Chirurgisch protocol voor een groot, herafsluitbaar schedelraam dat longitudinale, multimodale elektrofysiologische opnames van het muis default mode netwerk mogelijk maakt

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een tweefasige chirurgische methode om een groot, hersluitbaar, dura-sparend craniaal venster bij muizen te creëren. Deze techniek maakt chronische, multimodale elektrofysiologische opnames mogelijk van verspreide, diepe-hersennetwerken, zoals het Default Mode Network, gedurende meerdere weken.

Samenvatting

Het default mode network (DMN) is een central, grootschalig hersennetwerk dat betrokken is bij een reeks cognitieve functies en neuropsychiatrische stoornissen, zoals major depressive disorder (MDD). Het bestuderen van de complexe dynamiek van het DMN in diermodellen levert onschatbare inzichten op in de functie ervan in zowel gezonde als pathologische toestanden. Het uitvoeren van stabiele, langdurige, grootschalige elektrofysiologische opnames van de meerdere diepe en verspreide knooppunten van het DMN blijft echter een aanzienlijke uitdaging bij wakkere, gedragende muizen.

Hier wordt een nieuw tweefasen-chirurgisch protocol gepresenteerd om een groot (4 mm × 7,6 mm), duurzaam en hersluitbaar schedelraam bij muizen te creëren. De procedure is ontworpen om de integriteit van de dura mater te behouden, wat van groot belang is voor de langdurige hersengezondheid en de stabiliteit van de registratie.

Dit venster maakt gelijktijdige, herhaalde, longitudinale opnames mogelijk van meer dan 1.000 elektroden door micro-elektrocorticografie op oppervlakteniveau (μECoG) te combineren met twee high-density intracraniële elektrodeprobes, wat ongekende toegang tot het DMN biedt. Deze techniek biedt een robuust platform voor multimodaal, multischaalonderzoek naar netwerkbrede elektrofysiologische dynamiek gedurende enkele weken, en opent nieuwe wegen om de neuroplastische veranderingen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de pathofysiologie van hersenaandoeningen en om de chronische effecten van nieuwe therapieën te evalueren.

Inleiding

Het Default Mode Network (DMN) werd voor het eerst geïdentificeerd in menselijke hersenbeeldvormingsstudies als een constellatie van regio's die consequent onderdrukt worden tijdens extern gerichte, aandachtzoekende taken¹. Het wordt nu beschouwd als een fundamenteel grootschalig netwerk dat intern georiënteerde cognitieve processen ondersteunt, zoals zelfreferentieel denken, autobiografisch geheugen en planning van toekomstige gebeurtenissen ^2,3. Bij mensen bestaat het canonieke DMN uit een reeks anatomisch verbonden kerngebieden, waaronder de mediale prefrontale cortex (mPFC), posterior cingulate cortex (PCC), inferior pariëtale lobule (IPL) en de hippocampale formatie⁴. Dysfunctie binnen dit netwerk is een belangrijk kenmerk van verschillende neuropsychiatrische aandoeningen. Bij een ernstige depressieve stoornis (MDD) vertoont de DMN vaak hyperactiviteit en veranderde patronen van functionele connectiviteit, waarvan wordt gedacht dat ze ten grondslag liggen aan kernsymptomen van MDD, zoals piekeren en een negatief zelfbeeld ^5,6.

Om de cellulaire en circuitmechanismen die DMN-disfunctie aansturen te bestuderen, zijn robuuste diermodellen onmisbaar. Een homoloog DMN is betrouwbaar geïdentificeerd bij knaagdieren, bestaande uit vergelijkbare hersengebieden zoals de mPFC, cingulate cortex en retrospleniale cortex (RSP), waarmee de muis valideert als een translationeel relevant model voor mechanistisch onderzoek ^7,8. Bovendien is aangetoond dat chronische stress, een belangrijke factor bij depressie, de DMN-connectiviteit bij knaagdieren op een vergelijkbare manier verandert als bij menselijke MDD-patiënten⁹.

Het begrijpen van de neuroplastische veranderingen die optreden in ziektetoestanden of als reactie op chronische therapeutische interventies vereist longitudinale observatie van neurale activiteit, aangezien een enkele opnamesessie de dynamische aanpassing van neurale circuits over tijd niet kan vastleggen¹⁰. In vivo elektrofysiologie biedt de temporele resolutie op millisecondeschaal die nodig is om neurale oscillaties en synchronisatie in het lokale veldpotentiaal (LFP) te bestuderen. LFP vertoont het opgetelde extracellulaire signaal dat de gesynchroniseerde synaptische activiteit van lokale neuronale populaties weerspiegelt, die de fundamentele substraten van netwerkcommunicatie^{zijn 11,12}. Het uitvoeren van chronische, grootschalige elektrofysiologische opnames bij wakkere muizen blijft echter technisch veeleisend. Conventionele chronische craniale vensters zijn ontwikkeld voor optische beeldvorming bij de wakkere muis en blijven de standaardvoorbereiding voor dat doel, waarbij hun typische enkelhemisfeervoetafdruk en transparante glazen deklaag optimaal zijn voor de beoogde uitlezing¹³. Ze waren echter niet ontworpen voor wakkere multi-site elektrofysiologie, dus het werkgebied en de optische interface sluiten gelijktijdige hoogdichtheidsopname uit van de verspreide bilaterale knooppunten van een netwerk zoals de DMN¹⁴ uit. Chronische elektrodeimplantaten maken op hun beurt longitudinale opnames mogelijk, maar veroorzaken progressieve inkapseling van vreemde voorwerpen en gliale littekens rond de permanent geplaatste schacht, waardoor de signaalkwaliteit over tijd afneemt^15,16.

