Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Eenstaps overlappende PCR voor snelle synthese van single-guide RNA-DNA-sjablonen voor het CRISPR-systeem

194 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70369

⸱

24 april 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cytology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China, 2Translational Medicine Institute, the First People's Hospital of Chenzhou, Hengyang Medical School, University of South China, 3National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention & Ministry of Education Key Lab of Rare Pediatric Diseases, Institute of Cell Biology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China

In dit artikel

Samenvatting

Een eenstaps overlappende PCR-methode met vier primers maakt snelle, goedkope generatie van DNA-sjablonen voor in vitro sgRNA-transcriptie mogelijk. Een geoptimaliseerde primerverhouding (50:5:1:50) levert binnen 5 uur hoogwaardige sgRNA's op, met functionele validatie aangetoond via in vitro assays en bewerkingsactiviteit in HEK293T cellen.

Samenvatting

Het CRISPR–Cas-systeem heeft genoombewerking gerevolutioneerd; conventionele methoden voor het genereren van single-guide RNA (sgRNA) omvatten echter vaak tijdrovende kloonstappen of dure commerciële synthesekits. Een geoptimaliseerde éénstaps overlappende PCR-strategie wordt gepresenteerd voor de snelle, kosteneffectieve synthese van DNA-sjablonen voor in vitro sgRNA-transcriptie. Met behulp van vier gedeeltelijk overlappende primers die de T7-promotor, doelspecifieke gidssequentie en sgRNA-scaffold bespannen, worden volledige templates in één enkele PCR-reactie samengesteld zonder klonen. Systematische experimentele optimalisatie stelde een optimale primerverhouding vast (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50), waarbij niet-specifieke bijproducten werden geminimaliseerd en de volledige productopbrengst gemaximaliseerd, zoals bevestigd door agarosegelelektroforese. Deze benadering werd met succes uitgebreid om templates te genereren voor Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9) sgRNA, waarmee cross-systeem toepasbaarheid werd aangetoond buiten Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9). Hoewel directe chemische synthese van sgRNA's voordelen biedt zoals hoge zuiverheid, chemische modificaties om de stabiliteit te verbeteren en minder off-target effecten, blijft het onbetaalbaar voor toepassingen met hoge doorvoer of grootschalige screens die talrijke sgRNA's vereisen. In vitro spleetassays toonden aan dat gids-RNA's die met deze methode worden gegenereerd, bewerkingsefficiënties bereiken vergelijkbaar met die verkregen via conventionele plasmide-gebaseerde klonen. Bovendien resulteerden ribonucleoproteïnecomplexen die met deze sgRNA's werden samengesteld en via elektroporatie in HEK293T cellen werden afgeleverd, tot detecteerbare delvorming bij het doellocus, wat de functionaliteit in vivo bevestigt. Kostenanalyse geeft aan dat deze methode de kosten voor templatevoorbereiding aanzienlijk verlaagt vergeleken met commerciële synthesekits, terwijl de doorlooptijd van dagen naar uren wordt verkort, waardoor een toegankelijke en schaalbare aanpak wordt geboden voor laboratoria die zich bezighouden met genetisch onderzoek.

Inleiding

Het CRISPR–Cas-systeem, afgeleid van een adaptief immuunmechanisme in bacteriën en archaea, heeft genetische engineering gerevolutioneerd door precieze genoombewerking mogelijk te maken over diverse organismen 1,2. Een belangrijk onderdeel is het single-guide RNA (sgRNA), een chimerisch RNA dat Cas-nucleasen naar specifieke genomische loci leidt; het modulaire ontwerp maakt retargeting mogelijk door aanpassing van een ongeveer 20-nucleotide protospacersequentie3. Naast SpCas9 zijn andere Cas-nucleasen met verschillende eigenschappen breed toegepast. Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9) is kleiner, wat de levering van adeno-geassocieerd virus (AAV) faciliteert en daarmee de afgiftemogelijkheden uitbreidt4. Elk systeem vereist specifieke gids-RNA-architecturen, waardoor een veelzijdige synthesemethode zeer wenselijk is3.

