Methodenartikel

Milieu-DNA-monsters van walviskijkvaartuigen voor walvisachtige monitoring

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70334

⸱

10 april 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Iceland's Húsavík Research Center, Húsavík, Iceland, 2Applied Animal Ecology Research Unit, Department of Zoology, University of Innsbruck, 3Politecnico di Milano DICA Civil and Environmental Engineering Department, 4Department of Life and Environmental Science DISVA, Marche Polytechnic University, 5CetaceanWatching Lda, 6Tethys Research Institute, 7WasserCluster Lunz - Biologische Station GmbH

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde workflow voor het verzamelen van ececa DNA (eDNA)-monsters van walvisobservatievaartuigen. De haalbaarheid voor onderzoekers en getrainde burgerwetenschappers wordt vooropgesteld, terwijl omgevingsomstandigheden, filtratietijd, troebelheid en logistiek aan boord de praktische grenzen van de toepassing bepalen.

Samenvatting

Omgevings-DNA (eDNA) biedt een niet-invasieve benadering voor het monitoren van walvisachtigen, maar de brede toepassing ervan vanuit operationele platforms vereist gestandaardiseerde en haalbare bemonsteringsworkflows. Deze studie beschrijft een protocol voor het verzamelen van eDNA van walvisachtigen van walviskijkvaartuigen, ontworpen voor implementatie door onderzoekers en getrainde burgerwetenschappers onder gedefinieerde omgevings- en logistieke omstandigheden. De aanpak integreert flukeprint-gerichte zeewaterverzameling, filtratie aan boord met zelfbehoudende filters en downstream moleculaire analyses om operationeel haalbare datageneratie onder echte omstandigheden te ondersteunen. Het protocol werd uitgevoerd tijdens gecoördineerde veldcampagnes in 2024 in drie regio's in de Noord-Atlantische Oceaan en de Middellandse Zee (IJsland, Portugal en Italië), waarbij meerdere walvisachtige taxa werden omvat. De methodeprestaties werden geëvalueerd met behulp van een nieuw ontwikkelde, soortspecifieke kwantitatieve PCR-assay gericht op mitochondriaal DNA van bultrugwalvis (Megaptera novaeangliae), waarmee consistente detectiesnelheden werden aangetoond onder wisselende omgevings- en logistieke omstandigheden. Door praktische richtlijnen te bieden voor veldimplementatie en verontreinigingsbeheersing ondersteunt dit protocol reproduceerbare, op eDNA gebaseerde monitoring van walvisachtigen en bevordert het cross-regionale vergelijkbaarheid in mariene biodiversiteitsstudies.

Inleiding

Effectief natuurbeheer van mariene megafauna, waaronder walvisachtigen en andere wijdverspreide soorten, is essentieel voor de bescherming van de biodiversiteit. Als toppredatoren en ecosysteemingenieurs dragen walvisachtigen bij aan trofische regulatie, nutriëntencyclus en ecologische veerkracht in oceaanbekkens1. Het genereren van uitgebreide ecologische kennis over deze zeer mobiele soorten blijft echter een uitdaging en is vaak afhankelijk van resource-intensieve monitoringsprogramma's2. Conventionele benaderingen, zoals biopsiebemonstering, foto-identificatie, passieve akoestische monitoring, satelliettelemetrie en luchtonderzoeken, hebben cruciale inzichten opgeleverd in de ecologie van walvisachtigen 3,4,5,6,7, maar deze methoden zijn vaak kostbaar, logistiek veeleisend, ruimtelijk beperkt of invasief en onderworpen aan strikte ethische en regelgevende controle8. Daardoor zijn de frequentie van bemonstering, geografische dekking en mogelijkheden voor participatie van belanghebbenden vaak beperkt, vooral bij het bestuderen van wijdverspreide of zeldzame soorten.

Milieu-DNA (eDNA, gedefinieerd als genetisch materiaal dat door organismen in hun omgeving wordt afgestoten) is uitgegroeid tot een krachtig, niet-invasief hulpmiddel om watersoorten uit watermonsters te detecteren 9,10. Soortspecifieke kwantitatieve PCR (qPCR) assays die zich richten op mitochondriale DNA-fragmenten maken zeer gevoelige en specifieke detectie van mariene taxa mogelijk, waaronder walvisachtigen 11,12,14. Naast aanwezigheid/afwezigheiddetectie leveren de relatieve eDNA-signaalsterkte en doel-DNA-sequenties waardevolle informatie over nabijheid, relatieve abundantie en genetische patronen op populatieniveau 15,16,17,18,19. Daarnaast bevatten milieumonsters die nabij walvissen worden verzameld vaak DNA van gelijktijdig voorkomende taxa, waaronder prooidieren, symbionten en parasieten, wat bredere ecologische associaties ondersteunt 20,21,22. Gezamenlijk tonen deze vooruitgangen het potentieel aan van eDNA-gebaseerde benaderingen om traditionele methoden aan te vullen en het bereik van walvisachtig onderzoek over mariene systemen uit te breiden23,24.

Ondanks deze voordelen ondervindt eDNA-gebaseerde monitoring van mariene megafauna aanhoudende uitdagingen met betrekking tot representatieve bemonstering, ruimtelijke dekking en methodologische reproduceerbaarheid, vooral in open mariene systemen waar DNA snel wordt verdunden doelsoorten uitgebreide verspreidingsgebieden hebben en lage dichtheden voorkomen. Het aanpakken van deze beperkingen vereist schaalbare, operationeel haalbare steekproefkaders die kunnen worden toegepast op brede ruimtelijke en temporele schalen. Burgerwetenschapsinitiatieven zijn effectief gebleken in het uitbreiden van de verzameling van ecologische data en het bevorderen van publieke betrokkenheid bij mariene natuurbescherming, waardoor ze een veelbelovende mogelijkheid zijn voor grootschalige monitoring op basis vaneDNA. Walviskijkvaartuigen vormen een onderbenut maar zeer geschikt platform voor eDNA-monsters, met regelmatige toegang tot walvisachtige habitats over seizoenen en regio's31, 32, 33. De wereldwijde walviskijkindustrie ondersteunt uitgebreide operationele netwerken34, en eerdere studies hebben de haalbaarheid aangetoond van het verzamelen van eDNA van walvisachtigen van andere opportunistische platforms, zoals commerciële schepen, veerboten35, en door gerichte bemonstering geïntegreerd met foto-identificatie en gedragswaarnemingen36,37. De snelle uitbreiding van eDNA-onderzoek heeft geleid tot aanzienlijke methodologische innovatie, maar biologische variabiliteit tussen mariene systemen en het tempo van technologische vooruitgang bemoeilijken de inspanningen om protocollen te harmoniseren en vergelijkbaarheid tussen studies te waarborgen. Gestandaardiseerde, maar toch aanpasbare veldmethodologieën zijn daarom essentieel, vooral voor grootschalige multinationale monitoringsinitiatieven38.

eDNA-detectie wordt beïnvloed door het gefilterde watervolume, filtratiestrategie, filtermateriaal en poriegrootte. Het filteren van grotere volumes verhoogt over het algemeen de eDNA-opbrengsten en de detectiekans voor doelwitten van gewervelden, waaronder walvisachtigen 39,40,41,42. In productief of troebel water kan de filtratie-efficiëntie echter worden beperkt door snelle filterverstopping 43,44, wat afwegingen vereist tussen haalbaar volume en operationele haalbaarheid45,46. Bemonstering van flukeprints — de oppervlakteverstoring veroorzaakt door de streek van een walvisstaart — is consequent aangetoond de detecteerbaarheid van eDNA bij walvisachtigen te verbeteren, aangezien recent afgeworpen biologisch materiaal zich nabij het oppervlak concentreert(24,41,42,47,48). Het gebruik van afgesloten, zelfbehoudende filtersystemen vermindert de afhandelingsstappen en het risico op besmetting, waardoor ze goed geschikt zijn voor burgerwetenschapstoepassingen38,42. Daarnaast minimaliseert de opname van biologische replicaten en routinematige veldcontroles detectiefouten en verbetert het de betrouwbaarheid van de data 49,50,51.

Protocolontwikkeling en validatie
Het eWHALE project52 is een transnationaal initiatief dat onderzoekers, walviskijkoperators en burgerwetenschappers uit heel Europa integreert om mariene megafauna te monitoren met behulp van eDNA. Bemonsteringsinspanningen hebben meerdere walvisachtige taxa in de Noord-Atlantische Oceaan en de Middellandse Zee getarget, waarbij een kernprotocol wordt gebruikt met regiospecifieke aanpassingen om rekening te houden met lokale milieu- en logistieke omstandigheden.

Hier presenteren we een gestandaardiseerd, beginnend protocol voor het verzamelen van walvisachtig eDNA van walviskijkvaartuigen, verfijnd door de analyse van 308 zeewater eDNA-monsters, waaronder twee replicaten per monster en 21 veldcontroles, verzameld tijdens gecoördineerde veldcampagnes in 2024 in Skjálfandi Bay (IJsland), de Azoren (Portugal) en de Ligurische Zee (Italië). De methode integreert flukeprint-gerichte zeewaterverzameling, filtratie aan boord met behulp van zelfbehoudende eDNA-filters en downstream moleculaire analyses.

