Gestandaardiseerde flowcytometrietest met behulp van gedroogde recombinante antilichaampanelen voor karakterisering van CAR T-cellen

Samenvatting

Dit protocol toont aan hoe gedroogde recombinante antilichaampanelen de karakterisering van Chimerische Antigeenreceptor T (CAR T) cellen stroomlijnen door variabiliteit te verminderen en workflows te vereenvoudigen. Het maakt reproduceerbare beoordeling van kritieke kwaliteitsattributen mogelijk, waaronder absolute kwantificering van Chimerische Antigeen Receptor T-cellen, en is compatibel tussen verschillende flowcytometrieplatforms.

Samenvatting

Flowcytometrie wordt vaak gebruikt om kritieke kwaliteitskenmerken van Chimerische Antigeenreceptor T (CAR T) cellen te beoordelen, waaronder levensvatbaarheid, fenotype en transductie-efficiëntie. Conventionele vloeibare-reagensworkflows vereisen meerdere voorbereidingstappen, wat variabiliteit en verschillen in de gebruiker-afhankelijke behandeling kan veroorzaken. Voorgeformuleerde gedroogde recombinante antilichaampanelen bieden een alternatief formaat dat recombinante antistoftechnologie combineert met een gebruiksvriendelijke configuratie. Recombinante antilichamen bieden een duidelijke specificiteit en verminderde variabiliteit per lot, terwijl het gedroogde formaat de voorbereidingsstappen vermindert en de verwerking van reagens vereenvoudigt. Hier presenteren we een stapsgewijze workflow voor CAR T-celanalyse met behulp van gedroogde recombinante antilichaampanelen. Het protocol omvat monsterkleuring, gegevensverzameling en analyse, en wordt vergezeld door een schematisch overzicht van de workflow. Representatieve kleuringsresultaten worden getoond om de toepassing van het paneel te illustreren, en verschillen in hands-on tijd vergeleken met een conventionele workflow van vloeibare reagens worden benadrukt. De gegeven voorbeelden tonen aan hoe deze panelen kunnen worden gebruikt om de multiparametrische karakterisering van CAR T-cellen te stroomlijnen. Al met al biedt dit werk een praktisch kader voor het implementeren van gedroogde recombinante antilichaampanelen in flowcytometrie-gebaseerde CAR T-celanalyse.

Inleiding

CAR T-celtherapieën zijn uitgegroeid tot een belangrijke vooruitgang in de behandeling van kanker, met name bij hematologische maligniteiten. Deze methode maakt gebruik van het eigen immuunsysteem van de patiënt door T-cellen te modificeren om chimerische antigeenreceptoren (CAR's) te expresseren die^kankercellen herkennen en targeten. De zeer complexe infrastructuur en arbeidsintensieve productieprocessen die nodig zijn om CAR T-cellen te produceren, maken echter een rigoureuze, gestandaardiseerde karakterisering essentieel om zowel productkwaliteit als patiëntveiligheid te waarborgen. Een aanzienlijk deel van de totale kosten van CAR T-therapie komt voort uit het uitgebreide laboratoriumwerk en kwaliteitscontroleprocedures (QC), waarvan vele handmatige, meerstapsworkflows omvatten. In deze context zijn belangrijke karakteriseringsparameters—zoals transductie-efficiëntie en identiteitstesten—cruciaal voor het beoordelen van het therapeutische potentieel van de gemodificeerde cellen². Traditionele vloeistofkleuringsmethoden in de flowcytometrie, die vaak voor deze beoordelingen worden gebruikt, brengen verschillende uitdagingen met zich mee. Variabiliteit in pipetten, stabiliteitsproblemen van reagens en operatorbias kunnen leiden tot inconsistenties en onnauwkeurigheden in de data, wat de betrouwbaarheid van de resultaten mogelijk aantast³.