Traditionele methoden voor het genereren van functionele gids-RNA's zijn plasmide-gebaseerd klonen, commerciële sgRNA-synthesekits of directe commerciële synthese van sgRNA's 5,6. Plasmide-gebaseerd klonen vereist meerdere arbeidsintensieve stappen—restrictie-verteiering, ligatie, transformatie en koloniescreening—en duurt doorgaans meer dan 48 uur 2,4,6. Commerciële sgRNA-kits, hoewel ze een gestroomlijnde workflow bieden (<5 uur), blijven onbetaalbaar duur voor toepassingen met hoge doorvoer, doorgaans met een prijs van $35–$45 per reactie. Directe chemische synthese van sgRNA's biedt voordelen zoals hoge zuiverheid, chemische modificaties om de stabiliteit te verbeteren, en verminderde off-target effecten7; het is echter onbetaalbaar (meestal $200–$280 per SGRNA) voor toepassingen met hoge doorvoer of grootschalige screens die honderden SGRNA's vereisen.

Daarentegen voltooit de hier beschreven eenstaps-overlappende PCR-methode de template-synthese in minder dan 5 uur met standaardprimers tegen een kostprijs van ongeveer $5–8 per sgRNA, wat een aanzienlijke vermindering van zowel tijd als materiaalkosten betekent. Bovendien bereiken sgRNA's die met deze methode worden geproduceerd bewerkingsefficiënties vergelijkbaar met die van plasmide-gebaseerd klonen, zoals bevestigd door in vitro splitsingsassays. Een vergelijking van deze benaderingen is geïllustreerd in Figuur 1.

Overlap extensie PCR (OE-PCR) biedt een snelle, ligase-onafhankelijke strategie voor het samenstellen van DNA-fragmenten8. Deze benadering is aangepast voor sgRNA-sjabloonsynthese met behulp van overlappende primers. In een eenstapsreactie met vier gedeeltelijk overlappende primers vindt competitieve binding plaats: de buitenste primers (AF1 en Tracr-R) definiëren de amplificatiegrenzen, terwijl de binnenste primers (AF2 en AF3) verdund moeten worden om een ordelijke extensie van beide uiteinden naar het centrum te garanderen. Ondanks dit theoretische kader is een cruciale parameter die de assemblage-efficiëntie beïnvloedt – de optimale primerverhouding – niet systematisch onderzocht. Bovendien blijft de bredere toepasbaarheid van dergelijke OE-PCR-methoden op verschillende CRISPR-systemen onderbelicht.

Om deze beperkingen aan te pakken, werd een studie ontworpen om een eenstaps overlappende PCR-methode voor sgRNA-sjabloonsynthese te optimaliseren en te valideren. De optimale primerverhouding werd vastgesteld via een gestructureerd experimenteel ontwerp, waarbij agarosegelelektroforese werd gebruikt om condities te identificeren die resulteerden in één enkel, correct gedimensioneerd product. Na optimalisatie werd de veelzijdigheid van de methode geëvalueerd over twee veelgebruikte CRISPR-systemen (SpCas9 en saCas9), met succesvolle amplificatie van beide templates. Functionele validatie met behulp van in vitro splitsingsassays toonde aan dat sgRNA's die met deze methode werden gegenereerd efficiënties bereiken vergelijkbaar met die verkregen via plasmide-gebaseerde klonering.

Om de functionaliteit in een cellulaire context verder te beoordelen, werd SpCas9 sgRNA gecomplex met Cas9-eiwit om ribonucleoproteïne (RNP) complexen te vormen en via elektroporatie in HEK293T cellen afgeleverd. Genoombewerking op een endogene locus werd geëvalueerd met behulp van een T7 Endonuclease I (T7EI) assay, waarbij splijtingspatronen op agarosegels duiden op detecteerbare indelvorming in vivo. Gezamenlijk tonen deze bevindingen aan dat deze methode betrouwbaar hoogwaardige, functionele sgRNA-sjablonen produceert. Het volgende protocol beschrijft de gedetailleerde procedure met SpCas9 als representatief voorbeeld, met primertemplates die zijn voorzien voor aanpassing aan andere Cas-nucleasen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het gebruik van de commercieel verkrijgbare HEK293T cellijn (ATCC CRL-3216) werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Ethisch Comité van het First People's Hospital of Chenzhou City, University of South China voor het gebruik van menselijk afgeleide cellijnen. De gebruikte reagentia, software en apparatuur zijn vermeld in de Materiaallijst.