Dit protocol is ontworpen voor implementatie in echte walviskijkomstandigheden door getrainde onderzoekers en burgerwetenschappers, waarbij filtratie aan boord kan worden uitgevoerd onder kalme tot matige zeeomstandigheden zonder de walviskijkactiviteiten te verstoren. De implementatie vereist coördinatie met deelnemende organisaties (bijvoorbeeld walviskijkbedrijven, non-profitorganisaties, onderzoeksinstellingen) om bemonsteringsstrategieën en onderzoeksdoelstellingen te definiëren. Hoewel kernparameters vast moeten blijven om reproduceerbaarheid en kruisvergelijkbaarheid te waarborgen, kunnen protocol-afgestemde aanpassingen nodig zijn op locaties met hoge troebelheid, vaartuigbeweging of beperkingen in tijd, ruimte of personeel. Dergelijke aanpassingen omvatten filtertype, haalbaar gefilterd watervolume en hulpapparatuur. Ze moeten consequent worden toegepast binnen elke steekproefcampagne en transparant worden gerapporteerd. Gedetailleerde operationele richtlijnen en logistieke overwegingen worden gegeven in de protocolstappen en bespreking om gegevenskwaliteit, transparantie en regionale vergelijkbaarheid te ondersteunen.

qPCR-assayontwerp
Om de prestaties van het protocol te evalueren, werd eDNA van bultrugwalvissen (Megaptera novaeangliae), een goed bestudeerde trekvogelsoort die regelmatig wordt aangetroffen in Skjálfandi Bay (IJsland)53 en seizoensgebonden aanwezig is op de Azoren54, geamplificeerd uit monsters die in het veld zijn verzameld. DNA-lyse, extractie en qPCR-workflows werden aanvankelijk geoptimaliseerd via een interlaboratory ringtest waarbij vier deelnemende laboratoria van het eWHALE-project betrokken waren, waardoor consistentie en toepasbaarheid tussen instellingenverbeterd 14.

Om de aanwezigheid van bultrugwalvis eDNA betrouwbaar te detecteren, werd een soortspecifieke MGB (minor groove binder) qPCR-assay ontworpen en gevalideerd die zich richt op de mitochondriale ND5-regio volgens de vastgestelde richtlijnen55 (Tabel 1). Oligonucleotideprimers en een probe werden gegenereerd met software voor DNA-sequentie-uitlijning en analyse56, met als doel de specificiteit van de soorten en de amplificatie-efficiëntie te maximaliseren (Supplemental File 1-Supplemental Figure S1). De specificiteit van de test werd in vitro beoordeeld met doel- en niet-doeltaxa (Balaenoptera acutorostrata, Delphinus delphis, Physeter macrocephalus, Homo sapiens). DNA-concentraties die werden gebruikt om qPCR-standaardcurves te genereren, werden gekwantificeerd uit een weefselafgeleide DNA-standaard 42,57,58,59,60. De detectielimiet (LOD) van de assay, gedefinieerd als de laagste concentratie die positieve amplificaties oplevert in 95% van de monsterreplicaties, werd bepaaldals 11,61. Detecties van bultrugwalvis eDNA werden geëvalueerd voor veldmonsters door het aandeel positieve reacties en signaalsterkte (d.w.z. Cyclusdrempel, CT-waarde) voor elk monster te schatten over driedubbele qPCR-metingen, om rekening te houden met amplificatievariabiliteit en om de detectiebetrouwbaarheid te verbeteren 57,60,62. Soortdetecties werden vervolgens geverifieerd met bidirectionele Sanger-sequencing, gevolgd door bevestiging via BLAST-analyse63.

qPCR-gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). De statistische significantie tussen groepen werd beoordeeld met behulp van de niet-parametrische Mann-Whitney U-test en de twee-steekproef t-test van Welch. Verschillen werden als significant beschouwd bij p < 0,05. Alle analyses werden uitgevoerd met statistische analysesoftware64.

Protocol

Ethiek en naleving van regelgeving
Alle waarnemingsinspanningen van walvisachtigen en daaropvolgende watermonsters moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met nationale en regionale wildwetten. Voer uitsluitend bemonstering uit vanaf geautoriseerde vaartuigen die opereren onder geldige walviskijk- of onderzoeksvergunningen. Houd minimale naderingsafstanden tot de doelsoort zoals vastgelegd door lokale regelgeving en vermijd alle manoeuvres die uitsluitend bedoeld zijn voor bemonsteringsdoeleinden. Walvisweefselmonsters die voor assayvalidatie werden gebruikt, werden verzameld onder respectievelijke regionale vergunningen en gedeeld onder eWHALE-projectpartners in overeenstemming met nationale en institutionele regelgeving.

OPMERKING: Bekijk de volgende documenten voorafgaand aan de bemonsteringsactiviteiten en verzamel de benodigde apparatuur: Materiaaltabel, eDNA Sampling Kit (Supplemental File 1-Supplemental Figuur S2) materialen die worden gebruikt om omgevings-DNA-monsters te verzamelen (Figuur 1) en een overzicht van de bemonsteringsstappen en de onboard filtratieworkflow (Figuur 2).

1. Voorbereiding van eDNA-monsters

  1. Bereid velddocumentatie voor, waaronder veldgegevensbladen en gelamineerd veldprotocol (Supplemental File 2 en Supplemental File 3).
  2. Maak reservehandschoenen, reservefilters (één filter per replica van het monster), waterdichte marker en een speciale afvalcontainer klaar (Figuur 1A).
    OPMERKING: Gebruik afgesloten zelfbehoudende eDNA-filters (1,2 μm poriegrootte) om het hanteren en besmettingsrisico's te minimaliseren65,66.
  3. Bereid één of meer stijve emmers voor, geschikt voor het type vaartuig en de configuratie aan boord (Supplemental File 1-Supplemental Figure S3).
    1. Markeer emmers op 10 L met een permanente stift. Bereid meerdere kleinere bakjes voor als het omgaan met 10 liter onpraktisch is.
    2. Bevestig een touw stevig aan de bak als het bereik van de overboord beperkt is.
      OPMERKING: Gebruik emmers met deksel om morsen te minimaliseren wanneer de beweging van het vat overmatig is (Figuur 1B).
    3. Bereid een secundaire eDNA-container voor om kleinere volumes te combineren en een extra transportdoos om een besmettingsvrij transport van emmers te garanderen indien nodig (Figuur 1C).
  4. Bereid een draagbare peristaltische of vacuümwaterpomp voor (Figuur 1D). Laad de pomp volledig op voordat je hem instapt en koppel direct voor gebruik de stroom los.
  5. Wijs bemonsterings-, filtratie- en dataregistratietaken toe vóór vertrek.
    VOORZICHTIG: Draag handschoenen tijdens alle uitrustingsbehandeling en wissel handschoenen tussen de taken door.

figure-protocol-1
Figuur 1: Veldwerkmaterialen gebruikt om omgevings-DNA-monsters te verzamelen. (A) Toolkit met zelfbehoudende eDNA-filters, afvalcontainer, knijpfles met verdunde huishoudbleekmiddel (1:10), handschoenen, velddatasheet en waterdichte pen; (B) voorbeelden van buckettypes voor eDNA-bemonstering; (C) voorbeelden van extra eDNA-containers voor het transporteren en filteren van grote volumes en containers voor het vervoeren van emmers aan boord; (D) voorbeelden van draagbare pompen voor waterfiltratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-2
Figuur 2: Conceptueel diagram van milieu-DNA-monsters aan boord van walviskijkboten. De illustratie beschrijft begeleide stappen, waaronder het verzamelen van watermonsters en filtratie aan boord. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Apparatuurreiniging

  1. Doe wegwerphandschoenen aan voordat je schoonmaakt.
  2. Maak een bleekoplossing door huishoudelijke bleekmiddel (5-6% natriumhypochloriet) 1:10 te verdunnen met gezuiverd water (~50 mL per rit).
  3. Breng de oplossing aan door gelijkmatig over alle oppervlakken te spetteren op alle emmers, deksels, containers en pompslangen. Houd een minimale contacttijd van 2-5 minuten aan op alle oppervlakken.
  4. Spoel 3 keer grondig af met kraanwater (Figuur 3).
  5. Laat de materialen aan de lucht drogen op een veilige plek en bewaar ze op een veilige en schone plek voordat je aan boord gaat.

figure-protocol-3
Figuur 3: Stappen voor schoonmaakapparatuur. (A) Breng de (1:10) verdunde huishoudelijke bleekoplossing aan; (B) gelijkmatig verspreid met DNA-vrije handschoenen; (C) drie keer grondig spoelen met kraanwater; en (D) het proces herhalen voor extra materialen indien van toepassing (bijv. eDNA-containers). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Watermonsterverzameling

OPMERKING: Voldoen aan alle veiligheidsvoorschriften aan boord van elk vaartuig of platform, inclusief het gebruik van reddingsvesten of drijfoveralls indien nodig.