Flowcytometrie is een hoeksteentechnologie voor de karakterisering en kwaliteitscontrole van CAR T-cellen, waardoor gedetailleerde analyse van meerdere celparameters mogelijk is. Het conventionele gebruik van vloeibare reagentia in dit proces kent echter mogelijke valkuilen ^4,5. Pipetvariabiliteit kan aanzienlijke fouten veroorzaken, vooral bij kleine volumes en meerdere reagentia. Bovendien zijn vloeibare reagentia gevoelig voor degradatie na verloop van tijd, wat hun stabiliteit kan aantasten en inconsistente kleuringsresultaten kan opleveren⁶. Operatorbias, voortkomend uit handmatige voorbereiding en hantering, verergert deze problemen verder en kan leiden tot variabiliteit in resultaten tussen laboratoria en zelfs binnen runs in hetzelfde laboratorium. Kritieke kwaliteitskenmerken zoals cellevensvatbaarheid, transductiefrequentie, aantal CD3⁺ en identiteit zijn essentieel voor de veilige afgifte van CAR T-producten. Het waarborgen van de nauwkeurigheid en consistentie van deze metingen is van vitaal belang, omdat ze direct invloed hebben op de therapeutische effectiviteit en veiligheid van de CAR T-cellen¹. Zo is een nauwkeurige beoordeling van transductiefrequentie cruciaal om het aandeel T-cellen dat succesvol is aangepast om de CAR te expressieën, terwijl het aantal en percentage CD3⁺ inzicht geven in de algehele samenstelling en zuiverheid van de T-celpopulatie.

Gedroogde antilichaampanelen bieden een veelbelovende oplossing voor deze uitdagingen door consistente toediening van reagens te bieden en de opstellingstijd en het risico op fouten te verminderen. Deze panelen bestaan uit meerdere antilichamen die zijn gedroogd uit kant-en-klare cocktails. Na het drogen zijn deze panelen stabiel en klaar voor gebruik, waardoor complexe voorbereidingsstappen overbodig zijn en de kans op menselijke fouten^{minimaliseren.} Belangrijk is dat het niet nodig is om deze gedroogde panelen opnieuw samen te stellen vóór gebruik—celsuspensies kunnen direct aan het gedroogde antistofmengsel worden toegevoegd. De opname van recombinante antilichamen in deze gedroogde vormen biedt verschillende voordelen ten opzichte van conventionele polyklonale of hybridoma-afgeleide reagentia. Hun moleculair gedefinieerde structuur zorgt voor een hoge lot-tot-lot consistentie en reproduceerbaarheid, waardoor variabiliteit tussen experimenten en laboratoria wordt verminderd. Een gemanipuleerde Fc-regio gebaseerd op menselijke IgG1 minimaliseert kruisreactiviteit en achtergrondkleuring. Als gevolg hiervan is Fc-blokkering niet nodig, wat de benodigde tijd voor het uitvoeren van de flowcytometrische assay verder verkort. Het gedroogde formaat beschermt reagentia tegen degradatie en behoudt hun effectiviteit over tijd en batches heen. Deze consistentie is cruciaal voor het behalen van betrouwbare en reproduceerbare resultaten in flowcytometrie-assays⁸.

De toepasbaarheid van gedroogde reagentiaformaten strekt zich uit over verschillende stadia van de ontwikkeling en monitoring van CAR T-celtherapieën. Bij kwaliteitscontrole van de productie faciliteren gedroogde reagentia de bemonstering in gesloten systemen, waardoor steriliteit en consistentie worden gegarandeerd. Dit is vooral belangrijk in een klinische omgeving, waar het waarborgen van de integriteit van het monster van het grootste^{belang is}. Voor productkarakterisering maken gedroogde reagentia een nauwkeurige beoordeling van absolute tellingen en immuunsubsets mogelijk, wat cruciaal is voor het bepalen van de therapeutische kwaliteit van de CAR T-cellen. Bovendien zijn gedroogde reagentia in onderzoeksomgevingen van onschatbare waarde voor longitudinale patiëntmonitoring, omdat ze een consistente tracking van de persistentie van CAR T-cellen over tijd mogelijk maken, wat cruciaal is voor het begrijpen van de langetermijneffectiviteit en veiligheid van de therapie.

