Ruimtelijke transcriptomiek van vroege tandmorfogenese in formaline-gefixeerd paraffine-ingebed muizenembryonaal weefsel

Summary

Het huidige protocol beschrijft het gebruik van formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde secties uit de craniofaciale regio's van E13.5 en E15.5 van muisembryo's om de differentiële genexpressieprofielen te analyseren met behulp van ruimtelijke transcriptomics.

Abstract

De zich ontwikkelende tand bestaat uit diverse en sterk gespecialiseerde celpopulaties die samenwerken om de juiste vorm en functie te behouden. Het ophelderen van de interacties tussen deze cellen en hun omringende micro-omgeving is cruciaal om de regulerende mechanismen achter normale tandontwikkeling te begrijpen. Verstoringen in deze processen kunnen leiden tot aangeboren aandoeningen zoals tandagenese, dentinogenesis imperfecta en amelogenesis imperfecta. Ondanks de aanzienlijke vooruitgang die single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) mogelijk maakt in het onthullen van cellulaire heterogeniteit, behoudt het de ruimtelijke context van cellen binnen weefsels niet, waardoor het vermogen om genexpressie te koppelen aan weefselarchitectuur beperkt wordt. Ruimtelijke transcriptomische technologieën pakken deze beperking aan door hoogresolutie genexpressieprofilering te integreren met het behoud van de native weefselarchitectuur, waardoor de in situ lokalisatie van moleculaire signaturen mogelijk wordt. Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol voor het verzamelen, fixeren en paraffine-inbedding van embryonaal craniofaalt muisweefsel dat geschikt is voor downstream ruimtelijke transcriptomische toepassingen. De workflow beschrijft geoptimaliseerde sectie en behandeling van formaline-gefixeerd, paraffine-ingebed weefsel om RNA-integriteit en weefselmorfologie te behouden voor ruimtelijke analyse met hoge resolutie. Deze methode is compatibel met sequencing- en beeldgebaseerde ruimtelijke transcriptomica-platforms, waardoor reproduceerbare ruimtelijke transcriptomische profilering van vroege tandmorfogenese in muisembryo's mogelijk is. Deze benadering biedt krachtige inzichten in de ruimtelijke organisatie en functionele dynamiek van craniofaciale structuren in zowel ontwikkelings- als pathologische toestanden, en biedt een cruciaal kader voor het koppelen van moleculaire mechanismen aan weefselmorfologie.

Introduction

Tandontwikkeling is afhankelijk van een sterk gecoördineerde sequentie van morfogenetische processen tijdens vroege embryonale groei 1,2,3,4. Hoewel talrijke belangrijke genen en signaalroutes zijn geïdentificeerd door genetische en ontwikkelingsstudies, blijft ons begrip van hoe deze factoren samenwerken om individuele craniofaciale structuren te vormen beperkt. Opmerkelijk is dat, zelfs met aanzienlijke vooruitgang in het koppelen van specifieke genetische varianten aan zowel syndromische als niet-syndromische tandaandoeningen, de gedetailleerde moleculaire mechanismen achter structuurspecifieke morfogenese nog niet volledig zijn gedefinieerd 1,2,3,4. Deze kenniskloof blijft de vooruitgang van gerichte therapeutische strategieën voor tandagenese of andere tandaberraties beperken.

Single-cell mRNA-sequencing (scRNA-seq) heeft de ontdekking mogelijk gemaakt van voorheen onbekende celtypen in zowel gezonde als zieke weefsels, evenals de identificatie van meerdere celsubtypes op basis van verschillende genexpressieprofielen. Omdat scRNA-seq echter dissociatie van weefsels in afzonderlijke cellen vereist, gaat informatie over de oorspronkelijke ruimtelijke positie van elke cel binnen het weefsel verloren. Daardoor leggen deze datasets niet vast hoe cellen zijn gerangschikt ten opzichte van de weefselarchitectuur ^5,6,7. Daarnaast zijn voorspelde cel-tot-cel interacties afhankelijk van de aanwezigheid van complementaire transcriptie-interacties, maar houden ze geen rekening met daadwerkelijke ruimtelijke informatie, wat belangrijk is om te bepalen of dergelijke interacties in vivo^{plaatsvinden 5,6,7}.

