Generatie van tumororganoïde culturen uit de longadenocarcinoomcellijn

Samenvatting

Hier presenteren we een snelle, zuivere en kosteneffectieve methode voor het vestigen van tumororganoïden uit de A549-cellijn, geschikt voor voorlopige tests en educatieve doeleinden.

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van Cell Line-Derived Tumor Organoids (CDTO's) uit de A549 menselijke longadenocarcinoomcellijn. Het protocol omvat het inbedden van 2D-uitgebreide A549-cellen in Matrigel en het behouden ervan in een 3D-kweekmedium voor langdurige kweek. De aanbevolen zaaidichtheid van 500 cellen/μL werd vastgesteld als ondersteunend voor consistente organoïdevorming. De resulterende CDTO's werden gekarakteriseerd door hematoxyline- en eosine (H&E) kleuring en immunofluorescentie (IF). De organoïden handhaafden een hoge expressie van de longadenocarcinoommarkers Thyroid Transcription Factor 1 (TTF-1), adhesieproteïne E-Cadherin (ECAD) en cytoskeletproteïne Keratine 7 (KRT7). Bovendien toonde de expressie van tight junction protein Zona Occludens 1 (ZO-1) een gedysreguleerde polariteit van tumororganoïden. Dit protocol biedt een technisch eenvoudig, kosteneffectief en puur tumorus organoïde platform voor onderzoek naar longadenocarcinoom. De eenvoud en reproduceerbaarheid maken het ook geschikt voor laboratoriumonderwijs op bachelorniveau, waar het studenten kan helpen fundamentele 3D-tumororganoïdekweektechnieken binnen een beperkt labschema te verwerven.

Inleiding

Organoïden zijn in vitro. zelfgeorganiseerde driedimensionale (3D) structuren die afkomstig zijn van stamcellen en in^{aanzienlijke mate in} staat zijn de biologische complexiteit van echte organen te recapituleren. De cellen waaruit organoïden bestaan, kunnen afkomstig zijn van geïnduceerde pluripotente stamcellen of weefselafgeleide cellen, waarbij de laatste normale stam-/voorlopercellen, gedifferentieerde cellen en tumorcellen² omvatten. In vergelijking met traditionele tweedimensionale kweeksystemen en diermodellen kunnen organoïden de fysiologische eigenschappen van het menselijk lichaam nauwer nabootsen en tegelijkertijd meer experimentele flexibiliteit bieden. Daarom is organoïdetechnologie breed toegepast in geneesmiddelenontwikkeling³, gepersonaliseerde geneeskunde⁴ en ziektemodellering⁵.

Talrijke studies hebben organoïde modellen vastgesteld voor een breed spectrum van kankers, waaronder colorectale⁶, prostaat⁷, pancreatische⁸, maag⁹, hepatische¹⁰, gal¹¹, borst¹² en neuro-endocriene tumoren. Een van de grootste uitdagingen in het onderzoek naar tumororganoïden ligt echter in het behouden van zuiverheid. Zo toonde een studie naar niet-kleincellige longkanker aan dat slechts 17% van de gevestigde organoïden puur tumorus was, omdat tumormonsters vaak een mengsel bevatten van normale en kwaadaardige cellen die moeilijk volledig te scheiden zijn vóór kweek¹³. Dit onzuiverheidsprobleem kan leiden tot eliminatie van tumorcellen door uitgroei van niet-tumorcellen, interfereren met uitlezingen van geneesmiddelgevoeligheidstests en leiden tot onnauwkeurige moleculaire analyses, zoals RT-qPCR of Western blot, waarbij RNA's en eiwitten van tumorcellen worden verdund door oncontroleerbare hoeveelheden besmettende cellen.

Om dit probleem aan te pakken, hebben onderzoekers het ontwerp onderzocht van selectieve kweekmedia die de verminderde afhankelijkheid van tumorcellen van bepaalde groeifactoren benutten, waardoor normale celgroei wordt geremd en de groei van tumorcellen wordt bevorderd¹⁴. Daarnaast worden strategieën ontwikkeld zoals celsortering of monoklonale identificatie om pure tumororganoïden te construeren.

