Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Snelle productie van recombinante menselijke SLFN14-ribonuclease en stoichiometrische analyse door massafotometrie

961 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70393

⸱

20 februari 2026

 ,  , 
1Department of Structural Biology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, SUNY, 2Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Baylor College of Medicine, 3Therapeutic Innovation Center (THINC), Baylor College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de productie van recombinante humane SLFN14-ribonuclease en de stoichiometrische analyse daarvan door massafotometrie.

Samenvatting

Ribonucleasen zijn een gespecialiseerde klasse van RNA-bindende eiwitten die de RNA-splitsing katalyseren en bijdragen aan diverse biologische processen, waaronder genregulatie. Desalniettemin blijven de structuur, functie en regulatie van veel menselijke ribonucleasen slecht gekarakteriseerd vanwege de uitdagingen bij de productie van recombinante eiwitten. Deze methode beschrijft een efficiënte benadering voor de transiënte expressie, zuivering en stoichiometrische analyse van de menselijke Schlafen 14 (SLFN14) ribonuclease. Recombinant Flag-tagd SLFN14 werd tot expressie gebracht in HEK293-suspensiecellen en geïsoleerd met behulp van een snelle tweestapszuiveringsworkflow bestaande uit anti-Flag affiniteitschromatografie gevolgd door laagresolutie grootte-uitsluitingschromatografie. Massafotometrie, een gevoelige techniek met één molecuul, toonde aan dat SLFN14 onder fysiologische zoutcondities een stabiel homodimeer vormt dat gebonden is aan cellulair RNA, terwijl een hoog zoutgehalte RNA-dissociatie bevordert en de homodimeerordening behouden blijft. Het resulterende recombinante humane SLFN14-eiwit is geschikt voor downstream structurele studies en kwalitatieve biochemische assays. Deze snelle aanpak voor recombinante menselijke eiwitisolatie en monsterkarakterisering is breed toepasbaar voor de productie van andere zoogdierribonucleasen en RNA-bindende eiwitten die bedoeld zijn voor biofysische en biochemische karakterisering.

Inleiding

Schlafen 14 (SLFN14) is een onderbelicht ribonuclease en zoogdiergastrestrictiefactor 1,2,3. Het humane SLFN14-eiwit behoort tot een familie van zes SLFN-genregulatoren, die een rol spelen in immuniteit, antivirale activiteit, chemosensitiviteit en celdifferentiatie 4,5,6,7,8. Mechanistisch inzicht in de rol van SLFN-genregulatoren blijft onvolledig; Veel leden bevatten echter ribonuclease-activiteit die essentieel is voor translationele controle 7,9. SLFN-ribonucleasen worden geactiveerd bij eiwithomodimerisatie, waarbij een samengestelde RNA-bindende spleet ontstaat die vaardig is in substraatsplijting10,11. Om cellen te beschermen tegen valse RNA-splitsing, bestaan de meeste SLFN-ribonucleasen voornamelijk als monomeer en wachten ze op activatie door moleculaire signalen die specifiek zijn voor elk familielid 5,7,11,12.

Recombinante productie van menselijke SLFN14 heeft uitgebreide moleculaire studies mogelijk gemaakt van deze eerder onderbelichte ribonuclease, wat nieuwe inzichten biedt in de functie en regulatieervan 2,13,14. Het gezuiverde recombinante SLFN14-eiwit heeft de karakterisering van zijn structuurafhankelijke overdrachtsRNA-splitsingsactiviteit versneld met behulp van in vitro RNA-splitsingsassays 2,14. Cryo-elektronenmicroscopie (cryoEM) studies van gezuiverd SLFN14-eiwit tonen ook een SLFN14-homodimeer-opstelling aan, waarbij duplex-RNA in een centrale spleet 2,13,14 wordt geladen. De hogere orde assemblage van SLFN14 werd verder gekarakteriseerd door massafotometrie, een enkelmolecuultechniek voor het meten van moleculaire massa. Onverwacht toont deze gevoelige techniek aan dat SLFN14 voornamelijk een zoutresistent homodimeer vormt, maar ook een zoutgevoelige homotetrameer met onbekende functie 2,13,14 kan vormen. Gezamenlijk was het vermogen om gezuiverd menselijk SLFN14-eiwit te verkrijgen een cruciale mijlpaal, die vroege moleculaire inzichten mogelijk maakte die ongetwijfeld een spannende nieuwe onderzoeksfase naar SLFN14-gemedieerde translationele controle zullen stimuleren.