  1. Breng alle materialen aan boord voordat passagiers aankomen en bewaar ze in een aangewezen, schoon gebied.
  2. Coördineer de bemonsteringstijd en positionering van het vaartuig met de bemanning.
  3. Observeer oppervlaktepatronen om walvisduiken te anticiperen (Figuur 4). Doe nieuwe handschoenen aan voordat je proeft.
  4. Verzamel zo snel mogelijk 20 L zeewater (niet meer dan 10 minuten timelapse) uit de flukeprint na de walvisduiken, om twee replicaties van 10 L monsters te maken.
  5. Transporteer het verzamelde water naar een aangewezen filtratiestation aan boord, met deksels of een extra gesteriliseerde container om morsen te voorkomen (indien nodig).
  6. Noteer soortidentiteit, GPS-coördinaten, tijd en replicatificatie van het monster in het datablad.
  7. Wissel meteen van handschoen na rapportage.

figure-protocol-4
Figuur 4: Bultrugwalvis-opdrijvingssequentie. (A) Walviswaai; (B) de rug krommen en de staart optillen voordat hij duikt; (C) flukeprintpatroon op het oppervlak na de duik van de walvis. Afbeeldingsbron: Ocean Missions (A,B,C, 2024). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. eDNA-filtratie

  1. Open de filterzak en gebruik het filter alleen bij het stopcontact (Supplemental File 1-Supplemental Figuur S4).
  2. Steek de inlaat in de snorkel en verbind de pompbuis met de uitlaat (Figuur 5A,B).
  3. Dompel de snorkel onder in het watermonster zonder de filterbehuizing onder te dompelen (Figuur 5C).
  4. Stel de pomp in (zie Materiaaltabel voor pomptypes) op een snelle, constante debiet.
  5. Filter continu 10 L terwijl je de stroomstabiliteit monitort (controleer op luchtbellen, scheuren, scheuren of afdichtingsfouten).
    OPMERKING: Beëindig de filtratie bij een maximale duur van 45 minuten.
  6. Draai het filter om en laat de pomp 30-60 seconden draaien om het resterende water te verwijderen. Controleer of er geen zichtbaar vocht meer in de filterbehuizing achterblijft.
  7. Zet de pomp uit en koppel de slang los.
  8. Gooi de snorkel in de afvalcontainer, plaats het filter in de originele zak en label het direct.
  9. Bewaar filters aan boord in een gesloten stijve container of in een koelbox (bij de omgevingstemperatuur > 20 °C), weg van direct zonlicht en passagiersruimtes.
  10. Wissel handschoenen en herhaal de filtratie voor de tweede replicatie.

figure-protocol-5
Figuur 5: Stappen voor het instellen van de ingebouwde filtratieopstelling. (A) de filterinlaat (het witte deel) aan de snorkel (buis) bevestigen; (B) sluit de pompslang aan op de filteruitlaat (het gele deel); en (C) een deel van de snorkel in het watermonster onderdompelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Veldnegatieve controles en gegevensrapportage

  1. Filter één veldnegatieve controle na elke vijf flukeprintmonsters.
  2. Gebruik direct na terugkeer naar de kust en vóór het reinigen van de apparatuur DNA-vrij water.
  3. Zet alle gegevens na elke reis over naar het digitale eDNA-monstersheet (Supplemental File 4).

6. Filteropslag en verzending

  1. Bewaar zelfbehoudende eDNA-filters in een veilige, droge container in een schaduwrijke kamer bij omgevingstemperatuur—of in een koelkast als de omgevingstemperatuur boven de 20 °C uitkomt—niet langer dan 3 maanden voordat ze verzenden.
  2. Controleer filterzakken visueel op vocht voordat je het verzendt.
  3. Label en stuur filters in geïsoleerde containers met ijspacks naar het aangewezen laboratorium.

7. Laboratoriumanalyse

OPMERKING: Voer alle laboratoriumprocedures uit in speciale UV-gesteriliseerde kamers met voldoende ventilatie en aparte werkbanken voor PCR's, met DNA-vrije handschoenen en beschermende kleding 55,67,68.

  1. DNA-lysis
    1. Label een 2 mL reactiebuis per filter.
    2. Plaats het filter in een 200 mL Erlenmeyer-kolf en gooi het rubberen deksel weg (Figuur 6A).
    3. Met DNA-vrije tang vouw je het membraan (Supplemental File 1-Supplemental Figure S5) tot een driehoek en breng deze over in de 2 mL reactiebuis, met de punt naar beneden gericht (Figuur 6B-D).
    4. Voeg 380 μL TES-buffer en 20 μL Proteinase K (zie de Materiaaltabel) toe aan elke reactiebuis, wat resulteert in 400 μL lysisbuffer (Figuur 6E).
    5. Vortex kort en incubeer bij 56 °C gedurende ≥3 uur met beweging (Figuur 6F).
    6. Centrifugebuizen op 18.626 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Een helder tot licht gekleurd lysaat duidt op een succesvolle vertering.
      OPMERKING: Het protocol kan in dit stadium tijdelijk worden stopgezet als lysaten worden opgeslagen bij -20 °C.
  2. DNA-extractie
    1. Incubeer lysaten op 56 °C gedurende 10 minuten voordat je ze verwijdert.
    2. Pipetextractie-reagentia in wasplaten en elusieplaten, rekening houdend met negatieve controles en pipetfouten69 (zie Supplemental File 1-Supplemental Table S1).
    3. Voeg per plaat één extractieblank toe met behulp van TES-buffer.
    4. Breng 300 μL lysaat over in elke put in de bindplaat. Voeg 300 μL Buffer AL en 300 μL isopropylalcohol toe aan elke put. Gebruik meerdere bindplaten als het totale lysaatvolume meer dan 300 μL is. Vortex en voeg 30 μL magnetische deeltjes toe voor nucleïnezuurbinding per put aan de eerste bindplaat (Materiaaltabel).
    5. Bedek de bindplaat met een Rod cover.
    6. Voer het voorlopige DNA-opnameprogramma uit voor twee bindplaten (totaal 400 μL lysaat; zie de Materiaaltabel en Figuur 7) en het geautomatiseerde extractieprotocol op een op magnetische kralen gebaseerde laboratoriumrobot.
    7. Gooi extractiechemicaliën weg in aangewezen afvalcontainers.
    8. Overdracht van geëlueerd DNA naar gelabelde 1,5 mL reactiebuizen en bewaar bij −20 °C.
      OPMERKING: Het protocol kan in dit stadium tijdelijk worden stopgezet. Aanvullende verwijderingsstappen voor remmers kunnen op dit punt worden uitgevoerd.
  3. qPCR
    1. Bereid DNA-standaarden voor en kwantificeer doelsoorten, met behulp van weefselextracten en een fluorescentie-gebaseerde hooggevoelige dsDNA-assay, volgens de instructies van de fabrikant (Table of Materials). Genereer een achtpuntsstandaardkromme door seriële verdunning (1:10) beginnend bij 10 ng/μL11,55. Aliquot-standaarden vóór qPCR om vries-dooicycli te minimaliseren.
      OPMERKING: Het protocol kan in dit stadium tijdelijk worden stopgezet.
    2. Bereid alle qPCR-reacties in drievoud voor met behulp van 96-wellplaten.
    3. Voeg één no-template control (moleculair water) en één extractieblank per qPCR-plaat op.
    4. Bereid de mastermix voor volgens Supplemental File 1-Supplemental Table S2 en Figuur 8A.
    5. Voeg in een DNA-ladingskap de eerder voorbereide DNA-standaarden en 3 μL DNA-extract toe aan elke put met de mastermix (Figuur 8B).
    6. Sluit de plaat af met een afdichtfolie (Figuur 8C).
    7. Centrifugeer op 3.500 × g gedurende 10 seconden en laad deze in de realtime kwantitatieve PCR-thermocycler (Figuur 8D, E).
    8. Voer de assay uit bij geoptimaliseerde cyclusomstandigheden, gespecificeerd in Tabel 2, en registreer gegevens met de software van de fabrikant (Table of Materials)11.

figure-protocol-6
Figuur 6: Werkwijze voor DNA-lysis. (A) Verwijder de rubberen dop van het zelfbehoudende eDNA-filter en plaats deze in een Erlenmeyer-fles; (B) twee paar pincetten steriliseren door drie keer te verbranden; (C) het filtermembraan vouwen; (D) het in een 2 mL buis te plaatsen; (E) voeg lysisbuffer en Proteinase K toe, en (F) incubeer monsters bij 56 °C gedurende 3 uur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-7
Figuur 7: Materialen en apparatuur gebruikt voor DNA-extractie. (A) Bind-, was- en elutieplaten, verbruiksmaterialen en reagentia voor extractievoorbereiding; en (B) de op magnetische kralen gebaseerde laboratoriumrobot die wordt gebruikt voor monsterverwerking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-8
Figuur 8: Werkwijze voor qPCR. (A) Bereid de mastermix voor in een voorheen UV-gesteriliseerde kamer (onder een werkkap die is bestemd voor het voorbereiden van mastermixen); (B) DNA-standaarden, extracten en controles laden in een DNA-laadstation volgens het getoonde patroon; (C) afsluitplaat; (D) centrifuge; (E) laad in realtime kwantitatieve PCR-thermocycler. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