De voordelen van het gebruik van gedroogde antilichaampanelen in flowcytometrie zijn veelzijdig, waarbij een van de belangrijkste is dat ze pipettefouten kunnen verminderen door een volledig vooraf geconfigureerd paneel te bieden in plaats van dat individuele reagentia handmatig opnieuw gesuspendeerd en gecombineerd moeten worden. In tegenstelling tot enkele gedroogde antilichamen—die nog moeten worden gereconstitueerd en gepipetteerd en dus vooral een verlengde houdbaarheid bieden—elimineren voorgemonteerde gedroogde panelen meerdere handmatige voorbereidingsstappen. Dit stroomlijnt de workflow en minimaliseert de kans op operatorafhankelijke variabiliteit aanzienlijk. Daardoor wordt het hele proces minder foutgevoelig, minder tijdrovend en minder afhankelijk van uitgebreide technische training, waardoor het toegankelijk is voor een breder scala aan laboratoria¹⁰. Bovendien zorgt het stabiele, kant-en-klare formaat van gedroogde recombinante antilichaampanelen voor consistente, betrouwbare assayprestaties tussen operators en locaties⁹.

Om het potentieel van gedroogde reagentiatechnologie in flowcytometrie volledig te benutten, is het essentieel om een stapsgewijs protocol voor het gebruik ervan te ontwikkelen. Dit omvat richtlijnen voor gedroogde panelenkleuring, acquisitie en geautomatiseerde analyse, zodat alle aspecten van het proces gestandaardiseerd en geoptimaliseerd zijn voor nauwkeurigheid en efficiëntie. Door een duidelijk en uitgebreid protocol te bieden, kunnen laboratoria consistente en betrouwbare resultaten behalen, waardoor de veilige en effectieve afgifte van CAR T-celproducten^{mogelijk is}. Hier bieden we een protocol dat de voordelen van gedroogde antilichaampanelen benut om de beperkingen van traditionele vloeistofkleuringsmethoden aan te pakken, waardoor de betrouwbaarheid, efficiëntie en reproduceerbaarheid wordt verbeterd—belangrijke kenmerken om veilige en effectieve CAR T-celtherapieën te waarborgen (Figuur 1).

Protocol

Alle menselijke monsters zijn verzameld van gezonde, anonieme vrijwilligers nadat schriftelijke geïnformeerde toestemming was verkregen. Alle procedures werden goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Ärztekammer Nordrhein (#2020272) en uitgevoerd in overeenstemming met de vereiste ethische en bioveiligheidsvoorschriften.

1. Monsterverzameling en voorbereiding

1. Verzamel aseptisch monsters van Chimerische antigeenreceptor T (CAR T) uit de verwerkingszakken voor kwaliteitscontrole in de productie.
2. Verwerk de monsters snel om de levensvatbaarheid van de cel te behouden. Bewaar de monsters bij 2–8 °C, beschermd tegen licht, totdat ze vlekken.
3. Bepaal het celnummer van elk monster voordat je kleurt.
4. Pas elk monster aan op een concentratie van maximaal 10⁶ genucleeerde cellen per 100 μL met fosfaatgeboterde zoutoplossing (PBS)/2 mM EDTA/0,5% BSA-buffer, pH 7,2.
   1. Centrifugeer indien nodig de monsters op 300 × g gedurende 5 minuten. Aspireer het supernatant volledig.
   2. Sussief de cellen opnieuw tot de juiste concentratie.

