Evaluatie van triptolide-effecten op hippocampale gephyrine, collybisine en autofagie in een Aβ1-42 muismodel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de oprichting van een geaggregeerd Aβ1-42-geïnduceerd muismodel dat op Alzheimer lijkt en de beoordeling van triptolide-effecten op hippocampale remmende synapse-geassocieerde eiwitten, PI3K/Akt/GSK-3β signalering en autofagie-gerelateerde markers.

Samenvatting

De ziekte van Alzheimer wordt geassocieerd met synaptische disfunctie, maar gestandaardiseerde procedures voor het evalueren van hoe Aβ-geïnduceerde pathologie de remmende synapse-geassocieerde eiwitten en autofagie-gerelateerde signalering na kandidaatinterventie beïnvloedt, blijven beperkt. Dit protocol beschrijft een workflow voor het opstellen van een Aβ1-42-geïnduceerd muismodel van de ziekte van Alzheimer en het beoordelen van de effecten van triptolide op hippocampale Gephyrine, Collybistine, PI3K/Akt/GSK-3β signalering en autofagie-gerelateerde markers. Volwassen C57BL/6J-muizen krijgen bilaterale intracerebroventriculaire injectie van Aβ1-42, bereid onder aggregatie-inducerende omstandigheden, gevolgd door dagelijkse intraperitoneale toediening van triptolide met of zonder de PI3K-remmer LY294002. Ruimtelijk leren en geheugen worden geëvalueerd met behulp van Morris waterdoolhoftesten. Hippocampale neuronale schade en Aβ-depositie worden beoordeeld met hematoxyline- en eosine kleuring en Aβ-immunohistochemie, en hippocampale lysaten worden geanalyseerd met Western blotting om gephyrine, gefosforyleerde Gephyrin, Collybistine, PI3K/Akt/GSK-3β signaalproteïnen, LC3-II/I en p62 te kwantificeren. Belangrijke procedurele overwegingen zijn gestandaardiseerde Aβ1-42-voorbereiding, nauwkeurige stereotaxische injectie, consistente gedragstestcondities, geblindeerde selectie van interessegebieden en gestandaardiseerde beeld- en densitometrieanalyse. Met deze workflow veroorzaakte de toediening van Aβ1-42 ruimtelijke leer- en geheugentekorten, hippocampale neuronale beschadiging, Aβ-afzetting, verminderde expressie van Gephyrine en Collybistan, veranderde PI3K/Akt/GSK-3β signalering en verhoogde LC3-II/I en p62-accumulatie. Triptolide keerde deze gedrags-, histologische en moleculaire veranderingen gedeeltelijk om, terwijl LY294002 de effecten ervan verzwakte. Dit protocol kan worden gebruikt om Aβ-geïnduceerde hippocampale moleculaire veranderingen en kandidaatinterventies te evalueren, terwijl wordt erkend dat dit model de chronische, multifactoriële progressie van de ziekte van Alzheimer bij de mens niet reproduceert.

Inleiding

De ziekte van Alzheimer (AD) is een progressieve neurodegeneratieve aandoening die wordt gekenmerkt door cognitieve achteruitgang, geheugenproblemen en gedragsstoornissen, en het is een van de belangrijkste oorzaken van dementie bij oudere volwassenen. Hoewel amyloïde-β (Aβ) afzetting, tau-pathologie, synaptische disfunctie, neuro-inflammatie en verstoorde eiwithomeostase breed zijn betrokken bij AD-pathogenese, blijven de moleculaire mechanismen die Aβ-geassocieerde toxiciteit koppelen aan remmende synaptische eiwitverstoring onvolledig begrepen 1,2,3,4 . Remmende synaptische disfunctie kan het evenwicht tussen excitatie en inhibitie in neuronale circuits verstoren, wat bijdraagt aan netwerkinstabiliteit en cognitieve stoornissen. De intracellulaire signaalgebeurtenissen die remmende synapse-geassocieerde scaffold-eiwitten reguleren onder door Aβ geïnduceerde AD-achtige pathologische aandoeningen vereisen echter verdere verduidelijking⁵.

