Methodenartikel

Mapping van de morfologie van hepatische stellate cellen in muismodellen van leverfibrose

DOI:

10.3791/70396

⸱

13 februari 2026

 , 
1Division of Liver Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een uitgebreide beeldvormingspijplijn om de morfologie van leverstellate cellen in intact leverweefsel te visualiseren en te modelleren. Deze benadering combineert fluorescerende labeling van fibroblasten met behulp van muisgenetica, in situ leverperfusie-gebaseerde weefselvoorbereiding en een aangepaste iDISCO-weefselreinigingsmethode om optische transparantie te bereiken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weefselresidente fibroblasten zijn de cellulaire drijfveren van fibrose in weefsels. Binnen de lever activeren hepatische stellate cellen (HSC's), de residente pericyten met hun unieke "sterachtige" morfologie, tijdens het letsel tot fibrogene myofibroblasten om het leverlitteken te produceren. Hoewel decennia van onderzoek belangrijke signaalroutes ten grondslag aan HSC-activatie hebben verduidelijkt, blijft de functionele betekenis van hun onderscheidende dendritische morfologie ongrijpbaar vanwege technische beperkingen in beeldvorming en analyse. Dit protocol biedt een uitgebreide beeldvormingspijplijn om HSC-morfologie in intact leverweefsel te visualiseren en te modelleren. Deze benadering combineert fluorescerende labeling van HSC's met behulp van muisgenetica, in situ leverperfusie-gebaseerde weefselvoorbereiding en een aangepaste iDISCO-weefselreinigingsmethode om optische transparantie te bereiken in weefselmonsters die enkele centimeters dik kunnen zijn. Vrijgemaakte monsters worden gefotografeerd met geoptimaliseerde confocale microscopieplatforms, en beelddatasets worden verwerkt via een aangepaste analyseworkflow voor driedimensionale reconstructie van individuele HSC's met enkelcelresolutie. Samen maakt deze pijplijn reproduceerbare mapping van HSC-morfologie mogelijk binnen de complexe levermicro-omgeving, inclusief hun dendritische processen en ruimtelijke relaties met naburige cellen. Naast de lever is de werkwijze aanpasbaar aan fibroblasten in andere organen, zoals de long, nier, darm en hart, waar residente mesenchymale cellen vergelijkbare fibrogene rollen bij ziekten vertonen. Het voorgestelde kader legt daarom een methodologische basis voor vergelijkende cross-organstudies om fibroblastenstructuur-functie relaties en therapeutische kwetsbaarheden bij fibrotische ziekten te onderzoeken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibrose, ofwel pathologische littekenvorming van weefsel, is het laatste gemeenschappelijke traject voor bijna alle chronische orgaanziekten en draagt bij aan ongeveer 40% van de sterfgevallen in geïndustrialiseerde landen1. In de lever ontstaat fibrose door chronische beledigingen zoals virale hepatitis, alcoholgebruik of steeds vaker door metabole disfunctie geassocieerde steatotische leverziekte (MASLD), die momenteel 30-40% van de volwassenen in de VS treft. Chronische leverbeschadigingen en de daaruit voortvloeiende progressieve fibrose verhogen het risico op eindstadium leverziekten zoals cirrose, leverfalen en hepatocellulair carcinoomdrastisch 2, 3,4,5.

Hepatische stellate cellen (HSC's) zijn centraal voor leverhomeostase en fibrogenese. In gezonde levers bevinden HSC's zich in een rustende, vitamine A-opbergende toestand en dragen ze bij aan de homeostase van hepatocyten en in het algemeen de hele lever 6,7. Dit wordt duidelijk aangetoond door HSC-depletiestudies, waarbij het verwijderen van bijna alle HSC's in een gezonde lever de levermassa vermindert en leverregeneratieernstig beperkt 7,8. Bij verwonding activeren HSC's in myofibroblast-achtige cellen die zich vermenigvuldigen, migreren naar beschadigde gebieden en een overmatige extracellulaire matrix (ECM) produceren, waardoor fibrotische littekens ontstaan. Geactiveerde HSC's in fibrotische levers zijn ook de bron van kankergeassocieerde fibroblasten en spelen tumorbevorderende rollen bij hepatocellulair carcinoom 9,10,11,12. Rustende HSC's hebben een unieke neuronachtige morfologie met kleine cellichamen waaruit langeafstandsprojecties voortkomen. HSC's veranderen in een vlakke, velvormige myofibroblastvorm wanneer ze geactiveerd worden bij fibrose13. Hoewel decennia van onderzoek de signaalroutes die de productie van ECM door HSC's regelen hebben verduidelijkt, blijft het functionele belang van hun onderscheidende neuronale morfologie, hoe het wordt gereguleerd, of het interacties binnen de HSC-niche kan faciliteren en bijdraagt aan HSC-fibrogeniteit en ziekte ongrijpbaar14,15.

