Integratieve Multi-omics-analyse van Buti Huatan Tang bij chronische obstructieve longziekte

Samenvatting

Multi-omics profilering van Buti Huatan Tang (BTHTT) bij chronische obstructieve longziekte toont het potentieel om de metabole as van het IL-1R2/IL-1β-schildklierhormoon te moduleren. Dit werk biedt een kader voor verdere mechanistische validatie van de bioactieve componenten van BTHTT, en legt een basis voor toekomstige causale interventiestudies die nodig zijn om deze as te bevestigen.

Samenvatting

Deze studie maakte gebruik van een multi-omics en computationele biologie om het therapeutische potentieel van de Traditional Chinese Medicine (TCM)-formule Buti Huatan Tang (BTHTT) tegen chronische obstructieve longziekte (COPD) te onderzoeken. Significante fysiologische verbeteringen werden waargenomen in een rattenmodel na de interventie van BTHTT. Histologische analyse toonde een omkering van longpathologische schade aan, terwijl biochemische assays en transcriptomics de normalisatie van IL-1β - en IL-1R2-niveaus bevestigden. Daarnaast toonde metabole profilering aan dat BTHTT verstoringen in de T3- en T4-schildklierhormoonspiegels corrigeerde. Er werd een negatieve correlatie waargenomen tussen de IL-1β/IL-1R2-as en deze schildklierhormonen, wat aangeeft dat hun regulatie samenhangt met het therapeutische effect van de formule. Naast directe metingen identificeerden machine learning-algoritmen tien COPD-signatuurgenen uit klinische databases. Padverrijkingsanalyse suggereert dat BTHTT mogelijk werkt via cytokine-cytokine-receptorinteracties en schildklierhormoonsyntheseroutes. Bovendien zijn 283 componenten in vivo geïdentificeerd, maar verbindingen zoals tanshinon IIA en cryptotanshinon worden momenteel beschouwd als kandidaat-werkzame stoffen. Hun rol als primaire drivers wordt ondersteund door een model waarin ze stabiel binden aan IL-1R2; deze inferentie is gebaseerd op moleculaire docking en moleculaire dynamica (MD) simulaties in plaats van directe experimentele isolatie. Over het geheel genomen ondersteunen de gegevens een model waarin BTHTT een multi-target effect uitoefent op COPD door ontsteking en metabole homeostase te moduleren. Deze geïntegreerde benadering biedt een verfijnde wetenschappelijke basis voor de klinische toepassing van BTHTT en benadrukt specifieke routes voor toekomstige experimentele validatie.

Inleiding

Chronische obstructieve longziekte (COPD), een van de meest voorkomende luchtwegaandoeningen in de klinische praktijk, is wereldwijd de derde belangrijkste doodsoorzaak geworden vanwege het extreem hoge invaliditeitspercentage en terugkerende acute verergeringen¹. COPD was een belangrijke factor die leidde tot het verlies van arbeidscapaciteit in de bevolking en een scherpe stijging van de kosten voor gezinszorg, waarbij sociale en economische verliezen die van de meeste chronische ziekten ver overschrijden². In het "Healthy China Initiative 2030" is COPD genoemd als een belangrijke ziekte voor preventie en behandeling. Vanwege een onvolledig begrip van de mechanismen achter COPD bleef het gecombineerde gebruik van bronchodilatatoren en corticosteroïden de primaire behandeling. Hoewel deze aanpak relatief duidelijke verlichting van symptomen bood, kan het de progressieve achteruitgang van de longfunctie niet voorkomen. Bovendien verhoogt het langdurig gebruik van corticosteroïden onvermijdelijk de incidentie van bijwerkingen, wat de langetermijneffectiviteit van de geneesmiddelen en de tolerantie van de patiënten verder beïnvloedt^. Uit studies blijkt dat zelfs met drievoudige therapie 28%–31% van de patiënten nog steeds acute verergeringen of verergering van symptomen ervaart. Daarom blijft de ontwikkeling van effectieve geneesmiddelen voor COPD een belangrijk en primair onderwerp in het huidige COPD-onderzoek⁴.