De hier beschreven tweefasige chirurgische procedure pakt deze beperkingen direct aan. Het produceert een groot, hersluitbaar schedelraam dat tussen sessies wordt gesloten door een passief polydimethylsiloxaan (PDMS) membraan, siliconenkit en een 3D-geprinte kap, waardoor herhaalde niet-terminale invoeging van μECoG-roosters voor mesoschaal LFP-opnames mogelijk is, samen met meerdere hoogdichte intracraniële elektrodeprobes voor microschaal, laminair opgeloste single-unit en LFP-activiteit^17,18. In tegenstelling tot eerdere chronische benaderingen, die ofwel vertrouwen op permanent geïmplanteerde elektrodearrays die gliale encapsulatie van de elektroden in de loop van de tijd ophopen of terminale acute craniotomieën vereisen die longitudinale ontwerpen uitsluiten, behoudt het hier beschreven venster een intacte dura en voorkomt permanente contact met vreemde voorwerpen 15,16,18 . Bovendien verschilde in een validatiecohort waarin het craniale venster drie keer werd heropend (postoperatieve dagen 0, 21, 22) zonder elektrofysiologische registratie, de kwantitatieve immunoreactiviteit van gliale fibrillaire zuurproteïne (GFAP) en geïoniseerd calciumbindend adaptermolecuul 1 (IBA1) niet significant van niet-chirurgische controles, wat wijst op lage astrogliose en microgliose onder het hier gebruikte herhaalde openingsschema. De methode is bijzonder geschikt voor longitudinale, multi-site opnames van verspreide corticale netwerken, inclusief het DMN, gecombineerd met laminaire high-density intracraniële elektrode-probe toegang tot diepe structuren bij wakkere, kopgefixeerde muizen. De belangrijkste operationele beperkingen zijn de microchirurgische expertise die vereist is voor betrouwbare dura-besparende botflapverwijdering en de onverenigbaarheid met vrij bewegende opnames, aangezien de high-density intracraniële elektrodeprobes kopfixatie vereisen.

Protocol

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de nationale Dierproefraad in Finland (licentienummer: ESACI/40845/2022) en de experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement betreffende de bescherming van dierlijk gebruik voor wetenschappelijke doeleinden, en met de nationale richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

OPMERKING: Alle chirurgische ingrepen worden uitgevoerd in een laminair-flow chirurgische kap die vooraf is gesteriliseerd door ultraviolet bestraling (minimaal 15 minuten) of door grondige ethanol-oppervlaktedecontaminatie. Isoflurane afvalgas wordt opgevangen door een geactiveerd houtskoolverzamelsysteem dat in de motorkap is gemonteerd. De operator draagt een wegwerphaarkapje, een chirurgisch mondkapje, een laboratoriumjas met lange mouwen en enkelvoudige niet-steriele nitril onderzoekshandschoenen (bespoten met 80% ethanol voordat hij de kap binnengaat). Een container voor de vernietiging van scherpe middelen wordt in de kap geplaatst voor directe verwijdering van scalpelbladen en injectienaalden.

1. Preoperatieve voorbereiding en anesthesie

1. Gebruik C57BL/6JRj-muizen, minstens 10 weken oud en met een gewicht van meer dan 20 g.
2. Maak voor de operatie alle instrumenten schoon in een warm ultrasoon bad. Spoel, droog en laat het in 70% ethanol weken gedurende minimaal 15 minuten.
3. Of steriliseer instrumenten door kort voor gebruik door een glasvezel of infraroodsterilisator te passeren. Steriele gordijnen worden niet gebruikt. Tussen opeenvolgende dieren in dezelfde sessie moet je de instrumenten minstens 2 minuten^{en 19} minuten terugbrengen in de ethanolbad.
4. Weeg elke muis afzonderlijk op een gekalibreerde weegschaal en bereken de volumes van preoperatieve medicijnen.
5. Bereid de steriele PDMS-membranen vooraf voor (eenmaal per batch, buiten de acute operatiedag).
   1. Giet steriele PDMS-membranen uit een 10:1 elastomeer-tot-uithardingsmiddel mengsel, bereid volgens de instructies van de fabrikant en plaat tot een streefdikte van ongeveer 500 μm door het niet-uitgeharde mengsel tussen twee platte borosilicaatglazen platen te plaatsen, en hard vervolgens uit bij 60 °C gedurende minstens 2 uur.
   2. Verzegel de uitgeharde vellen in autoclavezakjes en steriliseer ze met stoomautoclaven. In de vooraf gesteriliseerde chirurgische kap gebruik je een steriele #11 scalpel en een kleine roestvrijstalen liniaal om elk vel in rechthoekige membranen te snijden die passen bij de afmetingen van het schedelraam.
   3. Bewaar de voorgesneden membranen in steriel laboratoriumgerei (bijvoorbeeld individuele putten van een celkweekplaat met 6 putten) tot gebruik.
6. Voer hardwarekwaliteitscontrole uit vóór elke opnamesessie.
   OPMERKING: Er wordt geen routinematige impedantiecontrole uitgevoerd op de μECoG-array: referentiedraadfouten zijn duidelijk zichtbaar in de ruwe sporen, en impedantietesten worden alleen uitgevoerd wanneer er een hardwareprobleem wordt vermoed. De high-density intracraniële elektrodeprobes bevatten ingebouwde impedantie- en kabelintegriteitsdiagnostiek die toegankelijk zijn via de grafische gebruikersinterface van de opnamesoftware; gebruik deze wanneer de signaalkwaliteit aantoonbaar is aangetast.