De recombinante SLFN14-ribonuclease is historisch gezien moeilijk te verkrijgen geweest met standaard eiwitproductiestrategieën. Het oorspronkelijke rapport waarin de enzymatische activiteit van SLFN14 werd beschreven, merkte de lage opbrengst, verminderde stabiliteit en lage oplosbaarheid1 op. Het humane SLFN14-eiwit wordt gekenmerkt door een lange polypeptideketen, uitgesproken hydrofobiciteit en ribonuclease-afhankelijke cytotoxiciteit, die samen het gebruik van conventionele bacteriële expressiesystemengrotendeels belemmeren 1,13,14. Geavanceerde eukaryote translatie- en chaperonnemachines bieden echter een krachtig alternatief dat efficiënt volledige menselijke SLFN14-eiwit15 produceert. Zowel baculovirus-insecten- als zoogdierexpressiesystemen zijn gebruikt om het volledige menselijke SLFN14-eiwit te verkrijgen voor cryoEM-studies en biochemische assays 2,13,14. In sommige gevallen vereiste het insectenafgeleide SLFN14-eiwit echter stabiliserende mutaties om monsteraggregatiete voorkomen 2. Baculovirus-gemedieerde genlevering gaat ook gepaard met een aanzienlijke inspanning en een lange levertijd, waardoor de onderzoeksvoortgang wordt vertraagd15,16. Aan de andere kant biedt recombinant SLFN14-eiwit dat is geïsoleerd uit een zoogdierexpressiegastheer het voordeel van snelheid en voorkomt het de noodzaak van eiwitengineering bij monsteroptimalisatie.

Deze methode is ontworpen om een relatief snelle en inspanningsarme benadering te bieden om recombinant wildtype SLFN14-eiwit te produceren dat geschikt is voor downstream moleculaire studies. Het gebruik van zoogdiercellen biedt een bijna natuurlijke omgeving om een correcte eiwitvouwing te behouden zonder de noodzaak van SLFN14 eiwitengineering13. Een chemisch gebaseerde genafgiftemethode, in tegenstelling tot een virale vectorstrategie, versnelt ook de productietijd van maanden naar dag15. Om de relatief hoge kosten van zoogdiercelkweek te compenseren, maakt deze methode gebruik van het kosteneffectieve polyethylimine (PEI) transfectie-reagens en transfection-efficiënte menselijke embryonale nier 293 (HEK293) cellen die in suspensie17,18 zijn gekweekt. Om eiwitverlies tijdens monsterverwerking te minimaliseren, maakt deze procedure ook gebruik van strategieën met weinig monsterverbruik voor SLFN14-eiwitzuivering en stoichiometrische analyse voor kwaliteitscontrole van monsters. Dit vierdaagse protocol geeft specifieke details over hoe 1) tijdelijke genexpressie in HEK293-cellen uitgevoerd kan worden, 2) een tweestapschromatografie met spinkolommen, en 3) het bepalen van eiwitstoichiometrie door massafotometrie. Het eindproduct van deze procedure is een wildtype menselijk SLFN14-eiwit met een dubbele C-terminal Myc-Flag-tag (SLFN14Myc-Flag) die kan worden gebruikt voor downstream cryoEM-studies en kwalitatieve biochemische karakterisering13. Deze veelzijdige benadering kan worden toegepast om andere onderbestudeerde menselijke RNA-bindende eiwitten te isoleren en te karakteriseren, met name grote en cytotoxische ribonucleasegenen die vaak moeilijk overexpressief zijn in heterologe expressiesystemen. Daarom verlaagt dit protocol de drempel voor een uitgebreide moleculaire karakterisering van het menselijke proteoom.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Experimenten met HEK293-celkweek moeten worden uitgevoerd onder Biosafety Level 2 (BSL-2) voorwaarden volgens goedgekeurde institutionele bioveiligheidsprotocollen.

1. Tijdelijke expressie van SLFN14Myc-Flag in zoogdiercellen

  1. Zaad zoogdier-HEK293-suspensiecellen bij 0,5 x 106 cellen/mL in voorverwarmd serumvrij groeimedium voor een eindvolume van 320 mL in een geventileerde, geïnspireerde 1 L kolf.
  2. Incubeer de cellen bij 37 °C, 125 toeren, 8% CO2 en 75-80% luchtvochtigheid gedurende 24-32 uur.
  3. Controleer of het celaantal 1,2-1,8 x 106 cellen /mL is en dat de levensvatbaarheid hoger is dan 90% met behulp van trypanblauwe kleuring en een celteller19.
  4. Dekanteer 40 mL kweek in acht conische buizen.
  5. Oogst cellen door centrifugatie op 400 x g gedurende 5 minuten bij 20-25 °C.
  6. Gooi groeimedium weg.
  7. Suspendeer elke celpellet voorzichtig opnieuw in 38 mL voorverwarmd serumvrij transfectiemedium voor een eindvolume van 304 mL.
    OPMERKING: De resterende 16 mL van het oorspronkelijke kweekvolume beschreven in stap 1.1 wordt geleverd door het transfectiemengsel beschreven in stap 1.12.
  8. Breng de cellen over in een nieuwe, geventileerde, met baffel 1 L kolf.
  9. Voeg in een conische buis 320 μg gezuiverd plasmide-DNA toe dat codeert voor het recombinante SLFN14Myc-Flag-gen aan 8 mL serumvrij transfectiemedium en incubeer 5 minuten bij 20-25 °C.
    OPMERKING: De plasmideconcentratie is typisch 500 ng/μL bij een eindvolume van 640 μL.
  10. Gelijktijdig met stap 1,9 voeg je 960 μg 0,22 μm filtergesteriliseerd PEI toe aan 8 mL serumvrij transfectiemedium en incubeer je 5 minuten bij 20-25 °C.
    OPMERKING: Werkmateriaal is doorgaans 1 mg/mL bij een eindvolume van 960 μL.
  11. Voeg langzaam het PEI-mengsel toe (zie stap 1.10) druppelwijs aan de recombinante plasmide-DNA-oplossing (zie stap 1.9) en incubeer 15 minuten bij 20-25 °C.
  12. Voeg langzaam 16 mL van het DNA/PEI-mengsel druppelwijs toe aan de cellen die in stap 1.8 zijn bereid.
  13. Incubeer de cellen bij 37 °C, 125 toeren, 8% CO2 en 75-80% luchtvochtigheid gedurende 48 uur.
  14. Dekanteer 40 ml getransfecteerde cellen in acht kegelvormige buizen.
  15. Oogst getransfecteerde cellen door centrifugatie bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 20-25 °C.
  16. Giet het supernatant over en bewaar de acht cellige pellets bij -80 °C.