Om aan deze behoeften te voldoen, zijn klassieke TCM-formules ontwikkeld zoals Buti Huatan Tang (BTHTT), Shengmai Yin en Bu Fei Tang. Onder hen was BTHTT vooral opmerkelijk vanwege de significante effecten in het versterken van de long, het verhogen van energie en het oplossen van slijm om hoest^te verlichten 5,6,7,8. BTHTT werd veel gebruikt in de klinische behandeling van COPD, niet alleen vanwege de opmerkelijke effectiviteit en minimale bijwerkingen, maar ook vanwege het potentieel om de progressieve achteruitgang van de longfunctie om te keren. Het had veelbelovend talent in klinische en sociale contexten en had het potentieel voor "secundaire ontwikkeling" als belangrijk geneesmiddel, met aanzienlijke wetenschappelijke en economische waarde⁽9,10,11,12^). Door het gebrek aan systematisch, langdurig wetenschappelijk onderzoek hebben studies over BTHTT over het algemeen te maken gehad met een onduidelijk begrip van de componenten en onbekende kerndoelen. In wezen was dit te wijten aan aanzienlijke tekortkomingen in onderzoek naar het hoofdmechanisme en de mogelijke therapeutische substantiebasis van BTHTT.

Als reactie op deze ^{eigenschap kan het} integreren van meerdere omics-technologieën zoals metabolomica en transcriptomics, evenals multi-algoritme miningmethoden, waarbij de focus ligt op de belangrijkste correlaties tussen karakteristieke sleutelgenen en belangrijke metabole routes in de^{micro-omgeving} van het lichaam, niet alleen de essentie van de behandeling onderzoeken, maar ook de synergetische effectiviteit van de actieve componenten evalueren. Er ligt bijzondere aandacht voor de as, zoals het schildklierhormoon, aangezien opnieuws onderzoek aantoont dat schildklierdysfunctie een veelvoorkomende comorbiditeit is bij COPD, vaak samenhangend met verhoogde systemische ontsteking en een verminderde ademhalingsfunctie. Het moduleren van deze as kan een nieuw pad zijn voor het herstellen van metabole homeostase bij longziekten^16,17.

Samenvattend hanteerde deze studie een drieledige benadering waarbij multi-omics-integratie werd gecombineerd met computationele biologie, gebaseerd op het uitgangspunt van syndroom- en formulecorrespondentie. Enerzijds maakte het gebruik van TCM-serumfarmacochemietechnieken om de in bloed gedragen componenten van BTHTT onder effectieve omstandigheden te identificeren. Aan de andere kant, met de focus op belangrijke kenmerkende genen van COPD, gebruikte het uitgebreide weefselmetabolomics om ziektebiomarkers te ontdekken van endogene kleine moleculen en om een nauwkeurige evaluatie van de algehele effecten van de formule te maken. Ondertussen identificeerde het in combinatie met multi-algoritme mining en transcriptomische identificatieanalyse de belangrijkste karakteristieke genen die door BTHTT onder effectieve omstandigheden werden gereguleerd en voerde het correlatieanalyse uit tussen de belangrijkste kenmerkende genen en belangrijke metabole routes. De potentiële therapeutische stofbasis werd gescreend met moleculaire docking en moleculaire dynamica-analyse.

Gebaseerd op ons multi-omics-kader en het farmacologische profiel van BTHTT, stelt deze studie de volgende testbare voorspellingen voor. Antiinflammatoire modulatie: BTHTT-interventie zal systemische en pulmonale ontstekingsmarkers aanzienlijk verminderen, specifiek door de expressie-as van IL-1β/IL-1R2 te normaliseren om weefselschade te beperken. Metabole herstel: BTHTT verandert signalen in de schildklierhormoonsyntheseroute, wat leidt tot een meetbare correctie van de T3/T4-niveaus en een daaropvolgende verbetering van de metabole toestand van de longmicro-omgeving. Metabole herstel: BTHTT verandert signalen in de schildklierhormoonsyntheseroute, wat leidt tot een meetbare correctie van T3/T4-niveaus en een daaropvolgende verbetering van de metabole toestand van het longmicro-omgeving.

Protocol

OPMERKING: De reagentia en de apparatuur die in deze studie zijn gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.

Klinische gegevensverzameling en preprocessing

Om de moleculaire signaturen van COPD te onderzoeken, werden transcriptomische datasets opgehaald uit de Gene Expression Omnibus (GEO) database. In totaal werden vijf datasets geselecteerd: GSE11784, GSE12472, GSE16972, GSE38974 en GSE222965. De ruwe data en platformannotatiebestanden werden gedownload voor probe-naar-gen-mapping. Wanneer meerdere probes zich richtten op één gen, bleef de maximale expressiewaarde behouden. De resulterende genexpressiematrices (rijen als genen, kolommen als monsters) werden samengevoegd tot één ontdekkingsdataset. Om rekening te houden met technische variaties tussen verschillende microarrayplatforms en studiecohorten, werd batch-effectcorrectie uitgevoerd met het ComBat-algoritme uit het sva R-pakket. De effectiviteit van de correctie werd gevalideerd via Principal Component Analysis (PCA)-plots. Na batchcorrectie werd de samengevoegde ontdekkingsdataset gebruikt voor differentiële analyse. Differentieel expressieve genen (DEGs) tussen COPD-patiënten en gezonde controles werden geïdentificeerd met behulp van het limma-pakket. De significantiedrempels werden vastgesteld op |logFC| ≥ 1 en p ≤ 0,05.