2. Fase 1: Diervoorbereiding en implantatie van de hoofdplaat

1. Dierlijke bereiding
   1. Verdoof de muis met isoflurane (inductie: 4%, onderhoud: 1,5−2,5%, zuurstofstroom van 0,5 L/min). Bevestig de diepte van de anesthesie door het verlies van de teenknielreflex.
   2. Scheer de vacht van de bovenkant van het hoofd, ongeveer van de ogen tot aan de nek.
   3. Plaats het dier op een door feedback geregelde verwarmingsmat, uitgerust met een interne temperatuursensor die gekalibreerd is om de lichaamstemperatuur gedurende de hele procedure op 37 °C te houden. Breng carbomer oogzalf aan om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
   4. Zet de muis vast in het stereotactische frame met niet-ruptuur oorbenen. Stel de snijtanden zo aan dat de schedel plat ligt, met bregma en lambda op gelijke dorsoventrale hoogte (platte schedelrichting). Houd de anesthesie met isoflurane (1,5–2,5%) toegediend via een neuskegel met een zuurstofstroom van 0,5 L/min.
   5. Dien preoperatieve pijnstillers en ontstekingsremmers toe via subcutane (s.c.) injecties: Carprofen (5 mg/kg), buprenorfine (0,05 mg/kg) en Dexamethason (2 mg/kg).
   6. Desinfecteer het geschoren gebied met een povidon-jodiumoplossing.
   7. Injecteer lidocaïne-epinefrine-oplossing (s.c.) als lokaal verdovingsmiddel onder de huid van de hoofdhuid.
2. Schedelblootstelling
   1. Maak een kleine dwarsdoorsnee bij de oorlijn (ongeveer 1 cm).
   2. Vergroot de incisie geleidelijk door de snee lateraal rond de oren en langs elke zijde van het hoofd richting de ogen te verlengen, maar overschrijd de snee naar de ogen niet. Maak de belichting compleet door aan elke kant een diagonale snede naar de middenlijn te maken, zodat het gehele dorsale schedeloppervlak zichtbaar is.
3. Reinigen van de schedel
   1. Maak de blootliggende schedel zorgvuldig schoon met aceton van laboratoriumkwaliteit. Doop een steriel wattenstaafje in aceton, verwijder overtollig oplosmiddel (waardoor druppel op aangrenzend weefsel wordt voorkomen) en breng het aan op het bot totdat al het zichtbare periost is verwijderd.
   2. Gebruik aceton vanwege het vermogen om vetresten en persistente membraneuze resten op het botoppervlak op te lossen, niet als desinfectiemiddel.
      OPMERKING: Volledige verwijdering van het periost en van lipidenresiduen van het botoppervlak is cruciaal voor sterke hechting van de hoofdplaat en tandcement. Omdat het implantaat bestand moet zijn tegen de mechanische spanningen die door de wakkere muis worden veroorzaakt, wordt elk restant periost of lipidefilm op het botadhesieuminterface een dominant faalpunt.
   3. Gebruik een stomp microchirurgisch (circulair) scalpelblad om eventuele restanten van periostale en bindweefselfragmenten te verwijderen die de acetonspoeling niet volledig heeft opgelost. Houd deze ongeveer 45° ten opzichte van het botoppervlak en schraap de schedel met lichte, radiale streken naar buiten gericht vanaf de bregma–middenlijn verbinding richting de laterale randen van het blootliggende bot.
   4. Ga door totdat het gehele blootliggende botoppervlak minstens één keer is doorkruist en er gelijkmatig schoon en mat uitziet.
   5. Sluit af met een laatste korte reinigingsronde met aceton op een watten applicator.
4. Het markeren van de craniotomie-locatie
   1. Bevestig een biocompatibele chirurgische huidmarker aan de digitale stereotactische arm.
   2. Markeer een rechthoekig gebied van 4 mm × 7,6 mm op de schedel ten opzichte van de bregma.
      1. Navigeer met de markertip naar de bregma en zet de X- en Y-coördinaten op de digitale weergave terug naar nul.
      2. Vertaal de arm naar elk van de vier hoeken van het geplande raam, zodat de rechthoek 2 mm zijwaarts uitsteekt vanaf bregma aan beide zijden, 3 mm rostral en 4,6 mm caudaal, en plaats een enkele stip op elke hoek.
5. Markeer de twee intracraniële inzetplaatsen van de probe op de rechterhersenhelft.
   1. Markeer de rostrale sondelocatie op 1,66 mm A/P en 1,95 mm M/L vanaf de bregma.
   2. Markeer de caudale sondeplaats op -2,2 mm A/P en 1,9 mm M/L vanaf bregma.
      OPMERKING: Deze locaties zijn aangepast om DMN-specifieke regio's te targeten. Met dit protocol kunnen insertieplaatsen worden aangepast naar meerdere verschillende regio's.
   3. Koppel de marker los van de stereotactische arm.
   4. Houd een gesteriliseerde, flexibele rechte rand (bijvoorbeeld een dun plastic kaartje) tegen de schedel en verbind de vier hoekpunten met de marker om het toekomstige schedelraam als een doorlopende rechthoek af te tekenen.