Huidige methoden om de morfologie van HSC's te visualiseren beperken zich tot tweedimensionale (2D) beelden van ofwel in vitro gekweekte cellen of in vivo weefseldoorsneden, en leggen zelden de volledige HSC-morfologie vast, met projecties die meerdere cellichaamlengtes in alle richtingen uitstrekken. Bovendien kan de meest gebruikte HSC-marker, desmin, de unieke neuronachtige morfologie van de HSC's niet volledig vastleggen bij immunofluorescentiekleuring, omdat desmin een cytoskeleteiwit is dat alleen tussenliggende filamenten binnenHSCs 16 labelt. Deze methodologische uitdagingen belemmerden tot nu toe het vermogen om HSC-morfologie en hun cellulaire interacties volledig op een driedimensionale (3D) manier vast te leggen in hun natuurlijke context bij enkelcelresolutie. Als gevolg hiervan zijn fundamentele vragen over hoe HSC-morfologie zich verhoudt tot hun functionele toestand en interacties met naburige celtypen onopgelost gebleven.

Dit artikel presenteert een innovatieve en uitgebreide beeldvormings- en analysepijplijn om HSC-morfologie te visualiseren en te modelleren in intact leverweefsel. Deze methode integreert verschillende belangrijke innovaties: (1) fluorescerende labeling van HSC's met behulp van genetische reportermuismodellen, (2) geoptimaliseerde in situ leverperfusie en fixatie om de intacte weefselarchitectuur en cellulaire relaties te behouden, (3) een aangepast iDISCO-gebaseerd weefselreinigingsprotocol om optische transparantie17 te bereiken, (4) hoge-resolutie confocale microscopie voor diepweefselbeeldopname, en (5) een aangepaste computationele workflow voor 3D-beeldreconstructie en kwantitatief analyse van individuele HSC's. Het protocol legt bepaalde beperkingen op aan weefselgrootte en tijdsinvestering die in aanmerking moeten worden genomen. Samen biedt dit protocol een robuust en reproduceerbaar kader voor het vastleggen van de complexe 3D-structuur van HSC's en voor het in kaart brengen van hun ruimtelijke relaties met naburige vasculaire, immuun- en parenchymale cellen. De strategieën en pipelines die hier voor de lever worden gepresenteerd, zijn ook gemakkelijk aan te passen aan andere organen17, 18, 19.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle muizenexperimenten die in deze studie zijn gebruikt, zijn goedgekeurd door het Icahn School of Medicine bij Mount Sinai Institutional Animal Care and Use Committee. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Generatie van muizen met tdTomato (TdT)-gelabelde HSC's

  1. Richtte Tg(lox-stop-lox-TdTomato) x Tg(Lrat:Cre) fokkers op (Jackson Laboratories stam #00791420 en Mutant Mouse Resource & Research Centers (MMRRC) stam #06959521-JAX, respectievelijk).
    OPMERKING: Verwacht kattenbakvulling na 3 weken. Gebruik LratCre-vrouwtjes voor de voortplanting, aangezien er enige Cre-expressie is vastgesteld in de mannelijke kiemlijn.
  2. Verzamel staarten en genotype F1-nest om Tg (Lrat:Cre) te identificeren; Tg(LSL-TdT) muizen die selectief de TdTomato-fluorofoor tot expressie brengen in lever-stellate cellen.