1. Ontwerp van sgRNA-doelsequenties

  1. Identificeer het doelgenomische gebied met behulp van gevestigde online tools (bijv. CRISPRscan, CHOPCHOP of Broad Institute CRISPick)3.
  2. Toegang tot de CHOPCHOP-webserver op https://chopchop.cbu.uib.no/ 3,9.
  3. Voer de informatie van het doelgenen in en selecteer het juiste CRISPR/Cas-systeem (bijv. EGFR voor CRISPR/Cas9) (Figuur 2A).
  4. Bekijk de outputtabel, inclusief rang, doelsequentie, genomische locatie, streng, GC-inhoud (%), zelfcomplementariteit, voorspelde off-target locaties (MM0, MM1, MM2, MM3) en efficiëntiescore (Figuur 2B).
  5. Selecteer een geleidelijke RNA-sequentie met een hoge on-target efficiëntie en lage voorspelde off-target activiteit.
  6. Registreer de definitieve sgRNA-doelsequentie voor primerontwerp (bijv. EGFR-doelsequentie: "CTTAATTCCTTGATAGCGACGG") (Figuur 2B).

2. Synthese en voorbereiding van vier overlappende primers

  1. Ontwerp vier oligonucleotide primers (AF1, AF2, AF3, Tracr-R) met overlappende gebieden als volgt (Figuur 3A):
    AF1: 5′–TTCTAATACGACTCACTATAG
    [doelwit-seq] GTTTTAGAGCTAGAAATAG–3′
    AF2: 5′–GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT
    TAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC–3′
    AF3: 5′–GGCTAGTCCGTTATCAACTTG
    AAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTT–3′
    Tracr-R: 5′–AAAAAAAGCACCGACTCGTGCCAC–3′
    OPMERKING: Vervang [target seq] in de AF1-primer door de sequentie verkregen in stap 1.6.
  2. Synthetiseer primers op een schaal van 25 nmol met standaard ontzoutingszuivering.
  3. Suspendeer gedroogde primers opnieuw in nucleasevrij water tot een voorraadconcentratie van 100 μM. Centrifugeer op 5000 × g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.

3. Optimalisatie van primerconcentratie en éénstaps overlappende PCR voor sgRNA-sjabloonsynthese

  1. Bereid primermengsels met variërende AF2- en AF3-concentraties voor volgens Tabel 1. Houd AF1 en Tracr-R op 10 μM.
  2. Bereid PCR-reacties voor in 0,2 mL nucleasevrije buizen volgens Tabel 2. Gebruik een high-fidelity DNA-polymerase.
  3. Meng voorzichtig door vijf keer te pipetteren. Niet vortexen. Centrifugeer op 5000 × g gedurende 1 minuut.
  4. Voer PCR uit met de cyclische condities beschreven in Tabel 3.

4. Elektroforese en terugwinning van DNA-sjablonen

  1. Bereid een 2% agarosegel door 2 g agarose op te lossen in 100 mL 1× TAE-buffer. Koel af tot 50–60 °C, voeg 5 μL nucleïnezuurkleuring toe en giet de gel.
  2. Laat de gel 30 minuten stollen bij kamertemperatuur.
  3. Laad 10 μL PCR-product gemengd met 2 μL 6× laadbuffer. Voeg een 100 bp DNA-ladder toe.
  4. Draai elektroforese op 100 V gedurende 30–40 minuten.
  5. Visualiseer onder UV-verlichting. Bevestig dat Voorwaarde 9 (AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:5:1:50) een enkele ~120 bp-band produceert (Figuur 4A).
  6. Gebruik geoptimaliseerde primerconcentraties: AF1 10 μM, AF2 1 μM, AF3 0,2 μM, Tracr-R 10 μM.
  7. Verwijder de doelband met een steriel scalpel. Beperk UV-blootstelling tot ≤30 seconden.
    OPMERKING: Bewaar gelplakjes tot 1 week op −20 °C of ga direct door.