2. Tweestaps recombinante SLFN14Myc-Flag zuivering

  1. Anti-vlag affiniteitschromatografie.
    Voer het anti-Flag affiniteitschromatografieprotocol dubbel uit, waarbij vier celpellets uit stap 1.16 per voorbereiding worden gebruikt.
    1. Resin voorbereiding.
      1. Balanceer anti-Flag agarose hars tot 20-25 °C gedurende 15 minuten.
      2. Suspendeer de hars voorzichtig opnieuw door de fles direct om te draaien voordat je 40 μL 50% harsslurry naar een 2 mL microcentrifugebuis overbrengt.
        OPMERKING: Knip het uiteinde van de pipettip af om de stroperige slurry gemakkelijk op te vangen.
      3. Sussie de hars opnieuw in 1 mL High Salt Wash Buffer (50 mM Tris pH 7,4, 600 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM β-ME, 0,1% Tween-20).
      4. Breng 45 minuten uit bij 4 °C.
      5. Centrifugeer de resin-slurry op 8.000 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
      6. Aspireer en gooi de High Salt Wash Buffer weg, terwijl je voorzichtig bent dat je de hars niet verstoort.
    2. Cellysaatverduidelijking.
      1. Suspenseer elke getransfecteerde celpellet opnieuw met 225 μL gekoelde Resuspension Buffer (50 mM Tris pH 7,4, 600 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM β-ME, 0,5% Triton-X-100, 1 mM PMSF, 5 μg/mL Leupeptine, 1 mM Benzamidine, 0,7 μg/mL Pepstatine A, 0,25 U/mL Genius nuclease) voor een totaal volume van 900 μL over vier celpellets.
      2. Breng cellen over naar een 2 mL microcentrifugebuis die voorgekoeld is op ijs.
      3. Incubeer de microcentrifugebuis horizontaal op een nutator gedurende 30 minuten bij 4 °C.
        OPMERKING: Bewaar een 20 μL aliquot van totaal lysaat bij -20 °C voor probleemoplossing bij lage eiwitexpressie.
      4. Klariseer cellysaat door centrifugatie bij 21.300 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
    3. Eiwitaffiniteitsvangst en was.
      1. Combineer het geklaarde lysaat (zie stap 2.1.2.4) met de gebalanceerde anti-Flag hars (zie stap 2.1.1.6).
      2. Incubeer het lysaat-hars mengsel in een microcentrifugebuis die horizontaal op een nutator is geplaatst, gedurende 60 minuten bij 4 °C.
      3. Centrifugeer het lysaat-hars mengsel op 8.000 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C om een harspellet te vormen.
      4. Gooi ongeveer 700 μL supernatant weg en wees voorzichtig om de harspellet niet te verstoren.
        OPMERKING: Bewaar een 20 μL aliquot supernatant bij -20 °C na resinbinding voor probleemoplossing bij slechte vangefficiëntie.
      5. Sussie het resterende hars-supernatant mengsel opnieuw en breng de oplossing over in een lege spinkolom met 800 μL capaciteit die in een lege 2 mL microcentrifugebuis is geplaatst.
      6. Centrifugeer de spinkolom op 1.000 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C en verwijder de doorstroom.
      7. Spoel de lege microcentrifugebuis van stap 2.1.3.5 met 500 μL High Salt Wash Buffer en breng de oplossing over in de spinkolom.
        OPMERKING: Deze stap helpt om eventuele resterende hars in de microcentrifugebuis terug te winnen.
      8. Centrifugeer de spinkolom op 1.000 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C en verwijder de doorstroom.
      9. Voeg 500 μL High Salt Wash Buffer toe aan de spinkolom. Centrifugeer de spinkolom op 1.000 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C en verwijder de doorstroom. Herhaal deze stap voor in totaal vier hoge zoutwassen.
      10. Voeg 500 μL Low Salt Wash Buffer (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM β-ME, 0,1% Tween-20) toe aan de spinkolom. Centrifugeer de spinkolom op 1.000 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C en verwijder de doorstroom. Herhaal deze stap voor in totaal twee zoutarme wasbeurten.
      11. Voeg 500 μL ATP Wash Buffer (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM β-ME, 0,1% Tween-20, 10 mM ATP) toe aan de spinkolom. Stop de onderkant van de spinkolom en incubeer 5 minuten op 4 °C. Koppel de spinkolom los en centrifugeer op 1.000 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C en laat de doorstroming weg. Herhaal deze stap voor in totaal vier ATP-wasbeurten.
      12. Voer een laatste wash uit door 500 μL Low Salt Wash Buffer aan de spinkolom toe te voegen. Centrifugeer de spinkolom op 1.000 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C en verwijder de doorstroom.
    4. Eiwit-eluutie door 3xFlag-peptide.
      1. Dep de onderkant van de spinkolom met een laagpluisdoekje om overtollig vocht te verwijderen en stop de onderkant van de spinkolom.