2. In situ leverperfusie en fixatie

  1. Voorbereiding voor de operatie
    1. Bereid een ketamine/xylazine-mengsel voor muizenanesthesie door 2 ml ketamine, 1 ml xylazine en 7 ml water te mengen.
      OPMERKING: Ketamine is een gereguleerde stof en vereist de juiste vergunning en regulering voor laboratoriumgebruik.
    2. Bereid de perfusieoplossing van 4% paraformaldehyde (PFA) voor in 1x fosfaatgeborduurde zoutoplossing (PBS).
    3. Stel de peristaltische pomp in door 1x PBS door de buis te laten stromen en stel de debiet in op 2 mL/min.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbel in de buis zit.
  2. Weeg de muis om de hoeveelheid ketamine/xylazinemengsel te bepalen die geïnjecteerd moet worden.
  3. Injecteer het ketamine/xylazinemengsel intraperitoneaal in de muis.
    OPMERKING: Injecteer 200 μL van het mengsel voor elke 20 g muisgewicht.
  4. Plaats de muis in een container met deksel en wacht ongeveer 20 minuten tot de muis volledig is verdoofd.
    OPMERKING: Knijp in de muisteen om te controleren of er geen reflex is. Zorg ervoor dat de muis nog leeft wanneer de perfusie begint.
  5. Breng de muis van de glazen container naar het operatieplatform in rugliggend.
    VOORZICHTIG: PFA is giftig en vluchtig; Voer daarom de perfusieprocedure uit in een chemische kap. Verzamel en verwijder de PFA-doorstroom-flow op de juiste manier volgens de institutionele bioveiligheidsrichtlijnen.
  6. Knijp met een pincet in de handpalmen van de muisvoet om te voorkomen dat de muis reflex- of spasmabewegingen vertoont.
  7. Steek 4 handpalmen met naalden om de buik van de muis te spreiden.
  8. Spuit de buik in met 70% ethanol om de vacht nat te maken.
  9. Gebruik een tang om de huid in het midden van de buik op te tillen, lijn uit met de achterpoten en begin de huid (beide lagen) te snijden om de buik te onthullen.
  10. Gebruik PBS-natte wattenstaafjes om darmen en andere organen opzij te bewegen en de linker kwab op te tillen.
  11. Snijd voorzichtig het membraan door dat tussen de linker kwab en de caudaatkwab zit.
  12. Gebruik een hechting om de bovenste basis van de linker lob vast te maken.
  13. Snijd de linker lob onder de hechtingsknoop en leg de linker lob apart voor weefselmonsterverzameling en -verwerking, afhankelijk van de experimentele behoeften (zoals direct invriezen in vloeibare stikstof, inbedding in Optical Cutting Temperature (OCT) verbinding, of formalinefixatie).
  14. Gebruik PBS-natte wattenstaafjes om de lever te bewegen en de portader bloot te leggen.
  15. Steek voorzichtig de katheternaald in de portaalader ongeveer halverwege de lengte van de portaalader.
    OPMERKING: Om het plaatsen van de katheter te ondersteunen, til je het lichaam van de muis op door een tang onder het lichaam te plaatsen om een vlakker oppervlak te garanderen. Lijn de katheternaald zorgvuldig zo parallel mogelijk aan de portaalader voordat je hem inbrengt.
  16. Verwijder de katheternaald.
    OPMERKING: Zorg voor een terugstroom van bloed door de katheter om succesvolle plaatsing aan te geven.
  17. Start de perfusiepomp met een debiet van 2 mL/min, verbind de slang met de katheter en perfusie de lever met 20 mL 1x PBS.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de katheter volledig gevuld is met bloed en dat de slang volledig gevuld is met de perfusiebuffer, voordat je ze aansluit, zodat er absoluut geen luchtbellen in het systeem komen.
  18. Klem de longslagader boven de lever af met een hemostaat om te voorkomen dat de 1x PBS door het hart gaat.
  19. Snijd de inferieure vena cava door om de drukopbouw los te laten.
  20. Stel de pompsnelheid in op 5 mL/min.
    OPMERKING: Wacht ongeveer 15 minuten om de perfusie af te maken.
  21. Stop de pomp om het reservoir te vervangen naar 4% PFA.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat je geen luchtbellen in de buis brengt door de pomp te stoppen terwijl er nog vloeistof in het reservoir zit.
  22. Perfusie de lever met 25 mL 4% PFA.
  23. Zodra de perfusie voltooid is, verwijder je de lever uit de omliggende organen door de verbindende weefsels te snijden.
  24. Plaats de lever in een 50 mL kegelvormige buis, gevuld met 25 mL 4% PFA.
  25. Zet de buis horizontaal op een bankwiegplatform gedurende 1 uur bij kamertemperatuur bij 1,5 toeren, om de beweging van de oplossing te garanderen.
  26. Was de lever drie keer in 1x PBS op een bankwiegplatform gedurende 30 minuten elk op kamertemperatuur bij 1,5 toeren.
  27. Bewaar de lever in 20 mL 1x PBS met 0,02% NaN3 bij 4 °C.
    OPMERKING: Bewaar de lever langdurig in dit stadium, tot minstens één jaar.