Om de meest robuuste karakteristieke genen te identificeren, werden drie onafhankelijke machine learning-algoritmen geïntegreerd. Om de betrouwbaarheid van de modellen te waarborgen en datalekken te voorkomen, werd het featureselectieproces waar van toepassing in de crossvalidatielussen geïntegreerd, en werd de discovery-dataset strikt gescheiden van de onafhankelijke validatiesets. Het LASSO-model werd toegepast op de DEG's met behulp van het glmnet-pakket. We gebruikten 10-voudige kruisvalidatie om de optimale strafparameter te bepalen. De optimale strafparameterwaarde die overeenkomt met de minimale kruisvalidatiefout werd geselecteerd als drempel om kernkenmerkegenen te identificeren. SVM werd gebruikt om genen te rangschikken op basis van hun discriminatievermogen. Er werd een 10-voudige kruisvalidatiestrategie geïmplementeerd om het punt van minimale generalisatiefout te identificeren, waarmee het optimale aantal karakteristieke genen werd bepaald. Het randomForest-pakket werd gebruikt om DEG's te rangschikken op basis van hun Mean Decrease Accuracy en Gini-index. Genen met de hoogste belangrijkheidsscores werden geselecteerd als ziektegerelateerde kenmerken.

De kruising van de kenmerken die door LASSO, SVM en randomForest zijn geïdentificeerd, werd gebruikt om de uiteindelijke kernkenmerkende genen te definiëren. De diagnostische prestaties van deze genen werden geëvalueerd met behulp van een Receiver Operating Characteristic (ROC) curve-analyse. Het Area Under the Curve (AUC) en de bijbehorende 95% betrouwbaarheidsintervallen (BI's) werden berekend met behulp van het pROC-pakket. Een gen werd beschouwd als een hoge diagnostische waarde als de AUC 0,70 >. Ten slotte werden de expressieniveaus en diagnostische nauwkeurigheid van deze genen verder gevalideerd in een onafhankelijke validatieset om de generaliseerbaarheid van de bevindingen te waarborgen.

Met behulp van PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) en drugbank (https://go.drugbank.com/) werden in totaal 12 specifieke geneesmiddelprofielen verkregen, zoals LABAs, LAMAs, SABAs, SAMAs, Fluticasononpropionaat, Budesonide, Beclomethason, Fluticason, Salmeterol, Umeclidinium, Vilanterol, Theofylline. De gecompileerde doelen werden gekalibreerd met behulp van de Uniprot-database (https://www.uniprot.org/), waarbij niet-menselijke genen werden verwijderd en ongeldige dubbele doelen werden verwijderd om gestandaardiseerde gennamen te verkrijgen. Door het trefwoord "chronische obstructieve longziekte", "COPD" in de GeneCards (https://www.genecards.org/), OMIM (https://www.omim.org/) en DisGENET (https://www.disgenet.org/) databases in te voeren, werden ziektegerelateerde doelen opgehaald. Alle doelen uit de drie databases werden samengevoegd in een Excel-bestand, dubbele genen werden verwijderd en de data werd gekalibreerd met behulp van de Uniprot-database om de uiteindelijke informatie over het ziektedoelgen te verkrijgen.

Ontwikkeling van machine learning-modellen

Een multi-algoritmisch machine learning-framework werd opgebouwd door sequentieel gebruik te maken van R-pakketten glmnet, e1071 en randomForest. Specifiek werd LASSO-regressie uitgevoerd voor strafgebaseerde dimensionaliteitsreductie, werd Support Vector Machine (SVM)-analyse gebruikt om validatiefouten te evalueren op basis van steekproefgroepering, en Random Forest werd gebruikt om kenmerken te filteren op basis van belangrijkheidsscores. Dit proces leverde bijbehorende diagnostische visualisaties op, waaronder kruisvalidatiecurves en genbelang-bubbelplotten. Na modelconstructie werd een Venn-diagramanalyse uitgevoerd op de gensets die door deze meerdere algoritmen werden geïdentificeerd om de overlappende "intersectie"-genen te extraheren, waardoor de betrouwbaarheid van de potentiële biomarkers werd verhoogd. De expressiematrix van deze doorsnede genen werd vervolgens geëxtraheerd om intergroepsexpressieverschillen te visualiseren via vioolplots. Ten slotte werden ROC-curves gegenereerd via iteratieve lussen voor elk gen om het Area Under the Curve (AUC) te berekenen, waarmee hun diagnostische waarde als kandidaat-biomarkers werd gevalideerd.

