$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ethische goedkeuring was niet vereist voor deze studie, omdat deze geen menselijke deelnemers of klinische monsters betrof. Alle procedures met cellijnen werden uitgevoerd in overeenstemming met institutionele bioveiligheidsrichtlijnen en -regelgeving. De prostaatepitheelcellijn die in deze studie werd gebruikt, werd verkregen van een gecertificeerde commerciële leverancier.
OPMERKING: Alle reagentia, instrumenten en software die in deze studie worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaalkunde. Het stroomdiagram van deze studie is te zien in Figuur 1.
1. Screening van werkzame stoffen
- Toegang tot de TCMSP-database.
- Selecteer "Kruidennaam" in het zoekvak, voer "Huangbo" in en klik op "Zoeken".
- Klik op het "OB"-filter, stel "≥30" in en pas het toe.
- Klik op het "DL"-filter, stel "≥0.18" in en pas het toe.
- Kopieer de gefilterde resultaten naar een Excel-spreadsheet.
- Pas dezelfde screeningsmethode toe om de werkzame bestanddelen van "Cangzhu" te verkrijgen.
- Verwijder de dubbele actieve ingrediënten door alle datasets te importeren in Microsoft Excel (versie 2019) en de samengestelde lijsten in Excel-formaat samen te voegen.
- Verwijder dubbele werkzame ingrediënten door verbinding-namen te standaardiseren en identieke vermeldingen te identificeren. Wanneer meerdere archieven overeenkwamen met hetzelfde terrein, werd slechts één representatieve vermelding behouden.
- Leg associaties vast tussen "Huangbo", "Cangzhu" en actieve ingrediënten.
2. Verkrijg de doelen die overeenkomen met de werkzame bestanddelen
- Toegang tot de TCMSP-database.
- Selecteer "Chemische naam" in het zoekvak, voer de actieve ingrediënten in en klik op "Zoeken".
- Kopieer de naam Target die bij elk actief ingrediënt hoort.
- Verwijder dubbele Target-namen en leg associaties tussen actieve ingrediënten en Target-namen.
- Toegang tot de UniProt-database (https://www.uniprot.org/)18, haal de officiële gensymbolen voor elke Target-naam op en vervang deze systematisch.
3. Acquisitie van ziektedoelen
- Toegang tot de GeneCards-database (https://www.genecards.org)19.
- Voer "Prostatitis" in het zoekveld in en druk op het zoekicoon om de relevante genenlijst te verkrijgen.
- Sorteer genen in aflopende volgorde op relevantiescore.
- Exporteer de relevante genen in Excel-formaat.
- Doelwitten met een score ≥1 werden geselecteerd als prostatitis-gerelateerde doelwitten.
4. Voorbereiding op de opbouw van een regulerend netwerk voor geneesmiddel-actieve ingrediënten-doelziekten
- Bepaal het snijvlak tussen de doelwitten gerelateerd aan de werkzame stoffen en de prostatitis-gerelateerde doelwitten, en definieer dit als de doelen van EMP voor de behandeling van prostatitis.
- Stel de associatie vast tussen de werkzame bestanddelen en therapeutische doelwitten van EMP voor prostatitis.
- Maak een Excel-bestand aan met de naam "Netwerk" met de eerste drie kolommen genaamd "Node1", "Node2" en "Net".
- Plak de associaties tussen EMP en het geneesmiddel in de kolommen "Node1" en "Node2", terwijl je "geneesmiddel" invoert in de kolom "Net" voor alle rijen.
- Plak de associaties met het werkzame bestanddeel van het geneesmiddel in de kolommen "Node1" en "Node2", terwijl je "ingrediënt" invoert in de kolom "Net" voor alle rijen.
- Vul de kolommen "Node1" en "Node2" met de actieve ingrediënt-doel-associaties voor doelen van EMP voor de behandeling van prostatitis, waarbij "doel" wordt ingevoerd in de kolom "Net".
- Plak de therapeutische doelen van EMP voor prostatitis in de kolom "Node1", terwijl je "prostatitis" invoert in de kolom "Node2" en "ziekte" in de kolom "Net" voor alle rijen.
- Sla het Excel-bestand "Network" op als een txt-formaat bestand.
- Maak een Excel-bestand aan met de naam "Type" met de eerste twee kolommen genaamd "Node" en "Type".
- Vul de kolom "Node" in met "EMP", met "formule" in de kolom "Type".
- Voer "Huangbo" en "Cangzhu" in de kolom "Node"; voer "drug" in de kolom "Type" in voor alle rijen.