3. iDISCO+-gebaseerde weefselverwijdering

OPMERKING: De oorspronkelijke beschrijving van het iDISCO+-protocol is toegankelijk op 17

Dag 1: Monsteruitdroging

  1. Snijd de levermonsters in stukken met een grootte van ongeveer 0,5-1 cm3.
    OPMERKING: Snijd verschillende monsters in verschillende vormen voor gemakkelijker detectie tijdens beeldvormingsstappen.
  2. Maak 20% (vol/vol), 40%, 60% en 80% methanolverdunning in water in aparte glazen flessen.
  3. Plaats levermonsters in glazen flesjes met schroefdoppen (bijv. 4-7 mL).
    OPMERKING: Plaats tot 6 stukjes levermonsters in één glazen flesje van 7 mL.
  4. Dehydrateer het monster met behulp van de methanolverdunning in de H2O-serie, 20% (vol/vol), 40%, 60% en 80% gedurende 1 uur elk bij kamertemperatuur op een wielrotator bij 8 toeren, zonder centrifugatie.
  5. Was het monster met nog een 100% methanol op een wielrotator bij 8 toeren, zonder centrifugatie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  6. Koel het monster op 4 °C gedurende 30 minuten tot 1 uur.
  7. Maak 66% (vol/vol) DCM-verdunning in methanol in een glazen fles.
    OPMERKING: Bereid elke keer nieuwe verdunningen voor. Gebruik glazen cilinders om de oplossing te bereiden, omdat DCM plastic kan oplossen, zoals polystyreen.
  8. Incubeer monsters in 66% DCM/methanoloplossing 's nachts op een wielrotator bij 8 toeren per minuut bij kamertemperatuur, zonder centrifugatie.
    OPMERKING: Wees voorzichtig met monsters die naar boven zweven zodra de oplossing is toegevoegd.

Dag 2: Voorbeeld van bleken

  1. Was het monster twee keer met 100% methanol op een wielrotator bij 8 toeren, zonder centrifugatie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  2. Koel het monster op 4 °C gedurende 30 minuten tot 1 uur.
  3. Bleek het monster in gekoelde 5% H2O2 in methanol (1 volume van 30% H2O2 tot 5 volumes methanol), op een wielrotator bij 8 rpm, zonder centrifugatie, bij 4 °C gedurende de nacht.
    OPMERKING: Bereid elke keer een nieuwe oplossing voor.

Dag 3-5: Monsterpermeabilisatie

  1. Rehydrateer met methanol/H2O-serie: 80%, 60%, 40%, 20%, 1x PBS voor 1 uur bij kamertemperatuur op een wielrotator bij 8 toeren, zonder centrifugatie.
  2. Was het monster twee keer in PTx.2 (Tabel 1) gedurende elk 1 uur op kamertemperatuur op een wielrotator bij 8 toeren, zonder centrifugatie.
  3. Incubeer de monsters in Permeabilisatieoplossing (Tabel 1) bij 37 °C gedurende 2 dagen.

Dag 5-17: Immunolabeling

  1. Blokkeer de monsters in Blocking Solution (Tabel 1) gedurende 2 dagen bij 37 °C.
    OPMERKING: Maak elke keer een verse blokkeringsoplossing vanwege de instabiliteit van het ezelserum. Bewaar de overgebleven blokkende oplossing tot 1 maand op 4°C.
  2. Incubeer de monsters in primaire antilichamen verdund in PTwH (Tabel 1) met 5% DMSO en 3% Donkey Serum bij 37 °C op een wielrotator bij 5 rpm, zonder centrifugatie gedurende 4 dagen.
    OPMERKING: Begin met een primaire antistofverdunning van 1:500.
  3. Was de monsters in PTwH 4-5 keer gedurende 1 uur elk op kamertemperatuur op een wielrotator bij 8 toeren, zonder centrifugatie.
    OPMERKING: Laat de monsters optioneel een nacht wassen.
  4. Incubeer de monsters in secundaire antilichamen en propidiumjodide verdund in PTwH met 3% Donkey Serum bij 37 °C op een wielrotator bij 5 toeren, zonder centrifugatie gedurende 4 dagen.
    OPMERKING: Begin met een secundaire antistofverdunning van 1:500. Gebruik een propidiumjodiedverdunning van 1:250 uit een propidiumjodide-oplossing van 5 mg/mL.
  5. Was de monsters in PTwH 4-5 keer gedurende 1 uur elk op kamertemperatuur op een wielrotator bij 8 toeren, zonder centrifugatie.
  6. Laat het monster 's nachts in PTwH wassen, op kamertemperatuur op een wielrotator op 8 rpm, zonder centrifugatie.