Dit protocol beschrijft de generatie van Celllijn-afgeleide Tumororganoïden (CDTO's) met behulp van de A549 menselijke longadenocarcinoomcellijn, waarvan is gerapporteerd dat deze gedeeltelijk kankerstamcelachtige eigenschappen vertoont, evenals een verhoogde clonogeniciteit, proliferatief potentieel en tumorigeniciteit in vitro.¹⁵. De resulterende CDTO's handhaafden de expressie van lijnspecifieke biomarkers Thyroid Transcription Factor 1 (TTF-1)¹⁶, adhesieproteïne E-Cadherin (ECAD)¹⁷ en cytoskeletproteïne Keratine 7 (KRT7)¹⁶ en vertoonden fysiologische kenmerken die kenmerkend zijn voor tumororganoïden. Dit model is eenvoudig op te zetten en bevat gedefinieerde kankercelcomponenten, waardoor het geschikt is voor onderzoekers die nieuw zijn in het tumororganoïdeveld of voor degenen die worden uitgedaagd door verlies van tumoridentiteit in primaire tumororganoïde-kweken. Potentiële toepassingen zijn onder andere voorlopige geneesmiddelgevoeligheidstests¹⁸, tumormicro-omgevingsstudies¹⁹ en educatieve training in 3D-kweektechnieken.

Protocol

De kamertemperatuur in het laboratorium is 22–24 °C en wordt RT genoemd. Het gebruik van een swing-bucket centrifuge wordt aanbevolen. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Oprichting van primaire A549-organoïden

1. Bereiding en A549-celoogst
   1. Bereid een schaal van 6 cm met A549-cellen op 70% confluentie. Voorwarmen TrypLE en PBS tot 37 °C. Bereken de celhoeveelheid en het matrigelvolume volgens het experimentele ontwerp en Tabel 1.
      1. Ontdooiing vereiste Matrigel-aliquots met redundantie voor ten minste twee putten die minstens 60 minuten op ijs stonden. Bereid polystyreen- en TC-behandelde platen voor zodat de koepels halfrond blijven.
      2. Vers bereid 2D medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium met 10% foetaal rundserum) en 3D medium (Human Lung Adenocarcinoma Organoid Medium). 3D-medium kan worden gegenereerd uit commerciële kits of, volgens het werk van Sachs, N. et al. uit Hans Clever's lab²⁰.
         OPMERKING: Eén schaal van 6 cm kan meestal ongeveer 5.000.000 cellen opleveren na de spijsvertering. Verminder het aantal inputcellen voor het experimentele ontwerp. Platen die zijn ontworpen voor confocale beeldvorming met een glazen bodem zijn niet geschikt voor Matrigel om een juiste 3D-vorm te vormen.
   2. Aspireer het gebruikte 2D-medium en was de cellen één keer met 1 mL PBS om het resterende serum te verwijderen. Aspireer PBS, voeg 1 mL vooropgewarmde TrypLE toe en incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 4 minuten.
   3. Bekijk de cellen onder een microscoop. Wanneer het cytoplasma zich terugtrekt en de cellen intercellulaire verbindingen verliezen, voeg je een gelijk volume (1 mL) vers 2D-medium toe om de enzymatische reactie te beëindigen.
   4. Pipetteer voorzichtig om de hechtende cellen los te maken en weer op te hangen van het kweekoppervlak. Breng de celsuspensie over in 1,5 mL centrifugebuizen en centrifugeer op 300 × g gedurende 3 minuten bij RT om de cellen te pelleten.
   5. Verwijder het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in 1 mL 2D-medium. Verdun 10 μL celsuspensie tot 100 μL en tel celnummers met een hemocytometer. Bereken het vereiste volume volgens stap 1.1.1 en aspireer naar een 1,5 mL centrifugebuis met voorgespoelde tips.
2. Het zaaien van geoogste cellen in Matrigel
   1. Bereid ijs en pipettentippen voor in de koelkast van -20 °C gedurende 1 minuut en gebruik indien mogelijk tips met weinig retentie. Zorg ervoor dat er geen kristallen in de Matrigel-aliquoten achterblijven en dat er geen belletjes ontstaan wanneer de punt in de oplossing komt.
   2. Centrifugeer de buis met oogstte cellen op 300 × g bij RT en gooi het supernatant weg. Zet de buis op ijs. Gebruik voorgekoelde pipettips om langzaam het benodigde volume Matrigel te aspireren en voeg dit toe aan de pellet op het ijs. Suspensie langzaam met alleen de eerste stop van de pipet op ijs. Laat het ijs niet langer dan 10 seconden liggen als observatie vereist is.
   3. Gebruik voorgekoelde pipetentips en houd het mengsel op ijs. Geef één aliquot van het mengsel in het midden van elke put. Trek de pipet langzaam terug tijdens het doseren, waarbij alleen de eerste stop wordt gebruikt om bubbelvorming te voorkomen.
      OPMERKING: Het mengsel moet in het midden een koepelvormige 3D-structuur vormen. Suss het mengsel opnieuw voordat je naar de volgende put gaat. Vermijd indien mogelijk het gebruik van de edge wells en voeg PBS toe aan deze wells.
   4. Incubeer de plaat bij 37 °C in een 5% CO₂-incubator gedurende 40 minuten om gelpolymerisatie mogelijk te maken. Nadat de matrigel is gestild, voeg je voorzichtig 3D-medium toe langs de putwand en ga je verder met cultiveren bij 37 °C.
      OPMERKING: Vermijd het genereren van belletjes tijdens het uitdienen. Als er bellen ontstaan, vermijd dan dat deel van het mengsel.
   5. Vervang tijdens de teelt het 3D-medium elke 3 dagen of wanneer een kleurverandering (van roze naar geel) wordt waargenomen. Onderzoek de groei van organoïden onder een omgekeerde microscoop bij elke mediumwissel en documenteer de morfologie fotografisch om de structurele ontwikkeling te monitoren.
      OPMERKING: Organoïden moeten dicht en gekrompen zijn met diameters langer dan 30 μm in plaats van uiteengevallen of gefragmenteerd zoals aangegeven door 5000 cellen/μL (Figuur 1D).