In totaal werden in 2024 154 flukeprintmonsters (308 eDNA-filters) verzameld met dit geoptimaliseerde protocol, waaronder 96 filters in Skálfandi Bay (IJsland; 9 veldcontroles en 76 bultrugwalreplicaten) verkregen van maart tot november, 151 filters op de Azoren (Portugal; 12 veldcontroles en 15 bultrugwalvisreplicaties) verkregen in juli en 61 filters in de Ligurische Zee (Italië; 4 veldcontroles) verkregen van mei tot oktober. Alle monsters bestonden uit het verzamelen van maximaal 10 L zeewater (twee replica's per flukeprint-monster) met behulp van zelfbehoudende eDNA-filters (Tabel 3). Tijdens veldwerk werden twee soorten negatieve controles verzameld: gezuiverd water dat werd gefilterd na bleekreinigingsmiddel van de apparatuur, en zeewater dat werd verzameld bij het herbetreden van de haven(s)42. Deze laatste werd bewust gefilterd vóór bleekreinigings om mogelijke kruisbesmetting met eDNA van walvisachtigen tijdens de bemonstering te beoordelen. Monsters werden van elke bemonsteringsplaats in twee batches verzonden naar de Applied Animal Ecology Research Unit, afdeling Zoölogie, Universiteit van Innsbruck (Oostenrijk) voor laboratoriumverwerking.

Assay- en controleprestaties
Een subset van 44 filters (30 replicata, waaronder 2 veldcontroles uit Skjálfandi Bay, IJsland, en 14 filters, waaronder 1 veldcontrole uit de wateren rond het eiland Faial en Pico, de Azoren, Portugal) werd geanalyseerd op bultrugwalvis eDNA (Figuur 9). Het signaal werd gemeten in driedubbele qPCR-reacties. Een monster (d.w.z. eDNA-filter) werd als positief beschouwd als één op de drie qPCR-replicaties werd versterkt. De detectiegrens (LOD) van de assay in deze studie werd berekend als 0,0001 ng/μL (gemiddelde Ct van LOD = 35,8). Over de 41 geanalyseerde filters leverden 20 (49%) versterkingen op, terwijl 24 (58%) geen versterking vertoonden. Niet-detecties (geen CT-waarde) weerspiegelen hoogstwaarschijnlijk het ontbreken of de extreem lage concentraties van doel-DNA. Niet-detecties bestonden uit 5 van de 13 filters van de Azoren (38%) en 19 van de 28 filters uit IJsland (68%). Extractieblanks werden gescreend op mariene gewervelde DNA met behulp van de MarVer3 assay70 en toonden geen detecteerbare amplificatie, wat wijst op geen kruisbesmetting tijdens DNA-extractie. Veldcontroles (NC) en qPCR-controles (NT) leverden geen versterkingen op, wat de afwezigheid van besmetting tijdens veldwerk en de qPCR-screening bevestigde (Tabel 4).

Van de 20 positieve filters leverden negen (22%) minstens één Ct-waarde op onder de detectiegrens van de assay (LOD; 0,0001 ng/μL) en werden daarom als betrouwbare detecties geclassificeerd. Deze omvatten 4 van de 8 filters van de Azoren (50%) en 5 van de 12 van IJsland (42%). Nog eens 11 filters (27%) produceerden één of meer Ct-waarden boven de LOD, bestaande uit 4 filters van de Azoren (50%) en 7 van IJsland (58%), wat op plausibele detecties wijst (Figuur 10). Vergelijkende analyse toonde een marginaal lagere gemiddelde cyclusdrempel (Ct) voor de Azorenfilters (34,7 ± 3,60; n = 8) vergeleken met de IJslandse filters (36,9 ± 3,60; n = 10). De Mann-Whitney U-test toonde aan dat dit verschil niet statistisch significant was (U = 199,0, p = 0,204). Gezien de omgekeerde relatie tussen de Ct-waarde en de sterkte van het DNA-signaal, wijzen de resultaten op iets hogere concentraties van doel-bultrugwalvis eDNA in de filters van de Azoren (Figuur 11).

Haalbaarheidsbeperkingen
Het aantal flukeprint-monsters per tocht varieerde afhankelijk van de duur van de reis en de weersomstandigheden. Ongeveer twee tot drie monsters (wat tot zes eDNA-filters opleverde) werden verzameld tijdens 3 uur durende reizen op de Azoren, twee tot vier monsters gedurende ~8 uur in Italië (wat tot acht filters opleverde), en één tot twee monsters (wat tot 4 filters opleverde) tijdens 3,2 uur durende tours in IJsland. De filtratieprestaties waren over het algemeen hoog op de Azoren en in Italië. Op de Azoren werd 10 liter zeewater consequent binnen 10-15 minuten gefilterd, terwijl in Italië hetzelfde volume in ongeveer 10 minuten werd gefilterd. In IJsland varieerden de gefilterde volumes van 4,5 tot 10 L (gemiddelde = 8,5 L), met een gemiddelde filtratietijd van ~40 minuten door frequente filterverstopping, waarschijnlijk door fijnstof in het water in het onderzoeksgebied. Specifiek werden 10 L succesvol gefilterd voor 46 van de 98 filters (47%), volumes tussen 7 L en 10 L werden verkregen voor 31 filters (32%), en volumes tussen 4 L en 7 L voor 21 filters (21%) (Supplemental File 1-Supplemental Table S3).

Het protocol raadt aan om na elke vijf flukeprintmonsters één veldnegatieve controle te filteren. Onder operationele walviswaarnemingsomstandigheden kon dit echter niet volledig worden vervuld in de beschreven casestudy vanwege logistieke beperkingen, waaronder beperkte beschikbaarheid van filters, tijdsdruk en vertragingen in de verzending. Dit verlaagde de haalbare controle-tot-steekproefverhouding tot 1:10,7 in IJsland (9/96), 1:12,6 op de Azoren (12/151) en 1:15,3 in Italië (4/61). Ondanks deze afwijkingen vertoonden geen veld- of laboratoriumnegatieve controles versterking.

figure-results-1
Figuur 9: Overzicht van steekproeflocaties. Zwarte stippen op de kaart geven locaties aan waar monsters zijn genomen van een bultrugval-flukeprint in Skjálfandi Bay (IJsland) en op de Azoren. De naam van het eDNA-filter wordt aangegeven nabij het bijbehorende bemonsteringsgebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 10: Detecties van een subset eDNA-filters uit de Azoren en IJsland. qPCR-gemiddelde CT-waarden en DNA-signaalsterkte voor positieve detecties op Azoren en IJsland (ten minste één positieve PCR-replicatie), met SD en LOD. Balken zijn gekleurd op signaalsterkte ten opzichte van de LOD: donkerblauw = sterk signaal (Ct ≤ 35.8) duidt op betrouwbare detecties, lichtblauw = zwak signaal (Ct > 35.8) duidt op plausibele detecties. SD-foutbalken geven variabiliteit tussen PCR-replicaties weer. De rood gestippelde lijn geeft de LOD aan (Ct = 35,8). Gemiddelde Ct-waarden worden boven elke streep weergegeven. Afkortingen: Ct = cyclusdrempel; SD = standaarddeviatie; LOD = detectielimiet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 11: Gemiddelde cyclusdrempelwaarden voor bultrugwalvis-DNA-detecties van de Azoren en IJsland. Zwarte lijnen binnen de boxplots geven de mediaan aan, en rode vierkanten geven de gemiddelde Ct-waarden (SD) aan, terwijl snorharen de minimum- en maximumwaarden voor de Azoren en IJsland aangeven. De Mann-Whitney U-test toonde aan dat dit verschil niet statistisch significant was (U = 199,0, p = 0,204). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Primer- en probesequenties voor de ND5-gerichte qPCR-assay. Deze sequenties omvatten voor- en achteruitprimers, MGB-probesequenties (5′-3′), optimale annealingtemperatuur en assay limit of detection (LOD). (*) LOD wordt gedefinieerd als de laagste DNA-concentratie (ng/μL) van het DNA van de doelsoort, waarbij ≥95% van PCR-replicaties positieve amplificatie opleverde. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Geoptimaliseerde cyclische condities voor de bultrugwalvis eDNA qPCR-assay. Deze geoptimaliseerde qPCR-instellingen zijn 95°C voor 10 minuten (enzymactivatie), daarna 40 cycli bij 95°C voor 15 seconden (denaturatie) en 60°C voor 90 seconden (annealing/extension). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Overzicht van de configuratie van veldbemonstering. Overzicht van bemonsteringsregio's, veldpartners, vattypes, doelsoorten, bemonsteringsperioden en monsterreplicaties op de Azoren, IJsland en Italië. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4: qPCR-detectiesamenvatting voor omgevingsmonsters en controles. Positieve detecties (geel gemarkeerd), qPCR repliceert CT-waarden en detectieresultaten worden getoond; monsters werden als positief geclassificeerd wanneer ten minste één van de qPCR-replicaties amplificatie vertoonde. "Geen Ct" duidt op geen versterking, negatieve controles toonden geen versterking, en de M. novaeangliae standaard verdunningsreeks die wordt gebruikt om assayprestaties en de LOD te definiëren, is onderaan de tabel opgenomen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Bevat aanvullende figuren en tabellen, met aanvullende informatie over de protocoltoepassing, inclusief primerontwerp eDNA-bemonsteringskit, typen walviskijkvaartuigen, eigenschappen van zelfbehoudende eDNA-filters, reagensvolumes voor DNA-extractie en qPCR-reacties, en variaties in filtratiesnelheden tussen bemonsteringsgebieden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 2: Velddatasheet gebruikt tijdens het bemonsteren van eDNA bij walvisachtigen. Gestandaardiseerd formulier voor het vastleggen van cruisemetadata, walvisachtige waarnemingen en steekproef- en filterinformatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend Dossier 3: Stapsgewijze veldprotocol voor het bemonsteren van eDNA van walvisvisachtigen aan boord van walvisobservatievaartuigen, inclusief het reinigen van apparatuur, het verzamelen en filteren van zeewater aan boord, het rapporteren van monsters en opslag. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: Sjabloon voor walvisachtige eDNA-bemonstering spreadsheet. Gestandaardiseerd formulier voor het vastleggen van bemonsteringsinformatie na het verzamelen van monsters en de filtratie aan boord. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Operationele haalbaarheid en implementatie in het veld
Het hier gepresenteerde protocol draagt bij aan een gestandaardiseerde eDNA-workflow die detectiegevoeligheid in balans brengt met de beperkingen in de praktijk. Door grootschalige, op flukeprints gerichte bemonstering te integreren, onboard filtratie met zelfbehoudende gesloten filters en gestandaardiseerde besmettingscontrolemaatregelen, biedt het protocol een reproduceerbaar kader dat kan worden toegepast op regio's en bemonsteringscampagnes. Deze aanpak sluit aan bij de groeiende erkenning van eDNA als een kostenefficiënte en schaalbare aanvulling op conventionele mariene monitoringtechnieken 9,10,22.