- Voer actieve ingrediënten in de kolom "Node" in, terwijl je "ingrediënt" invoert in de kolom "Type" voor alle overeenkomstige rijen.
- Vul de kolom "Node" met de therapeutische doelen van EMP voor prostatitis, waarbij "target" wordt ingevoerd in de kolom "Type".
- Voer de prostatitis-gerelateerde doelen in in de kolom "Node", terwijl je "ziekte" invoert in de kolom "Type" voor alle overeenkomstige rijen.
- Sla het Excel-bestand "Type" op als een bestand in .txt formaat.
5. Visualisatie van het "Geneesmiddel-Actieve Ingrediënt-Doelziekte" regulerend netwerk door Cytoscape
- Start Cytoscape.
- Ga naar "Bestand > Import > netwerk vanuit het bestandssysteem" en open het bestand "network.txt".
- Open het paneel "Stijl". Selecteer "Vorm", kies "Type" uit het keuzemenu "Kolom" en zet "Mapping Type" op "Discrete Mapping".
- Ken verschillende knoopvormen toe aan de volgende categorieën: formule, geneesmiddel, ingrediënt, doelwit, ziekte.
- Selecteer "Vulkleur", kies "Type" uit het "Kolom"-keuzemenu en stel "Mapping Type" in op "Discrete Mapping".
- Ken verschillende knoopkleuren toe aan de volgende categorieën: formule, geneesmiddel, ingrediënt, doelwit, ziekte.
- Selecteer "Hoogte" en "Breedte", kies "Type" uit het keuzemenu "Kolom" en zet "Mapping Type" op "Discrete Mapping".
- Ken verschillende knooppuntgroottes toe aan de volgende categorieën: formule, geneesmiddel, ingrediënt, doelwit, ziekte.
- Selecteer "Label Lettergrootte", kies "Type" in het keuzemenu "Column" en zet "Mapping Type" op "Discrete Mapping".
- Ken verschillende lettergroottes van het label toe aan de volgende categorieën: formule, geneesmiddel, ingrediënt, doelwit, ziekte.
- Herpositioneer de knooppunten handmatig om de netwerkindeling te optimaliseren.
- Ga naar "Bestand > Exporteer > netwerkimage naar bestand" en sla het netwerk op als een afbeelding.
6. PPI-netwerkanalyse en visualisatie
- Toegang https://cn.string-db.org/ en ga naar de module "Meerdere Eiwitten".
- Voer de lijst met doelgenen in het zoekvak in, selecteer "Homo sapiens" als organisme en klik op "Zoeken".
- Nadat de resultaten geladen zijn, klik je op "Doorgaan".
- Open het paneel "Instellingen", stel "minimum vereiste interactiescore" in op "hoge betrouwbaarheid (0,700)" en vink "verberg losgekoppelde knooppunten in het netwerk" aan.
- Klik op "Update" en exporteer vervolgens de PPI-associatiegegevens in TSV-formaat via het menu "Exporteren".
- Start Cytoscape, ga naar het Bestandsmenu en selecteer "Import Network from File System" om je TSV-bestand te openen.
- Ga naar het menu "Tools" en selecteer vervolgens "NetworkAnalyzer > Network Analysis > Network Interpretation > Behandel het netwerk als ongericht".
- Ga naar het menu "Bestand", selecteer "Tabel exporteren naar het bestand"-systeem en exporteer de netwerkgegevens.
- Ga naar het paneel "Stijl" en configureer de attributen "Vorm", "Vulkleur", "Hoogte" en "Breedte".
- Pas de indeling van het PPI-netwerk aan door de knooppunten te herpositioneren.
- Ga naar het menu "Bestand", selecteer "Export Network Image to File" en exporteer het gevisualiseerde netwerk als afbeelding.
- Open de geëxporteerde PPI-netwerkgegevens met WPS en sorteer deze in aflopende volgorde op de kolom "Graad".
- Selecteer de top 20 gesorteerde doelen, genereer een staafdiagram en sla het diagram op als afbeelding.
7. KEGG-padverrijkingsanalyse
- Open een terminal of de opdrachtprompt, typ R en druk op Enter.
- Voer in de R-console de volgende commando's één voor één uit:
install.packages(c("RSQLite", "colorspace", "stringi", "BiocManager"))
BiocManager::install(c("org. Hs.eg.db", "DOSE", "clusterProfiler", "pathview"))
- Zet de gensymbolen van de doelwitten van EMP om voor de behandeling van prostatitis naar Entrez-ID's met org. Hs.eg.db.
- Lees de Entrez-ID's en voer KEGG-verrijkingsanalyse uit met het clusterProfiler-pakket met parameters: organisme = "heeft", pvalueCutoff = 0,05, qvalueCutoff = 0,05.
