Eenstaps overlappende PCR voor snelle synthese van single-guide RNA-DNA-sjablonen voor het CRISPR-systeem

Yao Yao; Jia Li; Lili Duan; Jun Chen; Guoqing Li; Zheng Hu

doi:10.3791/70369

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Eenstaps overlappende PCR voor snelle synthese van single-guide RNA-DNA-sjablonen voor het CRISPR-systeem

221 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70369

⸱

24 april 2026

Yao Yao¹^,² , Jia Li² , Lili Duan² , Jun Chen² , Guoqing Li¹^,³ , Zheng Hu¹^,²

¹Institute of Cytology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China, ²Translational Medicine Institute, the First People's Hospital of Chenzhou, Hengyang Medical School, University of South China, ³National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention & Ministry of Education Key Lab of Rare Pediatric Diseases, Institute of Cell Biology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China

In dit artikel

Samenvatting

Een eenstaps overlappende PCR-methode met vier primers maakt snelle, goedkope generatie van DNA-sjablonen voor in vitro sgRNA-transcriptie mogelijk. Een geoptimaliseerde primerverhouding (50:5:1:50) levert binnen 5 uur hoogwaardige sgRNA's op, met functionele validatie aangetoond via in vitro assays en bewerkingsactiviteit in HEK293T cellen.

Samenvatting

Het CRISPR–Cas-systeem heeft genoombewerking gerevolutioneerd; conventionele methoden voor het genereren van single-guide RNA (sgRNA) omvatten echter vaak tijdrovende kloonstappen of dure commerciële synthesekits. Een geoptimaliseerde éénstaps overlappende PCR-strategie wordt gepresenteerd voor de snelle, kosteneffectieve synthese van DNA-sjablonen voor in vitro sgRNA-transcriptie. Met behulp van vier gedeeltelijk overlappende primers die de T7-promotor, doelspecifieke gidssequentie en sgRNA-scaffold bespannen, worden volledige templates in één enkele PCR-reactie samengesteld zonder klonen. Systematische experimentele optimalisatie stelde een optimale primerverhouding vast (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50), waarbij niet-specifieke bijproducten werden geminimaliseerd en de volledige productopbrengst gemaximaliseerd, zoals bevestigd door agarosegelelektroforese. Deze benadering werd met succes uitgebreid om templates te genereren voor Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9) sgRNA, waarmee cross-systeem toepasbaarheid werd aangetoond buiten Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9). Hoewel directe chemische synthese van sgRNA's voordelen biedt zoals hoge zuiverheid, chemische modificaties om de stabiliteit te verbeteren en minder off-target effecten, blijft het onbetaalbaar voor toepassingen met hoge doorvoer of grootschalige screens die talrijke sgRNA's vereisen. In vitro spleetassays toonden aan dat gids-RNA's die met deze methode worden gegenereerd, bewerkingsefficiënties bereiken vergelijkbaar met die verkregen via conventionele plasmide-gebaseerde klonen. Bovendien resulteerden ribonucleoproteïnecomplexen die met deze sgRNA's werden samengesteld en via elektroporatie in HEK293T cellen werden afgeleverd, tot detecteerbare delvorming bij het doellocus, wat de functionaliteit in vivo bevestigt. Kostenanalyse geeft aan dat deze methode de kosten voor templatevoorbereiding aanzienlijk verlaagt vergeleken met commerciële synthesekits, terwijl de doorlooptijd van dagen naar uren wordt verkort, waardoor een toegankelijke en schaalbare aanpak wordt geboden voor laboratoria die zich bezighouden met genetisch onderzoek.

Inleiding

Het CRISPR–Cas-systeem, afgeleid van een adaptief immuunmechanisme in bacteriën en archaea, heeft genetische engineering gerevolutioneerd door precieze genoombewerking mogelijk te maken over diverse organismen ^1,2. Een belangrijk onderdeel is het single-guide RNA (sgRNA), een chimerisch RNA dat Cas-nucleasen naar specifieke genomische loci leidt; het modulaire ontwerp maakt retargeting mogelijk door aanpassing van een ongeveer 20-nucleotide protospacersequentie³. Naast SpCas9 zijn andere Cas-nucleasen met verschillende eigenschappen breed toegepast. Sta....