Dag 18: Opklaren

  1. Dehydrateer het monster met behulp van de methanolverdunning in de H2O-serie, 20% (vol/vol), 40%, 60%, 80% gedurende 1 uur elk bij kamertemperatuur op een wielrotator bij 8 rpm, zonder centrifugatie.
  2. Was het monster twee keer met 100% methanol tijdens rotatie gedurende 1 uur op kamertemperatuur op een wielrotator bij 8 tpm, zonder centrifugatie.
  3. Incubeer het monster in 66% (vol/vol) DCM-verdunningen in methanol gedurende 3 uur bij kamertemperatuur op een wielrotator bij 8 rpm, zonder centrifugatie.
  4. Was het monster twee keer in 100% DCM gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een wielrotator bij 8 toeren, zonder centrifugatie.
  5. Incubeer het monster een nacht in DBE bij kamertemperatuur voordat je beeldvorming neemt.
  6. Bewaar de monsters langdurig in DBE tot 1 jaar zonder invloed op het kleursignaal.

4. Confocale microscopiebeeldvorming

  1. Plaats het doorgeklaarde monster in een schaal met een glazen bodem van 35 mm en een #1,5 glazen bodem.
  2. Vul het schaaltje met ethylcinnamat om het monster volledig onder te dompelen.
  3. Plaats de schotel op de confocale en stel de scherpstelling aan om het beste vlak te vinden dat het helderste signaal geeft.
  4. Neem een tegelafbeelding op het helderste vlak om een groot deel van het monster vast te leggen, met een 1024 x 1024 formaat en snelheid 600.
    OPMERKING: Gebruik een lager objectief (10x of 20x) voor het tegelbeeld om de beeldtijd en bestandsgrootte te verkorten.
  5. Op basis van de tegelafbeelding selecteer je interessante gebieden om een z-scan met hogere resolutie te verzamelen.
  6. Maak een z-scan door het vrijgefilterde weefsel, waarbij de hele diepte van het weefsel wordt besproken met de beste resolutie van de microscoop, met 1024 x 1024 formaat en snelheid 600.
    OPMERKING: Gebruik een 40x objectief bij olie-onderdompeling om de beste resolutie voor HSC te krijgen.
  7. Sla afbeeldingsbestanden op in LIF-formaat en bekijk bestanden met Fiji of ImarisViewer 11.0.0.

5. Beeldanalyse voor 3D-reconstructie en kwantitatieve analyse van individuele HSC's

  1. Converteer afbeeldingsbestanden naar IMS-formaat met behulp van de ImarisFileConverter 10.2.0.
  2. Gebruik het Surface-model op Imaris 10.2.0 om het object in de afbeeldingen te detecteren.
  3. Gebruik de Create-wizard om analyse uit te voeren op een geselecteerd 3D-gebied van interesse, en pas deze vervolgens toe op de hele afbeelding.
    OPMERKING: Gebruik dit om het analyseproces te versnellen.
  4. Selecteer het bronkanaal, absolute intensiteit, en haal het uitvinkje voor de gladde knop om de intensiteitsdrempel voor het hele beeld te definiëren.
  5. Pas de drempel aan om alle objecten in de afbeelding vast te leggen.
  6. Gebruik het aantal voxels om puinobjecten eruit te filteren.
  7. Voltooi de wizard, druk op de statistiekknop om alle statistische metingen te krijgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Succesvolle perfusie en fixatie van de muizenlever wordt weergegeven door een uniforme bleke, beige-gele kleur van de lever, wat een efficiënte verwijdering van bloed en penetratie van het fixatief weerspiegelt (Figuur 1A,B). Onjuiste perfusie resulteert in donkerrode of bruine gebieden van bloedstolsels, wat de optische helderheid vermindert en leidt tot een hoog achtergrondsignaal in deze monstergebieden (Figuur 1C