Ruimtelijke transcriptomiektechnologie maakt hoogdoorvoerprofilering van genexpressie mogelijk, terwijl ruimtelijke informatie binnen weefselsecties^{behouden blijft.} Ruimtelijke transcriptomiektechnologieën zijn ofwel beeldvormingsgebaseerd 10,11,12 of sequencing-gebaseerd ^12,13. Beeldvormingsgedreven ruimtelijke transcriptomics-benaderingen maken gebruik van FISH om gerichte genexpressie te detecteren en te meten met cellulaire of subcellulaire ruimtelijke precisie. Daarentegen leggen sequencing-gebaseerde technologieën transcriptom-brede genexpressie vast met een lagere ruimtelijke resolutie. Sequencing-gebaseerde ruimtelijke transcriptomics maken gebruik van een strategie om een resolutie van bijna één cel te bereiken met volledige transcriptomdekking (~20.000 genen), wat onbevooroordeelde exploratieve analyses ondersteunt, terwijl beeldgebaseerde ruimtelijke transcriptomics zich richten op genpanelen (tot ~5.000 genen), waardoor precieze, hypothese-gebaseerde analyse van specifieke routes en cellulaire interacties mogelijk is¹⁴.

Technologische vooruitgang in ruimtelijke transcriptomics maakt nu de analyse van genexpressie binnen de bewaarde weefselarchitectuur mogelijk. Formaline-gefixeerde paraffine-embedded (FFPE) en cryosectie-gebaseerde workflows bieden complementaire benaderingen voor ruimtelijke transcriptomics 15,16,17. FFPE biedt superieure behoud van weefselarchitectuur, waardoor nauwkeurige ruimtelijke mapping van genexpressie in structureel complexe weefsels zoals zich ontwikkelende tanden en palatale shelves mogelijk maakt. In onze studie en andere hebben FFPE-fixatie en archivering zeer nauwkeurige en reproduceerbare ruimtelijke transcriptomische^gegevens opgeleverd. Cryosectieworkflows behouden RNA-integriteit, maar zijn gevoeliger voor weefselvervorming¹⁸. Daarom werd FFPE geselecteerd voor deze studie. Hoewel het succes van scRNA-seq grotendeels afhangt van het behouden van hoge RNA-integriteit, vereist ruimtelijke transcriptomics ook hoogwaardige weefselmorfologie om genexpressiesignalen nauwkeurig te lokaliseren naar specifieke histologische kenmerken.

Dit protocol is het meest geschikt voor FFPE-muisembryonale craniofaciale weefsels die zich uitstreken over vroege ontwikkelingsstadia, waarbij het behoud van fijne weefselarchitectuur cruciaal is voor ruimtelijke transcriptomische analyse. De workflow zal waarschijnlijk suboptimaal presteren bij overgefixeerde monsters, slecht georiënteerde paraffineblokken of weefsels met verminderde RNA-integriteit, wat kan leiden tot verminderde signaalkwaliteit en verlies van ruimtelijke resolutie. Succesvolle toepassing van deze methode wordt aangetoond door intacte weefselmorfologie, minimale doorsnedevervorming en robuuste, ruimtelijk opgeloste transcriptomische signalen die aansluiten bij histologische kenmerken.

Protocol

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development Animal Care and Use Committee (ACUC), onder Animal Study Protocol #21-031.