6. Het oppervlak vergroten voor betere hechting
   1. Voer alle volgende stappen uit tot sectie 4 onder de verrekijkermicroscoop.
   2. Graver een kruispatroon over alle blootgestelde botoppervlakken buiten het aangewezen raamgebied met een #11 chirurgisch blad en maak ondiepe maar gedefinieerde groeven van 0,2–0,4 mm diep om een uniform raster van ongeveer 1 mm × 1 mm vierkanten te vormen.
      OPMERKING: Dit vergroot het effectieve oppervlak en daarmee de mechanische grip van de overliggende lijm en tandcement.
   3. Maak een fijne lijmapplicator door een steriele naald van 30 G op de punt van een wattenstaafje met een lange hals te steken en de naald in een V-vorm te buigen.
   4. Doe cyanoacrylaatlijm in een wegwerpplastic weegboot en doop de applicator in het lijmreservoir.
   5. Leg lijm af op elk blootgesteld en gegraveerd botoppervlak, waarbij je niet meer dan één afzetting per plek aanbrengt zodat de dekking grondig is maar nooit overdreven. Laat de lijm 7 minuten drogen.
7. Het implanteren van de referentiesocket
   1. Kies een boorplaats boven het linker cerebellum, zodat zichtbare oppervlakkige vaten worden vermeden.
   2. Bevestig de tandzaakboor op een boorhouder in de stereotactische arm.
   3. Boor het pilotgat in 5–10 seconden bursts met een ronde stalen boor bij 20.000–25.000 RPM, en trek de boor tussen bursts in om de locatie onder de verrekijker te inspecteren.
   4. Boor totdat het gat doorschijnender wordt, waardoor een lichtroze tint ontstaat en de dura zichtbaar wordt door het dunne bot.
   5. Stop onmiddellijk met boren om durale penetratie te voorkomen. Wijs het afgewerkte gat tot een diameter van ongeveer 0,5 mm, slechts marginaal groter dan de buitendiameter van de referentiedop.
   6. Plaats de vergulde referentiedop in het pilotgat, bevestig deze met cyanoacrylaatlijm en versterk de verbinding met UV-uithardbare tandcement. Hard het tandcement uit met een 405 nm lichtdiode (LED) uithardende penlamp gedurende 1 minuut.
8. Het implanteren van de hoofdplaat
   1. Breng een kleine hoeveelheid UV-uithardend tandcement aan op de top van het blootgestelde rostralbot (het punt het dichtst bij de neus) als nivelleringssteun.
   2. Leg de hoofdplaat op de schedel zodat één rand rust op de tandheelkundige cementsteiger die rond de referentiesok is uitgehard (stap 2.7.6), en met de tegenoverliggende rand op de verse rostrale cementdab.
   3. Lijn de hoofdplaat zo uit dat de lange as gecentreerd is op de sagittale middenlijn en de twee fixatiehandvatten loodrecht (90°) op de middellijnas uitsteken. Hard het composiet uit onder UV-licht om de hoofdplaat op zijn plaats te zetten.
   4. Versterk de structuur door opeenvolgende UV-uithardbare tandcementlagen van ongeveer 1 mm dikte aan te brengen rond de basis van de hoofdplaat, waarbij het gegraveerde bot en de referentiesocket worden omcirkeld, totdat er een doorlopende, afgesloten omhulsel rond de omtrek van het toekomstige schedelraam is gevormd.
   5. Hard elke increment afzonderlijk uit met een 405 nm LED-uithardingspen gedurende 40 seconden op een werkafstand van 1–2 cm, zodat volledige polymerisatie wordt gegarandeerd voordat de volgende laag wordt aangebracht. Zorg ervoor dat de afgewerkte betonnen wand gelijk loopt met het bovenste oppervlak van de hoofdplaat en de blootliggende botomtrek volledig omsluit zonder te overlappen met het gemarkeerde raam.
9. Laat de muis herstellen van de narcose. Breng de muis minstens 48 uur terug naar zijn thuiskooi.
10. Controleer voordat je doorgaat naar sectie 3 of het dier weer binnen 5% van zijn preoperatieve lichaamsgewicht is en geen tekenen van pijn vertoont op de muisgrimasschaal²⁰. Als aan een van deze criteria niet wordt voldaan, verleng dan de herstelperiode totdat ze zijn voldaan.
    OPMERKING: Dit gefaseerde ontwerp met een interchirurgisch herstelinterval is cruciaal. Het stelt het dier in staat te herstellen van de initiële fysiologische stress en ontsteking vóór de craniotomie, wat de operatieve succeskans en de langetermijngezondheid van het implantaat verbetert; Hier wordt minimaal 48 uur gebruikt, en een gefaseerd schedelimplantaat met een herstelinterval van meerdere dagen tussen fixatie van de hoofdplaat en craniotomie is aangetoond peri-operatieve ontstekingen te verminderen en de kwaliteit van de langdurige voorbereiding te verbeteren¹⁴.