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een reproduceerbare en aanpasbare monstervoorbereidingspijplijn die leidt tot de driedimensionale visualisatie en kwantitatieve analyse van HSC-morfologie in intact leverweefsel. De integratie van genetische fluorescerende cellabeling, in situ leverperfusie en een aangepaste iDISCO+-clearingmethode maakt beeldvorming van grote weefselvolumes met enkelcelresolutie mogelijk, terwijl de ruimtelijke architectuur van de levermicro-omgeving behouden blijft.

...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door 1R01 DK136016-01 en 5P30CA196521 (NCI center grant). Microscopie en/of beeldanalyse werden uitgevoerd bij de Microscopy and Advanced Bioimaging CoRE aan de Icahn School of Medicine in Mount Sinai. Dit onderzoek werd deels ondersteund door het Tisch Cancer Institute at Mount Sinai, P30 CA196521 - Cancer Center Support Grant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-RFP Antibody,rabbit, pre-adsorbedRockland600-401-379
4-Chamber 35mm glass bottom dish with 20 mm microwell, #1.5 cover glassCellvisD35C4201.5N
AnaSed Injection (xylazine injection)Akorn, Inc.NDC 593990110-2020 mg/mL
Conical centrifuge tubes: 50ml Falcon352098
Cotton swabsMedlineMDS202000
Curved Locking HemostatsFisher Scientific16-100-117
Cy3-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch712-165-153
Delicate Operating Scissors 4.75" Curved Sharp/BluntRoboz Surgical Instrument
728501
Dibenzyl Ether (DBE), 98%Sigma Aldrich108014
Dichloromethane (DCM),  ≥99.8%Sigma Aldrich270997
Dimethyl sulfoxide (DMSO), ≥99.9%Sigma AldrichD8418
Donkey anti Rabbit IgG (H+L) Highly Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA31573
Donkey SerumEMD MilliporeS30
Ethyl cinnamate, 99%Sigma Aldrich112372
Extra Fine Micro Dissecting Scissors; 24 mm BladeFisher ScientificNC9232515
F4/80 Monoclonal Antibody ratThermoFisher Scientific14-4801-82
FijiNIH
ForcepsFisher ScientificNC9214139
GlycineBio-Rad1610718
Heparin Sodium SaltChem-Impex29984
Hybaid Hybridization OvenTriad ScientificMaxi 14
Hydrogen peroxide, 30 %Sigma Aldrich31642
Imaris 10.2.0 softwareOxford Instruments
ImarisFileConverter 10.2.0 softwareOxford Instruments
ImarisViewer 11.0.0Oxford Instruments
IV CatheterExel International Inc.EXE 26751
Ketamine, Hydrochloride injectionDechraB8U4100 mg/mL
LAS X 4.4.0.24861 softwareLeica
Leica Stellaris 8 Confocal MicroscopeLeica
Methanol, HPLC gradeFisherA452-2
Multi-purpose rotatorScientific Industries, Inc.Model 151
Needles (27G x 1/2'')BD305109
Paraformadehylde, powder, 95%Sigma Aldrich158127
Peristaltic pumpGilsonModel Minipuls 3
Peristaltic pump tube, MasterFlexThermo Scientific96400-163.1mm ID x 7.6m L/S Peroxide-Cured Silicone Precision Pump Tubing, Size L/S 16, 1/8in Hose Barb
Phosphate Buffered Saline (PBS)CytivaSH30256.01Sterile, pH 7.0 - 7.2, without calcium, magnesium
Propidium iodide, ≥94.0% (HPLC)Sigma AldrichP4170
Razor BladesAmerican Line66-0362
Rocking platformVWRModel 200
Sodium Azide, ≥99.5%Sigma AldrichS2002
SutureEthiconJ109T
Syringe (1 mL)BD309628
TritonX-100SigmaT9284
Tween-20Thermo ScientificJ20605-AP
Vials, screw top with solid cap with aluminum liner, preassembledSigma Aldrich27470-Uvolume 7 mL, amber glass vial, O.D. × H 17 mm × 60 mm, thread for 15-425

