningen. Deze tests, aangepast van gevestigde protocollen voor neurodegeneratieve ziektemodellen, zoals de ziekte van Huntington en spinocerebellaire ataxia¹⁰, zijn zeer geschikt om tumor-geïnduceerde vestibulaire disfunctie in NF2-SWN<...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fetaal bovien serum	ThermoFisher	A5670701
GloMax 96 Microplate Luminometer	Promega	GM3000
McKesson blauwe procedure onderlaag	McKesson	75402
Schwann cel groei supplement	ScienCell	1752