- Na het verwijderen van menselijke ziekte- en metabolisme-gerelateerde routes uit de verkregen KEGG-verrijkingsanalyseresultaten, sorteer je de overige routes op basis van het aantal verrijkte genen.
- Stel de associatie vast tussen de top 15 gerangschikte signaleringsroutes en de doelen.
- Bereid een bestand met twee kolommen voor met associaties "pathway" en "target", en importeer het vervolgens in Cytoscape via "File > Import > Network from File".
- Stel nodevormen en kleuren in om paden van doelen te onderscheiden met behulp van het paneel "Stijl".
- Pas de lay-out handmatig aan en exporteer het netwerk als een afbeelding.
8. Farmaceutische bereiding
OPMERKING: De formulering EMP bestaat uit 15 g Phellodendri Chinensis Cortex (Huangbo) en 15 g Atractylodis Rhizoma (Cangzhu). De waterextractie- en alcoholprecipitatiemethode werd gebruikt om het extract te verkrijgen voor latere celgebaseerde experimenten20.
- Dompel het medicijn onder in een massa water van tien keer zoveel water.
- Decoct 1 uur en filter dan door gaas om het aftreksel te verkrijgen.
- Voeg opnieuw een massa water van 10 keer toe aan het medicijn, decoct 30 minuten en filter door gaas om het aftreksel te verkrijgen.
- Voeg opnieuw een massa water van tien keer toe aan het medicijn, decoct 30 minuten en filter door gaas om het aftreksel te verkrijgen.
- Combineer de drie gefilterde sdecoties en filter het mengsel vervolgens door filterpapier.
- Concentreer het aftrek onder verminderde druk tot 10% van het oorspronkelijke volume.
- Koel het concentraat af, voeg langzaam ethanol toe tot 75% met roeren, gevolgd door afdichten en bewaren bij 4 °C gedurende 12 uur.
- Centrifugeer het mengsel en verzamel het supernatant.
- Ga verder met destilleren onder verminderde druk.
- Tot slot het product gelyofilieerd met een vacuüm vriesdroger.
OPMERKING: Het gelyofilieerde poeder kan tot 3 maanden worden bewaard bij –20ºC, wat dient als een veilig pauzepunt. Om het te hervatten, reconstitueer het poeder indien nodig in een geschikt oplosmiddel.
9. Celdooi en kweek
OPMERKING: De gekochte cellen werden op droogijs naar het laboratorium gebracht. Voorafgaand aan de start van het experiment werd Keratinocyte Serum Free Medium (K-SFM) vooraf bereid door het aan te vullen met humane recombinante epidermale groeifactor (rEGF) tot een uiteindelijke concentratie van 5 ng/mL, runderhypofyse-extract tot een eindconcentratie van 50 μg/mL, en 1% penicilline-streptomycine.
- Activeer het waterbad en stel de temperatuur in op 37 °C.
- Verwijder de cellen uit het droogijs en beweeg ze direct in het waterbad tot ze volledig ontdooid zijn.
- Voeg 5 ml K-SFM toe aan de cellen. Meng voorzichtig en centrifugeer het mengsel vervolgens (4 °C, 500 × g, 5 min).
- Verwijder het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in volledige K-SFM.
- Breng de cellen over naar een T-25 kolf en plaats ze in een celkweekincubator.
OPMERKING: De omgevingsparameters van de celkweekincubator werden gehandhaafd op 37 °C, 5% CO₂ en ≥ 95% relatieve luchtvochtigheid.
10. Cellensubculturatie
OPMERKING: Subculturing werd uitgevoerd wanneer cellen 80–90% confluentie bereikten, met een subcultuurverhouding van 1:2 tot 1:3.
- Aspiraat het kweekmedium supernatant, gevolgd door twee spoelingen van de cellen met PBS zonder calcium en magnesium.
- Introduceer 2 ml trypsine-EDTA en laat de cellen 3 minuten rusten voor enzymatische dissociatie.
VOORZICHTIG: Dit protocol omvat het gebruik van gevaarlijke reagentia, waaronder lipopolysaccharide (LPS), chloroform, ethanol en TRIzol-reagentia. Alle procedures met gevaarlijke chemicaliën moeten worden uitgevoerd in een gecertificeerde chemische dampkap terwijl je passende persoonlijke beschermingsmiddelen draagt (labjas, handschoenen en oogbescherming). Biologische materialen moeten worden behandeld volgens institutionele bioveiligheidsrichtlijnen.
- Voeg K-SFM medium toe aangevuld met 10% fotaal rundserum om de spijsvertering te beëindigen.