2. Fixatie, inbedding en sneden van organoïden

1. Bereid organoïde culturen voor op dag 6–9. Verwijder het kweekmedium van de celkweekplaat. Verwijder de organoïden voorzichtig door te pipetteren met 1 ml koude PBS en plaats ze in een 1,5 ml buisje dat vooraf is afgespoeld met 5% BSA om adhesie te voorkomen. Laat de organoïden zich natuurlijk door de zwaartekracht op ijs vestigen en verwijder voorzichtig het supernatant.
2. Voeg 1 ml koude PBS toe om de pellet opnieuw te laten ophangen. Laat de organoïden door de zwaartekracht minstens 5 minuten natuurlijk neerzetten en verwijder voorzichtig de supernatant. Als sommige organoïden niet kunnen afzinken, centrifugeer dan kort op 200 × g gedurende 1 minuut bij 4 °C om ze te verzamelen. Deze stap wordt meerdere keren uitgevoerd en wordt aangeduid als 'small wash'.
3. Voer de kleine wasbeurt twee keer uit om restanten van de Matrigel te verwijderen. Als er restmatrigel blijft zitten, voeg dan tijdens het wassen een laatste concentratie van 10 mM EDTA toe aan koude PBS.
   VOORZICHTIG: Breng de monsters over naar de dampkap. Voeg 4% paraformaldehyde (PFA) toe, voldoende om de organoïden te bedekken, en zet het 1 uur op ijs in een dampkap. Gooi het fixatiemiddel weg en voer de kleine wasbeurt twee keer uit. Ga verder met stap 4.1 voor IF-kleuring.
4. Nadat de organoïden op de bodem van de buis zijn neergedaald, gooi je het supernatant weg en verhit je de monsters voor in een 70–75 °C metalen bad gedurende 5 minuten om snelle agarose-stolling tijdens stap 2.7 te voorkomen.
5. Maak 3% (met v/v) agarose in 1× PBS en verwarm het mengsel in een magnetronbad tot het volledig opgelost en transparant is. Vermijd koken om volumeverlies of veranderingen in de agaroseconcentratie te voorkomen.
6. Snel de vaste organoïden opnieuw ophangen in 30–50 μL van 3% agarose, zodat een gelijkmatige verdeling wordt gegarandeerd, en koel af op ijs gedurende 20–30 minuten tot het is gestold, zodat er geen bubbels ontstaan.
7. Zodra het agarose-organoïde mengsel is gestold, verwijder je voorzichtig het agaroseblok uit de buis met een naald en plaats je het in een gelabelde weefsel-inbeddingcassette.
8. Dompel de cassette met het agaroseblok achtereenvolgens onder in gegradeerde ethanoloplossingen (30%, 50%, 70% [kan een nacht worden bewaard bij 4 °C], 80%, 90%, 95%, 100% en 100%) voor dehydratie. Bred elke stap uit op een schudplatform bij 20 toeren per minuut gedurende 30 minuten.
9. Smolt paraffinewasblokken vooraf in de oven voordat je ze gebruikt bij 65 °C. Breng de gedehydrateerde, met agarose ingebedde organoïden over in xyleen voor verwijdering. Dompel twee keer, elk 15–20 minuten, om de restanten van ethanol te verwijderen.
10. Breng de weefselcassettes achtereenvolgens over in paraffinebad 1 voor 45 minuten, en daarna in paraffinebad 2 voor nog eens 45 minuten.
11. Plaats de weefselcassettes en metalen mallen in de gesmolten paraffinekamer van het inbeddingstation. Verwijder het organoïde of weefselmonster uit de cassette en plaats het in het midden van de metalen mal. Plaats de mal op een koude plaat om de oriëntatie van het monster te fixeren.
12. Plaats de tissue cassette bovenop de metalen mal, vul met extra gesmolten paraffine en laat minstens 60 minuten afkoelen op de koude plaat. Zodra het paraffineblok volledig is gestold, verwijder je de metalen mal en bewaar je het met paraffine ingebedde organoïdeblok bij 4 °C tot het snijden.
13. Snijd de paraffine-beladen organoïde blokken door met behulp van een microtoom. Zorg ervoor dat de dikte van elke sectie uniform is om het latere kleuren en beeldvorming te vergemakkelijken.
14. Laat de gesneden secties drijven in een waterbad dat op 40 °C wordt gehouden om volledige uitzetting van de paraffinelinten mogelijk te maken. Zorg ervoor dat elk deel zich uitspreidt als een enkele, kreukvrije laag; Gooi alle gevouwen of overlappende delen weg.
15. Bevestig de uitgezet secties op zelfklevende microscoopglaasjes door de glaasje onder een lichte hoek onder de sectie te dompelen en verticaal op te tillen om het weefsel vast te leggen. Label de dia's met een potlood om de monsteridentificatie tijdens de verdere verwerking te behouden.