Inductie van diermodel

Het experimentele protocol werd goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Guizhou Medical University (2303411) en volgde de ARRIVE-richtlijnen en dierenwelzijnsvoorschriften. In totaal 72 mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten van SPF-kwaliteit (230 ± 20 g). Na 1 week adaptieve huisvesting onder standaardomstandigheden (25 ± 1 °C, 50 ± 5% luchtvochtigheid, 12 uur licht-donker cyclus) werden de ratten willekeurig verdeeld in de controlegroep (C-groep) (n = 24) en de modelgroep (M-groep) (n = 48).

De M-groep werd onderworpen aan dual-factor modellering: Intermitterende blootstelling aan sigarettenrook (9 weken, 6 dagen per week, 3 onderzoekswaardige sigaretten per dag, verdeeld over 2 sessies, 30 minuten per sessie) en intratracheale instillatie van LPS (200 μg per instillatie, eens om de week)^18,19. De C-groep ontving een gelijk volume normale zoutoplossing. Na succesvolle modellering werden de groepen willekeurig verdeeld in de M-groep (n = 12), de hoge dosis BTHTT-groep (H-groep) (hoog, 1× klinische dosis, n = 12) en de laag-dosis BTHTT-groep (L-groep) (laag, 1/2× klinische dosis, n = 12), met continue gavage-interventie gedurende 2 weken. De C- en M-groepen kregen synchroon gedestilleerd water.

Lichaamsgewicht en parameters voor spontane activiteit werden wekelijks geregistreerd. Aan het einde van modellering en behandeling werden longweefsel, serum en serum- en bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF) verzameld. De niveaus van ontstekingsmarkers (d.w.z. TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, OPN en MCP-1) werden gemeten met ELISA volgens de instructies van de kit. Er werden ook weefselpathologie- en multi-omics-analyses uitgevoerd.

Behandelingstoediening

Buti Huatan Tang (BTHTT) bestaat uit negen traditionele Chinese medicinale kruiden: Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. (Astragali Radix, 15 g), Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax (Pseudostellariae radix, 15 g), Cinnamomum cassia (L.) J. Presl (Cinnamomi Cortex, 15 g), Angelica sinensis (Oliv.) Diels (Angelicae Sinensis Radix, 10 g), Salvia miltiorrhiza Bge. (Salviae miltiorrhizae radix et rhizoma, 15 g), Perilla frutescens (L.) Britt. (Perillae Folium, 10 g), Raphanus sativus L. (Raphani Semen, 10 g), Lepidium apetalum Willd. (Descurainiae Semen, 10 g), en Mahonia fortunei (Lindl.) Fedde (Mahoniae Folium, 10 g). De kruidenmaterialen werden 30 minuten in water geweekt met 10 keer hun gezamenlijke gewicht en vervolgens 1 uur gedecocteerd. Het aftrek werd gefilterd en het filtraat werd verzameld en in drie gelijke porties verdeeld voor orale toediening.

Op basis van klinische veiligheid en werkzaamheid was de standaarddosis BTHTT voor volwassenen 1,57 g∙^kg-1∙^dag-1 volgens de klinische medicatierichtlijnen. Rekening houdend met de dosisconversiefactor voor ratten, die aangaf dat de standaard dosis van ratten 6,3× de menselijke standaarddosis was, was de overeenkomstige H-groep voor ratten ingesteld op 9,9 g∙kg-1∙dag-1, en de L-groep op de helft van deze dosis (4,95 g∙^kg-1∙^dag-1). Aangezien het uiteindelijke geconcentreerde volume van BTHTT 50 mL was, was het toegediende volume voor de H-groep bij ratten ongeveer 1,6 mL, en voor de L-groep ongeveer 0,8 mL. Het medicijn werd eenmaal per dag toegediend via orale gavage.

Weefsel- en BALF-verzameling

Bij de experimentele eindpunten (week 9 en week 11) werden ratten verdoofd via intraperitoneale injectie van 5% natriumpentobarbital (1 mL/100 g). Bloed werd verzameld uit de portader, liet het 30 minuten staan bij kamertemperatuur, en werd vervolgens 15 minuten gecentrifugeerd bij 13.000 × g bij 4 °C. Het supernatant werd opgeslagen bij -80 °C. Longweefsels werden snel ingevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij -80 °C. BALF werd verzameld door drie opeenvolgende lavages met koude PBS.