2. Gedroogde paneelbeitsing

OPMERKING: Twee vooraf geformuleerde gedroogde antilichaampanelen worden gebruikt om monsters te kleuren: de gedroogde recombinante Immune Cell Composition (ICC) Cocktail, menselijk, en de gedroogde recombinante CAR T Transduction Cocktail, menselijk. CAR-kleuring voor het CAR T transductiepaneel is cruciaal. Betrouwbare scheiding van CAR-negatieve en CAR-positieve cellen is vereist voor nauwkeurige bepaling van de transductiefrequentie. Wassen kan het celherstel verminderen door celverlies tijdens centrifugatie en aspiratie. Daarom worden no-wash protocollen over het algemeen geprefereerd wanneer nauwkeurige celconcentratie vereist is.

1. ICC Cocktail (no-wash protocol)
   1. Voeg 100 μL van de voorbereide celsuspensie direct toe aan de gedroogde ICC-antistofbuis. Meng door op en neer te pipetteren en/of kort vortex te laten draaien om de pellet volledig op te lossen. Broed 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur (19–25 °C).
   2. Controleer of de gedroogde antistofpellet volledig is opgelost. Ga direct door naar de overname zonder was.
2. CAR T transductiecocktail (wasprotocol)
   1. Voeg 100 μL van de voorbereide celsuspensatie toe aan de gedroogde CAR T-transductiebuis.
   2. Voeg het juiste volume CAR-detectiereagens toe (bijv. 2 μL). Meng door op en neer te pipetteren en/of kort vortex te laten draaien om de pellet volledig op te lossen. Broed 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur (19–25 °C). Controleer of de gedroogde antistofpellet volledig is opgelost.
   3. Was de cellen door 1 ml buffer toe te voegen. Centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant volledig.
3. Secundaire kleuring (indien nodig)
   1. Voer een tweede wash uit (zie stap 2.2.3) voor biotine-gelabelde CAR-detectiereagentia om vrij biotine-geconjugeerd reagens te verwijderen en achtergrondverkleuring te verminderen.
   2. Sussen de cellen opnieuw in 98 μL buffer. Voeg 2 μL van een door phycoerytrin (PE) gelabeld secundair antilichaam toe. Vortex even om te mengen. Broed 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur (19–25 °C).
   3. Was de cellen om ongebonden secundair antilichaam te verwijderen (zie stap 2.2.3).
4. Laatste voorbereiding op de overname
   1. Stel het volume van alle gekleurde monsters (CAR T Transduction Cocktail en ICC Cocktail) aan op 300–500 μL met buffer. Bescherm monsters tegen licht en houd het op 2–8 °C.
   2. Voer de opname binnen 1 uur uit om de stabiliteit van de fluoroforen te behouden en de levensvatbaarheid van de cel te behouden.

3. Flowcytometrische acquisitie en data-analyse

1. Bereid de flowcytometer voor en prim deze voor zodat calibratie en instrumentinstellingen geoptimaliseerd zijn.
2. Zet de lasers aan en spoel het vloeistofsysteem uit. Laat de optische bank minstens 30 minuten opwarmen.
3. Tijdens het warmen start je een reinigingsprogramma met een 1% hypochlorietoplossing.
4. Gebruik kalibratiekralen om de laserinstellingen aan te passen.
5. Bereid enkelkleurige controles voor voor compensatie met bijpassende antistofsets.
   1. Voor kralen: voeg een passend volume van positieve en negatieve controlekralen toe.
   2. Voor cellen: voeg 100 μL celsuspensie toe.
   3. Voor biotine-geconjugeerde reagentia: neem een buis met 98 μL buffer plus 2 μL PE-gelabelde secundaire antistof.
   4. Controleer of compensatiereagentia overeenkomen met de antistofcocktail (lotnummers).
6. Incubeer controles 10–20 seconden, vortex 5 seconden, en broede dan 10 minuten in het donker bij 19–25 °C.
7. Verdun monsters met 600 μL buffer en meng grondig.
8. Stel compensatie in met enkelkleurige controles.
9. Pas FSC- en SSC-spanningen aan en definieer drempels om puin uit te sluiten.
10. Verzamel minstens 50.000–100.000 levende lymfocyten per monster.
11. Voer gating uit om de levensvatbaarheid, CD3-expressie en CAR-expressie te evalueren.
12. Voor absolute kwantificering bepaal je het aandeel CAR-positieve T-cellen (f₍CAR T₎).
13. Definieer totale leukocyten (N₍totaal₎) als levensvatbare CD45⁺, losse cellen na uitsluiting van afval.
14. Meet het totale aantal leukocyten door direct te tellen uit ICC-gekleurde monsters indien ondersteund door het instrument of met telkralen of een hematologie-analyzer.
15. Bereken de concentratie van CAR T-cels:
    