1. Bereiding van proefdieren en verzameling van weefsel

1. Koppel gezonde, vruchtbare mannelijke en vrouwelijke Mus musculus voor getimede paringen. Identificeer zwangere vrouwelijke muizen aan de hand van een vaginale plug, aangeduid als embryonale dag (E) 0,5.
2. Euthanasen zwangere vrouwelijke muizen via CO₂-inademing gevolgd door een cervicale ontwrichting. Plaats de rugligging van het dier op een steriel, absorberend chirurgisch oppervlak en desinfecteer het buikgebied met 70% ethanol langs de bedoelde incisieplaats.
3. Maak een incisie in de buik in het midden met een steriele chirurgische schaar en open voorzichtig de peritoneale wand met een microchirurgische schaar om de baarmoederhoorns bloot te leggen. Voorzichtig de baarmoederketen naar buiten brengen met een stompe pincett. Isoleer embryo's door het baarmoederweefsel langs het myometrium los te laten en het afsnijden van de eileider en de bevestiging van de mediane baarmoederhoorn.
4. Breng direct hele embryo's over in ijskoude, steriele 1x PBS in een petrischaal van 10 cm.
5. Scheid voorzichtig elk embryo van de omliggende baarmoeder-, amnion- en chorionmembranen en plaats het in een verse schaal van 10 cm met ijskoude, steriele 1x PBS.
6. Ontleed embryonale koppen in de gewenste ontwikkelingsstadia met een steriel chirurgisch mesje en spoel ze één keer af in ijskoude, 1x PBS voordat je verder verwerkt wordt.

2. Fixatie en verwerking van het weefsel

1. Ontleed embryonale muizenkoppen in de gewenste ontwikkelingsstadia en fixeer in 10% neutrale gebufferde formaline 's nachts bij kamertemperatuur op een shaker.
2. Na fixatie verwijder je de formaline en spoel je de monsters af met 1x PBS voordat ze worden overgebracht naar 70% ethanol voor opslag. Voer weefseldehydratie, -verwijdering en paraffine-infiltratie uit met behulp van een geautomatiseerde weefselverwerker.
3. Inbed embryohoofden in paraffine met oriëntatie in het coronale of sagittale vlak.
4. Na het stollen van de was verwijder je de paraffineblokken uit de mallen, plaats je ze in gelabelde luchtdichte containers of ziplockzakken en bewaar je ze bij 4 °C tot het in secties wordt gesneden.
   OPMERKING: FFPE-blokken kunnen meerdere jaren worden bewaard voordat ze worden doorgesneden, zonder de weefselintegriteit in gevaar te brengen.

3. Verwerking van FFPE-weefsel voor ruimtelijke transcriptomiek

1. Desinfecteer werkoppervlakken en instrumenten met 70% ethanol, gevolgd door behandeling met een RNase-decontaminaterende oplossing om RNA-afbraak te minimaliseren.
2. Bereid een waterbad met gedeïoniseerd water voor en houd het op 40 °C, waarbij de temperatuur wordt aangepast tussen 40 °C en 43 °C indien nodig op basis van embryonale stadium of weefselkenmerken.
3. Stel het microtoom in, plaats een nieuw mesje nadat je het voorzichtig hebt afgeveegd met een RNase-decontaminatie-oplossing, zet het mes vast en stel de vrijingshoek in op 10°.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat het nieuwe mes wordt gebruikt voor het snijden om precieze weefselsneden te bereiken. Het veranderen van de hoek van het microtoom mes kan de doorsnedekwaliteit aanzienlijk beïnvloeden, wat de weefselintegriteit, de uniformiteit van de dikte en het behoud van morfologische kenmerken beïnvloedt.
4. Verwijder overtollig paraffine rond het ingebedde weefsel en monteer het FFPE-blok op de koude fase van het microtoom.
5. Bereid schone pincetten en borstels voor en behandel deze met een RNase-ontsmettingsoplossing voordat u ze gebruikt.
6. Lijn het paraffineblokvlak uit met het microtoomblad en maak knipsneden van ongeveer 12 μm totdat het interessegebied wordt benaderd (bijvoorbeeld totdat het mesiale deel van de molaren zichtbaar wordt in coronale secties). Pas de positie van blok en lemmet indien nodig aan om symmetrische, goed georiënteerde coronale secties van de hele kop te waarborgen.
7. Als RNA-isolatie van weefselsecties moet worden uitgevoerd, verzamel dan direct 10 μm-secties in 1 mL microcentrifugebuizen en verwerk deze volgens de aanbevelingen van de fabrikant^19,20 voor DV200-kwaliteitsbeoordeling.
8. Snijd seriële secties van 5 μm dikte en monitor continu de nabijheid van het interessegebied door testsecties op een gewone glaasje onder een microscoop te onderzoeken.
9. Zodra je dicht bij het interessegebied bent, snijd je het weefselgebied zorgvuldig met een No. 11 scalpelblad zonder volledig door te snijden, in twee strategisch gespreide gebieden om krullen of hechting van secties te voorkomen. Verwijder na het delen van de vastzittende paraffine met de borstelharen van een fijne borstel.
10. Laat weefselsecties op het waterbad drijven bij 41 °C voor zachte ontspanning en afvlakking voordat je ze op een glijbaan opneemt.