- Breng het celmengsel over in een 15 mL centrifugebuis, centrifugeer (4 °C, 500 × g, 5 min) en verwijder het supernatant.
- De celpellet werd opnieuw opgehangen in volledige K-SFM en vervolgens overgebracht in nieuwe kweekkolven.
11. Bepaling van de maximale concentratie van geneesmiddelbehandeling via MTS-assay
OPMERKING: Elke geneesmiddelconcentratie werd getest met 5 technische replicata.
- Vertering van RWPE-1-cellen in de logaritmische groeifase.
- Sussen de cellen opnieuw in een volledig K-SFM-medium en bepaal vervolgens de celconcentratie door te tellen.
- Stel de celsuspensie bij op een dichtheid van 1 × 105 cellen/mL met een volledig K-SFM medium.
- Doseer de celsuspensie in een 96-wellplaat met 100 μL per put.
- De 96-well plaat werd geplaatst in een celkweekincubator voor teelt.
- Na 24 uur, zodra de cellen volledig waren gehecht, werd het kweekmedium geaspireerd en afgevoerd.
- Vervang het medium door een volledig K-SFM-medium met verschillende concentraties EMP-oplossing.
- Plaats de plaat terug in de celkweekincubator voor nog eens 24 uur incubatie.
- Aspireer het medium en spoel de cellen vervolgens twee keer af met PBS.
- Voeg 100 μL compleet K-SFM medium toe aan elke put en incubeer de plaat vervolgens nog eens 4 uur in de celkweekincubator.
- Doseer 10 μL MTS-oplossing in elke put en bepaal de OD bij 490 nm na een incubatie van 1 uur.
- Met de blanke controlegroep (cellen gekweekt in volledig medium zonder LPS-stimulatie of medicamenteuze behandeling) als basislijn werd celproliferatie onder elke behandelingsconcentratie berekend.
OPMERKING: De hoogste concentratie zonder significant effect op celproliferatie werd gedefinieerd als de behandeling met hoge dose, gevolgd door de halve concentratie als middeldosisbehandeling en een kwart als de laagdosisbehandeling.
12. Cellulaire interventie
- Vertering van RWPE-1-cellen in de logaritmische groeifase.
- De cellen werden opnieuw gesuspendeerd in een volledig K-SFM-medium, en de celconcentratie werd bepaald door celtelling.
- De celsuspensie werd aangepast tot een dichtheid van 5 × 105 cellen/mL met behulp van een volledig K-SFM medium.
- De celsuspensatie werd ingezaaid in een 6-wellplaat van 2 mL per put.
- De plaat werd in een kweekincubator geplaatst en 12 uur geïncubeerd om celadhesie mogelijk te maken.
- Cellen werden behandeld met respectievelijk lage (150 μg/mL), medium (300 μg/mL) en hoge dosis (600 μg/mL) EMP-concentraties.
- Na 1 uur werd 10 μg/mL LPS-oplossing aan het kweekmedium toegevoegd.
- Na 24 uur behandeling werd het supernatant verzameld voor ELISA en werden de cellen geoogst voor RT-PCR-analyse.
OPMERKING: LPS werd geselecteerd om een ontstekingsreactie op te wekken vanwege het goed gevestigde vermogen om pro-inflammatoire signaalroutes in prostaatepitheelcellen te activeren; de concentratie (10 μg/mL) werd gekozen op basis van eerdere studies die robuuste cytokine-inductie aantoonden.
13. Isolatie van totaal RNA
OPMERKING: Om RNA-degradatie te voorkomen, werden gedurende het hele experimentele proces handschoenen en maskers gedragen, en werden RNase-vrije pipettips en centrifugebuizen gebruikt.
- Spoel na de interventie de cellen twee keer af met PBS.
- Voeg 1 ml Trizolreagens toe aan de cellen en meng dit herhaaldelijk met een pipet om homogenisatie te garanderen.
VOORZICHTIG: Alle procedures uitvoeren in een chemische dampkap terwijl je passende persoonlijke beschermingsmiddelen draagt.
- Breng het lysaat over in een 1,5 mL microcentrifugebuis en laat het 15 minuten op kamertemperatuur incuberen.
- Voeg vervolgens 0,2 mL chloroform toe en laat het monster krachtig vortexen.
- Na 5 minuten op kamertemperatuur te hebben staan, centrifugeer je het monster op 10.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
- Na centrifugatie wordt de bovenste kleurloze waterige fase zorgvuldig overgebracht naar een verse microcentrifugebuis.