    OPMERKING: Voorbeeldberekening met waarden uit Figuur 2 en Figuur 3
    ​
    
16. Pas deze methode toe voor CAR T-celkwantificatie over verschillende instrumenten en workflows.

Resultaten

Gedroogde recombinante antilichaampanelen werden toegepast op CAR⁺ T-celmonsters om flowcytometriekleuringsworkflows te demonstreren. Zoals geïllustreerd in Figuur 1, elimineert het vervangen van conventionele vloeibare-reagensworkflows door voorgeformuleerde gedroogde antilichaampanelen verschillende voorbereidingstappen—waaronder het labelen van buisjes (om de samenstelling van het paneel aan te geven; elke buis vereist nog steeds de juiste monsteridentificatie), combinaties en handmatig mengen—waardoor het kleuringsproces wordt vereenvoudigd. Buizen bevatten een label dat gescand kan worden met compatibele cytometers of handmatig kan worden uitgelezen, wat flexibele opties biedt voor monsteridentificatie.

Representatieve voorbeelden tonen aan dat het panel van de samenstelling van gedroogde immuuncellen de identificatie van belangrijke leukocytensubsets mogelijk maakt (Figuur 2), terwijl het gedroogde CAR T-transductiepaneel visualisatie van CAR-expressieve T-cellen en beoordeling van transductie mogelijk maakt (Figuur 3). Fc-blokkering is niet vereist voor deze panelen, en slechts één isotypecontrole is nodig voor alle antilichamen in het paneel. Deze voorbeelden benadrukken de toepassing van gedroogde panelen voor multiparametrische analyse van CAR T-cellen en laten zien hoe de workflow efficiënt kan worden uitgevoerd met minder praktische stappen. De samenstelling van de gedroogde antistofpanelen die in deze studie zijn gebruikt, is weergegeven in Tabel 1.

Figuur 4 illustreert de vermindering van de voorbereidingstijd voor een representatief experiment bij het gebruik van gedroogde panelen voor zowel minder ervaren als ervaren gebruikers. Het gedroogde formaat stroomlijnt kleurprocedures, minimaliseert handmatige behandeling en biedt praktische richtlijnen voor workflowimplementatie en training. Belangrijk is dat het gebruik van gedroogde antilichaamcocktails immuuncelsubsetfrequenties opleverde die vergelijkbaar zijn met die verkregen met conventionele vloeibare cocktails (Figuur 5). Daarnaast zijn gedroogde antilichaampanelen stabiel bij kamertemperatuur en kunnen ze gedurende hun houdbaarheid van één jaar bij omgevingsomstandigheden worden bewaard, in tegenstelling tot conventionele vloeibare antilichamen die doorgaans koude opslag vereisen. Deze stabiliteit ondersteunt herhaald gebruik, langetermijnstudies en vereenvoudigd voorraadbeheer.

Samenvattend laten de gegeven voorbeelden zien hoe gedroogde recombinante antilichaampanelen kunnen worden gebruikt om de multiparametrische karakterisering van CAR T-cellen te stroomlijnen. Al met al biedt dit werk een praktische aanpak voor het implementeren van gedroogde antilichaampanelen in flowcytometrie-gebaseerde CAR T-celanalyse, met vereenvoudigde behandeling, verminderde voorbereidingsstappen en aanpasbare paneelconfiguraties.