3. Fase 2: Chronische schedelvenstercreatie

1. Preoperatieve voorbereiding
   1. Bereid het operatiegebied en de instrumenten voor zoals beschreven in sectie 1.
   2. Opnieuw narcouse de muis met isoflurane (inductie 4%, onderhoud 1,5–2,5%)
   3. Plaats de muis in het stereotactische kader zoals beschreven in stap 2.1.4.
   4. Dien de preoperatieve medicijnen toe in dezelfde doseringen als beschreven in stap 2.1, behalve het lidocaïne-epinefrine lokale anestheticum (de huid van de hoofdhuid is al verwijderd in fase A, dus het is niet langer toepasbaar).
2. Het boren van het raam
   1. Begin met het verdunnen van het bot met een tandboor langs de rechthoekige omtrek die in Fase 1 (stap 2.4) is aangegeven. Begin bij 25.000 RPM met het boorapparaat loodrecht (≈ 90 °) op het botoppervlak en voer één of twee iets diepere passes uit langs de rechthoekige randen om een eerste snijgroef te creëren.
      OPMERKING: De startsnelheid van de oefening kan worden aangepast aan het ervaringsniveau van de operator.
   2. Boor groeven (ongeveer 0,2–0,3 mm diep) in het bot en tandcement naast het schedelraam bij de twee probe-insertiecoördinaten die in stap 2.5 zijn aangegeven.
      OPMERKING: Deze groeven dienen als blijvende visuele herkenningspunten die zichtbaar blijven nadat de botflap is verwijderd en worden gebruikt om de intracraniële probes herhaalbaar te positioneren in latere elektrofysiologische sessies.
   3. Breng ijskoude, steriele kunstmatige hersenvocht (ACSF; bereid volgens het cefazoline-bevattende recept van Goldey et ^al.14) regelmatig toe tijdens het boren om thermische schade aan de onderliggende cortex te voorkomen en bloeding¹⁴ te minimaliseren.
   4. Verlaag de boorsnelheid geleidelijk tot 20.000 toeren naarmate het bot dunner wordt, en kantel het handstuk naar ≈ 45°, zodat de bediener de boor tegen de hand kan stabiliseren en overgaat in zachtere, meer gecontroleerde slagen.
3. Het verwijderen van de botflap (kritieke stap)
   1. Blijf boren langs de rechthoekige rand totdat het bot binnen de omtrek ongeveer 90% verdund is. Boor niet helemaal door de schedel.
   2. Controleer de resterende botdikte met twee aanvullende controles:
      1. Tik zachtjes met een bot instrument onder de verrekijkermicroscoop op de rand van de verdunde botplank. De omvang van de doorbuiging die door een lichte tik wordt veroorzaakt, geeft een directe indicatie van de resterende botdikte.
      2. Breng ijskoude ACSF aan op het geboorde venster en inspecteer onmiddellijk door de verrekijker: gedurende de eerste 20–30 seconden, voordat de ACSF het bot doordringt, versterkt de vloeistoflaag het visuele contrast scherp, waarbij de onderliggende corticale capillairen worden opgelost waar het bot dicht bij de dura is verdund, terwijl de resterende dikte relatief ondoorzichtig blijft onder de vloeistof. Zodra de flap uniform doorschijnend en aantoonbaar flexibel lijkt, ga je door naar stap 3.3.3.
   3. Schakel over op de fijn gebogen dura-haak, die eindigt in een 90° gebogen punt. Breng de punt met uiterste voorzichtigheid onder de rand van het dunne bot in onder een hoek van ongeveer 15° ten opzichte van het botoppervlak en schuif de haak langs de raamomtrek, waarbij je de botflap voorzichtig losmaakt van de omliggende schedel en het onderliggende weefsel.
   4. Werk geleidelijk van de ene hoek naar de andere langs de zijkanten aan beide zijden, en beweeg tenslotte vanuit de hoeken naar het midden van de rechthoek totdat de hele omtrek losstaat van de onderliggende dura.
   5. Oefen geen neerwaartse druk uit op de dura-haak tijdens het glijden en vermijd het aanraken van de hersenen.
      OPMERKING: Afwisselend diagonaal tegenovergestelde hoeken onder een ondiepe haakhoek verdeelt de mechanische spanning gelijkmatig rond de botflap. Deze strategie voorkomt durale scheuren en behoudt de langdurige gezondheid van het onderliggende hersenweefsel.
   6. Forceer geen beweging als de haak op een hoek focale weerstand ondervindt. Laat in plaats daarvan de flap zakken en keer terug naar stap 3.4 om het hechtende gebied verder te verdunnen.
      1. Als er een durale scheur optreedt, stop dan de procedure voor dat dier (herkenbaar aan een plotselinge focale uitstulping, een roze getinte vloeistoflek of felrode arteriële bloeding die niet afneemt na drie keer onder water te hebben gegooid met ijskoude ACSF, waarbij elke wasbeurt 30 seconden kan zitten).
         OPMERKING: Een succesvolle loskoppeling wordt aangeduid doordat de botflap over de volledige omtrek uniform mobiel wordt zonder zichtbare durale uitpuiling en slechts lichte capillaire bloedingen.
   7. Til de succesvol losgemaakte botflap voorzichtig op met de dura-haak in een achter-naar-voorste richting tot ongeveer 35° boven het schedeloppervlak.
   8. Pak de opgetilde rand vast met de tang en zwaai zachtjes naar links en rechts totdat de plaat volledig loslaat. Als de plaat op een hoek weerstand biedt, laat deze dan weer zakken en keer terug naar stap 3.3.4 om het hechtende gebied te verdunnen voordat je opnieuw probeert te verwijderen; Deze weerstand duidt op een lokaal onderverdundde botsectie.
   9. Maak het blootgestelde gebied voorzichtig schoon van gestold bloed met herhaalde washes van ijskoude ACSF.
   10. Controleer of de dura intact en transparant is voordat je verder gaat.
       OPMERKING: Langzaam, geleidelijk optillen vanaf de achterrand is essentieel om het risico op letsel aan de onderliggende superior sagittale en transversale veneuze sinussen en aan het corticale oppervlak te minimaliseren.
4. Het schedelraam afdichten
   1. Plaats een enkele steriel, voorgefabriceerd PDMS-membraan (voorbereid in sectie 1) direct op het durale oppervlak zodra het bloeden is afgenomen. Wanneer het de juiste grootte heeft, zal het het raam precies bedekken en passief aan de dura hechten, waardoor het vlak tegen de hersenen wordt gehouden.
   2. Absorbeer residuele ACSF vanaf de rand van het raam met een vezelvrije doek.
      OPMERKING: Het doekje mag nooit de blootgestelde dura raken, en een strikte aseptische techniek (steriele bediening, gereedschap en veld) moet gedurende de hele fase worden gehandhaafd, omdat het raam herhaaldelijk wordt geopend en elke verontreiniging die bij deze stap wordt aangebracht, de latere longitudinale opnames in gevaar brengt.
   3. Bereid de tweecomponentige siliconen-elastomeerkit voor volgens de instructies van de fabrikant en breng het gemengde elastomeer binnen 30 seconden na het doseren aan om elke kier tussen de tandcementbehuizing en de binnenrand van de hoofdplaat te vullen, waarbij de randen van het PDMS-membraan volledig worden omringd en overlappend.
   4. Laat het elastomeer ongeveer 2 minuten uitharden (of de door de fabrikant aangegeven tijd). Zorg ervoor dat de uitgeharde zegel continu en vloeibaar is, maar toch mechanisch verwijderbaar blijft aan het begin van elke opnamesessie.
   5. Bevestig een op maat gemaakte 3D-geprinte beschermkap op de hoofdplaat met een kleine hoeveelheid cyanoacrylaatlijm om het raam tussen opnamesessies te beschermen.
   6. Laat de muis herstellen van de narcose en breng de muis terug naar zijn thuiskooi voor individuele huisvesting om schade aan het implantaat te voorkomen.