Analyse van transcriptomics

Totaal RNA werd uit longweefsel geëxtraheerd en kwaliteitsgecontroleerd met behulp van (A₂₆₀/A₂₈₀ > 1,8) (RIN ≥ 7,0). RNA-sequencingbibliotheken werden geconstrueerd: mRNA werd verrijkt met oligo(dT), gefragmenteerd en gebruikt om dubbelstrengs cDNA te synthetiseren, dat vervolgens werd geligeerd aan adapteroligonucleotiden en geamplificeerd door PCR. Bibliotheken werden gekwantificeerd en kwaliteitsgecontroleerd voordat ze werden gesequenced. Inclusief inspectie van inhoudsdistributie, FPKM-dichtheidsverdelingsanalyse van elk monster, en algehele kwaliteitsbeoordeling van RNA-seq²⁰.

Ruwe transcriptomics-gegevens die door het sequencingplatform werden gegenereerd, werden verwerkt met Perl-scripts om adaptersequenties en laagwaardige reads te verwijderen (reads met Q ≤ 25 bases die > 60% of N-rate > 5% uitmaken). Na dit filterproces werden schone reads verkregen. De schone reads werden afgestemd op het referentiegenoom met behulp van HISAT2, en genexpressieniveaus werden gekwantificeerd om FPKM-waarden te berekenen. Er werd een differentiële expressieanalyse uitgevoerd (met screeningscriteria van |log2FC| > 1 en p-adj < 0,05). De annotatie van transcriptiefactoren was gebaseerd op Animal TFDB of Pfam/DBD databases, waarbij gen-ID's en eiwitdomeininformatie²¹ werden overeengekomen.

Er werd een orthologe genmappingstrategie toegepast om methodologische nauwkeurigheid voor cross-species validatie te waarborgen. Deze strategie hield in dat orthologen in ratten werden teruggevonden voor kerngenen van mensen (bijv. SRPX2, IL-1R2, TFF3) met behulp van de NCBI HomoloGene en Ensembl BioMart databases. De selectie was beperkt tot genparen met een duidelijke "één-op-één" mapping relatie en hoge eiwitsequentie-identiteit. In gevallen waarin meerdere kandidaten aanwezig waren, werd voorkeur gegeven aan orthologe paren die door de HGNC waren gecertificeerd. Om een hoge detectieprecisie te waarborgen, werden specifieke RT-qPCR-primers ontworpen op basis van de mRNA-sequenties van de geïdentificeerde ratorthologen. Validatiecriteria werden gedefinieerd door consistentie in expressierichting en functionele verificatie. Consistentie in expressierichting: In een rook-geïnduceerd rat COPD-model toonde RT-qPCR aan dat de expressietrends van doelgenen in longweefsel van ratten volledig consistent waren met die waargenomen in menselijke GEO-klinische datasets. Genen met dezelfde polariteit van verandering tussen soorten werden beschouwd als conserveringsbiomarkers als ziekte-biomarkers. Pathologische verificatie: Na expressieconsistentie werd correlatieanalyse uitgevoerd om de betrokkenheid van deze genen in de pathologische evolutie van COPD te verifiëren.

Metabolomics-workflow

Longweefsel (20–50 mg) werd gehomogeniseerd in voorgekoeld methanol-acetonitril-water (2:2:1, v/v) en soniceerd in een ijsbad. Het homogenaat werd 13.000 × g gecentrifugeerd gedurende 20 minuten bij 4 °C. De supernatant werd vacuümgeconcentreerd, opnieuw opgelost in acetonitrilwater (1:1, v/v) en gefilterd door een membraan van 0,22 μm voor LC-MS-analyse²².