Figuur 1: Vergelijking van de workflow voor handmatige kleuring en gedroogde recombinante antilichaampanelen. De traditionele handmatige workflow (boven) omvat meerdere voorbereidingstappen, waaronder het labelen van buisjes, het combineren en mengen van reagentia, en het toevoegen van monsters, wat de praktische inspanning kan vergroten. Daarentegen gebruikt de workflow van het gedroogde recombinante antilichaampaneel (onderaan) voorgemengde, afgedroogde panelen die alleen de toevoeging van het monster vereisen. Deze gestroomlijnde aanpak vermindert handmatige stappen en vereenvoudigt het kleurproces, wat de efficiëntie van de workflow en praktische implementatie illustreert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Flowcytometrische analyse van een leukaferesemonster gekleurd met het gedroogde recombinante antilichaampaneel "Immune Cell Composition Cocktail". (A) Afval werd uitgesloten door FSC versus SSC te gaten om alle cellen te includeren. (B) Doublets werden verwijderd met een FSC-A versus FSC-H gate. (C) Leukocyten werden geïdentificeerd door te koppelen op CD45^+-cellen, waardoor resterende erytrocyten werden uitgesloten. (D) Dode cellen werden uitgesloten met 7-AAD kleuring. (E,F) CD3^+-cellen werden geïdentificeerd en verder geclassificeerd in (E) T-cellen en (F) NKT-cellen op basis van CD56-expressie. (G) T-cellen werden vervolgens gescheiden in CD4⁺ en CD8⁺ subsets. (H) Binnen de CD3-populatie werden monocyten gedefinieerd door CD14-expressie en B-cellen door CD19-expressie. (I) De overige CD14^–/CD19^– cellen werden onderverdeeld in SSC high/CD16^– eosinofielen, SSC high/CD16⁺ neutrofielen, en SSC low/CD56⁺/CD16⁺ cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Flowcytometrische analyse van CD19 CAR T-cellen (FMC63) gekleurd met het gedroogde recombinante antistofpaneel "CAR T Transduction Cocktail". (A) Afval werd uitgesloten door te koppelen op FSC versus SSC om alle cellen te includeren. (B) Doublets werden verwijderd met een FSC-A versus FSC-H gate. (C) Leukocyten werden geïdentificeerd door gating op CD45^+- cellen. (D) Dode cellen werden uitgesloten op basis van 7-AAD⁻ kleuring. (E,F) CD3^+- cellen werden geïdentificeerd en vervolgens gescheiden in CAR⁺ - en CAR⁻ populaties. (G) CAR⁺ en (H) CAR⁻ cellen werden verder onderverdeeld in CD4⁺ en CD8⁺ T-cel subsets. (I) Binnen de CD3⁻ -populatie werden residuele monocyten gedefinieerd door CD14-expressie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Tijdsbesparing behaald met gedroogde antistofpanelen over ervaringsniveaus heen. Voor niet-ervaren (links) en ervaren gebruikers (rechts) werd de tijd ingenomen om een flowcytometrisch experiment op te zetten (gedroogde recombinante antilichaampaneel "Immune Cell Composition Cocktail", technische drievoudige exemplaren) vanaf het begin van het experiment tot aan het begin van de incubatie, inclusief het hanteren van reagentia, pipetten en documentatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Flowcytometrie-analyse van gelyseerd heel bloed, overleg van een monster gekleurd met het gedroogde recombinante antilichaampaneel "Immune Cell Composition Cocktail" (blauw) en een monster gekleurd met dezelfde antilichamen in vloeibaar formaat (oranje). (A) Afval werd uitgesloten door te schakelen op FSC versus SSC om alle cellen te includeren. (B) Doublets werden verwijderd met een FSC-A versus FSC-H gate. (C) Leukocyten werden geïdentificeerd door gating op CD45^+-cellen, waardoor resterende erytrocyten werden uitgesloten. (D) Dode cellen werden uitgesloten met 7-AAD kleuring. (E) CD3^+-cellen werden geïdentificeerd. (F) Deze cellen werden vervolgens geclassificeerd in T-cellen en NKT-cellen op basis van CD56-expressie. (G) T-cellen werden vervolgens gescheiden in CD4⁺ en CD8⁺ subsets. (H) Binnen de CD3-populatie werden monocyten gedefinieerd door CD14-expressie en B-cellen door CD19-expressie. (I) De overige CD14^–/CD19^– cellen werden onderverdeeld in SSC high/CD16^– eosinofielen, SSC high/CD16⁺ neutrofielen, en SSC low/CD56⁺/CD16⁺ cellen. (J) Frequenties verkregen met vloeibare antilichamen en gedroogde reagentiapanelen werden vergeleken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Doel	V1 VioBlue	V2 VioGreen	B1 FITC	B2 PE	B3 7-AAD PerCP-Vio 700	B4 PE-Vio770	R1 APC	R2 APC-Vio770
Bepaling van cellevensvatbaarheid en samenstelling van immuuncellen	CD45	CD4	CD3	CD56/CD16	7-AAD	CD19	CD14	CD8
Bepaling van transductie-efficiëntie van CAR T-cellen	CD45	CD4	CD3	CAR-detectiereagens	7-AAD	/	CD14	CD8