Eerdere eDNA-studies van walvisachtigen hebben grotendeels vertrouwd op transectgebaseerde zeewaterbemonstering van grote onderzoeksvaartuigen of opportunistische kleinvolumebemonstering nabij waarnemingen van walvisachtigen. Transectgebaseerde benaderingen maken een brede ruimtelijke dekking mogelijk, maar vangen vaak verdunde en tijdelijk ontkoppelde DNA-signalen, waardoor detecties van zeldzame of tijdelijke soorten71 worden beperkt, zelfs wanneer bemonstering dicht bij het oppervlak plaatsvindt, en doorgaans gespecialiseerde vaten en infrastructuur vereist 25,37,72. Omgekeerd verbetert klein-volume bemonstering nabij opkomende walvissen de ontmoetingsspecificiteit, maar blijft het gevoelig voor vals-negatieve uitslagen door beperkte watervolumes en inconsistente filtratiepraktijken72,73. Door expliciet flukeprints te targeten en grote volumes aan boord te filteren, vergroot de hier gepresenteerde workflow de kans om laaggeconcentreerd walvisachtig eDNA te vangen, terwijl het haalbaar blijft onder de tijd- en ruimtebeperkingen die kenmerkend zijn voor walviskijkoperaties. Het gebruik van afgesloten, zelfbehoudende filters minimaliseert verder de risico's op hantering en besmetting, waardoor de noodzaak voor in het veld toegepaste conserveringsbuffers wordt overbodig en de logistiek wordt vereenvoudigd onder beperkte omstandighedenaan boord 42,66.

Om kruisvergelijkbaarheid te waarborgen, moeten de volgende parameters binnen een bemonsteringscampagne vastblijven: verzameling van zeewater rechtstreeks uit zichtbare walvisachtige afdrukken; twee biologische replicaten van 10 L per flukeprint; het gebruik van zelfbehoudende eDNA-filters zorgt voor onboardfiltratie tijdens gestandaardiseerde besmettingscontrolemaatregelen, inclusief regelmatige veldnegatieve controles op een gedefinieerde minimumfrequentie; en soortspecifieke qPCR-screening uitgevoerd in drievoud met passende controles. Andere parameters kunnen variëren zonder het methodologische kader te compromitteren, mits ze consequent en transparant worden gerapporteerd, waaronder waterverzamelapparatuur en -hantering, filterporiegrootte, pomptype en slangconfiguratie, filtratieduur en haalbaar gefilterd volume onder verstopte omstandigheden, logistiek van het boordmonster en kortetermijnopslag vóór verzending. Omdat veel verwerkingsstappen in eDNA-studies variabel blijven, wordt een rigoureuze rapportage van alle bemonsterings- en analyseprocessen sterk aanbevolen.

De haalbaarheid van dit protocol is het grootst onder kalme tot matige zeetoestanden (≤ Beaufort 3), met lage tot matige troebelheid, wanneer tijd en ruimte aan boord de verwerking van twee eDNA-filters per flukeprint en een gefilterd watervolume van 10 L per filter mogelijk maken. In de praktijk kunnen getrainde wetenschappers tot Beaufort 3 bemonsteren, maar burgerwetenschappers zouden alleen onder kalme omstandigheden moeten werken (Beaufort 1-2), vanwege de beweging van het vaartuig en turbulentie, ondanks dat walviskijktochten soms plaatsvinden op Beaufort 3. De filtratie moet zo snel mogelijk beginnen na waterafname om DNA-afbraak te minimaliseren47,74. Bemonsteringsstrategieën die door de propeller veroorzaakte verdunning van oppervlakte-eDNA minimaliseren, zoals bemonstering vanaf de lijzijde en onderkant van het vaartuig, ondersteunen verder de nauwkeurigheid van richting en betrouwbare detecties47. Het vermijden van omgekeerde manoeuvreren en het voorkomen dat touwen (bevestigd aan emmers) in contact komen met zeewatermonsters, vermindert het risico op besmetting verder, in overeenstemming met de best practices van aquatisch eDNA38. Afhankelijk van de configuratie en logistiek van het vaartuig (bijv. vaartuighoogte, beweging en beschikbare ruimte aan boord) worden twee bemonsteringsstrategieën ondersteund mits consequent toegepast: (i) onafhankelijke verzameling en filtratie van twee 10 L replica's met twee aparte emmers, of (ii) het verzamelen van één 20 L watermonster dat wordt overgebracht naar een afgesloten steriele container voor veilig transport aan boord en vervolgens wordt opgesplitst in twee 10 L replica's voor filtratie. Een filtratievolume van 10 L per filter vormt een praktisch compromis tussen detectiekans en filtratie-inspanning onder walvisobservatieomstandigheden.

Grotere volumes vergroten de kans om zeldzame of laaggeconcentreerde eDNA vast te leggen, en verminderen vals-negatieven die vaak voorkomen in walvisachtige studies 39,40,75, terwijl het operationeel haalbaar blijft in combinatie met zelfbehoudende filters en grote poriëngroottes 42. Verhoogde deeltjesbelastingen, beweging van het vaartuig, beperkte dekruimte of tijdsbeperkingen kunnen de filtratieefficiëntie en haalbare volumes verminderen, waardoor de toepasbaarheid van het protocol wordt beperkt. In dergelijke gevallen kunnen protocol-afgestemde aanpassingen, zoals verminderde watervolumes of alternatieve filterporiegroottes, nodig zijn en consequent worden toegepast binnen steekproefcampagnes om gegevensvergelijkbaarheid te behouden. De duur van de reis, het tijdstip van walvisontmoetingen en de filtratiecapaciteit bepalen het haalbare aantal monsters. Bij standaard walvissafari's van 3 uur kunnen meestal één tot twee flukeprintmonsters (soms drie) worden voltooid zonder de operatie of de burgerwetenschapservaring te verstoren. Tijdens langere expedities schaalt de bemonsteringscapaciteit met de dagelijkse walvissafari-inspanning (bijvoorbeeld ~8 uur per dag in onze Italiaanse casestudy). In de praktijk zou eDNA-bemonstering op alle drie de locaties kunnen worden uitgevoerd tijdens de piek van toeristen.

succes van eDNA-amplificatie en besmettingscontrole
Omgevingsmonsters, vooral die verzameld in voedingsrijk water, kunnen PCR-remmers bevatten die amplificatie kunnen onderdrukken en vals-negatieve resultaten76 kunnen genereren. Hoewel er in eerdere analyses van IJslandse monsters binnen hetzelfde project42 geen remming werd vastgesteld, zorgde de opname van een stap voor het verwijderen van de inhibitor consistente amplificatie-successen (zie Materiaaltabel) en sluit aan bij de best practice-aanbevelingen voor aquatische eDNA-workflows14,55.