Gephyrine is een belangrijk postsynaptisch scaffolding-eiwit dat remmende neurotransmitterreceptoren, waaronder glycinereceptoren en γ-aminoboterzuur type A receptoren, verankert en stabiliseert op postsynaptische locaties⁶. Collybistine, gecodeerd door ARHGEF9, is een guaninenucleotide-uitwisselingsfactor die interageert met gephyrine en de clustering en membraanlokalisatie van remmende synaptische componenten^{bevordert 7}. De functionele interactie tussen gephyrine en collybistine is daarom essentieel voor de organisatie, het behoud en de plasticiteit van remmende synapsen. Verstoring van dit eiwitcomplex kan de remmende neurotransmissie aantasten en bijdragen aan cognitieve tekorten. Opmerkelijk is dat gephyrinstabiliteit en synaptische clustering kunnen worden gereguleerd door fosforyleringsafhankelijke mechanismen. Aβ-oligomeer-geassocieerde signalering beïnvloedt kinasen zoals glycogeensyntase-kinase-3β (GSK-3β), wat de gefyrinfosforylering bij serine 270 kan bevorderen en daarmee de clustering en afbraak van gephyrine kan beïnvloeden. Deze bevindingen suggereren dat de door kinase-gemedieerde regulatie van Gephyrin een belangrijke moleculaire link kan vormen tussen Aβ-geassocieerde pathologie en remmende synaptische disfunctie ^8,9.

De PI3K/Akt-route is een belangrijke intracellulaire signaalroute die betrokken is bij neuronale overleving, synaptische plasticiteit, eiwithomeostase en autophagieregulatie. Akt-activiteit kan GSK-3β onderdrukken door remmende fosforylering, waardoor downstream substraten die betrokken zijn bij neuronale functie en synaptische stabiliteit worden gemoduleerd. Dysregulatie van PI3K/Akt/GSK-3β signalering is in verband gebracht met AD-gerelateerde neuronale schade en kan bijdragen aan zowel synaptische stoornissen als abnormale eiwitafbraak^10,11. Parallel daarbij is autofagie een essentiële intracellulaire afbraakroute die beschadigde organellen en verkeerd gevouwen eiwitten verwijdert. Autofagie-lysosomale disfunctie is nauw geassocieerd met Aβ-accumulatie, tau-pathologie en neuronale schade in AD¹². Echter, alleen LC3-II/I veranderingen kunnen verhoogde autofagosoomvorming niet onderscheiden van verstoorde autofagische afbraak; Daarom zijn extra markers zoals P62 nodig om autofagie-gerelateerde fluxveranderingen beter te evalueren. Samen ondersteunen deze observaties de noodzaak om PI3K/Akt-activiteit, GSK-3β-gemedieerde regulatie van Gephyrine en autofagie-gerelateerde markers binnen hetzelfde experimentele kader te onderzoeken.

Triptolide, een bioactief diterpeentriepoxide geïsoleerd uit Tripterygium wilfordii, is gerapporteerd als ontstekingsremmende, immunomodulerende en neuroprotectieve effecten¹³. Eerdere studies suggereren dat triptolide cognitieve prestaties kan verbeteren en remmende synapse-geassocieerde eiwitten in AD-achtige modellen kan behouden. Desalniettemin is de mechanistische relatie tussen triptolidebehandeling, PI3K/Akt-routeactivatie, GSK-3β-gemedieerde gefirinefosforylering, collybistyne-expressie en veranderingen in autofagie-gerelateerde eiwitten niet volledig gedefinieerd. Of triptolide hippocampale gephyrine en collybistineexpressie reguleert via een PI3K/Akt/GSK-3β-geassocieerd mechanisme in een door Aβ1-42 geïnduceerd AD-achtig muismodel blijft onduidelijk^14,15.

In vergelijking met chronische transgene AD-modellen, zoals APP/PS1- of 5xFAD-muizen, en tauopathie-gebaseerde modellen, biedt intracerebroventriculaire injectie van geaggregeerd Aβ1-42 een relatief snelle en technisch toegankelijke aanpak om Aβ-geassocieerd hippocampusletsel en cognitieve stoornissen op te wekken. Dit protocol is geschikt wanneer het experimentele doel is om kortetermijn-Aβ-geïnduceerde neurotoxiciteit, hippocampusmoleculaire veranderingen en interventiegerelateerde effecten op gedefinieerde signaalroutes te evalueren. Dit model reproduceert echter niet de chronische amyloïdeproductie, tau-pathologie, vasculaire veranderingen, neuro-immuuncomplexiteit of leeftijdsafhankelijke progressie van menselijke AD. Daarom moeten bevindingen die met dit protocol worden verkregen worden geïnterpreteerd als Aβ-geïnduceerde AD-achtige pathologie en idealiter gevalideerd worden in chronische transgene modellen, tau-gerelateerde modellen of menselijk afgeleide neuronale systemen. Ondanks eerder bewijs dat Aβ-pathologie, PI3K/Akt/GSK-3β-signalering, remmende synapse-geassocieerde eiwitten en autofagie-gerelateerde afwijkingen koppelt aan AD-achtige pathologie, integreren weinig protocollen gedragsonderzoek, hippocampus-histoologische beoordeling, Aβ-immunohistochemie, analyse van remmende synapse-geassocieerde eiwitten, kinase-signaalbeoordeling en detectie van autofagie-gerelateerde markers binnen één Aβ1-42-geïnduceerd interventiemodel. Deze methodologische kloof beperkt de reproduceerbare evaluatie van of kandidaatverbindingen veranderingen in remmende, synapse-geassocieerde eiwitten moduleren via gedefinieerde intracellulaire signaalroutes.