Tabel 1: Samenstelling van gedroogde recombinante antilichaampanelen gebruikt voor CAR T-celanalyse. Deze tabel geeft een overzicht van de antilichamen die in elk gedroogd paneel zijn opgenomen, met het doelantigeen, de kloon, fluorochroom en de typische hoeveelheid per buis. Twee panelen worden getoond: het "Immune Cell Composition"-paneel voor identificatie van belangrijke leukocytensubsets, en het "CAR T-transductie"-paneel voor detectie van CAR-expressie en karakterisering van T-celsubsets. De informatie biedt een referentie voor workflowimplementatie en optionele aanpassing met extra vloeistofgeconjugeerde antilichamen.

Discussie

Gedroogde recombinante antilichaampanelen bieden een gestroomlijnde, praktische workflow voor de karakterisering van CAR T-cellen in het laboratorium. Het voorgeformuleerde formaat vermindert de voorbereidingsstappen en vereenvoudigt de afhandeling, waardoor de operator-afhankelijke variabiliteit wordt beperkt en de consistente uitvoering van multiparametrische flowcytometrieprocedures wordt ondersteund⁸. Representatieve voorbeelden illustreren het gebruik van deze panelen om leukocytensubsets te identificeren, CAR-expressie te detecteren en T-celsubsets te evalueren. Panelen kunnen ook worden aangevuld met extra vloeistof-geconjugeerde antilichamen om extra markers of immuunsubsets toe te voegen, wat flexibele aanpassing aan specifieke experimentele behoeften of analyses met hogere parameters mogelijk maakt.

Nauwkeurige CAR-detectie is cruciaal voor de betrouwbare bepaling van transductiefrequentie¹. Een duidelijke scheiding van CAR-negatieve en CAR-positieve populaties hangt af van de passend geoptimaliseerde kleuringsomstandigheden, vooral wanneer de expressieniveaus van CAR variëren. Controles zoals fluorescentie-minus-één (FMO) monsters kunnen nauwkeurige gating ondersteunen. In sommige gevallen kunnen wasstappen de discriminatie verbeteren door ongebonden antistoffen te verwijderen; Deze stappen kunnen echter het celherstel verminderen door celverlies tijdens centrifugatie en aspiratie. Daarom kunnen no-wash workflows worden verkiezen wanneer nauwkeurige celkwantificatie vereist is.