3. Hematoxyline- en eosinekleuring (H&E)

1. Bak de preparaten met weefsel of organoïde secties 1–2 uur in een oven van 60 °C om een goede hechting te garanderen en de resterende paraffine te verwijderen.
2. Dewax de secties achtereenvolgens door ze 15 minuten in xyleen I te dompelen, 15 minuten xyleen II, en vervolgens te rehydrateren door een gegradueerde ethanolreeks van 100%, 100%, 95%, 90%, 80% en 70%, elk gedurende 5 minuten. Spoel de slides daarna twee keer af in dubbel gedestilleerd water (ddH₂O), elk 5 minuten.
3. Kleur de secties 5 minuten met hematoxyline, spoel 1–2 minuten af met stromend kraanwater en differentieer daarna in 1% zuur alcohol gedurende 2 seconden. Was opnieuw 1–2 minuten in kraanwater, bleek de kernen 5 seconden in 1% ammoniakwater, gevolgd door een laatste spoeling in kraanwater gedurende 1–2 minuten.
4. Dehydrateer de secties door een gegradueerde ethanolserie van 70%, 80%, 90% en 95% elk gedurende 3 minuten, en kleur daarna met eosine in een alcoholgebaseerde eosine gedurende 10 minuten.
5. Spoel de stukken twee keer af in absolute ethanol, elk gedurende 5 minuten.
   OPMERKING: Voor alcoholhoudende eosine, zorg ervoor dat je tot 95% ethanol uitdroogt voordat je kleurt. Voor wateroplosbare eosine moet je eerst kleuren voordat je het dehydrateert.
6. Maak de secties leeg door ze twee keer in xyleen te dompelen, elk 5 minuten, en houd ze in xyleen tot je ze opzet.
7. Monteer de slides direct na het verwijderen van xyleen met een neutrale resin montagemedium, waarbij je luchtbellen zorgvuldig vermijdt.
8. Laat de gemonteerde glaasjes 30–60 minuten aan de lucht drogen bij RT, en observeer daarna onder een lichtmicroscoop.
   OPMERKING: Directe montage na het verwijderen van xyleen voorkomt oxidatie en zorgt voor optische helderheid.

4. Whole-mount immunofluorescentiekleuring

1. Ga verder vanaf stap 2.4. Voeg 1 ml blokkerings- en permeabilisatieoplossing (5% BSA + 0,3% Triton X-100) toe aan de pellet en incubeer bij RT gedurende 60 minuten of bij 4 °C als stoppunt voor 1–2 dagen.
2. Verdun primaire en secundaire antilichamen volgens de door de fabrikant aanbevolen verhouding in de blokkerings- en permeabilisatieoplossing. Was één keer en voeg 200 μL verdund primaire antilichamen toe aan de pellet. Incubeer 's nachts bij 4 °C.
3. Voer de kleine wash 3 keer uit en voeg 200 μL verdunde secundaire antilichamen toe aan de pellet. Incubeer 60 minuten bij RT.
4. Voer vervolgens de kleine wasbeurt drie keer uit. Voeg 15 μL montagemedium toe om de pellet opnieuw op te hangen en laat het medium met organoïden op een glazen glaasje vallen. Breng langzaam een deklaag aan op het medium en sluit het dekfolie af met nagellak. Druk de dekselslip niet handmatig samen en laat het montagemedium zich niet verspreiden door oppervlaktespanning.