4. Sequencing-gebaseerde ruimtelijke transcriptomiek

1. Verzamel weefselsecties op de aanbevolen glazen glaasjes, waarbij alle interessegebieden binnen een gebied van 6,5 × 6,5 mm worden beperkt. Wanneer meerdere aangrenzende secties op dezelfde glijbaan worden geplaatst, verwarm je de glijbanen kort op een glijverwarmer tot 40 °C om hechting te bevorderen en losraken van eerder geplaatste secties te voorkomen. Nadat alle secties zijn geplaatst, incubeer je de glaasjes in een overdekte glaasverwarmer op 60 °C gedurende 2 uur om de weefselhechting te verbeteren.
   OPMERKING: Secties die verder reikten dan het gebied van 6,5 × 6,5 mm werden niet verwerkt.
2. Na de incubatie voer je hematoxyline en eosine (H&E) kleuring uit met een standaard H&E-kleuringsprotocol, waarbij gedeïoniseerd water wordt vervangen door kraanwater om de RNA-integriteit te behouden.
3. Bevestig coverslips met 80% glycerol en neem hoogresolutie H&E-beelden, waardoor een referentiebeeld van hogere kwaliteit wordt geboden ter vervanging van het typische H&E-beeld dat wordt gegenereerd door het diabeeld- en weefseltransfersysteem.
4. Na de beeldvorming verwijder je de dekfolies door de glaasjes afzonderlijk onder te dompelen in 50 mL buizen met gedeïoniseerd water, en bereid je de glaasjes voor voor indiening bij de kernfaciliteit voor verdere verwerking.

5. Beeldgebaseerde ruimtelijke transcriptomiek

OPMERKING: De dia's werden geleverd door de fabrikant²⁰, elk met een aangewezen beeldbaar gebied (omlijnde lijnen) van 12 mm × 24 mm, met een beschikbare monsterplaatsingsgebied van ongeveer 235 mm² (10,45 mm × 22,45 mm).

1. Plaats de weefselsecties volledig binnen dit afgebakende gebied, zodat de secties, inclusief residuele paraffine, niet overlappen. Bij het plaatsen van meerdere aangrenzende secties verwarm je de slides kort op een slidewarmer tot 40 °C om de hechting te bevorderen en losraken van eerder gemonteerde secties te voorkomen.
2. Nadat alle weefselsecties zijn geplaatst, plaats je de glaasjes in een overdekte glaaswarmer en laat ze ze een nacht uitbroeden op 40 °C om een goede hechting te garanderen.
3. Na incubatie volgt u het^19-protocol van de fabrikant om de dia's te verwerken en laadt u ze in de machine voor RNA-sequencing, waarbij het protocol wordt vergeleken met de meest recente versie, aangezien procedurele details periodiek worden bijgewerkt.
   OPMERKING: Alle gevaarlijke stoffen die tijdens het protocol worden geproduceerd, zoals formaline, ethanol en RNase-ontsmettingsoplossingen, moeten worden afgevoerd in overeenstemming met institutionele veiligheidsbeleid en lokale regelgeving, met gebruik van de juiste chemische afvalcontainers, biohazard-verwijderingsmethoden en de afzuigkappraktijken.

Results

Deze methode beschrijft de verwerking van vers gedissecte embryonale muiskoppen om FFPE-monsters van craniofaciaal weefsel, inclusief de zich ontwikkelende tand, te genereren die gemakkelijk met microtoom kunnen worden gesneden terwijl de RNA-integriteit behouden blijft (Figuur 1). Dit protocol werd met succes toegepast op E13.5 (embryonale dag 13.5), E15.5 en E16.5 muisembryohoofden voor hoge-resolutie beeldgebaseerde (Figuur 2...