Hoewel de aanpak idealiter een CAR-specifiek detectiereagens gebruikt dat het extracellulaire domein van de geengineerde CAR herkent, kunnen ook alternatieve reagentia, zoals antilichamen die geconserveerde linkergebieden tussen het antigeenbindende en signaaldomein aanpakken, worden toegepast. Deze alternatieven maken het mogelijk om CAR-expressieve cellen te detecteren en kunnen worden geïntegreerd in workflows waar CAR-specifieke reagentia niet beschikbaar zijn, met passende optimalisatie.

Integratie met geautomatiseerde acquisitie- en analysesystemen, waaronder Express Mode, kan de gegevensverzameling en -analyse verder stroomlijnen, waardoor de hands-on tijd wordt verminderd en consistente uitvoering van workflows tussen operators mogelijk wordt.

Hoewel dit werk de methode illustreert, is er geen formele assayvalidatie uitgevoerd voor gereguleerde productie of release-testen. Multicentervalidatie is nog niet uitgevoerd, dus reproduceerbaarheid tussen laboratoria moet nog worden bevestigd⁵. De aanpak is gebaseerd op voorgeformuleerde panelen, wat de flexibiliteit voor zeer gespecialiseerde toepassingen kan beperken. Op maat gemaakte gedroogde paneelopties kunnen echter worden ontworpen met specifieke markers of combinaties, waardoor op maat gemaakte workflows mogelijk is en de beperkingen van standaardpanelen worden overwonnen. Kostenoverwegingen worden grotendeels in balans gebracht door minder hands-on tijd en gestroomlijnde procedures, wat vooral voordelig kan zijn in workflows met hoge doorvoer.

Toekomstig werk kan zich richten op kwantitatieve prestatiebeoordelingen, formele validatie voor gereguleerd gebruik en uitbreiding naar multicenterstudies om workflowconsistentie tussen laboratoria te evalueren. Ontwerp van op maat gemaakte panelen biedt een praktische manier om de markerdekking uit te breiden, unieke experimentele vragen aan te pakken of zich aan te passen aan longitudinale immunomonitoringstudies.

Samenvattend bieden gedroogde recombinante antilichaampanelen een flexibel en praktisch platform voor CAR T-cel flowcytometrie. Ze verminderen voorbereidingsstappen, vereenvoudigen workflows en ondersteunen flexibel experimenteel ontwerp, inclusief aangepaste paneelconfiguraties.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
(Optioneel) Biotin Antilichaam, PE, REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-951	Alleen nodig als een Biotin-geconjugeerd CAR Detectie Reagens wordt gebruikt.
(Optioneel) CAR T Cell Express Mode Pakket	Miltenyi Biotec	160-002-376	Software add-on voor MACSQuant Analyzers; maakt geautomatiseerde gating en data-analyse mogelijk, hoewel handmatige analyse ook mogelijk is.
CAR Detectie Reagens naar keuze detecteerbaar in het PE kanaal, b.v. CD19 CAR Detectie Reagens, menselijk, Biotin	Miltenyi Biotec	130-129- 550	Alternatieve opties: CD19 CAR FMC63 Idiotype Antilichaam, PE, REAfinity (130-127-342); CD22 CAR Detectie Reagens, menselijk, Biotin (130-126-727); BCMA CAR Detectie Reagens, menselijk, PE (130-133-888)
Flow cytometer, b.v. MACSQuant Analyzer 16	Miltenyi Biotec	130-109-803	StainExpress buizen zijn compatibel met alle standaard flow cytometers.
StainExpress CAR T Transductie Cocktail, menselijk	Miltenyi Biotec	130-127-638	Aangepaste gedroogde antilichaam panel configuraties kunnen worden aangevraagd via uw lokale Miltenyi Biotec vertegenwoordiger of technische ondersteuningsteam.
StainExpress Immuuncel Compositie Cocktail, menselijk	Miltenyi Biotec	130-127-637	Aangepaste gedroogde antilichaam panel configuraties kunnen worden aangevraagd via uw lokale Miltenyi Biotec vertegenwoordiger of technische ondersteuningsteam.