4. Postoperatieve zorg en gewenning

1. Houd de gezondheid van de muis minimaal 2 dagen na de operatie nauwlettend in de gaten. Dien 2 dagen na de operatie extra pijnstillers toe als de muis tekenen van pijn vertoont op basis van de muisgrimasschaal²⁰.
2. Laat de muis minimaal 4 dagen na de operatie ongestoord herstellen. Daarna begin je met een 5-daagse wenningsperiode met geleidelijk toenemende duur: 5 minuten op dag 1, gevolgd door 15, 30, 45 en 60 minuten op respectievelijk dag 2, 3, 4 en 5, om de muis te wennen aan het hanteren en het hoofdfixatie-opnameplatform.
   OPMERKING: Postcraniotomie-oedeem en lokale ontsteking kunnen tot twee weken²¹ aanhouden. Waar de experimentele tijdlijn het toelaat, is een verlengde herstelperiode vóór de eerste opnamesessie daarom aan te raden. Controleer vóór de eerste opnamesessie of het hersenvenster onder de binoculaire microscoop vrij en vrij van ondoorzichtigheid of vezelig weefsel lijkt, en dat het gewicht en gedrag van het dier normaal zijn.

5. Procedure voor longitudinale elektrofysiologische opnames

1. Het dier op het opnameplatform plaatsen
   1. Plaats de muis op het opnameplatform en stuur de fixatieklemmen voor de muiskop. Zorg ervoor dat de hoogte vooraf is aangepast om de natuurlijke staande houding van het dier tijdens de kopfixatie te behouden.
      OPMERKING: Als de muis consequent weerstand biedt aan hoofdfixatie, forceer dan de procedure niet. Breng het dier terug naar zijn thuiskooi en verleng de habituatiefase (sectie 4) met één of twee extra sessies voordat je de fixatie opnieuw probeert.
   2. Draai de vergrendelingsschroeven van de klem aan.
   3. Laat het stompe microchirurgische ronde mes direct voor gebruik weken in 80% ethanol.
   4. Plaats het lemmet tussen de 3D-geprinte kap en het bovenste oppervlak van de kopplaat, waarbij het blad bijna parallel blijft aan het oppervlak van de hoofdplaat. Beweeg het lemmet nooit voorbij de binnenrand van de openingsopening van de hoofdplaat, om het risico op contact met de hersenen te voorkomen.
      OPMERKING: De kap is bewust gedrukt in transparante hars zodat de bladdiepte overal zichtbaar blijft.
   5. Beweeg rond de kap met zachte links-rechts wiebelbewegingen die de lijmlaag geleidelijk splijten.
   6. Gebruik een fijne dissectietang om de kap op te tillen en verwijder hem zodra hij volledig losgelaten is.
   7. Grijp de buitenrand van de siliconen elastomeerafdichting en til deze langzaam van de caudale kant naar de rostrale zijde op. De elastomeerafdichting en het onderliggende PDMS-membraan lossen samen los als één eenheid, waardoor een intacte dura zichtbaar wordt.
   8. Houd de hersenen vochtig door een paar druppels ACSF aan te brengen.
2. Het plaatsen van de opnameapparaten
   1. Monter de μECoG-array op een scharnierende arm met een magnetische basis; Pas de wrijvingsknop van de arm aan op basis van de ervaring van de operator, waarbij ervaren operators de voorkeur geven aan een wrijvingsarme instelling die de fijne motorische controle tijdens het positioneren behoudt.
   2. Leid de array zodat het elektrodevlak loodrecht (90°) op het corticale oppervlak landt langs de rechterrand van het schedelvenster; Als het goed is gepositioneerd, draai dan de wrijvingsknop aan om de arm te verstevigen.
   3. Gebruik een puntig siliconen tiptool om de platte lintkabel van de array voorzichtig naar beneden te tikken op het bovenste oppervlak van de hoofdplaat, zodat de kabel in overeenstemming met de kopplaat klikt en de array zelf plat tegen de dura neerzet, waar resterende ACSF passieve hechting biedt. Omdat het craniale venster zo is gedimensioneerd dat het twee-subraster array in één richting kan worden gepast, is grove uitlijning gemakkelijk detecteerbaar.
   4. Maak de laatste fijne aanpassingen met het siliconen gereedschap, waarbij je de array lateraal duwt totdat de sagittale middenlijn duidelijk gecentreerd is binnen de semi-transparante array.
      OPMERKING: Het doorschijnende μECoG-rooster onthult de sagittale sinus als een ondubbelzinnige anatomische uitlijningsaanwijzing die zichtbaar blijft door de array, waardoor dezelfde laterale offset kan worden gereproduceerd tijdens longitudinale sessies. De array is zo gepositioneerd dat het de voorste cingulate cortex (ACC) bilateraal in zijn rostrale helft en de retrospleniale cortex (RSP) aan beide zijden in de caudale helft bestrijkt, waarbij de DMN-knooppunten die in deze studie worden beoogd, overspannen. Een open-source analysepakket (ephy_spatial_fidelity-toolkit, beschikbaar op https://github.com/RazBalin/ephy_spatial_fidelity-toolkit) kwantificeert sessie-tot-sessie rasterplaatsing drift van conservatieve opnames.
   5. Verbind de μECoG-referentiedraad met de verguldde referentiesocket die in stap 2.7 is geïmplanteerd.
      OPMERKING: Als optionele kwaliteitscontrole vóór de sessie, maak een korte opname waarbij de sondes en array worden ondergedompeld in een 50 mL conische buis ACSF om te bevestigen dat de Faraday-kooi effectief elektromagnetische interferentie in de omgeving dempt voordat je doorgaat met de in vivo opname.
   6. Plaats de caudale high-density intracraniële elektrodeprobe op een micromanipulatorarm die loodrecht (≈ 90°) op het hersenoppervlak is gepositioneerd en de rostrale high-density intracraniële elektrodeprobe op een tweede arm die 50° gekanteld is.