Het doel van dit protocol is het bieden van een reproduceerbare workflow voor het evalueren van hippocampale expressie van Gephyrine en Collybistine en hun bijbehorende regulatiemechanismen in een Aβ1-42-geïnduceerd AD-achtig muismodel behandeld met triptolide, met of zonder de PI3K-remmer LY294002. De oorspronkelijke bijdrage van dit werk is de integratie van stereotaxische toediening van Aβ1-42, farmacologische modulatie van signaalwegen, Morris-waterdoolhoftesten, histologische en immunohistochemische beoordeling, en Western blot-analyse van remmende synapse-geassocieerde eiwitten, PI3K/Akt/GSK-3β signalering en autofagie-gerelateerde markers. De werkhypothese was dat door Aβ1-42 geïnduceerde AD-achtige pathologie geassocieerd zou zijn met verstoorde PI3K/Akt-signalering, veranderde GSK-3β-geassocieerde gephyrinfosforylering, verminderde hippocampale Gephyrine- en Collybistyne-expressie, en abnormale accumulatie van autofagie-gerelateerde eiwitten, terwijl triptolidebehandeling deze gedrags- en moleculaire afwijkingen gedeeltelijk zou omkeren.

Protocol

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Medische Ethische Commissie van de Hubei Universiteit van de Geneeskunde en werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen voor dierenverzorging en gebruik (nr. SYXK2019-0031.). Alle procedures waarbij dieren betrokken zijn, Aβ1-42, triptolide, LY294002, paraformaldehyde, xyleen, ethanol en chemiluminescente reagentia, moeten worden uitgevoerd met passende persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder een laboratoriumjas, handschoenen en beschermende brillen. Dierlijke karkassen, hersenweefsel, met Aβ besmette verbruiksstoffen, paraformaldehydeafval, xyleenafval en met ECL besmette materialen moeten apart worden verzameld en afgevoerd volgens de institutionele voorschriften voor bioveiligheid en chemische afvalverwijdering. Beeldanalyse werd uitgevoerd met ImageJ. Voor immunohistochemische analyse werden beelden omgezet naar 8-bits grijstinten of onderworpen aan kleurdeconvolutie om DAB-positieve kleuring te isoleren. Dezelfde drempel werd toegepast op alle beelden binnen hetzelfde experiment. Het positieve kleuringsgebied, het totale regio-van-interessegebied en de geïntegreerde dichtheid werden gemeten. Voor Western blotting werden bandintensiteiten gemeten met het gelanalyse-instrument na achtergrondaftrekking. Doeleiwitniveaus werden genormaliseerd naar β-actine, terwijl gefosforyleerde eiwitten werden genormaliseerd tot hun overeenkomstige totale eiwitniveaus.

De reagentia en apparatuur die in deze studie worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel, inclusief productnamen, fabrikanten, catalogus- of modelnummers en algemene beschrijvingen.

Dieren en experimentele groepering
Achtenveertig volwassen C57BL/6J-muizen, waaronder 24 mannetjes en 24 vrouwtjes, 10-12 weken oud en met een gewicht van 22-28 g, werden gekocht bij het Animal Experimental Center van de Hubei University of Medicine. De muizen werden gehuisvest onder specifieke ziekteverwekkervrije omstandigheden bij 22 ± 2 °C met vrije toegang tot autoclavenwater en standaard knaagdieret. Na 1 week acclimatisatie werden de muizen willekeurig toegewezen aan vier groepen: de controlegroep, de Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige modelgroep, de triptolide-behandelde groep en de LY294002 plus triptolide co-behandelingsgroep, met 12 muizen per groep. Mannelijke en vrouwelijke muizen waren zo gelijk mogelijk verdeeld over groepen.

Het Aβ1-42-peptide werd opgelost in steriele normale zoutoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 10 μg/μL. Om Aβ1-42 onder aggregatie-inducerende omstandigheden te bereiden, werd de oplossing 7 dagen geïncubeerd bij 37 °C in een circulerend waterbad, voorzichtig gemengd voor gebruik en tijdens de injectie op ijs gelaten. Deze voorbereidingsvoorwaarde is aangepast van eerder gepubliceerde Aβ42-aggregatieprocedures. In de huidige studie werd de aggregatietoestand van de exacte geïnjecteerde Aβ1-42-batch niet onafhankelijk gekarakteriseerd door Thioflavin T-fluorescentie, SDS-PAGE/Western blotting of transmissie-elektronenmicroscopie. Daarom verwijst de term "geaggregeerd Aβ1-42" in dit protocol naar Aβ1-42, bereid onder aggregatie-inducerende incubatiecondities.