5. Zuivering van DNA-sjablonen

  1. Zuiver DNA met een gelextractiekit volgens de instructies van de fabrikant10.
  2. Eluteer DNA in 20–30 μL voorverwarmd (60 °C) nucleasevrij water.
  3. Meet de DNA-concentratie. Typische opbrengst: 15–50 ng/μL; A260/A280: 1,8–2,0.
    OPMERKING: Bewaar gezuiverd DNA tot 1 jaar bij −20 °C.

6. In vitro transcriptie en zuivering van sgRNA

  1. Stel de transcriptiereactie samen met een T7 RNA-synthesekit (Tabel 4). Bereid op ijsvoor 11.
    OPMERKING: Gebruik materialen zonder RNase en ontsmet alle oppervlakken.
  2. Broeden uit bij 37 °C gedurende 16 uur.
  3. Voeg 1 μL DNase I toe en incubeer bij 37 °C gedurende 15 minuten.
  4. Zuiver sgRNA met een RNA-clean-up kit12.
  5. Elut in 30–50 μL nucleasevrij water.
  6. Kwantificeer sgRNA. Verwachte opbrengst: 700–900 ng/μL; A260/A280: 1,9–2,1.
    OPMERKING: Bewaar sgRNA tot 1 jaar op −80 °C.

7. In vitro splijtingstest om sgRNA-activiteit te verifiëren

  1. Bereid doel-DNA voor en zuiver dat. Pas de concentratie aan op 60 ng/μL13.
  2. Stel de splijtingsreactie samen (Tabel 5)—pre-incubeer zonder DNA bij 25 °C gedurende 30 minuten. Voeg een negatieve controle toe.
  3. Voeg 1 μL doel-DNA toe.
  4. Broeden op 37 °C gedurende 2 uur.
  5. Voeg 4 μL 6× laadbuffer toe om de reactie te stoppen.
  6. Voer producten uit op een 2% agarosegel op 100 V gedurende 30–40 minuten.
  7. Visualiseer onder UV-licht. Bevestig de splijting (bijv. 617 bp → 414 bp + 203 bp) (Figuur 4C).

8. Cellulaire validatie van sgRNA-geleide Cas9-bewerking

  1. Bereid het ribonucleoproteïne (RNP) complex voor door Cas9-eiwit en sgRNA te mengen in een molaire verhouding van 1:2. Combineer 10 μL Cas9 (4 mg/mL), 280 μL sgRNA (60 ng/μL) en 200 μL DMEM. Incubeer 15 minuten.
  2. Kweek HEK293T cellen tot ~80% confluentie. Oogst en pas aan op 3 × 10 à6 cellen per monster.
  3. Combineer het RNP-complex met de cellen en incubeer 10 minuten op kamertemperatuur.
  4. Overbrengen naar een 2 mm elektroporatiecuvet. Elektroporate bij 115 V, 4 ms, één puls (575 V/cm). Voeg onmiddellijk 10 mL volledig medium toe en breng het over in een 6-wellplaat.
  5. Incubeer bij 37 °C met 5%CO2 gedurende 48 uur.
  6. Haal genomisch DNA uit behandelde en controlecellen. Meet de concentratie.
    OPMERKING: Bewaar DNA tot 6 maanden bij −20 °C.
  7. Versterk de doellocus met PCR (Tabel 6 en Tabel 7).
    OPMERKING: Verwachte productgrootte: 617 basispunten voor EGFR.
  8. Controleer PCR-producten op een 2% agarosegel. Zuiver de juiste band en kwantificeer DNA.
  9. Voer heteroduplexvorming uit (Tabel 8 en Tabel 9).
  10. Voeg 1 μL T7 Endonuclease I toe en incubeer bij 37 °C gedurende 15 minuten. Inactiveer bij 85 °C gedurende 10 minuten.
  11. Voeg een laadbuffer toe en gebruik een agarosegel van 2%.
  12. Visualiseer onder UV-licht. Bevestig de vorming van de indelering (617 bp → 414 bp + 203 bp) (Figuur 4D).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Succesvolle toepassing van het éénstaps-overlappende PCR-protocol levert een enkele, scherpe DNA-band van de verwachte grootte op wanneer geanalyseerd met agarosegelelektroforese.