      2. Voeg 55 μL 3xFlag Elution Buffer (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM β-ME, 0,1% Tween-20, 300 μg/mL 3xFlag peptide) direct toe over de hars.
      3. Sluit de opening van de spinkolom af met parafilm en plaats de kolom in een 1,7 mL microcentrifugebuis.
      4. Incubeer de spinkolom verticaal op een nutator gedurende 60 minuten bij 4 °C.
        OPMERKING: Om de spinkolom verticaal te houden, monteer je een microcentrifugebuis met elastiekjes op de nutator.
      5. Verwijder de parafilm en de spinkolomplug. Verzamel het geëlueerde recombinante SLFN14Myc-Flag-eiwit in een schoon 1,7 mL microcentrifugebuisje door centrifugatie op 1.000 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
      6. Houd 50 μL anti-Flag hars-eluaat vast voor latere grootte-uitsluitingschromatografie en 5 μL voor SDS-PAGE-analyse.
  2. Grootte-uitsluitingschromatografie.
    Voer het grootte-uitsluitingschromatografieprotocol uit met behulp van de Low Salt Desalting Buffer (150 mM NaCl) voor standaard SLFN14Myc-Flag eiwitanalyse of High Salt Desalting Buffer (500 mM NaCl) voor apo SLFN14Myc-Flag karakterisering.
    1. Combineer twee 50 μL anti-Flag hars-eluaten uit stap 2.1.4.6 voor een totaal monster van 100 μL.
    2. Bereid een 0,5 mL spin-ontzoutingskolom voor met een 40 kDa molecuulgewichtsafsnijding door de kap los te maken, de onderste sluiting te verwijderen en de kolom in een 2 mL microcentrifugebuis te plaatsen.
    3. Centrifugeer de spin-ontzoutingskolom op 700 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C om de kolomopslagoplossing te verwijderen. Gooi de doorstroming weg.
    4. Voeg 300 μL Low of High Salt Desalting Buffer (20 mM Tris pH 7,4, 150/500 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM TCEP) toe aan de spin-desaltingskolom. Centrifugeer de spinkolom op 700 x g gedurende 1-2 minuten bij 4 °C en verwijder de doorstroom. Voer deze stap drie keer uit om de kolom volledig in evenwicht te brengen.
    5. Dep de onderkant van de spin-ontzoutingskolom met een laagpluisige doek.
    6. Breng de spin-ontzoutingskolom over naar een schone 1,7 mL microcentrifugebuis.
    7. Voeg 100 μL gecombineerde anti-Flag hars eluaat toe (zie stap 2.2.1) aan het midden van het kolombed zonder de hars te verstoren.
    8. Eluteer het recombinante SLFN14Myc-Flag eiwit door de spin-dezoutkolom te centrifugeren op 700 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
    9. Houd 95 μL teruggewonnen recombinant eiwit voor moleculaire karakterisering en 5 μL voor SDS-PAGE-analyse.
  3. Karakteriseer gezuiverd recombinant SLFN14Myc-Flag eiwitmonster.
    1. Voer natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese uit (SDS-PAGE).
      1. Combineer 5 μL van 2x Laemmli-monsterbuffer met 5 μL aliquots van monster die in verschillende stadia van het zuiveringsprotocol zijn verzameld.
      2. Verwarm monsters op 95 °C gedurende 5 minuten.
      3. Verdeel een brede eiwitladder samen met 10 μL monster-Laemmli buffermengsel met 4-15% SDS-PAGE bij 200V gedurende 30 minuten.
      4. Visualiseer eiwitbanden door de gel 30 minuten te kleuren met Coomassie G-250 kleuroplossing op een orbitale shaker en destaine de gel met gedeïoniseerd water op een orbitale shaker totdat de achtergrond helder is.
      5. Inspecteer de resulterende eiwitbanden om te verzekeren dat het teruggevonden monster uit stap 2.2.9 een enkele eiwitband is die overeenkomt met het SLFN14Myc-Flag theoretisch molecuulgewicht van 107,5 kilodalton (kDa).
    2. Kwantificeer eiwit en nucleïnezuur met UV/vis spectrofotometrie.
      1. Blank een microvolume spectrofotometer met 2 μL van een Low of High Salt Desalting Buffer, passend bij de eiwitopslagbuffer.
      2. Meet de absorptie bij 260 nm en 280 nm uit 2 μL van teruggewonnen recombinant SLFN14Myc-Flag-eiwit (zie stap 2.2.9) met een microvolumespectrofotometer.
      3. Bereken de recombinante SLFN14Myc-Flag eiwitconcentratie met behulp van de geregistreerde absorptie bij 280 nm en de extinctiecoëfficiënt (93330 M-1 cm-1) met behulp van Beer-Lambert Law20.
      4. Bereken de absorptieverhouding A260/280 door de absorptiewaarde van 260 nm te delen door de absorptiewaarde gemeten bij 280 nm om te bepalen of nucleïnezuur co-zuivert met het recombinante SLFN14Myc-Flag-eiwit .
        OPMERKING: Een A260/280-verhouding boven 0,7 wijst waarschijnlijk op de aanwezigheid van nucleïnezuur21.
    3. Kwantificeer cellulair RNA met fluorometrie.
      1. Kwantificeer RNA-inhoud met 1-3 μL van teruggewonnen recombinant eiwit uit stap 2.2.9 met behulp van een hooggevoelig RNA-specifiek fluorescerende kleurstof22.