- Voeg een gelijke hoeveelheid voorgekoelde isopropanol toe, meng grondig en laat het dan 10 minuten op kamertemperatuur incuberen.
- Centrifugeer het monster nogmaals (4 °C, 10.000 × g, 10 min), gooi daarna de vloeibare fase weg en behoudt het neerslag.
- Spoel de pellet af met 1 ml voorgekoelde 75% ethanol en laat het voorzichtig opnieuw suspenderen door te pipetteren.
- Voer een laatste centrifugatie uit bij 4 °C en 7.500 × g gedurende 10 minuten, verwijder vervolgens het supernatant en laat de RNA-pellet aan de lucht drogen in een bioveiligheidskast.
- Los het gezuiverde RNA op in 50 μL DEPC-behandeld water.
- Bepaal de RNA-concentratie, de A260/A280-verhouding en de A260/A230-verhouding met behulp van een NanoDrop-spectrofotometer om de RNA-zuiverheid te evalueren en minimale eiwit- en oplosmiddelverontreiniging te waarborgen vóór downstream-analyses.
14. RT-PCR
- Gebruik 1 μg totaal RNA om een reverse-transcriptiereactiesysteem van 20 μL voor te bereiden.
- Incubeer het reactiesysteem bij 42 °C gedurende 15 minuten, gevolgd door 95 °C gedurende 5 minuten, en koel daarna af tot 4 °C.
- Verdun het resulterende cDNA tien keer met gedestilleerd water.
- Bereid een 20 μL PCR-reactiesysteem voor met behulp van het verdunde cDNA.
- Programmeer de thermische cycler en stel een initiële pauze in op 95 °C voor 60 seconden, gevolgd door 40 cycli van 95 °C voor 15 seconden en 60 °C voor 60 seconden.
- Voer een smeltcurveanalyse uit en registreer de CT-waarden voor alle doelgenen en referentiegenen na voltooiing.
- Gebruik de 2(-ΔΔCT) -methode om de genormaliseerde expressieniveaus van de doelgenen te bepalen.
15. ELISA-toets
OPMERKING: Haal de ELISA-kit uit de opslag en laat hem 30 minuten op kamertemperatuur balanceren voordat je hem gebruikt.
- Bereid de standaardoplossing voor volgens de instructies van de fabrikant en voer passende verdunningen uit voor standaarden, biotinyleerde antilichamen, enzymconjugaten en wash buffer.
- Centrifugeer het verzamelde celkweek-supernatant (4 °C, 10.000 × g, 10 min) en verzamel het supernatant.
- Breng 100 μL van de standaard verdunnings- en testmonsters over naar de voorgecoate putten.
- Sluit de putten af met een lijmstrip en incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 90 minuten.
- Verwijder de vloeistof uit de putten en was de plaat met een automatische plaatwasser.
OPMERKING: Stel de parameters van de automatische wasmachine in op: 350 μL wasbuffer per put, 15 seconden wektijd tussen doseren en aspiratie, 5 volledige cycli.
- Doseer 100 μL biotinyleerde antilichaam-werkoplossing in elke put. Laat 60 minuten incuberen op 37 °C.
- Gooi de oplossing weg en was het bord zoals beschreven in 15.5.
- Pipette 100 μL enzymgeconjugeerde werkoplossing per put, en incubeer dan bij 37 °C gedurende 60 minuten.
- Gooi de oplossing weg en was het bord zoals beschreven in 15.5.
- Voeg aan elke put 100 μL chromogeen substraat toe. Houd de temperatuur 15 minuten op 37 °C terwijl je bescherming biedt tegen licht.
- Pipetteer 100 μL stopoplossing per put en meng dan voorzichtig.
- Meet onmiddellijk de optische dichtheid (OD) bij 450 nm.
- Stel een standaardcurve vast door de gemiddelde OD-waarden uit te zetten tegen de standaardconcentraties met behulp van de Curve Expert-software.
- Bepaal de concentratie van elk monster door interpolatie van de standaardcurve met behulp van de OD-waarde.
16. Statistische analyse
- Gebruik de SPSS-software (versie 20.0).
- Importeer de dataset in SPSS Statistics en definieer variabelen op de juiste manier. Gebruik Analyze > Descriptive Statistics> Explore om het gemiddelde en de standaarddeviatie (SD) te berekenen.
- Gebruik Analyze > Compare Means > One-Way ANOVA voor vergelijkingen met meerdere groepen.
- Verkrijg p-waarden direct uit de testoutputtabellen en rapporteer deze dienovereenkomstig.
- Presenteer alle resultaten als gemiddelde ± SD en beschouw verschillen die statistisch significant zijn wanneer p < 0,05.