   7. Onder de verrekijkermicroscoop verplaats u elke sonde tot ongeveer 1 mm boven de dura en lijnt u de Y-as van elke sonde uit met de bijbehorende gegraveerde geleidegroef die in stap 3.2.4 is gefreesd.
   8. Registreer via een schriftelijke notitie of via een foto via de verrekijker, waarbij het μECoG-elektroderooster direct naast het geplande toegangspunt van elke sonde ligt.
      OPMERKING: Wanneer de operatie correct wordt uitgevoerd en er geen corticaal oedeem aanwezig is, is de afstand tussen de botrand en de μECoG-array minimaal, waardoor de selectie van het ingangspunt ondubbelzinnig wordt. Voor maximale ruimtelijke precisie over longitudinale sessies maak je een foto van de blootgestelde cortex met de array op zijn plaats en identificeer je een onderscheidend piaal vat binnen het smalle gebied tussen de botrand en de μECoG-array. Deze afbeelding, geannoteerd met het referentievat en zijn relatieve positie ten opzichte van de μECoG-pads, dient als een sessie-tot-sessie referentiekaart om hetzelfde instappunt op volgende opnamedagen weer te geven.
   9. Trek elke sonde ongeveer 15 mm omhoog zodra de correspondentie tussen sonde en pad is geregistreerd, om de fragiele elektrodeschacht tijdens de durale punctie te beschermen.
   10. Fabriceer het duraalpunctuurgereedschap door een steriele 30 G injectienaald aan de punt van een watten-tip applicator te bevestigen en de naaldpunt 90° te buigen met niet-getande fijne tangen.
   11. Leid het prikgereedschap langzaam over de kopplaat. Door de verrekijker te kijken, tel μECoG-elektrodepads om het gereedschap uit te lijnen met de geregistreerde invoercoördinaat. Laat de gebogen punt zakken naar het durale oppervlak zodat de snijpunt de dura onder 90° nadert terwijl de steel van het gereedschap parallel wordt gehouden aan de lange as van de rug van de muis.
   12. Schuif de punt ongeveer 1 mm onder het duralvlak en trek het in. Een lichte tijdelijke doorbloeding bij de punctie wordt verwacht; Droog het weg met de gedraaide hoek van een niet-vezelige doek.
   13. Laat elke high-density intracraniële elektrodeprobe direct na de punctie onder continue binoculaire observatie zakken naar het durale oppervlak onder continue binoculaire observatie. Als de perforatie precies is geplaatst, glijdt de probe soepel door de perforatie, zonder schachtbuiging.
   14. Laat elke sonde geleidelijk zakken tot de doeldiepte van 5 mm onder de dura met een gecontroleerde snelheid van ongeveer 0,1 mm/s of langzamer²².
   15. Laat de probes mechanisch 10 minuten tot rust komen voordat je begint met het verzamelen van gegevens.
       OPMERKING: De kleine durale perforatie die door de 30 G-naald wordt veroorzaakt, sluit binnen enkele minuten zelf; daarom moet de insteek van de probe direct na de punctie volgen.
3. Data-acquisitie
   1. Begin met gegevensverzameling.
      OPMERKING: De μECoG-signalen worden versterkt door vier 128-kanaals digitale headstages die via SPI-interfacekabels zijn verbonden met een open-source acquisitiebord, terwijl de twee high-density intracraniële elektrodeprobes worden verkregen via een speciale high-density probe acquisitiemodule in een modulaire instrumentatiebehuizing, samen met multifunctionele in-/uitgang- en data-acquisitiemodules voor synchronisatie en digitale signalering. Een gemeenschappelijke TTL-masterklok wordt gegenereerd door het open-source μECoG-acquisitiebord en als een hardware-synchronisatielijn naar het probe-acquisitiechassis verspreid (via zijn multifunctionele I/O-module), zodat de twee acquisitiestromen een sample-uitgelijnde tijdbasis delen. Alle datastromen worden synchroon geregistreerd via de grafische gebruikersinterface van het acquisitiesysteem; volledige hardwaremodellen en catalogusnummers staan vermeld in de Materiaaltabel.
   2. Aan het einde van de opnamesessie doseer 0,5 mL ACSF op de μECoG-roosters, trek vervolgens elke high-density intracraniële elektrodeprobe terug met dezelfde snelheid als voor het inbrengen (≈6 mm/min) en verwijder de μECoG-array voorzichtig.
   3. Maak de sondes en array schoon door 45 minuten te weken in een vers bereide 1% (w/v) enzymatische wasmiddeloplossing.
   4. Na het enzymatische detergent weken spoel je de elektroden met drie opeenvolgende dompelingen in omgekeerd-osmose-gezuiverd water, waarbij je voor elke spoelbeurt een nieuwe buis gebruikt.
   5. Vervang het PDMS-membraan door een verse steriele laag zoals in stap 3.4.1.
   6. Breng de elastomeerkit opnieuw aan (stap 3.4.3–3.4.4) en bevestig een nieuwe 3D-geprinte beschermkap (stap 3.4.5).
   7. Laat de opnieuw afgesloten constructie 5 minuten aan de lucht drogen voordat de muis terug in de thuiskooi wordt gezet. De procedure kan herhaald worden gedurende meerdere opnamesessies over meerdere weken.

Resultaten

Een geslaagde operatie resulteert in een helder, transparant venster over de cortex, met zichtbare bloedvaaten en minimale tekenen van ontsteking of infectie. Deze helderheid kan meer dan 21 dagen worden gehandhaafd (Figuur 1), waardoor langdurige longitudinale studies mogelijk zijn. De robuustheid van het implantaat blijkt uit het vermogen om stabiel te blijven, zelfs gedurende een 21-daags chronisch corticosterontoedieningsparadigma, een veelgebruikt model...

