Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van enkele kernen uit het coronaire endarterectomieweefsel van coronaire bypass-transplantatiepatiënten

699 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70382

⸱

3 april 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biotechnology, Gujarat Biotechnology University, 2U. N. Mehta Institute of Cardiology and Research Centre

In dit artikel

Samenvatting

Weefselmonsters van de coronaire endarterectomie werden verwerkt om enkele kernen te isoleren met behulp van een geoptimaliseerd dissociatieprotocol. De integriteit van de geïsoleerde kernen werd gevalideerd via drie complementaire benaderingen: trypan blue exclusion kleuring om membraanintegriteit te beoordelen, DAPI-gebaseerde confocale microscopie om de kernmorfologie te bevestigen, en flowcytometrie om kernopbrengst en zuiverheid te kwantificeren.

Samenvatting

Atherosclerose is een chronische, progressieve ontstekingsaandoening die wordt gekenmerkt door de ophoping van plaque in de wanden van slagaders. Tijdens de progressie van plaquevorming worden bepaalde laesies instabiel, zogenaamde hoogrisicoplaques, en kunnen ze myocardinfarct (MI) veroorzaken. Een atherosclerotische plaque bestaat uit gladde spiercellen, endotheelcellen, immuuncellen, vetcellen en necrotische cellen, waarvan elk plaque kan ruptureren. Het is cruciaal om cellulaire heterogeniteit binnen atherosclerotische plaques te bestuderen om de mechanismen achter plaque-instabiliteit beter te begrijpen. We presenteren een gemakkelijk reproduceerbaar protocol voor het isoleren en valideren van kernen uit menselijk coronaire endarterectomieweefsel verkregen van patiënten die een coronaire bypassoperatie (CABG) ondergaan. Alle weefsels worden op nat ijs in het Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium bewaard om de cellulaire integriteit te behouden vóór oogsten. De weefselmonsters worden fijn gehakt en vervolgens voorzichtig verstoord met een microstamper in de lysisbuffer om cellen te lyseren en kernen vrij te geven. De geïsoleerde kernen worden vervolgens beoordeeld op integriteit en opbrengst met behulp van de trypan blue exclusion assay in een samengestelde omgekeerde microscoop. DAPI-kleuring maakt het mogelijk om intacte kernen te visualiseren met confocale microscopie, en flowcytometrie biedt fluorescentie-gebaseerde kwantificatie om de opbrengst van nucleaire isolatie te beoordelen en de nucleaire populatie te valideren. In tegenstelling tot traditionele isolatiemethoden via single-cell dissociatie, vermindert nucleaire isolatie de celstress en behoudt het de native transcriptomische omgeving, waardoor veranderingen in genexpressie worden voorkomen. De hoogwaardige nucleaire preparaat die via deze methode wordt verkregen, is compatibel met downstream toepassingen zoals single-nuclei RNA-sequencing (snRNA-seq).

Inleiding

Atherosclerotische hart- en vaatziekte (ASCVD) is de belangrijkste doodsoorzaak en invaliditeit ter wereld, en ondanks grote therapeutische vooruitgang blijft de last ervan onverminderd1. Atherosclerose is een chronische ontstekingsziekte van de arteriële wand, veroorzaakt door complexe en dynamische interacties tussen diverse celpopulaties die gezamenlijk de stille progressie van vroege subklinische ziekten naar levensveranderende cardiovasculaire (CV) gebeurtenissen orkestreren2.

In middelgrote en grote slagaders is de ophoping van cholesterolafzettingen in macrofagen een kenmerk van atherosclerose3. De atherosclerotische plaque bestaat uit vetzuren, cholesterol, ontstekingscellen, calcium, fibrine, gladde spiercellen, endotheelcellen en cellulair afval in het subendotheel4. Atherosclerotische plaques worden ingedeeld in twee typen: laag risico en hoog risico. Hoogrisicoplaques worden geïdentificeerd door hun neiging om een daaropvolgende cardiovasculaire gebeurtenis te veroorzaken, meestal via mechanismen zoals plaqueerosie of ruptuur5.