Voor modelvestiging werden muizen verdoofd door intraperitoneale injectie van 10% pentobarbital natrium in een dosis van 0,04 mL/10 g lichaamsgewicht. Voldoende verdoving werd bevestigd door het ontbreken van het terugtrekken van het pedaal en de hoornvliesreflexen. Elke muis werd vervolgens vastgezet op een stereotaxisch apparaat, en de hoofdhuid werd afgeschoren en gedesinfecteerd met jodofor, ofwel 75% ethanol. Er werd een middenlijnincisie gemaakt om de schedel bloot te leggen, en de bregma werd onder een stereomicroscoop geïdentificeerd. De schedel werd zo afgesteld dat bregma en lambda op hetzelfde horizontale vlak lagen.

Bilaterale laterale ventrikelinjecties werden uitgevoerd met de volgende coördinaten ten opzichte van bregma: anteroposterior, −0,50 mm; middelzijdig, ±1,00 mm; en dorsoventral, −3,00 mm van het schedeloppervlak. Een totaalvolume van 2 μL geaggregeerde Aβ1-42-oplossing werd langzaam (2 μL/min) in elke laterale ventrikel geïnjecteerd met een microspuit. De injectie werd op een constante, lage snelheid uitgevoerd om weefselschade en reflux te verminderen. Na de injectie bleef de naald ongeveer 5 minuten zitten en werd daarna langzaam teruggetrokken. Controlemuizen kregen een gelijke hoeveelheid steriele normale zoutoplossing op dezelfde coördinaten en met dezelfde chirurgische procedure. Na de injectie werd de hoofdhuidincisie gesloten met hechtingen of wondclips, en werden de muizen in een verwarmde herstelkooi geplaatst totdat ze weer bij bewustzijn kwamen. Postoperatief herstel, lichaamsgewicht, wondgenezing, verzorgingsgedrag, locomotorische activiteit en tekenen van pijn of stress werden dagelijks gemonitord.

De medicatieinterventie werd gestart 2 weken na stereotaxische injectie, nadat het model als stabiel werd beschouwd. Triptolide werd opgelost in normale zoutoplossing met 4% propyleenglycol en dagelijks gedurende 30 opeenvolgende dagen intraperitoneaal toegediend. De met triptolide behandelde groep kreeg triptolide van 0,2 mg/kg per dag, terwijl de groep met een co-behandeling van LY294002 plus triptolide triptolide samen met de PI3K-remmer LY294002 kreeg bij 0,3 mg/kg eenmaal daags gedurende 30 opeenvolgende dagen. De controlegroep en de Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige modelgroep ontvingen gelijke volumes voertuigoplossing met hetzelfde injectieschema¹⁶.

Morris waterdoolhoftest
Ruimtelijk leren en geheugen werden 24 uur na de laatste toediening van het middel met het Morris waterdoolhof beoordeeld. Het waterdoolhof bestond uit een cirkelvormig bassin gevuld met water dat op 22 °C ± 1 °C werd gehouden. Visuele aanwijzingen werden rond het zwembad geplaatst en bleven gedurende het hele experiment ongewijzigd. Tijdens de plaatsnavigatiefase was het verborgen platform vastgesteld in het doelkwadrant. Voor elke dag mochten de muizen ongeveer 30 minuten wennen aan de testruimte.

De plaatsnavigatietest werd zes dagen achter elkaar uitgevoerd. Bij elke poging werd de muis voorzichtig in het water geplaatst, met het gezicht naar de zwembadwand vanuit een van de startkwadranten, en mocht tot wel 60 seconden zoeken naar het verborgen platform. Als de muis het platform binnen 60 seconden vond, mocht hij 15 seconden op het platform blijven. Als de muis het platform niet binnen 60 seconden kon lokaliseren, werd deze naar het platform geleid en daar 20 seconden laten staan om ruimtelijke geheugenconsolidatie te vergemakkelijken. Elke muis onderging 4 proeven per dag, waarbij ontsnappingslatentie, zwemafstand en zwemsnelheid werden vastgelegd met een geautomatiseerd videotrackingsysteem.

Op dag 7 werd het platform verwijderd voor het onderzoek van het onderzoek. De muis werd vanuit het kwadrant tegenover de oorspronkelijke platformlocatie in het water geplaatst en mocht 60 seconden vrij zwemmen. Het aantal perronovergangen en het percentage tijd dat in het doelkwadrant werd doorgebracht, werden geregistreerd. Na elke proef werd de muis gedroogd en teruggebracht naar een verwarmde kooi om onderkoeling^{te voorkomen 17,18}.