Discussie

Dit rapport beschrijft een tweefasen, dura-besparend chirurgisch protocol dat een betrouwbare en zeer effectieve methode biedt om een groot, chronisch en herdichtbaar schedelvenster bij muizen te creëren. De betekenis van deze techniek reikt verder dan de grootte van het raam. Het belangrijkste voordeel is de mogelijkheid tot gelijktijdige, multischaal onderzoeken van grootschalige hersennetwerken over longitudinale tijdschalen. Door oppervlakte-μECoG-roosters (die mesoschaal LFP-data le...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
µECoG array — 512-kanaals custom (2 × 256 ch)	NeuroNexus	E256-200-30-80	Verpakking: IH256. Twee 16×16 sub-grids (elk 3,3 mm × 3,5 mm); 200 μm pitch; 80 μm elektrode diameter. DMN-opnamen op oppervlakteniveau.
3-assige linkerhand micromanipulatorarm	World Precision Instruments (WPI)	504926	10 μm resolutie; digitaal display; gebruikt voor headplate/probe positionering tijdens chirurgie
3D-geprinte beschermende dop	In-house (Anycubic Photon Mono 4K)	N/A	Aangepast ontwerp; gedrukt in Anycubic High Clear UV-hars; STL-bestand beschikbaar op https://github.com/RazBalin/ProtectiveDMN_Cap
Aceton (laboratoriumkwaliteit)	Sigma-Aldrich	179973	Ontvetten van schedeloppervlak en verwijdering van periosteum vóór het aanbrengen van lijm
Adson Dura Hook 5 mm (Fijne dura-haak)	gSource	gS 25.2570	Gebruikt om botplaat los te maken van dura langs de omtrek; gemaakt van fijne wolfraamdraad of iets dergelijks
Anycubic High Clear UV-hars	Anycubic	STMGCL-102B	Fotopolymeerhars gebruikt met Anycubic Photon Mono 4K-printer voor 3D-gedrukte beschermende doppen
Anycubic Photon Mono 4K 3D-harsprinter	Anycubic	PHOTON-MONO-4K	Gebruikt om beschermende raamdoppen af te drukken van Anycubic High Clear Resin
Anycubic UV-hars was- en uithardingsapparaat 2.0	Anycubic	285-550	Post-print wassen en UV-uitharding van 3D-gedrukte doppen
Articulerende arm met magnetische basis (×2)	Haas Tooling	09-0535	Gebruikt om µECoG sub-grids op de corticale oppervlakte tijdens opnamen vast te houden
Kunstmatige CSF (aCSF)	In-house bereiding	N/A (In-house)	aCSF-recept: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 1,25 mM KH2PO4, 10 mM D-Glucose; direct na bereiding met 95% O2 / 5% CO2 oxideren. Catalogusnummers afzonderlijk vermeld.
Bots microchirurgisch mes (Cirkelmes)	Iogen	374769	Gebruikt voor schedeloppervlak schrapen en dop verwijdering
Buprenorfine (Temgesic)	Indivior	BE-112515	Opioïde pijnstiller; 0,05 mg/kg s.c. pre-operatief
C57BL/6JRj muizen	Janvier Labs		Mannelijk of vrouwelijk; minimaal 10 weken oud, >20 g lichaamsgewicht op tijdstip van chirurgie
Calciumchloride dihydraat (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C-7902	2 mM; MW 147,02; 0,29 g/L. Bereid als Ca ×100-stock. Onderdeel van in-house aCSF.
Carprofen (Rimadyl)	Zoetis Animal Health	RXRIM-INJ	NSAID-analgeticum; 5 mg/kg s.c. pre-operatief
Corticosteron	Sigma-Aldrich	C2505	Opgelost in drinkwater voor 21-daags chronisch stress/depressiemodel
Wattenstaafje	Fisherbrand	22-363-157	Dient als handgreep voor 30 G dura-punctieapparaat en voor ontvetten van schedeloppervlak met aceton
Cyanoacrylaatlijm — Loctite 401	Henkel Adhesives	Loctite 401	Dunne viscositeit cyanoacrylaat; gebruikt voor priming van schedeloppervlak, headplate en dopbevestiging
Tandartsboor — Foredom K.1070	Foredom	K.1070	Roterende boor met flexibele as; gebruikt voor craniotomie-verdunning en pilotgat boren
Dexamethason	Dopharma	1DEX004	Corticosteroïde ontstekingsremmer; 2 mg/kg s.c. pre-operatief
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G-7021	10 mM; MW 180,20; 1,80 g/L. Bereid als Glucose ×100-stock. Onderdeel van in-house aCSF.
Boorkop Staal Boor rond 1/007W	Hager & Meisinger	18089	Gebruikt voor de referentieplaats en de schedelvenster
Ethanol 80% (v/v) - A12t Dilutus	Berner	13221132	Pre-operatief weken van chirurgische instrumenten en chirurgische laminaire kap voor sterilisatie
Gasafvoerapparaat	RWD Life Science	R546W	Verzamelt afval-anesthesiegassen uit chirurgisch gebied
Goudovertrokken referentie-aansluiting	DigiKey	310-13-102-41-001000	Geïmplanteerd boven linker cerebellum; dient als ECoG-aarde/referentie
GRANT Ultrasoon Reinigingsapparaat — Model 17002A	GRANT Instruments	17002A	EAN: 4064343191654. Heetwater ultrasoon bad; gebruikt met TICKOPUR TR 3 voor instrumentreiniging
Verwarmingspad — Supertech TMP-5B	Supertech	TMP-5B	Houdt lichaamstemperatuur op 37 °C gedurende anesthesie
Isofluraan	Piramal Healthcare	66794-017-25	Inhalatieanestheticum; inductie 4%, onderhoud 1,5–2,5%
Kimtech Science, Precision Wipes (Niet-fibrous weefsel)	KIMBERLY