De kenmerken van hoogrisicoplaques omvatten grote lipidenkernen, meerdere ontstekingscellen, minder gladde spiercellen, een dunne vezelige kap, microcalcificatie, intraplaque bloeding, neo-vaten en een necrotische kern6. De detectie van hoogrisicoplaques wordt klinisch uitgevoerd met niet-invasieve en invasieve beeldvormingsmethoden, namelijk coronaire computertomografie angiografie (CCTA) en optische coherentietomografie (OCT), respectievelijk 7,8. Ondanks talrijke vooruitgang in cardiovasculaire beeldvorming blijft het lastig om de ruptuur van atherosclerotische plaque die myocardinfarct (MI) veroorzaakt te voorspellen, en het is niet altijd nuttig in klinische situaties9.

Ondanks decennia van onderzoek ontbreekt het ons nog steeds aan betrouwbare circulerende biomarkers die specifiek fenotypes van hoogrisicoplaques kunnen identificeren, wat een kritieke leemte ontstaat in onze klinische behandeling van atherosclerose. Dit onderstreept de noodzaak van moleculaire strategieën die deze plaques op een fundamenteler biologisch niveau kunnen karakteriseren, 7,10. In deze context hebben RNA-gebaseerde markers veel aandacht gekregen, omdat ze de ingewikkelde transcriptieactiviteit binnen het plaque-micro-milieu11 kunnen vastleggen. Recente ontwikkelingen in single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) zijn bijzonder krachtig gebleken, met een ongekende oplossing om individuele cellen binnen atherosclerotische plaques te profileren en verschillende celpopulaties, genexpressiepatronen en moleculaire routes te ontdekken die ten grondslag liggen aan plaquekwetsbaarheid12,13. Ondanks deze ontwikkelingen is er weinig kennis over de regulerende processen, interacties en functionele betekenis van de verschillende celtypen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van atherosclerose14.

Wanneer de atherosclerotische last ernstig en diffus is, wordt chirurgische revascularisatie de definitieve behandelstrategie. Coronaire endarterectomie (CE) is een chirurgische aanvulling op een coronaire bypassoperatie (CABG), waarbij atherosclerotische plaque mechanisch wordt verwijderd uit diffuus zieke kransslagaders om bypass-transplantatie mogelijk te maken en volledige myocardrevascularisatiete bereiken. Atherosclerotische plaques en endarterectomiemonsters zijn bijzonder uitdagend om mee te werken omdat ze overvloedig necrotisch weefsel, lipidenafzettingen, fibrine en verkalkingen bevatten. Wanneer deze weefsels worden afgebroken voor analyse, produceren ze aanzienlijke resten die filters en microfluidische systemen verstoppen, waardoor het isoleren van levensvatbare enkele cellen extreem moeilijk wordt17,18. Uit een studie van carotisplaque bleek zelfs dat levensvatbare cellen minder dan 1% van alle deeltjes uitmaakten na weefselverwerking; de rest was simpelweg plaquetteafval18.

Om deze uitdaging nog verder te verergeren, bestaan atherosclerotische plaques in een staat van chronische metabole en oxidatieve stress, waarbij cellen die apoptose, veroudering en andere degeneratieve processen ondergaan, celmembranen steeds fragieler en gevoeliger maken voor verstoring, waardoor het isoleren van levensvatbare individuele cellen extreem moeilijk is 18,19,20. De mechanische en enzymatische vertering die nodig is om monsters voor scRNA-seq voor te bereiden, beschadigt vaak deze al aangetaste cellen, waardoor de levensvatbaarheid verder afneemt en de celvangstsnelheden slecht zijn. Dit proces leidt er ook vaak tot selectief verlies van fragiele of zeldzame celpopulaties, wat aanzienlijke bias introduceert in zowel de transcriptomische data als de celtypen die in de uiteindelijke resultaten worden weergegeven. Dit probleem wordt nog duidelijker bij verkalkte of zwaar zieke plaques, waar de zware verwerkingsomstandigheden die nodig zijn om het weefsel af te breken extra schade aan de cellevensvatbaarheidveroorzaken 18,21,22.