Consistente qPCR-detectieprestaties in verschillende regio's geven aan dat het protocol cetacean eDNA betrouwbaar vastlegt onder diverse omgevingsomstandigheden. Kleine CT-variaties weerspiegelen waarschijnlijk regionale verschillen in temperatuur, troebelheid en productiviteit, die invloed hebben op eDNA-afgifte, afbraak en verspreiding75,76. De detectiegrens van de assay (0,0001 ng/μL) valt binnen het gevoeligheidsbereik dat is gerapporteerd voor andere gevalideerde walvis-assays ontwikkeld binnen het eWHALE-project 14,11,42. De detectiepercentages waren consistent met eerder gepubliceerde flukeprint-gebaseerde onderzoeken, wat de invloed van soortgedrag en frequentie van oppervlakken op detectiesucces benadrukt 41,42,47. Weefselafgeleide DNA-standaarden werden gebruikt voor qPCR-kwantificatie, wat een gangbare praktijk weerspiegelt in marien eDNA-onderzoek 57,72,77,78,79. Hoewel deze benadering variatie kan introduceren in absolute kwantificatie 11,61,80,81,82,83, met name voor laaggeconcentratie en heterogene omgevingsmonsters 84,85, weerspiegelt het de complexiteit van de echte monster55,86. Het gebruik van synthetische standaarden kan de kwantitatieve reproduceerbaarheid en de vergelijkbaarheid tussen studies verbeteren en wordt aanbevolen voor toekomstige toepassingen11,87.

Mogelijke bronnen van besmetting zijn onder meer kruismonsterovervoering, evenals de introductie van menselijk of niet-doelwit omgevings-DNA tijdens de behandeling, wat kan leiden tot vals-positieve detecties88. Strikte besmettingscontrole is essentieel tijdens het hele veld- en laboratoriumproces, vooral onder de beperkte omstandigheden die typerend zijn voor burgerwetenschap. Routinematige handschoenwissels, het gebruik van DNA-vrije apparatuur, afgesloten filtratiesystemen, gestandaardiseerde training, de routinematige opname van veld- en laboratoriumcontroles, documentatie van potentiële besmettingsgebeurtenissen en assayvalidatie volgens vastgestelde kaders zijn cruciaal voor het waarborgen van databetrouwbaarheid en soortdetectie 11,31,49,51,55,89. Hoewel het gebruik van plastic een onvermijdelijke beperking is bij veldgebaseerde moleculaire bemonstering, werd het verbruik waar mogelijk geminimaliseerd en werden gedeeltelijk biologisch afbreekbare filtratiematerialen gebruikt66.

Beperkingen, schaalbaarheid en toekomstige implicaties
Filterverstopping blijft een belangrijke beperking in troebele of productieve omgevingen zoals Skjálfandi Bay (IJsland), waar sussend organisch materiaal en planktondichtheid waarschijnlijk de filtratie-efficiëntiemet 43,90 verminderden. Het registreren van de filtratieduur, indicatoren van filterverstopping zoals verminderde doorstroming, zichtbare luchtbellen in het filter of pompspanning, en het beperken van de filtratietijd tot ongeveer 45 minuten per replica ondersteunt downstream interpretatie en vergelijking. Het gebruik van een gesteriliseerd drijvend apparaat om het filter te laten hangen of door zwaartekracht gevoede filtratiezakken kan mogelijk de verwerkingstijd tijdens de filtratie verkorten, hoewel deze laatste mogelijk niet compatibel zijn met zelfbehoudende eDNA-filters en grote volumes (≥1 L)91. Filters met grotere poriegrootte (≥ 5 μm) kunnen de filtratiesnelheid verder verbeteren, hoewel taxonspecifieke detectie-efficiëntie moet worden geëvalueerd tijdens pilotbemonstering voor eDNAvan walvisachtigen 45,92.

Belangrijke overwegingen voorafgaand aan volledige bemonstering zijn onder andere: het prioriteren van de filtratie aan boord boven vertraagde verwerking, het handhaven van consistente watervolumes en filterconfiguratie, het uitvoeren van pilotmonsters om de filtratie onder lokale omstandigheden te optimaliseren, en het afstemmen van de bemonsteringsinspanning op de capaciteit van het vaartuig en de reisduur. Digitale gegevensinvoertools die gestructureerde, in het veld registratie door burgerwetenschappers mogelijk maken, worden aanbevolen voor toekomstige toepassingen93.

De succesvolle toepassing van deze start-to-end workflow toont robuustheid onder operationele beperkingen, terwijl beperkingen worden benadrukt met betrekking tot ruimte, tijd, weer en verontreinigingsrisico's die inherent zijn aan burgerwetenschapscontexten10,94. Ondanks deze beperkingen vormen walviskijkvaartuigen een krachtig en onderbenut platform voor eDNA-monitoring van walvisachtigen, wanneer gestandaardiseerde training en supervisie worden aangeboden 31,32,42,95. Door deze workflow te integreren met gevestigde monitoringstools voor walvisachtigen, zoals foto-identificatie, passieve akoestiek en biopsiebemonstering, kunnen genetische detecties gekoppeld worden aan gedrags- en demografische gegevens. Hoewel deze studie zich richt op soortspecifieke qPCR-gebaseerde detectie, zouden toekomstige toepassingen DNA-metabarcoding of populatiegenetische analyses kunnen integreren, wat de ecologische en conserveringswaarde van eDNA-monitoring bij walvisachtigen verder uitbreidt.

Naarmate eDNA-gebaseerde benaderingen blijven floreren, biedt deze workflow een schaalbare basis voor het integreren van genetische monitoring in bestaande mariene observatie- en beschermingsprogramma's, met name in walvisachtige hotspots en gevoelige ecosystemen.

Openbaarmakingen

Belén García Ovide is oprichter en uitvoerend directeur van Ocean Missions, een non-profitorganisatie gericht op oceaanbehoud en gevestigd in Húsavík, Noordoost-IJsland. Ocean Missions coördineert de bemonstering van walvisobservatievaartuigen in IJsland, evenals van Arctische expeditieschepen. Ze is ook vertegenwoordiger van North Sailing, een walviskijkbedrijf in Húsavík, binnen het eWHALE-project. Deze samenwerkingen hadden geen invloed op het onderzoeksontwerp, de gegevensverzameling, analyse of interpretatie van de resultaten.

Dankbetuigingen

We willen alle mensen die betrokken zijn bij veldwerk en laboratoriumwerk erkennen, namelijk:

i) Aidan Mabey, Matteo Tosato, Anouk Adolph, Jeanne Laporte, Romi Neerot en Isabell Österle, die deelnamen aan monsters die werden verzameld in Skjálfandi Bay, IJsland; ii) Dania Tesei, Michael Costa, Rita Norberto, Marlene Schwandt, Rita Leitão, Ricardo Ventura, Martijn Schouten, Giada Viscontini, Katharina Leeb, Anthony Le Floch, Francisco Nunes, Renato Cardoso, Faustine Darius, Monique Schouten, Laura Biet op de Azoren (Portugal); iii) Sandra Schallhart, Jana Robertson in Oostenrijk; en iv) Sabina Airoldi, Mario Gabualdi, Marina Costa, Morgana Vighi, Nino Pierantonio, Roberto Raineri voor gegevensverzameling in het Pelagos-reservaat (Italië).