Resultaten

Het algemene proces van dit protocol omvat het uitbreiden van 2D A549-cellen naar de exponentiële fase (Aanvullende Figuur 1A) en het doorgaan in 3D-matrigel om organoïden te vormen (Figuur 1A). Bij inkapseling in Matrigel vermeerderden en assembleerden cellen zichzelf, waarbij voornamelijk monoklonale organoïden werden gevormd (Figuur 1B). De dichte en ingewikkelde morfologie was uniform in de doorgangen (Aanvullende Figuur 1C)...

Discussie

Dit protocol beschrijft een methode voor het genereren van A549 longadenocarcinoom Cellline-afgeleide tumororganoïden, geoptimaliseerd voor technische eenvoud, reproduceerbaarheid en educatief gebruik. Drie parameters bepalen het succes cruciaal: initiële celtoestand, mediumformulering en matrixsamenstelling. Daarnaast wordt een kweekduur niet aanbevolen om langer dan 14 dagen te zijn. Hieronder staan belangrijke parameters en probleemoplossingen.

Init...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL Micro Centrifuge tube	Biofil	CFT003015
A549 [A-549]human non-small cell lung cancer cells	ZQXZbio	ZQ0003	STR: Amelogenin: X,Y; CSF1PO: 10,12; D13S317: 11; D16S539: 11,12; D5S818: 11; D7S820: 8,11; TH01: 8,9.3; TPOX: 8,11; vWA: 14. Mycoplasma was negatief bij aankoop, getest om de 2 weken. Passagenummer binnen 10 passages van de P1 aliquoten van de aangeschafte batch werd gebruikt.
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Anti-E Cadherin antibody	Abcam	ab231303
Anti-Fade Mounting Medium	YEASEN	36307ES08
Anti-HIF-1 alpha antibody	Abcam	ab51608
Biological Safety Cabinet	Nuaire LABGARD	NU-540
Biological Tissue Embedding Machine	KEDEE	KD-BM
BSA	Sigma	A1933
Cell-Grade BSA	Sigma	A1933-100G
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5702 R	Swing bucket; Mild to low speed.
Centrifuge tube	Biofil	CFT920150
Citrate Antigen Retrieval Solution (pH 6.0)	ZSGB-BIO	ZLI-9065
Cryostage	KEDEE	KD-BL
Cytation 5 Cell Imaging Multimode  Reader	Biotek	Cytation 5
Cytokeratin 7 (KRT7) Rabbit mAb	Abclonal	A4357
DMEM	Gibco	11965092
DMSO	Solarbio	D8371
Donkey Serum	Solarbio	SL050
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11965118
Eclipse Ts2 Inverted Microscope	Nikon	Eclipse Ts2
Eosin Staining Solution (Alcohol-Soluble)	Servicebio	G1001
FBS	Nobimpex	B118-500
Forma Steri-Cycle i160 CO2 Incubator	Thermo Scientific	i60
Hematoxylin Bluing Solution	Servicebio	G1040
Hematoxylin Differentiation Solution	Servicebio	G1040
Hematoxylin Staining Solution	Servicebio	G1004
Hemocytometer	Solarbio	YA0810
Human Lung Adenocarcinoma Organoid Medium (3D medium)	PMO Bio	HC1001
Immunohistochemistry (IHC) Pen	ZSGB-BIO	ZLI-9305	Bewaar bij 4°C
Laser Confocal Microscope  FV3000	Olympus	FV3000	Gebruikelijke parameterbereik: PMT Voltage: 500 ± 200 V; Laser Transmissiviteit: 5 ± 3%; Offset: 3 %
Manual Rotary Microtome	Leica	RM2235
Metal Bath	ALLSHENG	MK-3000
Microwave Oven	Galanz
Nail Polish	Lete
Neutral Balsam (Mounting Medium for Microscopy)	Beyotime	C0173
Organoid-Specific Extracellular Matrix Gel	PMO Bio	BM1001
PBS	WISENT	311-010-CL
Peroxidase Blocking Solution	Beyotime	P0100A
Pipettes	Eppendorf	312300063/312300020/312400083
Pipettes tips	Axygen	14-222-692/14-222-723/14-222-869	Overweeg om zo mogelijk tips met lage retentie te gebruiken.
Three-Dimensional Shaker	SCILOGEX	SK-D3309-Pro	Low speed.
Tissue Flotation Water Bath	KEDEE	KD-P
Triton X-100	VWR	92046-34-9
Trypan Blue	Gibco	15250061
TryPLE	Gibco	12605028
TTF1 Recombinant Monoclonal Antibody	HUABIO	HA720067