Weefselverzameling
Na gedragstesten werden muizen diep verdoofd door intraperitoneale injectie van 10% pentobarbital natrium in een dosis van 0,04 mL/10 g lichaamsgewicht. Acht muizen uit elke groep werden willekeurig geselecteerd voor hippocampale eiwitextractie. Hun hersenen werden snel verwijderd op ijs, en bilaterale hippocampale weefsels werden op een ijskoud oppervlak ontleed. De hippocampale monsters werden in vooraf gelabelde cryovials geplaatst, ingevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij −80 °C tot eiwitextractie.

De overige vier muizen uit elke groep werden gebruikt voor histologische en immunohistochemische analyses. Onder diepe anesthesie werden de muizen transcardiaal gepfuseerd met fosfaatgepufferde zoutoplossing totdat de lever bleek werd, gevolgd door 4% paraformaldehyde. De hersenen werden zorgvuldig verwijderd en daarna vastgezet in 4% paraformaldehyde bij 4 °C gedurende 24 uur. Na fixatie werden de hersenweefsels voorgelegd aan het pathologie-experimentele platform, waar paraffine-inbedding en daaropvolgende secties werden uitgevoerd. Paraformaldehyde werd verwerkt in een chemische dampkap, en afval dat paraformaldehyde bevatte werd apart verzameld volgens de institutionele eisen voor de verwijdering van chemisch afval.

Hematoxyline- en eosinekleuring
Paraffine-ingebedde hersenweefsels werden gesneden in 4 μm coronale secties die de hippocampus bevatten. De secties werden 1 uur gebakken op 60 °C, tweemaal gedeparaffiniseerd in xyleen gedurende elk 10 minuten, en gerehydrateerd via gegradueerde ethanoloplossingen (100%, 95%, 85% en 75%) gevolgd door gedestilleerd water (5 minuten per stap). Na rehydratatie werden secties 10 minuten gekleurd met hematoxyline, afgespoeld in stromend kraanwater, kort onderscheiden in zuur alcohol (2 s) wanneer nodig, en geblueed in stromend kraanwater. De secties werden vervolgens 5 minuten gecontrasteerd met eosine, gedehydrateerd door gegradueerd ethanol, twee keer 5 minuten in xyleen gezuiverd en gemonteerd met neutrale hars.

De morfologie van het hippocampus werd waargenomen onder een lichtmicroscoop. Beelden werden gemaakt van hetzelfde hippocampale subgebied in alle groepen, met behulp van de 20× vergrotings- en beeldvormingsparameters. Neuronale schade werd beoordeeld op basis van neuronale dichtheid, nucleaire pyknose en wanordelijke ordening met behulp van beeldanalysesoftware door een onderzoeker die blind was voor groepstoewijzing¹⁹.

Aβ immunohistochemie
Voor Aβ-immunohistochemie werden paraffinesecties gedeparaffiniseerd en gerehydrateerd zoals beschreven voor hematoxyline- en eozinkleuring. Antigeenterugwinning werd uitgevoerd in de EDTA-antigeenterugvindingsbuffer bij pH 8,0 door de secties twee keer 3 minuten op hoog vermogen in een magnetron te verwarmen. De secties werden afgekoeld tot kamertemperatuur en daarna drie keer gewassen met PBS gedurende 5 minuten per stuk. De endogene peroxidaseactiviteit werd geblokkeerd met 3% waterstofperoxide gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door PBS-wasbeurt drie keer gedurende 5 minuten per stuk. Niet-specifieke binding werd geblokkeerd met 5% normaal geitenserum gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De secties werden 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met een primaire antistof tegen Aβ verdund op 1:200 in PBS. Na de incubatie werden de secties drie keer gewassen met PBS gedurende 5 minuten, waarna ze 60 minuten bij kamertemperatuur werden geïncubeerd met een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam. Na het wassen met PBS werd DAB-substraat aangebracht en werd de kleurontwikkeling onder een microscoop gevolgd. De reactie werd gestopt met gedestilleerd water zodra bruin-positieve kleuring zichtbaar werd. Secties werden tegengekleurd met hematoxyline, gedehydrateerd met gegradueerd ethanol, gecleared met xyleen en gemonteerd met neutrale hars. Beelden werden gemaakt vanuit hetzelfde hippocampale subgebied in alle groepen met identieke microscoopinstellingen bij 20× vergroting. Aβ-immunokleuring werd gekwantificeerd met behulp van beeldanalysesoftware. De positieve kleuringsdrempel bleef consistent over alle beelden, en de Aβ-afzetting werd berekend als het positieve kleuringsgebied gedeeld door het totale aantal cellen in elk microscopisch veld.