Dit onderzoek werd gefinancierd door Biodiversa+, het European Biodiversity Partnership onder de gezamenlijke BiodivProtect-oproep voor onderzoeksvoorstellen 2021-2022, mede gefinancierd door de Europese Commissie (GA nr. 101052342) en met de financieringsorganisaties: 1) The Icelandic Center for Research (RANNÍS), (subsidie nr. 229030), 2) Ministerie van Universiteiten en Onderzoek (MUR), uit het FIRST- en IGRUE-speciale account met betrekking tot het Europese partnerschap Biodiversa+ Call 2021 - eWHALE-project, 3) het Oostenrijks Wetenschapsfonds (FWF) [doi: 10.55776/I6389] en het publicatiefonds van de Universiteit van Innsbruck.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alternative eDNA filters: SterivexTM /WaterraMerck Millipore/Waterra Pumps LimitedSVHVL10RC/NA0.45 µm pore size. Require eDNA preservation buffers 
AW1, AW2, AE buffersQiagen  19081, 19072, 19077Buffer solutions used for DNA purification during extraction
Bleach solution (1:10)DM - Denk mit, HygienereinigerCustomizedSurface decontamination. All steps in laboratory processes
BucketsBoating shops, fishing gear, AmazonRigid. Rubber or hard plastic (≥ 10 L). One or more depending on the sampling set-up and onboard logistics
Cleanup Reagent, Express PCR ExoSAP-IT75001.1.EAPCR products preparation for Sanger sequencing
Cooling boxHousingInsulated rigid container or cooling bag
Disposable gloves, Large (L) and Medium (M) sizes,
Powder-Free		Kimberly-Clark43431, 55090Disposable nitrile or latex gloves, 100-units box. Amount required: 1 box per 10 - 15 trips
DNA standards (3 μL) NACustomizedDNA tissue-derived- serial dilution (8 points, 10 ng/µL) from humpback whale. Calibration in qPCR
DNA-safe laboratory clothingFalano, PP-Overall081-2900All steps in laboratory processes.
eDNA containerHousing or hardware storesNALidded, durable, transparent (≥ 10 L). 
Elution plate, Rod cover, Wash plates, Bind plateQiagen19581, 997004, 1031656, 302570Plastics used for DNA extraction 
Ethanol (8:10)Endure, ACS ISO RangVariousBench sterilization. All laboratory steps
Field data sheets
Fluorescence-based high sensitivity assayThermo Fisher ScientificQ32851Qubit dsDNA High Sensitivity assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)
High-speed centrifuge (24,000 rpm)Hettich Zentrifugen Separates DNA-containing supernatant from debris. DNA lysis
Ice packsHousing storesCooling of the samples inside shipping container
IPC forward and reverse primersIntegrated DNA TechnologiesNACustom product used for the amplification of target species DNA
IPC PrimeTime qPCR ProbesIntegrated DNA TechnologiesNACustom product used for the amplification of target species DNA
Laminar flow hood Kendro Laboratory ProductsVFS1206Sterile environment for reagent preparations in qPCR preparation
Laminated illustrated field protocol Customized
Lysis bufferQiagen79216DNeasy lysis buffer AL. Alternative to TES Buffer + Proteinase K
Magnetic-bead–based DNA robotKingFisher Apex 96 PCR head5400910Software: BindIx PC 
Magnetic particles for nucleic acid binding (30 µL)Qiagen67563MagAttract particles. Facilitates DNA binding to magnetic beads in DNA extraction
Master mix (5 μL)EMM, Life Technologies4396838TaqMan Environmental Master Mix (2.0)
Mini Plate Spinner Centrifuge LabnetC1000Spin down liquid droplets and condensation from PCR and microplates
OneStep-96 PCR Inhibitor Removal KitZYMO ResearchD6035Purification and removal of contaminants in eDNA extracts 
PCR PlatesBio-RadHSP9601Hard-Shell 96-Well
Pipettes + sterile filtered tipsPipettes: BIOHIT, Filter tips: Biozym Safe  Seal Tips  professionalVariousManual or electronic pipettes can be used at various maximum volumes
Plate Spinner Centrifuge NANARemoves bubbles before qPCR 
Proteinase KAvantor VWRA4392.0010Digests proteins to help release DNA during lysis
Purified waterMilliQNARNase free water, used for negative controls and cleaning solution 
Reaction tubes (2 mL)Eppendorf30120094DNA lysis
Real-time quantitative PCR thermocyclerAnalytikjenaNAQTower 3G platform. Amplifies and quantifies DNA in real time
RopesBoating, hardware stores, fishing harborsNAStrong material (e.g., polyethylene or braid rope). Length at least two times the height of the vessel
Sealing film, adhesive, opticalBio-RadMSB1001Microseal 'B'. Seal PRC plate before PCR
Self-preserving eDNA filtersSmith-Root 11579-251.2 µm pore size. Amount per sampling campaign: as needed
Shipping containerLaboratories, pharmacies, AmazonVariousStyrofoam insulated
Software for biological sequence alignment and analysisBio EditVersion 7User-Friendly Biological Sequence Alignment Editor and Analysis Program for Windows 95/98/NT
Squeeze bottleLaboratories, pharmaciesVariousFilled with household bleach (1:10)
Statistical analysis softwareR Studio Team. (2023)Version 4.2.1
Sterilized DNA-free glovesSempercare  edition79712All steps in laboratory processes. 
TES bufferCustom product, equivalent to DNeasy lysis buffer
Toxic waste containerSafe disposal of hazardous waste. All steps
UV lamp SterilAIRHood sterilization for qPCR preparation
Vortex-genie 2 vortex mixer Thermo Fisher Scientific50728002Homogenizes and mixes reagents. DNA lysis, extraction
Waste containerHousing storesSmall rigid container
Water pump (peristaltic/vacuum)Eijkelkamp; Solinst/Smith-Root 12.34.SB; 410/12099Portable pumps
Waterproof markerVarious