Suboptimale primerverhoudingen, vooral die met overmatige concentraties van binnenste primers (AF2 en AF3), resulteren in extra banden groter dan het verwachte product, wat wijst op niet-specifieke versterking of primer-dimeer vorming, samen met zwakke banden die overeenkomen met onv...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er wordt een gestroomlijnd, economisch protocol beschreven voor het synthetiseren van sgRNA-DNA-sjablonen via een eenstaps overlappende PCR-strategie. Deze methode elimineert de noodzaak voor plasmideconstructie en klonen, waardoor de voorbereidingstijd van de sjabloon wordt teruggebracht van enkele dagen tot ongeveer 5 uur. Een belangrijk aspect van deze aanpak is de systematische optimalisatie van de primerverhouding, vastgesteld op 50:5:1:50 (AF1:AF2:AF3:Tracr-R), overeenkome...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Health Research Project van de Provinciale Gezondheidscommissie van Hunan (subsidienummer W20243264), de Natural Science Foundation van de provincie Hunan (subsidienummer 2023JJ50368), het Key Research Project van het Departement van Onderwijs van de provincie Hunan (subsidienummer 24A0607) en het Innovatieve Teamproject van het First People's Hospital van Chenzhou (subsidienummer CX202103).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 bp DNA LadderTIANGENMD109DNA grootte marker voor elektroforese
2Taq Plus MasterMixCWBIOCW2849MPCR-amplificatiereagens
50 bp DNA LadderTIANGENMD108DNA grootte marker voor kleine fragmenten
6DNA loading bufferTIANGEN1109565Staal laden buffer voor elektroforese
Agarose Gel DNA Recovery KitTIANGENDP219DNA zuivering van agarose gel
Agarose I Thermo Scientific 17850Agarose gel bereiding
Broad Institute CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/publicsgRNA ontwerp tool
CentrifugeHENGNUO2-16RStaal centrifugatie
Certified Copper Fetal Bovine SerumUmedium, Beijing BioTopped Technology Co., Ltd3023ACelcultuur supplement
CH3CO2HShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA758682TAE bufferoplossing voorbereiding reagentia
CHOPCHOPhttps://chopchop.cbu.uib.no/sgRNA ontwerp tool
CO2 incubatorThermo Scientific51032874Zoogdiercelcultuur incubatie
CRISPRscanhttps://www.crisprscan.org/sgRNA ontwerp tool
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)KeyGEN BioTECHKGL1211-500Celcultuur medium
dsDNaseThermo Scientific EN0771Verwijdering van DNA template na transcriptie
ECM 830 Square Wave Electroporation SystemBTXECM830Elektroporatie van cellen
EDTA Na2BioSharpBS108TAE bufferoplossing voorbereiding reagentia
Electric thermostatic water bathSHANGHAI SUMSUNG LABORATORY INSTRUMENT CO.,LTDDKD8Temperatuurgestuurde incubatie
Electrophoresis Apparatus TrophoresisLIUYIDYCP-31BNAgarose gel elektroforese
Gel Imaging analysis systemShanghHai JiaPengZF-258Gel visualisatie en beeldvorming
GenCRISPR SpCas9GenScriptZ03624-GMP-2.5Cas9 nuclease voor genoombewerking
Genomic DNA extraction kitTIANGENYDP304Genoom DNA isolatie
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNEBE2040SIn vitro transcriptie van sgRNA
MiniAmp ThermocyclerThermo Scientific A37834PCR-amplificatie
NanoDrop 2000c SpectrophotometerThermo Scientific 2000cNucleïnezuur kwantificering
Nucleic acid stain (e.g., GeneRed)TIANGENRT211DNA visualisatie in agarose gel
PCR Using Q5 Quick-Load High-Fidelity 2X Master MixNEBM0578Hoge-fideliteit PCR-amplificatie
Primers (AF1, AF2, AF3, Tracr-R)GenScriptOligonucleotiden voor sgRNA template samenstelling
Tris-baseBioSharpBS083TAE bufferoplossing voorbereiding reagentia
VAHTS RNA Clean BeadsVAHTSN412-01RNA zuivering