3. Analyse van de moleculaire massa van SLFN14Myc-Flag door massafotometrie

  1. Massafotometer-instrumentopstelling.
    1. Zet de laser aan met de schakelaar aan de achterkant van de elektronicakast van de massafotometer.
    2. Zet het isolatiedek aan en klik op de "isolatie"-knop om instrumenttrillingen te minimaliseren.
    3. Open de AcquireMP-software.
    4. Wacht 1 uur tot het instrument thermisch evenwicht bereikt.
  2. Cover slide voorbereiding.
    1. Houd een glazen schuif in verticale positie met een zachte pincet.
    2. Spoel beide zijden van de glazen afdekkingsglaasje met Type I ultrazuiver water gevolgd door isopropylalcohol. Herhaal deze stap in totaal drie keer.
    3. Spoel elke kant van de glazen afdekking nog één keer af met Type I ultrazuiver water gedurende 45 seconden.
    4. Verwijder voorzichtig overtollige waterdruppels van de glazen schuif door te aspireren met een schone pipettip die is aangesloten op een vacuümleiding.
    5. Bewaar de schone glazen omslagglaasje in een plastic doos bekleed met lenspapier voor transport naar de massafotometer.
  3. Bevestig de deksel op het instrument.
    1. Plaats een 6-put siliconen pakking op het metalen uitlijngereedschap met een zachte pincet.
    2. Plaats de schone glazen kapslede van stap 3.2.5 bovenop de siliconen pakking en gebruik de zachte pincet om zachtjes rond de siliconen pakking te drukken.
      OPMERKING: Oefen geen druk uit op de monsterputten.
    3. Breng een druppel dompelolie op de oculus van de massafotometer.
    4. Draai de glazen schuif zodat de siliconen pakking omhoog wijst en plaats voorzichtig de glazen schuif op de oculus met een zachte pincet.
    5. Zet de linker- en rechterbenedenhoek van de glazen schuif vast met magneten.
    6. Selecteer onder laterale controle de bovenste linksboven in de AcquireMP-software om de laser uit te lijnen met het midden van de put.
  4. Analyseer eiwitstandaarden met brede bereik.
    1. Bereid een oplossing met 50x breedbereik (90 kDa tot 1 MDa) door 1 μL van een 500x kaliber voorraad te verdunnen tot 9 μL 1x fosfaatgeborrelde zoutoplossing.
    2. Bereid een 5x kaliber werkmateriaal voor door 2 μL van de 50x breedkaliber oplossing uit stap 3.4.1 te combineren met 18 μL 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing.
    3. Voeg 10 μL 0,22 μm gefilterde Low of High Salt Desalting Buffer toe aan de lege put.
      OPMERKING: Het is belangrijk om de gefilterde buffer in deze stap te matchen met de buffer die is gebruikt om het SLFN14Myc-Flag-monster voor te bereiden in stap 2.2.9.
    4. Doe het deksel dicht.
    5. Klik onder Focus zoeken op "druppelverdunning" in de AcquireMP-software om de juiste focus van de monsterput te bepalen.
    6. Voeg 10 μL van de 5x calibrant werkmateriaal toe aan de bufferdruppel (zie stap 3.4.3) en pipetteer voorzichtig omhoog en omlaag om de oplossing te mengen.
    7. Doe het deksel dicht.
    8. Controleer de instrumentinstellingen om te bevestigen dat de waarden voor beweging, signaal, verzadiging en scherpte stabiel en optimaal zijn.
      OPMERKING: Optimale waarden verschijnen blauw en uitschieters zijn oranje gekleurd.
    9. Klik op "opnemen" in de AcquireMP-software om een video van 60 seconden op te nemen.
    10. Sla het resultaatbestand (.mpr) op met een beschrijvende titel en tijdstempel.
  5. Maak een kalibratiecurve.
    1. Open de DiscoverMP-software.
    2. Klik onder metingen op de knop "+ open" en navigeer naar het calibriant resultaatbestand uit stap 3.4.10.
    3. Klik dubbel op het vermelde eiwitstandaardbestand om de resultaten te bekijken.
    4. Onder plotconfiguratie kun je de contrastgrenzen respectievelijk aanpassen naar 0,00000 en -0,03000.