Daarentegen blijft de kern structureel intact, zelfs onder deze ongunstige omstandigheden23. Dit komt voornamelijk door de nucleaire omhulsel, een dubbele lipide-dubbellaag versterkt door nucleaire lamins (Lamin A/C en Lamin B), die mechanische stijfheid en weerstand biedt tegen osmotische, enzymatische en fysieke spanningen die het plasmamembraan24,25 gemakkelijk verstoren. De nucleaire lamina behoudt ook de kernmorfologie, zelfs wanneer het omliggende cytoplasma ernstig is aangetast26. Dit maakt single-nucleus RNA-sequencing (snRNA-seq) een praktischer en betrouwbaarder alternatief voor single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) voor het profileren van atherosclerotisch weefsel27. Door transcriptie-informatie van intacte kernen te verzamelen in plaats van hele cellen, omzeilt snRNA-seq de beperkingen van slechte cellevensvatbaarheid en een hoog afvalgehalte, waardoor nauwkeurigere en uitgebreidere transcriptomische profilering van de plaque-microomgevingmogelijk is.

Daarom presenteren we in deze studie een geoptimaliseerd nuclei-isolatieprotocol dat specifiek is ontwikkeld voor coronaire endarterectomie, met niet-ionische detergent-gebaseerde lyse en empirisch aangepaste lyseduur op basis van de mate van weefselverkalking, om consequent hoogwaardige kernen te leveren met behouden structurele en RNA-integriteit, geschikt voor downstream snRNA-seq analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De huidige studie is uitgevoerd met goedkeuring en in overeenstemming met de richtlijnen van het Human Ethical Committee van het U.N. Mehta Institute of Cardiology and Research Centre (EC/Approval/26/Cardio/14/12/2024) en de Gujarat Biotechnology University (GBU_IHEC/2023/006). Geïnformeerde toestemming werd van alle deelnemers verkregen voorafgaand aan de monsterafname. De patiënten die een bypassoperatie met een coronaire endarterie-operatie ondergaan, werden geselecteerd voor de huidige studie. Na chirurgische verwijdering werd het weefsel van de endarterectomie onmiddellijk in een serumvrij RPMI-medium geplaatst, gehandhaafd op 4 °C, en binnen ongeveer 12 uur in een cryoviaal naar het laboratorium gebracht. Zie de Materiaaltabel voor details over alle materialen die in het volgende protocol worden gebruikt.

1. Kernisolatie

OPMERKING: Voer alle stappen uit op ijs en gebruik steriele materialen. Maak alle buffers vers klaar.

  1. Was het weefsel één of twee keer met serumvrij RPMI-medium om bloedvlekken en fragmenten te verwijderen. Met steriele pincet brengt u het weefsel over op een steriele petrischaal en registreert u het gewicht.
  2. Met een chirurgisch mes (nr. 10) snijdt u het weefsel in kleine stukjes ∼1 mm3 groot.