Chromatografische scheiding werd bereikt met behulp van een amide-gebaseerde UPLC-kolom (1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm). De kolomtemperatuur bleef op 25 °C gehandhaafd. De mobiele fase bestond uit (A) water met 25 mM ammoniumacetaat en 25 mM ammoniak, en (B) acetonitril. De debiet werd ingesteld op 0,5 mL/min en het injectievolume was 2 μL. Het gradiëntelusieprogramma was als volgt: 0–0,5 min, 95% B; 0,5–7 min, lineaire afname van B van 95% naar 65%; 7–8 min, lineaire afname van B van 65% naar 40%; 8–9 min, B bleef op 40%; 9–9,1 min, lineaire stijging van B van 40% naar 95%; 9,1–12 min, B bleef op 95%. Tijdens de gehele analyse werden de monsters op 4 °C in de autosampler gehoud. Om de stabiliteit van het systeem en de betrouwbaarheid van de experimentele gegevens te waarborgen, werden monsters in een willekeurige volgorde geanalyseerd, waarbij kwaliteitscontrolemonsters (QC) in de wachtrij werden geplaatst. Massaspectrometrie-analyse werd uitgevoerd met een ultra-high-performance vloeistofchromatografie (UHPLC) systeem gekoppeld aan een massaspectrometer. Monsters werden geïoniseerd met behulp van elektrospray-ionisatie (ESI) in zowel positieve als negatieve ionenmodi. ESI-bron- en MS-instellingen waren als volgt: vernevelaarsgas (Gas 1) werd ingesteld op 50, hulpgas (Gas 2) op 2, ionenbrontemperatuur op 350 °C, en sprayspanning (ISVF) op 3.500 V in positieve ionenmodus en 2.800 V in negatieve ionenmodus. Het massabereik voor MS1 werd ingesteld van 70 tot 1.200 Da, met een resolutie van 60.000 en een scanaccumulatietijd van 100 ms. Voor MS2 werd data-afhankelijke acquisitie (DDA) met getrapte botsingsenergie gebruikt. Het massabereik voor MS2 werd ook ingesteld van 70 tot 1.200 Da, met een resolutie van 60.000 en een scanaccumulatietijd van 100 ms. De dynamische uitsluitingstijd was ingesteld op 4 seconden.

Ruwe metabolomics-gegevens werden omgezet naar het mzXML-formaat en vervolgens verwerkt voor piekuitlijning, retentietijdcorrectie en piekoppervlakte-extractie. De workflow voor de gegevensvoorverwerking omvatte de volgende stappen: Ten eerste werden ionpieken met een ontbrekende snelheid > 50% verwijderd. Ten tweede werden de resterende ontbrekende waarden geïnimputeerd met behulp van het KNN-algoritme. Ten derde werden metabole kenmerken met een relatieve standaardafwijking (RSD) >50% weggelaten. De kwaliteit van de experimentele gegevens werd beoordeeld met behulp van principal component analysis (PCA) en clustering van QC-monsters. Vervolganalyses omvatten univariate statistieken (bijv. t-tests), multivariate statistieken (PLS-DA), differentiële metabolietscreening (VIP > 1 en p < 0,05) en KEGG-padverrijkingsanalyse (hypergeometrische test)^23,24.

Vaststelling van analytische methoden voor in vivo en in vitro componenten

Voorbereiding van BTHTT-monsters voor in vitro testen: BTHTT werd gewonnen door aftrek in water (2 x 30 min), geconcentreerd tot 1,1–1,2 g/mL, en vervolgens gevriesdroogd. Voor de analyse werd 600 μL van de vriesgedroogde poederoplossing gemengd met 400 μL methanol, opnieuw opgelost in 40% methanol en gecentrifugeerd om het supernatant op te vangen.

Voorbereiding van BTHTT-monsters voor in vivo testen: Serum werd gedeïnproteiniseerd door te mengen met methanol (1:1) en te precipiteren bij −20 °C gedurende 30 minuten, gevolgd door centrifugatie bij 20 minuten. Het supernatant werd vacuümgedroogd en opnieuw opgelost in 40% methanol om het uiteindelijke monster te verkrijgen. Voor de voorbereiding van blanco serum + BTHTT-monsters werd een passende hoeveelheid blanco serum vergiftigd met het in vitro BTHTT-supernatant, en de resterende stappen werden zoals beschreven uitgevoerd.

Monsters werden gescheiden met behulp van een UHPLC-systeem uitgerust met een omgekeerde fase UPLC-kolom (2,1 mm × 100 mm, 1,8 μm). De kolomtemperatuur bleef op 35 °C en de debiet werd ingesteld op 0,3 mL/min. De mobiele fase bestond uit (A) 0,1% mierenzuur in water en (B) 0,1% mierenzuur in acetonitril. De gradiëntelutie werd uitgevoerd zoals weergegeven in Tabel 1.

Een massaspectrometer werd gebruikt voor de verwerving van zowel MS1- als MS2-spectra. De massaspectrometer was gekoppeld aan het UHPLC-systeem en werkte zowel in positieve als negatieve ESI-modi. ESI-parameters waren als volgt: sprayspanning 3.800 V (ESI+) / 3500 V (ESI-), mantelgasdruk 45 arb, hulpgasdruk 20 arb, ionentransportbuistemperatuur 320 °C en verdampertemperatuur 350 °C. De detectiemodus was ingesteld op volledig scan-/data-afhankelijke MS2 (Full-MS/dd-MS2) met resoluties van 60.000 voor MS1 en 15.000 voor MS2. De top 10 MS1-ionen werden geselecteerd voor MS/MS-fragmentatie met getrapte genormaliseerde botsingsenergieën van 20, 40 en 60. Het massabereik voor MS1 werd vastgesteld van 90 tot 1.300 Da.