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Henderson, N. C., Rieder, F., Wynn, T. A. Fibrosis: from mechanisms to medicines. Nature. 587 (7835), 555-566 (2020).
  2. Wang, S., Friedman, S. L. Found in translation-Fibrosis in metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH). Sci Transl Med. 15 (716), eadi0759(2023).
  3. Amini-Salehi, E., et al. Global prevalence of nonalcoholic fatty liver disease: An updated review meta-analysis comprising a population of 78 million from 38 countries. Arch Med Res. 55 (6), 103043(2024).
  4. Ekstedt, M., et al. Fibrosis stage is the strongest predictor for disease-specific mortality in NAFLD after up to 33 years of follow-up. Hepatology. 61 (5), 1547-1554 (2015).
  5. Hagström, H., et al. Fibrosis stage but not NASH predicts mortality and time to development of severe liver disease in biopsy-proven NAFLD. J Hepatol. 67 (6), 1265-1273 (2017).
  6. Geng, Y., Schwabe, R. F. Hepatic stellate cell heterogeneity: Functional aspects and therapeutic implications. Hepatology. , (2025).
  7. Trinh, V. Q. -H., et al. Hepatic stellate cells maintain liver homeostasis through paracrine neurotrophin-3 signaling that induces hepatocyte proliferation. Sci Signal. 16 (787), eadf6696(2023).
  8. Sugimoto, A., et al. Hepatic stellate cells control liver zonation, size and functions via R-spondin 3. Nature. 640 (8059), 752-761 (2025).
  9. Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
  10. Gäbele, E., Brenner, D. A., Rippe, R. A. Liver fibrosis: Signals leading to the amplification of the fibrogenic hepatic stellate cell. Front Biosci. 8 (4), 69-77 (2003).
  11. Marra, F. Hepatic stellate cells and the regulation of liver inflammation. J Hepatol. 31 (6), 1106-1119 (1999).
  12. Milani, S., et al. Procollagen expression by nonparenchymal rat liver cells in experimental biliary fibrosis. Gastroenterology. 98 (1), 175-184 (1990).
  13. Sato, M., Suzuki, S., Senoo, H. Hepatic stellate cells: Unique characteristics in cell biology and phenotype. Cell Struct Funct. 28 (2), 105-112 (2003).
  14. Du, K., Jun, J. H., Dutta, R. K., Plasticity Diehl, A. M. heterogeneity, and multifunctionality of hepatic stellate cells in liver pathophysiology. Hepatol Commun. 8 (5), e0411(2024).
  15. Trivedi, P., Wang, S., Friedman, S. L. The power of plasticity-Metabolic regulation of hepatic stellate cells. Cell Metab. 33 (2), 242-257 (2021).
  16. Niki, T., et al. Comparison of glial fibrillary acidic protein and desmin staining in normal and CCl4-induced fibrotic rat livers. Hepatology. 23 (6), 1538-1545 (1996).
  17. Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  18. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17 (3), e9807(2021).
  19. Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (1), 43-55 (2014).
  20. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
  21. Mederacke, I., et al. Fate tracing reveals hepatic stellate cells as dominant contributors to liver fibrosis independent of its aetiology. Nat Commun. 4, 2823(2013).
  22. Slater, T. F., Cheeseman, K. H., Ingold, K. U. Carbon tetrachloride toxicity as a model for studying free-radical mediated liver injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 311 (1152), 633-645 (1985).
  23. Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387(2021).
  24. Shrirao, A. B., et al. Autofluorescence of blood and its application in biomedical and clinical research. Biotechnol Bioeng. 118 (12), 4550-4576 (2021).
  25. Croce, A. C., Bottiroli, G. Lipids: Evergreen autofluorescent biomarkers for the liver functional profiling. Eur J Histochem. 61 (2), 2808(2017).
  26. Jafree, D. J., Long, D. A., Scambler, P. J., Moulding, D. Tissue clearing and deep imaging of the kidney using confocal and two-photon microscopy. Methods Mol Biol. , 103-126 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

hepatische stellaire cellenweefselklaringconfocale microscopiedriedimensionale reconstructiebeeldvorming van leverweefselfibrogene myofibroblastenfluorescente labelingmuislevermodellen

Gerelateerde artikelen