  3. Bereid 1 mL lysebuffer voor door 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 (met standaardoplossingen van 1 M per component), 0,1% (v/v) Nonidet P-40 te combineren in nucleasevrij water. Voeg de componenten achtereenvolgens toe in de volgende volgorde: eerst nucleasevrij water, daarna Tris-HCl, NaCl, MgCl₂ en NP-40 als laatste, om schuimvorming te voorkomen.
    OPMERKING: De lysisbuffer moet vers worden voorbereid op de dag van gebruik en altijd gekoeld op ijs worden gehouden. Niet bevriezen.
  4. Voeg gekoelde 1 mL lysebuffer toe aan het weefsel in een 5 mL microcentrifugebuis.
  5. Lys het weefsel op ijs met een microstoot door een zachte, consistente kracht uit te oefenen en de microstamper afwisselend met de klok mee en tegen de klok in te draaien. Ga ongeveer 30 minuten door met de lysis, zodat het monster gedurende de hele tijd koud blijft.
    OPMERKING: Lys het weefsel totdat het troebel wordt. Gebruik een 1000 μL tip om zachtjes te mengen door te pipetten.
  6. Filter de oplossing met een 100 μm poriegrootte zeef in een 15 mL centrifugebuis om vuil en weefselresten te verwijderen.
    OPMERKING: Het filtraat moet minder troebel lijken met zichtbaar puin dat op de zeef blijft zitten.
  7. Centrifugeer de kernen op 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C met behulp van een schuddelende emmerrotor.
    OPMERKING: Er moet een zichtbare pellet ontstaan aan de onderkant van de buis.
  8. Verwijder het supernatant met een pipettip met een gewone boring zonder de pellet te verstoren.
  9. Bereid de kernspoel- en opsussiebuffer voor door 1% bovine serumalbumine (BSA) (met 10% voorraadoplossing), 0,2 U/μL RNase-remmer (met 20 U/μL stockoplossing) te mengen in 1X Dulbecco's fosfaatbuffer-zoutoplossing (DPBS). Voeg de componenten achtereenvolgens toe in de volgende volgorde: eerst DPBS, dan BSA, en tenslotte RNase-remmer.
    OPMERKING: De buffer moet op de dag van gebruik vers worden voorbereid en altijd gekoeld op ijs worden gehouden. Niet bevriezen.
  10. Suspendeer de pellet opnieuw in de kernspoel en herophangingsbuffer. Koel de buffer op ijs voordat je het gebruikt.
  11. Beoordeel de efficiëntie van de lyse en de levensvatbaarheid van cellen door te kleuren met 5 μL trypanblauw en te tellen in een hemocytometer.
    OPMERKING: Als levensvatbare cellen nog aanwezig zijn, centrifugeer dan op 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, en herhaal dan secties 3-10.
  12. Filter de oplossing met een 30 μm poriegrootte zeef in een 15 mL centrifugebuis om vuil en klonten te verwijderen.
  13. Centrifugeer de kernen op 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C met behulp van een schuddelende emmerrotor.
  14. Verwijder het supernatant met een pipettip met een reguliere boring en suspendeer de pellet vervolgens opnieuw in 1 mL nuclei wash en resuspension buffer.