Discussion

In dit werk presenteren we een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van FFPE-blokken van embryonale muiskoppen die geoptimaliseerd zijn voor gebruik met hoogresolutie ruimtelijke RNA-beeldvormingsplatforms, waaronder sequencing- en imaging-gebaseerde ruimtelijke transcriptomiek. Een belangrijk doel van dit protocol is het behouden van zowel de weefselmorfologie als de integriteit van nucleïnezuur over hele hoofdsecties, met bijzondere aandacht voor het zich ontwikkelende craniofa...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Thermo Fischer	10010023	Gebruik  voor het uitvoeren van wasbeurten tijdens de workflow
50 mL conische buizen (Ambion) RNAse-vrij	Thermo Fischer	AM12502	Gebruik voor het bewaren van monsters in verschillende oplossingen
Geavanceerd orbitaal schudder	VWR	6683-470	Gebruik om weefsels in fixatie-oplossing te schudden tijdens incubatie
Alcohol, 70%, Fisherbrand, HistoPrep	Fisher Scientific	HC-1000-1GL	Gebruik om alle werkruimte te reinigen en te desinfecteren
Automatische vacuümweefselprocessor	Leica Biosystems	ASP300S	Gebruik voor het verwijderen, dehydratie, rehydratie en waxinfiltratie van monsters
Dekglas Dikte 1,5, 25 mm x 25 mm	Corning	2850-25	Gebruik voor het monteren van de dia in Visium HD workflow
Dako Bluing Buffer, gebruiksklaar	Agilent Technologies	CS70230-2	Gebruik voor H&E-kleuring
Eosine-Y met phloxine	Fisher Scientific	22050198	Gebruik voor H&E-kleuring
Hematoxyline, Mayer's, klaar voor gebruik waterige oplossing	Agilent Technologies	S330930-2	Gebruik voor H&E-kleuring
HistoCore Waterbad	Leica Biosystems	HIS2326	Gebruik om de secties bij 40-43 °C te laten drijven om rimpels uit FFPE-secties te verwijderen
Loupe browser  9.0.0	10X Genomics, Inc.		Gebruik om Visium HD-gegevens te analyseren
Laag profiel wegwerpmessen DB80LX	Leica Biosystems	14035843496	Gebruik om FFPE-blokken te sectioneren
Neutraal gebufferd formaline 10%	Azer Scientific	NBF-4-G	Gebruik om weefsels te fixeren
RNaseZap RNase Decontaminatieoplossing	Thermo Fischer	AM9782	Gebruik om RNase te reinigen en te verwijderen
Semi-automatisch roterende microtoom	Leica Biosystems	RM2245	Gebruik om FFPE-blokken te sectioneren zoals vermeld in de richtlijnen.
Diaverwarmer met deksel	Premiere	XH2004	Gebruik voor het incuberen van dia's bij verschillende temperaturen
Superfrost Plus Dia's	Fisher Scientific	12-550-15	Gebruik om secties voor Vsium HD te bevestigen
Chirurgische mes No. 11	Integra Miltex	4-311	Gebruik voor het scoren van FFPE-weefsels
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Gebruik om weefselinfiltratie en inbedding van weefsels uit te voeren
TISsue kweekbak 100X20MM 500/CS	Fisher Scientific	877222	Gebruik voor het verzamelen en dissekeren van monsters in 1x PBS
UltraPure Glycerol	Thermo Fischer	15514011	Gebruik voor Visium HD diamontage van coverglas voor CytAssist
Visium CytAssist	10X Genomics, Inc.	PN-1000442	Gebruik voor Visium HD workflow experimenten
Visium HD Spatial RNA-sequencing	10X Genomics, Inc.	1000676	Gebruik om ruimtelijke transcriptomische experimenten uit te voeren
Xenium 5K In Situ RNA Lokalisatie	10X Genomics, Inc.	PN-1000724	Gebruik om ruimtelijke transcriptomische experimenten uit te voeren
Xenium Analyzer	10X Genomics, Inc.	PN-1000481	Gebruik om Xenium en Xenium 5K RNA beeldvorming uit te voeren
Xenium Explorer 4	10X Genomics, Inc.		Gebruik om Xenium-gegevens te analyseren
Xenium In Situ RNA Lokalisatie	10X Genomics, Inc.	1000672	Gebruik om ruimtelijke transcriptomische experimenten uit te voeren