Referenties

  1. Hammerschlag, N., et al. Ecosystem function and services of aquatic predators in the Anthropocene. Trends Ecol Evol. 34 (4), 369-383 (2019).
  2. Sequeira, A. M. M., et al. Overhauling ocean spatial planning to improve marine megafauna conservation. Front Mar Sci. 6, 639(2019).
  3. Noren, D. P., Mocklin, J. A. Review of cetacean biopsy techniques: Factors contributing to successful sample collection and physiological and behavioral impacts. Mar Mamm Sci. 28 (1), 154-199 (2012).
  4. Evans, P. G. H., Hammond, P. S. Monitoring cetaceans in European waters. Mammal Rev. 34 (1-2), 131-156 (2004).
  5. Bittencourt, L., et al. Mapping cetacean sounds using a passive acoustic monitoring system towed by an autonomous Wave Glider in the Southwestern Atlantic Ocean. Deep Sea Res Part I. 142, 58-68 (2018).
  6. Balmer, B. C., et al. Advances in cetacean telemetry: A review of single-pin transmitter attachment techniques on small cetaceans and development of a new satellite-linked transmitter design. Mar Mamm Sci. 30 (2), 656-673 (2014).
  7. Angliss, R. P., et al. Comparing manned to unmanned aerial surveys for cetacean monitoring in the Arctic: Methods and operational results. J Unmanned Veh Syst. 6 (3), 109-127 (2018).
  8. Jahoda, M., et al. Mediterranean fin whale (Balaenoptera physalus) response to small vessels and biopsy sampling assessed through passive tracking and timing of respiration. Mar Mamm Sci. 19 (1), 96-110 (2003).
  9. Fu, M., Hemery, L., Sather, N. Cost efficiency of environmental DNA compared to conventional methods for biodiversity monitoring at marine energy sites. PNNL Rep. , PNNL-32310(2021).
  10. Sahu, A., et al. Environmental DNA (eDNA): Powerful technique for biodiversity conservation. J Nat Conserv. 71, 126325(2023).
  11. Klymus, K. E., et al. Development and testing of species-specific quantitative PCR assays for environmental DNA applications. J Vis Exp. (165), e61825(2020).
  12. Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: The importance of primer specificity. PLoS ONE. 8 (3), e59520(2013).
  13. Wilcox Talbot, L. A., et al. Validated environmental DNA assay for detection of the rare Rice's whale (Balaenoptera ricei). Environ DNA. 7 (2), e70074(2025).
  14. Rodriguez, L. K., et al. Inter-laboratory ring test for environmental DNA extraction protocols: Implications for marine megafauna detection using novel qPCR assays. Metabarcoding Metagenomics. 9, e128235(2025).
  15. Adams, C. I., et al. Beyond biodiversity: Can environmental DNA cut it as a population genetics tool. Genes. 10 (3), 192(2019).
  16. Parsons, K. M., et al. Water everywhere: Environmental DNA can unlock population structure in elusive marine species. R Soc Open Sci. 5 (8), 180537(2018).
  17. Rourke, M. L., et al. Environmental DNA as a tool for assessing fish biomass: A review. Environ DNA. 4 (1), 9-33 (2022).
  18. Sard, N. M., et al. Comparison of fish detections using environmental DNA metabarcoding and traditional gears. Environ DNA. 1 (4), 368-384 (2019).
  19. Sigsgaard, E. E., et al. Population-level inferences from environmental DNA-Current status and future perspectives. Evol Appl. 13 (2), 245-262 (2020).
  20. Afonso, L., et al. Environmental DNA as a complementary tool for biodiversity monitoring. PLoS ONE. 19 (10), e0300992(2024).
  21. Silliman, K., et al. Evaluating prey availability for the Rice's whale based on environmental DNA. Ecol Evol. 16 (1), e72789(2026).
  22. Boyse, E., et al. Environmental DNA reveals fine-scale spatial and temporal variation of marine mammals and prey species. Environ DNA. 6 (4), e587(2024).
  23. Székely, D., Cammen, K. M., Olsen, M. T. Using environmental DNA to study marine mammals in the North Atlantic. NAMMCO Sci Publ. 12, (2021).
  24. Alter, S. E., et al. Using environmental DNA to detect whales and dolphins in the New York Bight. Front Conserv Sci. 3, 820377(2022).
  25. Parsons, K. M., et al. Environmental DNA for monitoring marine mammals: Challenges and opportunities. Front Mar Sci. 9, 987774(2022).
  26. Couton, M., Viard, F., Altermatt, F. Opportunities and inherent limits of using environmental DNA for population genetics. Environ DNA. 5 (5), 1048-1064 (2023).
  27. Leerhøi, F., et al. Exploring the potential of extreme citizen science with Danish high school students using environmental DNA for marine monitoring. Front Mar Sci. 11, 1347298(2024).
  28. Tøttrup, A. P., et al. Citizens in the lab: Performance and validation of eDNA results. Citiz Sci Theory Pract. 6 (1), (2021).
  29. Kelly, R., et al. Citizen science and marine conservation: A global review. Philos Trans R Soc B. 375 (1814), 20190461(2020).
  30. Church, E. K., et al. From citizen science experiences to stewardship action. Mar Policy. 173, 106537(2025).
  31. Barbaccia, E., et al. Combining citizen science, environmental DNA, and whale watching. Ocean Coast Manag. 269, 107827(2025).
  32. Barbaccia, E., et al. Willingness to engage in marine conservation through eDNA-informed citizen science. Sci Rep. 15 (1), 41983(2025).
  33. Broadhurst, H. A., et al. Citizen scientists' motivation to participate in environmental DNA (eDNA) surveys. Citiz Sci Theory Pract. 10 (1), (2025).
  34. O'Connor, S., et al. Whale Watching Worldwide. , Int Fund Anim Welfare. Yarmouth, MA. (2009).
  35. Valsecchi, E., et al. Ferries and environmental DNA: Underway sampling from commercial vessels. Front Mar Sci. 8, 704786(2021).
  36. Foote, A. D., et al. Investigating the potential use of environmental DNA (eDNA) for genetic monitoring of marine mammals. PLoS ONE. 7 (8), e41781(2012).
  37. Baker, C. S., et al. Environmental DNA (eDNA) from the wake of the whales. Front Mar Sci. 5, 342201(2018).
  38. Takahashi, M., et al. Aquatic environmental DNA: A review. Sci Total Environ. 873, 162322(2023).
  39. Govindarajan, A. F., et al. Improved biodiversity detection using a large-volume environmental DNA sampler. Deep Sea Res Part I. 189, 103871(2022).
  40. Bessey, C., et al. Maximizing fish detection with environmental DNA metabarcoding. Environ DNA. 2 (4), 493-504 (2020).
  41. Robinson, C. V., et al. DNA from dives: Species detection of humpback whales from flukeprint environmental DNA. Environ DNA. 6 (2), e524(2024).
  42. Rodriguez, L. K., et al. Enhancing environmental DNA sampling efficiency for cetacean detection. Environ DNA. 7 (3), e70103(2025).
  43. Jackman, J. M., et al. Performance of eDNA filtration methods in a hyper-tidal estuary. Environ DNA. 7 (5), e70206(2025).
  44. Majaneva, M., et al. Environmental DNA filtration techniques affect recovered biodiversity. Sci Rep. 8, 4682(2018).
  45. Liu, Q., et al. Optimization of pore size and filter material for better enrichment of environmental DNA. Front Environ Sci. 12, 1422269(2024).
  46. Li, J., et al. Effect of filtration method on environmental DNA capture efficiency. Mol Ecol Resour. 18 (5), 1102-1114 (2018).
  47. Robinson, C. V., et al. Temporal dynamics of flukeprint environmental DNA detection. Environ DNA. 7 (3), e70132(2025).
  48. Székely, D., et al. Environmental DNA captures the genetic diversity of bowhead whales. Environ DNA. 3 (1), 248-260 (2021).
  49. Bruce, K., et al. A practical guide to DNA-based methods for biodiversity assessment. Adv Books. 1, e68634(2021).
  50. Pogner, C. -E., et al. Airborne DNA: State of the art. Sci Total Environ. 957, 177439(2024).
  51. Goldberg, C. S., et al. Critical considerations for environmental DNA detection. Methods Ecol Evol. 7 (11), 1299-1307 (2016).
  52. Combining environmental DNA sampling, whale watching and citizen science. , eWHALE Project. accessed (2025).
  53. Klotz, L., et al. Annual and monthly fluctuations in humpback whale presence. J Cetacean Res Manag. 16, 9-16 (2017).
  54. Peres dos Santos, R., et al. First humpback whale re-sighting. Polar Biol. 45 (3), 523-527 (2022).
  55. Thalinger, B., et al. Validation scale for environmental DNA assays. Environ DNA. 3 (4), 823-836 (2021).
  56. Hall, T. A. BioEdit. Nucleic Acids Symp Ser. 41, 95-98 (1999).
  57. Benoit, N. P., et al. Using qPCR of environmental DNA to estimate salmon biomass. Environ DNA. 5 (4), 683-696 (2023).
  58. Skovhus, T. L., et al. Real-time quantitative PCR for marine bacteria. Appl Environ Microbiol. 70 (4), 2373-2382 (2004).
  59. Godhe, A., et al. Quantification of diatom and dinoflagellate biomasses. Appl Environ Microbiol. 74 (23), 7174-7182 (2008).
  60. Baudry, T., et al. Influence of distance and seasonality in eDNA detection. Environ DNA. 5 (4), 733-749 (2023).
  61. Hunter, M. E., et al. Detection limits of PCR assays. Mol Ecol Resour. 17 (2), 221-229 (2017).
  62. Lee, J., et al. Species-specific eDNA assay for Ascidiella aspersa. Ecol Evol. 15 (11), e72453(2025).
  63. National Center for Biotechnology Information. BLAST. , accessed (2025).
  64. R Foundation. R. , (2023).
  65. susannat, eDNA sampling protocol: Smith-Root citizen scientist sampler. , protocols.io. (2024).
  66. Thomas, A., et al. Self-preserving eDNA filter. Methods Ecol Evol. 10, 1137-1145 (2019).
  67. Thalinger, B., et al. eDNA shedding of freshwater fish. Front Ecol Evol. 9, 623718(2021).
  68. Hymus, C. [PhD Thesis]. , Murdoch Univ. (2016).
  69. Rodriguez, L. K., Thalinger, B. DNA extraction - Qiagen BioSprint® 96 Workstation using the Biosprint 96 tissue protocol UIBK eWHALE. , protocols.io. (2024).
  70. Valsecchi, E., et al. Universal primers for marine mammals. Environ DNA. 2 (4), 460-476 (2020).
  71. Rota, A., Valsecchi, E. Floating Lab SOP. J Vis Exp. 222, e67366(2025).
  72. Robinson, C. V., et al. Limited cetacean detection by low-volume eDNA. Environ DNA. 5 (6), 1641-1651 (2023).
  73. Pinfield, R., et al. False-negative detections in killer whale presence. Environ DNA. 1 (4), 316-328 (2019).
  74. Strickler, K. M., et al. eDNA degradation. Biol Conserv. 183, 85-92 (2015).
  75. Rishan, S. T., et al. Applications of eDNA metabarcoding. Environ Adv. 12, 100370(2023).
  76. Schrader, C., et al. PCR inhibitors. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  77. Thomsen, P. F., et al. Detection of marine fish fauna. PLoS ONE. 7 (8), e41732(2012).
  78. Guri, G., et al. Detection sensitivity of qPCR and ddPCR. Ecol Evol. 14 (12), e70678(2024).
  79. Andruszkiewicz, E. A., et al. Persistence of marine fish eDNA. PLoS ONE. 12 (9), e0185043(2017).
  80. Venegas, V., Halberg, M. C. mtDNA copy number. Methods Mol Biol. 837, 327-335 (2012).
  81. Naue, J., et al. mtDNA copy number variation. Mitochondrion. 74, 101823(2024).
  82. Andreu, A. L., et al. mtDNA copy number. Mitochondrion. 9 (4), 242-246 (2009).
  83. Langlois, V. S., et al. Robust qPCR-based eDNA assays. Environ DNA. 3 (3), 519-527 (2021).
  84. Barnes, M. A., Turner, C. R. Ecology of environmental DNA. Conserv Genet. 17, 1-17 (2016).
  85. Mathieu, C., et al. Variability in eDNA data. Front Ecol Evol. 8, 466868(2020).
  86. Wilson, C. C., et al. Synthetic controls for eDNA. Methods Ecol Evol. 7 (1), 23-29 (2016).
  87. Lux, M. W., et al. Reproducibility in synthetic biology. Synth Biol. 8 (1), ysad014(2023).
  88. Sepulveda, A. J., et al. Contamination in eDNA studies. Front Ecol Evol. 8, 609973(2020).
  89. Minamoto, T., et al. An illustrated manual for environmental DNA research. Environ DNA. 3 (1), 8-13 (2021).
  90. Barnes, M. A., et al. Environmental conditions influence eDNA persistence. Environ Sci Technol. 48 (3), 1819-1827 (2014).
  91. Oka, S. I., et al. Gravity filtration of eDNA. MethodsX. 9, 101838(2022).
  92. Berran, M. S., et al. eDNA sampling strategies. Hydrobiologia. 852, 3485-3501 (2025).
  93. Esri. ArcGIS Survey123. , (2025).
  94. Ralson, M. J., et al. Translating eDNA into conservation action. Conserv Sci Pract. 7 (2), e70000(2025).
  95. Dela Cruz-Modino, R., Cosentino, M. Whale-watching industry value. Sustainability. 14 (20), 13471(2022).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

eDNA bemonsteringFlukeprint collectiefiltratie aan boordmoleculaire analyseskwantitatieve PCRmitochondriaal DNAmariene biodiversiteit
Milieu-DNA-monsters van walviskijkvaartuigen voor walvisachtige monitoring
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.