2. Karakterisering van geïsoleerde kernen

  1. Trypan blauwe kleuring om de integriteit van kernen te beoordelen.
    1. Neem 15 μL van de geïsoleerde kernsuspensatie in een 1,5 mL microcentrifugebuis.
    2. Voeg 5 μL trypanblauwe kleurstof toe (0,4% w/v) en meng voorzichtig door te pipetten.
    3. Incubeer 5 minuten op kamertemperatuur om een goede kleur te garanderen.
    4. Laad 10 μL van het gekleurde mengsel op een hemocytometer.
    5. Bekijk onder een samengestelde omgekeerde microscoop de morfologie en tel het aantal kernen.
  2. Flowcytometrie-analyse van enkele kernsuspensie
    1. Neem 1 mL geïsoleerde kernsuspensie en centrifugeer de kernsuspensie op 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C met een schandlerende emmerrotor.
    2. Verwijder het supernatant met een pipettip met een reguliere boring en suspendeer de pellet opnieuw in een 200 μL FACS-buffer (1x PBS en 1% BSA).
    3. Verdeel 200 μL geresuspendeerde kernen in twee aliquoten: houd 100 μL als ongekleurde controle en gebruik 100 μL als gekleurd monster.
    4. Voeg 1 μL 4', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) (1 mg/mL voorraad) toe aan het gekleurde monster om een uiteindelijke concentratie van 10 μg/mL te bereiken. Meng voorzichtig en incubeer 5 minuten in het donker op kamertemperatuur voordat je de flowcytometrische analyse begint.
    5. In de flowcytometer die voor deze studie wordt gebruikt, gebruik je de violette laser op 405 nm en detecteer je met 448/45 nm. Voer eerst het ongekleurde controlemonster uit en verkrijg minimaal 10.000 gebeurtenissen van de totale populatie.
    6. Stel de spanning in op 183 V voor voorwaartse verstrooiing (FSC), 300 V voor zijverspreiding (SSC) en 400 V voor V450 (DAPI-laser). Stel de drempel in op 10.000 voor FSC.
      OPMERKING: Alle instrumentspanningen en versterkingsinstellingen zijn constant over samples om consistentie te behouden.
    7. Plot voorste verstrooiingsgebied (FSC-A) versus voorwaartse verstrooiingshoogte (FSC-H) om singlets te onderscheiden van dubbelen en aggregaten. Teken een poort rond gebeurtenissen die een lineaire relatie tonen om alleen singletkernen te behouden.
    8. Genereer een bivariate plot van FSC-A versus zijverstrooiingsgebied (SSC-A). Pas een brede poort toe die de gehele verstrooiingspopulatie omvat, aangezien geïsoleerde kernen doorgaans een heterogeen verstrooiingsprofiel vertonen zonder duidelijke subpopulaties.
    9. Maak een 2D-dichtheidsdiagram (pseudokleur) van SSC-A versus Violet 450 nm-gebied (V450-A). Gebruik de ongekleurde controle om achtergrondfluorescentie te definiëren en de nauwkeurige plaatsing van de poort te sturen. Identificeer en gate de onderscheidende DAPI⁺-populatie die overeenkomt met intacte kernen.
      OPMERKING: Omdat een enkele fluorochroom (DAPI) wordt gebruikt, is fluorescentiecompensatie niet vereist.
  3. Beeldvorming van de geïsoleerde kernen met behulp van confocale microscopie
    1. Neem 50 μL kernsuspensie en voeg 1 μL DAPI (1 mg/mL) toe aan het gekleurde monster om een uiteindelijke concentratie van 10 μg/mL te bereiken, meng voorzichtig en incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker voorafgaand aan confocale beeldvorming.
    2. Monteer 5 μL gekleurde kernsuspensatie op een schoon glazen schuifstuk en bedek het met een dekmantel.
      OPMERKING: Vermijd fixatie om de kernmorfologie te behouden.
    3. Visualiseer de kernen met een omgekeerde confocale microscoop. Open de confocale microscoopsoftware en observeer eerst in een 10x helder veld, daarna schakel over naar 40x helder veld.
    4. Maakt confocale beelden met een laserscanning confocale microscoop uitgerust met een spectrale detector en objectieven PLAN APO λD 40X (NA 0.95, RI 1.0). Exciteer DAPI met een 405 nm laser en verzamel emissie tussen 429-474 nm.
    5. De beeldparameters waren als volgt:
      1. Detectormodus: Multi-kanaal (GaAsP)
      2. Scanner: Galvano unidirectioneel
      3. Scanmodus: Band
      4. Lijngemiddelde: 2X
      5. Resolutie: 1024 × 1024 pixels
      6. Wachttijd: 2,0 μs
      7. Gaatjesgrootte: 47,7 μm
      8. Laservermogen: 0,1-9,3% (afhankelijk van de veldintensiteit)
      9. Detectorversterking: 37,8-45,9%
      10. Zoom: 1.0X
      11. Kalibratie: 0,43-0,58 μm/pixel
    6. Verzamel alle beelden met de AX-camera met minimale crosstalk-modus onder identieke optische configuraties, en het perfect focus-systeem (PFS) moet actief zijn tijdens de beeldvorming om de z-plane stabiliteit te behouden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het menselijke weefsel van de coronaire endarterectomie werd verzameld van patiënten die een CABG-operatie ondergingen. Het weefsel werd gewogen en verwerkt voor kernisolatie, en verdere geïsoleerde kernen werden bevestigd door flowcytometrie en confocale microscopie (Figuur 1).