Voor in vivo analyse, inclusief blanco groepsmonsters, gedoseerde groepsmonsters en blanco groep + BTHTT-monsters, werd 6 μL van elk monster nauwkeurig geïnjecteerd. Voor de in vitro-analyse van BTHTT werd 2 μL van het monster geïnjecteerd. Elke batch blanco en gedoseerde groepmonsters werd één keer geïnjecteerd, terwijl de blanco groep + BTHTT-monsters in drievoud werden geïnjecteerd en de BTHTT-monsters in vijfdelige exemplaren.

Gegevens in het mzXML-formaat werden verwerkt en verbindingen werden geïdentificeerd op basis van een lokale commerciële TCM-massaspectrometriedatabase met hoge resolutie. De criteria voor identificatie werden als volgt vastgesteld: een massafout van <25 ppm voor MS1 en een matchscore > 0,7 voor MS2 (waarbij de score de gelijkenis van fragmentionen weerspiegelde, met ≥0,7 als betrouwbare drempel)^25,26. De statistische analyse omvatte het tellen en classificeren van verbindingen (bijv. flavonoïden, alkaloïden), die werden uitgevoerd in combinatie met annotaties uit de massaspectrometriedatabase²⁷.

Moleculaire koppeling en MD-simulatie

Om mogelijke bindingsmodi tussen de geïdentificeerde karakteristieke eiwitten en hun bijbehorende liganden te onderzoeken, werd in silico moleculaire koppeling uitgevoerd. De driedimensionale structuren van de kleine moleculen werden opgehaald uit de PubChem-database en hun geometrische configuraties geoptimaliseerd. De kristalstructuren van de doeleiwitten zijn verkregen uit de RCSB Protein Data Bank (PDB). Met PyMOL werden watermoleculen en heteroatomen verwijderd en werden co-gekristalliseerde liganden geëxtraheerd om de coördinaten van de actieve plaatsen te definiëren. Waterstofatomen werden toegevoegd en Gasteiger-ladingen werden via software toegewezen. Docking-simulaties werden uitgevoerd, waarbij 15 onafhankelijke conformaties per run werden gegenereerd. De conformatie met de laagste bindingsenergie werd geselecteerd voor verdere analyse. Om de niet-covalente interacties rigoureus te karakteriseren, werden de receptor-ligandcomplexen geanalyseerd met behulp van de Protein-Ligand Interaction Profiler (PLIP). OPMERKING: Het is belangrijk te benadrukken dat deze koppelingsresultaten structurele ondersteuning bieden voor potentiële moleculaire interacties en dienen als basis voor verdere dynamische verfijning; ze vormen echter geen op zichzelf staand bewijs van biologische effectiviteit.

Om de stabiliteit en conformationele evolutie van de voorspelde eiwit-ligandencomplexen onder fysiologisch relevante omstandigheden te evalueren, werden moleculaire dynamica-simulaties uitgevoerd met behulp van het GROMACS-softwarepakket. Topologiebestanden voor zowel eiwitten als liganden werden gegenereerd op basis van het GROMOS96 43a1 krachtveld. Elk complex werd in het midden van een dodecaëdrische doos geplaatst, met een minimale afstand van 1,0 nm van de randen van de doos, en werd opgelost met behulp van het SPC-watermodel. Om elektrische neutraliteit te waarborgen, werden natrium- of chlorideionen aan het systeem toegevoegd indien nodig. Energieminimalisatie werd uitgevoerd met het steilste daalalgoritme totdat de maximale kracht minder was dan 1.000,0 kJ∙^mol-1∙^nm-1. Het systeem werd vervolgens in twee fasen in balans gebracht: eerst werd een NVT-ensemble gebruikt om het systeem te verwarmen tot 300 K over 100 pk met behulp van een V-rescale thermostaat; ten tweede werd een NPT-ensemble gebruikt om de druk te stabiliseren bij 1 bar boven 100 ps met behulp van een Parrinello-Rahman barostaat. Productiesimulaties werden uitgevoerd voor een totale duur van 10 ns met een tijdstap van 2 fs. Langeafstands-elektrostatische interacties werden berekend met de Particle Mesh Ewald (PME)-methode, terwijl korteafstands-van der Waals- en elektrostatische interacties werden beheerd met een cutoff-straal van 1,2 nm. Om de betrouwbaarheid van de simulaties te waarborgen, werden waar mogelijk drie onafhankelijke runs uitgevoerd. De stabiliteit van de complexen werd kwantitatief beoordeeld door de Root Mean Square Deviation (RMSD) en Root Mean Square Fluctuation (RMSF) van de eiwit-ruggraatatomen ten opzichte van de initiële structuur te berekenen. Het bereiken van een plateau in het RMSD-profiel werd gebruikt als het primaire criterium voor systeemevenwicht en structurele stabiliteit.