Extractie van hippocampale eiwitten en western blot-analyse
Bevroren hippocampusweefsel werd op ijs gehouden en gehomogeniseerd in ijskoude RIPA-lysebuffer met protease- en fosfataseremmers. De homogenaten werden 30 minuten op ijs geïncubeerd en met tussenpozen gevortexed om voldoende lysis te garanderen. Vervolgens werden lysaten gecentrifugeerd op 12.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C, en de supernatanten werden verzameld voor eiwitanalyse. De eiwitconcentraties werden bepaald met behulp van een BCA-eiwitassaykit volgens de instructies van de fabrikant. Kort gezegd werden BSA-standaarden en eiwitmonsters in duplicaat bereid, gemengd met BCA-werkreagens, 30 minuten geïncubeerd bij 37 °C en gemeten op 562 nm met een microplaatlezer. De eiwitconcentraties werden berekend volgens de standaardcurve en alle monsters werden aangepast naar dezelfde uiteindelijke concentratie vóór elektroforese²⁰.

20 μg totaal eiwit uit elk hippocampaal monster werd gescheiden door 12% SDS-PAGE en overgedragen op PVDF-membranen. Elektroforese werd uitgevoerd bij 80 V voor stapeling en 120 V voor scheiding. Eiwitten werden overgebracht naar PVDF-membranen die in methanol werden geactiveerd met behulp van natte transfer bij 100 V gedurende 90 minuten bij 4 °C. Na de overdracht werden de membranen 1 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd met 5% BSA. De membranen werden vervolgens 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met primaire antilichamen tegen gephyrine (1:1000 verdunning), gefosforyleerde gephyrine (1:500 verdunning), collybistine (1:1000 verdunning), PI3K (1:1000 verdunning), Akt (1:1000 verdunning), gefosforyleerd Akt (1:1000 verdunning), GSK-3β (1:1000 verdunning), gefosforyleerd GSK-3β (1:1000 verdunning), LC3 (1:1000 verdunning), p62 (1:1000 verdunning) en β-actine (1:5000 verdunning). Na het wassen met TBST werden de membranen 1 uur op kamertemperatuur geïncubeerd met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:5000 verdunning). Eiwitbanden werden gevisualiseerd met behulp van ECL chemiluminescente substraat en vastgelegd met een chemiluminescentiebeeldvormingssysteem. Bandintensiteiten werden gekwantificeerd met behulp van beeldanalysesoftware. De totale eiwitexpressieniveaus werden genormaliseerd naar β-actine. Hoogresolutie niet-bijgesneden Western blot-afbeeldingen werden opgenomen in het aanvullende materiaal.

Statistische gegevens
Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van software voor statistische analyse en grafiekgeneratie. De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD, zoals aangegeven in de figuurlegendes. Gedragstesten en beeldkwantificatie werden uitgevoerd door onderzoekers die blind waren voor groepstoewijzing. De ontsnappingslatentie tijdens de trainingsfase van het Morris-waterdoolhof werd geanalyseerd met tweerichtings-repeated-measures ANOVA, waarbij groep en trainingsdag als factoren dienden. Probe-trialgegevens, histologische kwantificatie, immunohistochemische kwantificering en Western blot-densitometrie werden geanalyseerd met behulp van een eenrichtingstest van ANOVA. Statistische significantie werd gedefinieerd als p < 0,05. De standaard significantienotatie werd als volgt gebruikt: *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001. Exacte steekproefgroottes werden vermeld in de bijbehorende figuurlegendes. Mannelijke en vrouwelijke muizen waren gelijkmatig verdeeld over de experimentele groepen. Echter, er werd geen geslachtsgestratificeerde statistische analyse uitgevoerd omdat de studie niet was ontworpen of uitgerust om geslachtsspecifieke effecten te detecteren. Deze beperking wordt erkend in de Discussiesectie.

Resultaten

Verminderd leren en geheugen bij Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige muizen en gedeeltelijke verbetering na triptolidebehandeling

Om een Aβ1-42-geïnduceerd AD-achtig muismodel op te zetten, werd geaggregeerd Aβ1-42 stereotaxisch geïnjecteerd in de bilaterale laterale ventrikels van C57BL/6J-muizen. Na het vestigen van het model werden muizen behandeld met voertuigen, triptolide of triptolide, gecombineerd met de PI3K-remmer LY294002. Ruimtelijk leren en geheugen werden vervolgens geëvalueerd met behulp van het Morris waterdoolhof.