Trypanblauwe beoordeling van de kwaliteit van kernisolatie
Het weefsel dat in RPMI-medium werd gehouden, werd gewogen en mat 247,8 mg....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een geoptimaliseerde workflow voor de isolatie van kernen uit menselijk coronaire endarterectomieweefsel wordt beschreven in het huidige protocol. Het hier beschreven nucleaire isolatieprotocol is specifiek ontworpen om de kritieke beperkingen van het verkrijgen van levensvatbare, intacte cellen uit geavanceerde coronaire atherosclerotische plaques te overwinnen. In tegenstelling tot conventionele scRNA-seq-benaderingen die vertrouwen op strenge enzymatische vertering en mechanische diss...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflict om te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Indian Council of Medical Research (ICMR) (EM/Dev/SG/34/01106/2024) en door samenwerking met het U. N. Mehta Institute of Cardiology and Research Centre in Ahmedabad. Khushi Jani erkent de University Grant Commission (UGC) en de Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), regering van India, voor het toekennen van de gezamenlijke CSIR-UGC NET-kwalificatie (NTA Referentienummer: 241620143543).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 μm strainerMiltenyi Biotech 130-098-463
30 μm strainerMiltenyi Biotech 130-098-458
Bovine Serum AlbuminHiMediaTC546-25G
CentrifugeMPWNAhttps://mpw.pl/en/offer/mpw-352r
Compound MicroscopeNikonNA Nikon Eclipse Ts2 inverted microscope (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ts2)
Confocal Microscope NikonNANikon Ti2-E inverted confocal microscope (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series)
CoverslipsHiMediaBG011C
CRYOCHIL Wide Mouth Specimen VialTarsons883191
DAPISigmaD9542-5MG
DPBSGibco (Thermofischer)10010-023
Centrifuge Tube (15 mL)Tarsons546021
Flow cytometer BD Biosciences663029BD FACSLyric (3L12C Instrument CEIVD)
HemocytometerAxibioCCB 100
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)Tarsons500010C
Microcentrifuge Tube (5 mL)Tarsons500050
MgCl2SigmaM1028-100ML
Micro pestleTarsons160020
NaClSigmaS9888-500G
NP-40HiMediaMB143-100ML
Nuclease free waterGibco (Thermofischer)W4502-1L
RNase inhibitorSigma333540201
RPMI 1640Gibco (Thermofischer)11875093
Slide Riviera72910135
Tris-HClSigmaT2194-100ML
Trypan blue Sigma302643-25G
```

Referenties

  1. Roth, G. A., et al. Global burden of cardiovascular diseases and risk factors- 1990-2019. J. Am. Coll. Cardiol. 76 (25), 2982-3021 (2020).
  2. de Winther, M. P. J., et al. Translational opportunities of single-cell biology in atherosclerosis. Eur. Heart J. 44 (14), 1216-1230 (2023).
  3. Mohebbati, R., Momeni-Moghaddam, M. A. The role of red blood cells in cholesterol accumulation and atherosclerotic plaque instability: a perspective on atherosclerosis. Curr. Cardiol. Rev. 21 (5), (2025).
  4. Ajoolabady, A., et al. Inflammation in atherosclerosis: pathophysiology and mechanisms. Cell Death Dis. 15 (11), 817(2024).
  5. Dawson, L. P., Layland, J. High-risk coronary plaque features: a narrative review. Cardiol. Ther. 11 (3), 319-335 (2022).
  6. Tong, W., et al. Highly sensitive magnetic particle imaging of vulnerable atherosclerotic plaque with active myeloperoxidase-targeted nanoparticles. Theranostics. 12 (17), 7641-7641 (2022).
  7. Lu, G., et al. Coronary computed tomography angiography assessment of high-risk plaques in predicting acute coronary syndrome. Front. Cardiovasc. Med. 8, (2021).
  8. Kinoshita, D., et al. High-risk plaques on coronary computed tomography angiography. JACC Cardiovasc. Imaging. 17 (4), 382-391 (2024).
  9. Canu, M., et al. Non-invasive multimodality imaging of coronary vulnerable patient. Front. Cardiovasc. Med. 9, (2022).
  10. Liu, X., et al. Assessment of coronary computed tomography angiography-derived plaque features in the diagnosis of optical coherence tomography-defined vulnerable plaques. Quant. Imaging Med. Surg. 15 (3), 2029-2041 (2025).
  11. Chiorescu, R. M., et al. Vulnerable atherosclerotic plaque: is there a molecular signature. Int. J. Mol. Sci. 23 (21), 13638(2022).
  12. The applications of single-cell RNA sequencing in atherosclerotic disease. Front. Cardiovasc. Med. Slenders, L., Tessels, D. E., van der Laan, S. W., Pasterkamp, G., Mokry, M. 9, (2022).
  13. Adam, C. A., et al. Novel biomarkers of atherosclerotic vascular disease-latest insights in the research field. Int. J. Mol. Sci. 23 (9), 4998(2022).
