Ruimtelijke transcriptomiek van vroege tandmorfogenese in formaline-gefixeerd paraffine-ingebed muizenembryonaal weefsel

Summary

Het huidige protocol beschrijft het gebruik van formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde secties uit de craniofaciale regio's van E13.5 en E15.5 van muisembryo's om de differentiële genexpressieprofielen te analyseren met behulp van ruimtelijke transcriptomics.

Abstract

De zich ontwikkelende tand bestaat uit diverse en sterk gespecialiseerde celpopulaties die samenwerken om de juiste vorm en functie te behouden. Het ophelderen van de interacties tussen deze cellen en hun omringende micro-omgeving is cruciaal om de regulerende mechanismen achter normale tandontwikkeling te begrijpen. Verstoringen in deze processen kunnen leiden tot aangeboren aandoeningen zoals tandagenese, dentinogenesis imperfecta en amelogenesis imperfecta. Ondanks de aanzienlijke vooruitgang die single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) mogelijk maakt in het onthullen van cellulaire heterogeniteit, behoudt het de ruimtelijke context van cellen binnen weefsels niet, waardoor het vermogen om genexpressie te koppelen aan weefselarchitectuur beperkt wordt. Ruimtelijke transcriptomische technologieën pakken deze beperking aan door hoogresolutie genexpressieprofilering te integreren met het behoud van de native weefselarchitectuur, waardoor de in situ lokalisatie van moleculaire signaturen mogelijk wordt. Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol voor het verzamelen, fixeren en paraffine-inbedding van embryonaal craniofaalt muisweefsel dat geschikt is voor downstream ruimtelijke transcriptomische toepassingen. De workflow beschrijft geoptimaliseerde sectie en behandeling van formaline-gefixeerd, paraffine-ingebed weefsel om RNA-integriteit en weefselmorfologie te behouden voor ruimtelijke analyse met hoge resolutie. Deze methode is compatibel met sequencing- en beeldgebaseerde ruimtelijke transcriptomica-platforms, waardoor reproduceerbare ruimtelijke transcriptomische profilering van vroege tandmorfogenese in muisembryo's mogelijk is. Deze benadering biedt krachtige inzichten in de ruimtelijke organisatie en functionele dynamiek van craniofaciale structuren in zowel ontwikkelings- als pathologische toestanden, en biedt een cruciaal kader voor het koppelen van moleculaire mechanismen aan weefselmorfologie.

Introduction

Tandontwikkeling is afhankelijk van een sterk gecoördineerde sequentie van morfogenetische processen tijdens vroege embryonale groei 1,2,3,4. Hoewel talrijke belangrijke genen en signaalroutes zijn geïdentificeerd door genetische en ontwikkelingsstudies, blijft ons begrip van hoe deze factoren samenwerken om individuele craniofaciale structuren te vormen beperkt. Opmerkelijk is dat, zelfs met aanzienlijke vooruitgang in het koppelen van specifieke genetische varianten aan zowel syndromische als niet-syndromi....

Protocol

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development Animal Care and Use Committee (ACUC), onder Animal Study Protocol #21-031.

1. Bereiding van proefdieren en verzameling van weefsel

1. Koppel gezonde, vruchtbare mannelijke en vrouwelijke Mus musculus voor getimede paringen. Identificeer zwangere vrouwelijke muizen aan de hand van een vaginale plug, aangeduid als embryonale dag (E) 0,5.
2. Euthanasen zwangere vrouwelijke muizen via CO₂-inademing gevolgd door een cervicale ontwrichting. ....

Results

Deze methode beschrijft de verwerking van vers gedissecte embryonale muiskoppen om FFPE-monsters van craniofaciaal weefsel, inclusief de zich ontwikkelende tand, te genereren die gemakkelijk met microtoom kunnen worden gesneden terwijl de RNA-integriteit behouden blijft (Figuur 1). Dit protocol werd met succes toegepast op E13.5 (embryonale dag 13.5), E15.5 en E16.5 muisembryohoofden voor hoge-resolutie beeldgebaseerde (Figuur 2.......

Discussion

In dit werk presenteren we een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van FFPE-blokken van embryonale muiskoppen die geoptimaliseerd zijn voor gebruik met hoogresolutie ruimtelijke RNA-beeldvormingsplatforms, waaronder sequencing- en imaging-gebaseerde ruimtelijke transcriptomiek. Een belangrijk doel van dit protocol is het behouden van zowel de weefselmorfologie als de integriteit van nucleïnezuur over hele hoofdsecties, met bijzondere aandacht voor het zich ontwikkelende craniofa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Thermo Fischer	10010023	Use  to perform washes during the workflow
50 mL conical tubes (Ambion) RNAse free	Thermo Fischer	AM12502	Use to store samples in different solutions
Advanced orbital shaker	VWR	6683-470	Use to shake tissues in fixation solution during incubation
Alcohol, 70%, Fisherbrand, HistoPrep	Fisher Scientific	HC-1000-1GL	Use to clean and disinfect all the work space
Automated vacuum tissue processor	Leica Biosystems	ASP300S	Use to clear, dehydration, rehydration and wax infiltration of samples
Cover Glass Thickness 1.5, 25 mm x 25 mm	Corning	2850-25	Use for mounting of slide in Visium HD workflow
Dako Bluing Buffer, Ready-to-use	Agilant Technologies	CS70230-2	Use for H&E staining
Eosin-Y with phloxine	Fisher Scientific	22050198	Use for H&E staining
Hematoxylin, Mayer's, Ready-to-use aqueous solution	Agilant Technologies	S330930-2	Use for H&E staining
HistoCore Water Bath	Leica Biosystems	HIS2326	Use to float the sections at 40-43 °C to remove wrinkles from FFPE sections
Loupe browser  9.0.0	10X Genomics, Inc.		Use to analyze Visium HD data
Low-Profile Disposable Blades DB80LX	Leica Biosystems	14035843496	Use to section FFPE blocks
Neutral Buffered Formalin 10%	Azer Scientific	NBF-4-G	Use to fix the tissues
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Thermo Fischer	AM9782	Use to clean and remove RNase
Semi-Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	RM2245	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Slide Warmer with Cover	Premiere	XH2004	Use for incubation of slides at different temperatures
Superfrost Plus Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Use to attach sections for Vsium HD
Surgical blade No. 11	Integra Miltex	4-311	Use for scoring of FFPE tissues
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Use to carry out tissue infiltration and embedding of tissues
TISsue culture DISH 100X20MM 500/CS	Fisher Scientific	877222	Use for collecting and dissecting samples in 1x PBS
UltraPure Glycerol	Thermo Fischer	15514011	Use for Visium HD slide mounting of coverglass before CytAssist
Visium CytAssist	10X Genomics, Inc.	PN-1000442	Use for Visium HD workflow experiments
Visium HD Spatial RNA-sequencing	10X Genomics, Inc.	1000676	Use to perform spatial transcriptomic experiments
Xenium 5K In Situ RNA Localization	10X Genomics, Inc.	PN-1000724	Use to perform spatial transcriptomic experiments
Xenium Analyzer	10X Genomics, Inc.	PN-1000481	Use perform Xenium and Xenium 5K RNA imaging
Xenium Explorer 4	10X Genomics, Inc.		Use to analyze Xenium data
Xenium In Situ RNA Localization	10X Genomics, Inc.	1000672	Use to perform spatial transcriptomic experiments