Tijdens de 6-daagse plaatsnavigatiefase nam de ontsnappingslatentie geleidelijk af in alle groepen, wat aangeeft dat de muizen de ruimtelijke leertaak hebben overgenomen door herhaalde training (Figuur 1A). Echter, door Aβ1-42 geïnduceerde AD-achtige muizen vertoonden consequent langere ontsnappingslatenties dan controlemuizen, vooral op latere trainingsdagen, wat wijst op verminderd ruimtelijk leren. Triptolidebehandeling verkortte de ontsnappingslatentie vergeleken met de Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige modelgroep, terwijl co-behandeling met LY294002 deze verbetering verzwakte. Deze bevindingen geven aan dat triptolide gedeeltelijk de door Aβ1-42 veroorzaakte ruimtelijke leerstoornis verbeterde, en dit effect werd afgezwakt door PI3K-inhibitie.

Representatieve zwembanen ondersteunden deze gedragsveranderingen verder (Figuur 1B). Controlemuizen vertoonden een directer, doelgericht zoekpatroon rond de platformlocatie, terwijl Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige muizen een verspreide, inefficiënte zwembaan vertoonden. Met triptolide behandelde muizen vertoonden verbeterd zoekgedrag, met banen die zich meer concentreerden rond het doelgebied. Daarentegen vertoonden muizen die met LY294002 en triptolide werden behandeld minder efficiënt zoeken dan muizen die alleen met triptolide werden behandeld. In de probe-proef na het verwijderen van het platform kruisten Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige muizen de oorspronkelijke platformlocatie minder vaak dan controlemuizen, wat wijst op een verminderde ruimtelijke geheugenretentie (Figuur 1C). Triptolidebehandeling verhoogde het aantal platformovergangen, terwijl LY294002 co-behandeling dit effect verminderde. Evenzo werd het percentage tijd in het doelkwadrant verminderd bij Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige muizen vergeleken met controlemuizen, verhoogd na triptolidebehandeling en weer afgenomen na LY294002 co-behandeling (Figuur 1D).

Samen tonen deze gedragsresultaten aan dat bilaterale intracerebroventriculaire injectie van geaggregeerde Aβ1-42 ruimtelijke leer- en geheugentekorten bij muizen veroorzaakte. Triptolide keerde deze gedragsstoornissen gedeeltelijk om, terwijl LY294002 het beschermende effect van triptolide verzwakte, wat suggereert dat PI3K/Akt-signalering kan bijdragen aan de gedragseffecten die in dit model worden waargenomen.

Aβ1-42-injectie veroorzaakte hippocampale neuronale schade en Aβ-depositie, die werden verzwakt door triptolide.

Om de vaststelling van Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige pathologische veranderingen verder te verifiëren en het effect van triptolide op hippocampusletsel te evalueren, werden hematoxyline- en eosinekleuring en Aβ-immunohistochemie uitgevoerd op hersensecties van elke groep.

HE-kleuring toonde aan dat neuronen in de controlegroep dicht en regelmatig gerangschikt waren, met relatief duidelijke celmorfologie en nucleaire structuur (Figuur 2A). Daarentegen vertoonden Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige muizen duidelijke neurole schade aan de hippocampus, gekenmerkt door een verstoorde cellulaire ordening, verminderde neuronale dichtheid en verhoogde nucleaire condensatie. Triptolidebehandeling verbeterde gedeeltelijk de morfologie van de hippocampale neuronen, met een beter bewaarde cellulaire ordening en minder zichtbare nucleaire pyknose vergeleken met de door Aβ1-42 geïnduceerde modelgroep. Echter, cobehandeling met LY294002 verzwakte het beschermende effect van triptolide, wat tot uiting komt in een meer uitgesproken neuronale desorganisatie en beschadiging vergeleken met de met triptolide behandelde groep.

Vervolgens werd de Aβ-immunohistochemie uitgevoerd om de Aβ-afzetting in de hippocampus te beoordelen (Figuur 2B). Minimale Aβ-positieve kleuring werd waargenomen in de controlegroep, terwijl de door Aβ1-42 geïnduceerde AD-achtige modelgroep duidelijk verhoogde bruine Aβ-positieve signalen liet zien. Triptolidebehandeling verminderde Aβ-positieve kleuring vergeleken met de modelgroep, wat aangeeft dat triptolide de Aβ-afzetting in dit model verzwakte. Daarentegen vertoonden muizen behandeld met LY294002 plus triptolide een verhoogde Aβ-positieve kleuring vergeleken met muizen die alleen met triptolide werden behandeld. Kwantitatieve analyse bevestigde deze histologische waarnemingen verder. Het Aβ-positieve signaalgebied genormaliseerd naar het totale aantal cellen in elk microscopisch veld werd verhoogd in de Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige modelgroep vergeleken met de controlegroep, verminderd na triptolidebehandeling en gedeeltelijk weer verhoogd na LY294002 co-behandeling (Figuur 2B).