  14. Ye, W., Chen, Z., Xia, Z., Li, D. Single-cell RNA sequencing in human atherosclerotic plaques reveals a novel smooth muscle cell subtype that possesses multi differentiation potential and shapes the microenvironment. Clin. Exp. Med. 25 (1), 251(2025).
  15. Kelly, J. J., et al. Coronary endarterectomy: analysis of the society of thoracic surgeons adult cardiac surgery database. Ann. Thorac. Surg. 114 (3), 667-674 (2022).
  16. Ghatanatti, R. Coronary endarterectomy: recent trends. J. Clin. DIAGNOSTIC Res. , (2017).
  17. Li, Y., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic cell populations and differential gene expression patterns in control and aneurysmal human aortic tissue. Circulation. 142 (14), 1374-1388 (2020).
  18. Alsaigh, T., Evans, D., Frankel, D., Torkamani, A. Decoding the transcriptome of calcified atherosclerotic plaque at single-cell resolution. Commun. Biol. 5 (1), 1084(2022).
  19. Iqbal, F., Lupieri, A., Aikawa, M., Aikawa, E. Harnessing single-cell RNA sequencing to better understand how diseased cells behave the way they do in cardiovascular disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 41 (2), 585-600 (2021).
  20. Ahmad, H., et al. Single cell RNA sequencing of haematopoietic cells in fresh and frozen human atheroma tissue. Cardiovasc. Res. 121 (3), 396-404 (2025).
  21. Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circ. Res. 127 (11), 1437-1455 (2020).
  22. Williams, J. W., et al. Single cell RNA sequencing in atherosclerosis research. Circ. Res. 126 (9), 1112-1126 (2020).
  23. Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. -A., Lee, H. -O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J. Pathol. Transl. Med. 57 (1), 52-59 (2023).
  24. Gruenbaum, Y., Foisner, R. Lamins: Nuclear intermediate filament proteins with fundamental functions in nuclear mechanics and genome regulation. Annu. Rev. Biochem. 84 (1), 131-164 (2015).
  25. Zwerger, M., Ho, C. Y., Lammerding, J. Nuclear mechanics in disease. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13 (1), 397-428 (2011).
  26. Dechat, T., et al. Nuclear lamins: major factors in the structural organization and function of the nucleus and chromatin. Genes Dev. 22 (7), 832-853 (2008).
  27. Oh, J. -M., et al. Comparison of cell type distribution between single-cell and single-nucleus RNA sequencing: enrichment of adherent cell types in single-nucleus RNA sequencing. Exp. Mol. Med. 54 (12), 2128-2134 (2022).
  28. Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nat. Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).
  29. Gulko, A., et al. Protocol for flow cytometry-assisted single-nucleus RNA sequencing of human and mouse adipose tissue with sample multiplexing. STAR Protoc. 5 (1), 102893(2024).
  30. Fernandez, D. M., et al. Single-cell immune landscape of human atherosclerotic plaques. Nat. Med. 25 (10), 1576-1588 (2019).
  31. Galvis, A. E., Fisher, H., Camerini, D. NP-40 fractionation and nucleic acid extraction in mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (20), (2017).
  32. Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nat. Med. 25 (8), 1280-1289 (2019).
  33. Pan, H., et al. Single-cell genomics reveals a novel cell state during smooth muscle cell phenotypic switching and potential therapeutic targets for atherosclerosis in mouse and human. Circulation. 142 (21), 2060-2075 (2020).
  34. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).
  35. Litviňuková, M., et al. Cells of the adult human heart. Nature. 588 (7838), 466-472 (2020).
  36. Hu, P., et al. Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts. Genes Dev. 32 (19-20), 1344-1357 (2018).
  37. Rani, U., et al. Evaluation of use of RPMI Medium to preserve cell morphology for pleural/peritoneal fluid cytology. J. Cytol. 39 (1), 26-29 (2022).
  38. Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends Cell Biol. 31 (11), 888-897 (2021).
  39. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat. Med. 26 (5), 792-802 (2020).
  40. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nat. Protoc. 11 (3), 499-524 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Atherosclerotische PlaqueProtocol voor Nucleaire IsolatieFlowcytometrieConfocale MicroscopieTrypanblauw KleuringDAPI KleuringSingle Nuclei RNA SequencingCellulaire Heterogeniteit
Isolatie van enkele kernen uit het coronaire endarterectomieweefsel van coronaire bypass-transplantatiepatiënten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.