    5. Definieer handmatig een Gaussiaanse curve voor de eerste vier eiwitstandaardpieken door de cursor over elke individuele piek te slepen.
    6. Klik op "Aanmaken" en selecteer "massakalibratie".
    7. Onder de kalibrantkop wijst je elke passende kaliberpiek toe van stap 3.5.5 aan de bekende molecuulmassa van respectievelijk 86, 172, 258 en 344 kDa.
    8. Controleer of de kalibratiecurve eenR2 dicht bij 1,0 heeft en een maximale massafout (MME) van minder dan 2%.
    9. Klik op "calibratie bevestigen" en sla het kalibratiecurvebestand op (.mc).
      OPMERKING: De massafotometer moet elk uur opnieuw worden gekalibreerd.
  6. Analyseer het recombinante SLFN14Myc-Flag eiwit onder omstandigheden met weinig en veel zout.
    1. Bereid een 50 μL oplossing voor van 50 nM recombinant SLFN14Myc-Flag eiwit (zie stap 2.2.9) met Low Salt Desalting Buffer voor standaard monsteranalyse onder fysiologische zoutcondities of High Salt Desalting Buffer voor apo-eiwitmonsterkarakterisering.
    2. Centrifugeer het 50 nM recombinante SLFN14Myc-Flag eiwitmengsel op 21.300 x g gedurende 10 minuten bij 20-25 °C om potentiële eiwitaggregaten en stof te verwijderen.
    3. Klik onder laterale controle op "volgende put" in de AcquireMP-software.
    4. Laad 10 μL 0,22 μm gefilterde Low of High Salt Desalting Buffer in de put en sluit het deksel.
      OPMERKING: Het is belangrijk om de gefilterde buffer in deze stap te matchen met de buffer die is gebruikt om de SLFN14Myc-Flag monsterverdunning voor te bereiden in stap 3.6.1.
    5. Klik onder 'focus zoeken' op "druppelverdunning" om de juiste focus van de nieuwe sampleput te bepalen.
    6. Laad 10 μL van de 50 nM recombinante SLFN14Myc-Flag eiwitoplossing vanuit stap 3.6.2 in de bufferdruppel en pipetteer voorzichtig om het monster te mengen.
    7. Sluit het deksel en zorg voor optimale instrumentinstellingen zoals beschreven in stap 3.4.8.
    8. Klik op "opnemen" in de AcquireMP-software om een video van 60 seconden op te nemen.
      OPMERKING: Optimale massa-resolutie wordt bereikt met een video van 60 seconden met ongeveer 1.000-4.000 totale tellingen.
    9. Sla het resultaatbestand (.mpr) op met een beschrijvende titel en tijdstempel.
  7. Bereken de molecuulmassa en stoichiometrie van het recombinante SLFN14Myc-Flag-eiwit .
    1. Klik onder metingen binnen de DiscoverMP-software op de knop "+ open" om het resultaatbestand uit stap 3.6.9 te selecteren.
    2. Bij kalibraties dubbelklikken op het kalibratiecurvebestand dat in stap 3.5.9 is aangemaakt om de kalibratie toe te passen.
    3. Definieer handmatig een Gaussische kromme voor elke waargenomen SLFN14Myc-Flag-soort door de cursor over elke piek te trekken om een berekende molecuulmassawaarde te verkrijgen.
    4. Bereken de gemiddelde molecuulmassa voor elke oligomere soort uit drie onafhankelijke metingen, samen met de bijbehorende standaarddeviatie.
    5. Bepaal de stoichiometrie van het recombinante SLFN14Myc-Flag-eiwit door de gemiddelde berekende molecuulmassa te evalueren met gehele getallen van de theoretische massawaarde van het SLFN14Myc-Flag-protomeer .
      OPMERKING: De theoretische massa van een SLFN14Myc-Flag monomeer is 107,5 kDa, een dimeer is 215 kDa, een trimer is 322,5 kDa en een tetrameer is 430 kDa.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een zoogdiervector die is ontworpen voor tijdelijke genexpressie van het volledige recombinante menselijke SLFN14Myc-Flag-eiwit is geïllustreerd in Figuur 1. Een tweestaps zuiveringsproces toont de isolatie van het SLFN14Myc-Flag-eiwit uit HEK293-cellen (Figuur 2A). Een succesvolle representatieve denaturerende gel van gezuiverd SLFN14Myc-Flag-eiwit is te zien in Figuur 2B