Algemene statistische analyse

In dit experiment werden groepsberekeningen uitgevoerd met behulp van t-tests of eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA).

Resultaten

Voorspelling van belangrijke karakteristieke genen bij COPD

Na batch-effectcorrectie van klinische gegevens van meerdere microarrayplatforms (Supplemental File 1–Supplemental Figure S1) werd een differentiële expressieanalyse uitgevoerd. Er werden 34 kandidaatgenen geïdentificeerd (32 opgereguleerd en 2 gedownreguleerd), waaronder SRPX2, CLDN10 en TFF3 (Figuur 1A...

Discussie

De synthese en het onderhoud van de schildklierhormoonspiegels zijn significant voor COPD-patiënten en gaan veel verder dan louter endocriene functie, en beïnvloeden de ziekteprogressie, voedingsstatus, longfunctie en de algehele prognose ^diepgaand. Vooral tijdens acute verergeringen vertoonden COPD-patiënten vaak een hypothyreoïdie-achtige toestand, aangeduid als het "low T3-syndroom". Er werd ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Acetonitrile (chromatographic-grade)	Merck, Duitsland	1499230-935
Agilent 4150 bioanalyzer	Agilent Technologies, VS
Ammoniumacetaat	SIGMA, Duitsland	SRE0035-20230321
Angelica sinensis (Oliv.) Diels (Angelicae Sinensis Radix),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240807
Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. (Astragali Radix),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240601
ChemOffice		software voor chemische structuurtekeningen en moleculaire modellering
Cinnamomum cassia (L.) J. Presl (Cinnamomi Cortex),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240901
Eppendorf Centrifuge 5430 R	Eppendorf, Duitsland
Experimentele sigaretten	Harbin Taihua, China	20230208
GraphPad Prism 8		software voor statistische analyse en grafisch weergeven
Huangshan sigaretten		onderzoekskwaliteit sigaretten voor rookblootstellingsexperimenten
IL-1β ELISA kit	Shanghai Enzyme-Linked Biotechnology, China	E-EL-R0012c-20230522
Illumina Novaseq 6000 sequencing platform	Illumina, VS
Lepidium apetalum Willd. (Descurainiae Semen)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240201
Lepidium sativum L. (Raphani Semen)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240301
Lipopolysaccharide (LPS)	Shandong Huino Pharmaceutical, China	20230315
Mahonia fortunei (Lindl.) Fedde (Folium Mahoniae)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240301
Methanol (chromatographic-grade)	Fisher, VS	DK745764
Nanodrop ND-2000 spectrofotometer	Thermo Scientific, VS
Perilla frutescens (L.) Britt. (Perillae Folium)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240510
Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax (Pseudostellariae Radix),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20250201
Qubit 4.0 fluorometer	Thermo Fisher Scientific, VS
RNA bibliotheekconstructie kit	ABclonal, VS	RK20301-20230415
SMINA		moleculaire docking software
Salvia miltiorrhiza Bge. (Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., China	20240902
Kleine dieren spontane activiteit recorder (KW-ZF)	Nanjing Karlvin Biotechnology, China
Natrium pentobarbital	Shanghai Experimental Reagent Procurement Company, China	20230412
TNF-α ELISA kit	Shanghai Enzyme-Linked Biotechnology, China	E-EL-R2856c-20230522
Traditionele Chinese geneeskunde MS-database (Shanghai Applied Protein Technology Co., Ltd.)		commerciële traditionele Chinese geneeskunde massaspectrometrie spectrale database
Trizol reagens	Magen, China	20230508
UPLC BEH Amide kolom		amide-gebaseerde UHPLC analytische kolom
UPLC HSS T3 kolom		omgekehrde fase UHPLC analytische kolom (T3-type)
Vanquish Neo UHPLC-Orbitrap Exploris 480 MS systeem	Thermo Scientific, VS
Vanquish UHPLC-Q-Exactive HF-X MS systeem	Thermo Scientific, VS