Referenties

  1. Tamura, R., Kamiyama, D. CRISPR-Cas9-mediated knock-in approach to insert the GFP(11) tag into the genome of a human cell line. Methods Mol Biol. 2564, 185-201 (2023).
  2. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  3. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  4. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  5. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  6. Graf, R., Li, X., Chu, V. T., Rajewsky, K. sgRNA sequence motifs blocking efficient CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Cell Rep. 26 (5), 1098 (2019).
  7. Hendel, A., et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol. 33 (9), 985-989 (2015).
  8. Brunetti, L., et al. Highly efficient gene disruption of murine and human hematopoietic progenitor cells by CRISPR/Cas9. J Vis Exp. (134), e57278 (2018).
  9. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  10. Bien, H. . Qiagen QIAquick gel extraction kit (28704 and 28706), centrifuge processing. , (2015).
  11. MalagodaPathiranage, K., Banerjee, R., Martin, C. T. A new approach to RNA synthesis: immobilization of stably and functionally co-tethered promoter DNA and T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 52 (17), 10607-10618 (2024).
  12. Xiao, G., et al. Direct detection from sputum for drug-resistant Mycobacterium tuberculosis using a CRISPR-Cas14a-based approach. BMC Microbiol. 25 (1), 188 (2025).
  13. Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).
  14. Hu, Z., et al. Customized one-step preparation of sgRNA transcription templates via overlapping PCR using short primers and their application in vitro and in vivo gene editing. Cell Biosci. 9 (1), 25 (2019).
  15. Pan, C., et al. A new method to synthesize multiple gRNA libraries and functional mapping of mammalian H3K4me3 regions. Nucleic Acids Res. 51 (9), e52 (2023).
  16. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  17. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  18. Nageshwaran, S., et al. CRISPR guide RNA cloning for mammalian systems. J Vis Exp. (140), e57998 (2018).
  19. Basila, M., Kelley, M. L., Smith, A. V. B. Minimal 2'-O-methyl phosphorothioate linkage modification pattern of synthetic guide RNAs for increased stability and efficient CRISPR-Cas9 gene editing avoiding cellular toxicity. PLoS One. 12 (11), e0188593 (2017).
  20. Kratschmer, C., Levy, M. Effect of chemical modifications on aptamer stability in serum. Nucleic Acid Ther. 27 (6), 335-344 (2017).
  21. Maio, G., et al. Systematic optimization and modification of a DNA aptamer with 2'-O-methyl RNA analogues. ChemistrySelect. 2 (7), 2335-2340 (2017).
  22. Pasternak, A., et al. A chemical synthesis of LNA-2,6-diaminopurine riboside, and the influence of 2'-O-methyl-2,6-diaminopurine and LNA-2,6-diaminopurine ribosides on the thermodynamic properties of 2'-O-methyl RNA/RNA heteroduplexes. Nucleic Acids Res. 35 (12), 4055-4063 (2007).
  23. Shang, Z., et al. CRISPR/Cas12a with Universal crRNA for Indiscriminate Virus Detection. Molecules. 29 (24), 5842 (2024).
  24. Wang, Z., et al. crRNA scaffold remodeling controls CRISPR–Cas12a activity for enhanced performance. Nucleic Acids Res. 54 (5), 2310-2325 (2026).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

DNA matrijsynthesein vitro transcriptieprimeroptimalisatieagarosegelelektroforeseribonucleoprote necomplexelektroporatiegenoomredigering
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.