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Verschillende cruciale stappen onderstrepen de prestaties en veelzijdigheid van dit eiwitproductieprotocol. Om de opbrengst van recombinante eiwitten te maximaliseren, maken we gebruik van HEK293-cellen die een hoge opname van vreemd plasmiden-DNA hebben en in suspensie kunnen worden gekweekt om de celdichtheid in het mediumvolume 23 te maximaliseren. PEI-transfectiereagens wordt gebruikt in dit grootschalige transgenafgifteprotocol omdat het een hoge transfectie-...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken leden van het Pillon-lab voor hun kritische lezing van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door het US National Institute of Health Extramural Research Program, National Institute of General Medical Sciences (NIGMS; R35GM147123 naar M.C.P.) uitgegeven aan Baylor College of Medicine en overgedragen aan de State University of New York in Buffalo.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-mercaptoethanol (b-Me)SigmaM3148-500ML14,3 M oplossing stock
AcquireMP 2024 R2Refeyn/data acquisitie software
Adenosine-5'-trifosfaat dinatriumzout trihydraat (ATP)Chem-Impex International00015-100Glos oplossing pH 7,0 aanpassen
Anti-Flag M2 affiniteitsgelMilliporeA2220anti-flag affiniteitshars
Benzamidinehydrochloride hydraatSigmaB6506-25Gproteaseremmer
Breed scala van eiwitstandaarden (10-250 kDa)Bio-RadP7719Svoorgekleurde eiwitstandaarden
Countess 3InvitrogenA49862geautomatiseerde celteller
DiscoverMP v2024 R2Refeyn/data analyse software
Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossingCorning21-031-CV1x oplossing stock
DYKDDDDK peptideThermo Fisher ScientificA368053xFlag peptide
FreeStyle 293-F CellenThermo Fisher ScientificR79007zoogdiersuspensiecellen
Geniust M nuclease DMF veldSanta Cruzsc-391121Buniversele nuclease
HyClone CDM4HEK293 mediaCytivaSH3085802serumvrij groeimedium
HyClone SFM4Transfx-293 mediaCytivaSH3086002transient transfectiemedium
Immersol 518FZeiss4Y00-R0DY-1007-3BF3immersieolie
Isopropyl alcoholMacron Fine Chemicals3032-02
Laemmli monsterbufferBio-Rad16107372x oplossing stock
LeupeptineVWRJ580-25MGproteaseremmer
Magnesiumchloride hexahydraat (MgCl2)Fisher ScientificM33-500
MassFerence P1 RefeynMP-CON-41033500x calibratie stock
MassGlass UC monstervoorbereidingskitRefeynMP-CON-21022schuif en pakking
Micro bio-spin kolomBio-Rad7326204lege polypropyleen spin kolom
Milli-Q IQ 7000 systeemMilliporeZIQ7000T0CType I ultrapuur water
Mini-Protean TGX stain-free gelsBio-Rad45680864-15% SDS-PAGE
Minitron met vochtigheid, koeling en CO2Infors72175incubator shaker
MP uitlijningskitRefeynMP-CON-21019uitlijningstool, soft tip pincet, magneet
NanophotometerImplenNP80UV-vis spectrofotometer
NutatorClay Adams Brand421105
Pepstatine ASanta Cruzsc-45036Bproteaseremmer
Fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)Research Products InternationalP20270-25.0proteaseremmer
Polycarbonaat schudkolf Duran Wheaton KimbleWPFBC1000Sontluchtingsfles met gekartelde basis
Polyethylenimine (PEI) MW 40.000Polysciences24765transfectiereagens
Qubit 4 FluorometerThermo Fisher ScientificQ33226
Qubit RNA hoge gevoeligheid assay kitThermo Fisher ScientificQ32852kwantificering met RNA-specifieke kleurstof
SimplyBlue SafeStainThermo Fisher ScientificLC6065Coomassie G-250
SLFN14 expressie plasmide DNAOrigeneRC226257menselijke getagged ORF clone
Natriumchloride (NaCl)Millipore1.37017
Tris, pH 7,4Thermo Fisher ScientificJ60202.K21 M gebufferde oplossing stock
Tris (2-carboxyethyl) fosfine hydrochloride (TCEP)Gold BiotechnologyTCEP10TCEP
Triton X-100VWRM143-1Ldetergens
Trypanblauwe kleurstofThermo Fisher ScientificT102820,4% oplossing stock
Tween 20VWR0777-1Ldetergens
TwoMPRefeynMP-PRO-00001massa fotometer
Zeba 40K Desaltin KolomThermo Fisher ScientificA57759exclusiechromatografie op basis van grootte
```

Referenties

  1. Pisareva, V. P., Muslimov, I. A., Tcherepanov, A., Pisarev, A. V. Characterization of novel ribosome-associated endoribonuclease slfn14 from rabbit reticulocytes. Biochemistry. 54 (21), 3286-3301 (2015).
  2. Li, M., et al. Human schlafen 14 cleavage of short double-stranded rnas underpins its antiviral activity. Adv Sci (Weinh). 12 (37), e01727(2025).
  3. Seong, R. K., et al. Schlafen 14 (slfn14) is a novel antiviral factor involved in the control of viral replication. Immunobiology. 222 (11), 979-988 (2017).
  4. Jo, U., Pommier, Y. Structural, molecular, and functional insights into schlafen proteins. Exp Mol Med. 54 (6), 730-738 (2022).
  5. Lee, S., et al. Velcrin-induced selective cleavage of trna(leu)(taa) by slfn12 causes cancer cell death. Nat Chem Biol. 19 (3), 301-310 (2023).
  6. Murai, J., Thomas, A., Miettinen, M., Pommier, Y. Schlafen 11 (slfn11), a restriction factor for replicative stress induced by DNA-targeting anti-cancer therapies. Pharmacol Ther. 201, 94-102 (2019).
  7. Zhang, P., et al. Schlafen 11 triggers innate immune responses through its ribonuclease activity upon detection of single-stranded DNA. Sci Immunol. 9 (96), eadj5465(2024).
  8. Li, M., et al. Codon-usage-based inhibition of hiv protein synthesis by human schlafen 11. Nature. 491 (7422), 125-128 (2012).
  9. Valenzuela, C., Saucedo, S., Llano, M. Schlafen14 impairs hiv-1 expression in a codon usage-dependent manner. Viruses. 16 (4), (2024).
  10. Metzner, F. J., et al. Mechanistic understanding of human slfn11. Nat Commun. 13 (1), 5464(2022).
  11. Garvie, C. W., et al. Structure of pde3a-slfn12 complex reveals requirements for activation of slfn12 rnase. Nat Commun. 12 (1), 4375(2021).
  12. Kugler, M., Metzner, F. J., Witte, G., Hopfner, K. P., Lammens, K. Phosphorylation-mediated conformational change regulates human slfn11. Nat Commun. 15 (1), 10500(2024).
  13. Van Riper, J., et al. Cryoem structure of the slfn14 endoribonuclease reveals insight into rna binding and cleavage. Nat Commun. 16 (1), 5848(2025).
  14. Luo, M., et al. Structural and functional characterization of human slfn14. Nucleic Acids Res. 53 (10), (2025).
  15. Schellenberg, M. J., Maheshwari, S., Pillon, M. C. Encyclopedia of cell biology. Vol. 1, Elsevier. 57-73 (2022).
  16. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system. J Vis Exp. (173), e62510(2021).
  17. Ojha, R., Timin, E., Szirovicza, L., Xu, W., Hepojoki, J. A systematic comparison of in-house prepared transfection reagents in the delivery of mrna or DNA to a wide range of cultured cells. J Biol Chem. 301 (12), 110742(2025).
  18. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension. J Vis Exp. (106), e53568(2015).
  19. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell counting and viability assessment of 2d and 3d cell cultures: Expected reliability of the trypan blue assay. Biol Proced Online. 19, 8(2017).
  20. Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 4 (11), 2411-2423 (1995).
  21. Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. Biotechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
  22. Li, X., Ben-Dov, I. Z., Mauro, M., Williams, Z. Lowering the quantification limit of the qubittm rna hs assay using rna spike-in. BMC Mol Biol. 16, 9(2015).
  23. Swiech, K., et al. Transient transfection of serum-free suspension hek 293 cell culture for efficient production of human rfviii. BMC Biotechnol. 11, 114(2011).
  24. Gu, J., et al. Correction: Advances in the structures, mechanisms and targeting of molecular chaperones. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 117(2025).
  25. Bernhard, H., et al. Structural basis of spliced leader rna recognition by the trypanosoma brucei cap-binding complex. Nat Commun. 16 (1), 685(2025).
  26. Lai, S. H., Tamara, S., Heck, A. J. R. Single-particle mass analysis of intact ribosomes by mass photometry and orbitrap-based charge detection mass spectrometry. iScience. 24 (11), 103211(2021).
  27. Liu, H., May, K. Disulfide bond structures of igg molecules: Structural variations, chemical modifications and possible impacts to stability and biological function. MAbs. 4 (1), 17-23 (2012).
  28. Marenchino, M., Armbruster, D. W., Hennig, M. Rapid and efficient purification of rna-binding proteins: Application to hiv-1 rev. Protein Expr Purif. 63 (2), 112-119 (2009).
  29. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Sci Adv. 7 (46), eabk0734(2021).
  30. Carrasco-Zanini, J., et al. Mapping biological influences on the human plasma proteome beyond the genome. Nat Metab. 6 (10), 2010-2023 (2024).
  31. Adhikari, S., et al. A high-stringency blueprint of the human proteome. Nat Commun. 11 (1), 5301(2020).
  32. Liao, J. Y., et al. Rbpworld for exploring functions and disease associations of rna-binding proteins across species. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D220-D232 (2025).
  33. Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcarcel, J., Hentze, M. W. Rna-binding proteins in human genetic disease. Nat Rev Genet. 22 (3), 185-198 (2021).
  34. Poodts, J., et al. Improved expression of sars-cov-2 spike rbd using the insect cell-baculovirus system. Viruses. 14 (12), (2022).
  35. Mckenzie, E. A., Abbott, W. M. Expression of recombinant proteins in insect and mammalian cells. Methods. 147, 40-49 (2018).
  36. Shi, X., Jarvis, D. L. Protein n-glycosylation in the baculovirus-insect cell system. Curr Drug Targets. 8 (10), 1116-1125 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Productie van recombinant eiwitRNA-bindende eiwittenHEK293-suspensiecellenaffiniteitschromatografiegrootte-uitsluitingschromatografieeiwitstoichiometrieSDS-PAGE-gelbiochemische karakterisering
Snelle productie van recombinante menselijke SLFN14-ribonuclease en stoichiometrische analyse door massafotometrie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.