Deze resultaten geven aan dat Aβ1-42-injectie induceerde hippocampale neuronale schade en Aβ-accumulatie, terwijl triptolide deze pathologische veranderingen gedeeltelijk verlichtte. De omkering die na LY294002 co-behandeling wordt waargenomen, suggereert dat PI3K/Akt-signalering kan bijdragen aan het beschermende effect van triptoliede.

Triptolide herstelde de expressie van hippocampale gephyrine en collybistine en moduleerde PI3K/Akt/GSK-3β signalering

Om te bepalen of de gedrags- en histologische veranderingen gepaard gingen met veranderingen in remmende synapse-geassocieerde eiwitten en hun upstream regulatieve signalering, werden hippocampale lysaten van elke groep geanalyseerd met Western blotting. Vergeleken met de controlegroep vertoonden Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige muizen een duidelijke vermindering van hippocampale Gephyrine-expressie, terwijl de gefosforyleerde Gephyrine-niveaus verhoogd waren (Figuur 3A). Triptolidebehandeling herstelde gedeeltelijk de totale gefyrinexpressie en verlaagde de gefosforyleerde gefyrinniveaus. Daarentegen verzwakte LY294002 co-behandeling het effect van triptolide, zoals blijkt uit verminderde gefyrinexpressie en verhoogde fosforylatie gephyrine in vergelijking met de triptolide-behandelde groep. Deze resultaten suggereren dat door Aβ1-42 geïnduceerde pathologie niet alleen geassocieerd was met een verminderde hippocampale gephyrine-abundantie, maar ook met verhoogde gefyrinfosforylering, terwijl triptolide deze veranderingen gedeeltelijk omkeerde.

Collybistine vertoonde een vergelijkbaar expressiepatroon als totale Gephyrin. Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige muizen vertoonden een verminderde expressie van hippocampale Collybistine vergeleken met controlemuizen, terwijl triptolidbehandeling de expressie van Collybistine herstelde. LY294002 co-behandeling keerde dit effect gedeeltelijk om (Figuur 3B). Deze bevindingen geven aan dat triptolide de expressie van remmende, synapse-geassocieerde scaffold-eiwitten in de hippocampus behield, en dat dit effect werd afgezwakt door PI3K-inhibitie. De PI3K/Akt/GSK-3β signaalroute werd vervolgens onderzocht om de moleculaire veranderingen die ten grondslag liggen aan de gefirinefosforylering verder te verduidelijken. In de Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige modelgroep waren PI3K-expressie en de p-Akt/Akt-verhouding verminderd ten opzichte van de controlegroep, wat wijst op verminderde PI3K/Akt-signaalactiviteit (Figuur 3B). De p-GSK-3β/GSK-3β-verhouding werd ook verlaagd in de modelgroep. Omdat fosforylering van GSK-3β op de remmende plaats de onderdrukking van GSK-3β-activiteit weerspiegelt, suggereert deze reductie een relatief verhoogde GSK-3β-activiteit in de door Aβ1-42 geïnduceerde AD-achtige hippocampus. Triptolidebehandeling verhoogde de PI3K-expressie, herstelde de p-Akt/Akt-verhouding en verhoogde de p-GSK-3β/GSK-3β-verhouding. Deze effecten werden verzwakt door LY294002 co-behandeling.

Samen suggereren deze resultaten dat door Aβ1-42 geïnduceerde AD-achtige pathologie geassocieerd was met verminderde hippocampale gephyrine- en collybistage-expressie, verhoogde gefyrinfosforylering en een verstoorde PI3K/Akt-gemedieerde remmende fosforylering van GSK-3β. Triptolide keerde deze moleculaire veranderingen gedeeltelijk om, terwijl LY294002 de effecten van triptolide verzwakte, wat de betrokkenheid van PI3K/Akt/GSK-3β signalering bij de regulatie van hippocampale gefirine en collybistine in dit model ondersteunde.

Triptolide-verzwakte autofagie-gerelateerde eiwitafwijkingen in de hippocampus van Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige muizen

Om te bepalen of Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige pathologie en triptolidebehandeling geassocieerd waren met veranderingen in autofagie-gerelateerde eiwitten, werden LC3- en p62-expressie onderzocht in hippocampale lysaten met Western blotting. In vergelijking met de controlegroep vertoonden Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige muizen een verhoogde LC3-II/I-ratio, wat wijst op een verhoogde accumulatie van LC3-II geassocieerd met autofagosomen. Parallel daarmee was de p62-expressie ook verhoogd in de modelgroep, wat wijst op ophoping van autofagie-gerelateerde substraten in de hippocampus. Triptolidebehandeling verminderde zowel de LC3-II/I-ratio als de p62-expressie vergeleken met de door Aβ1-42 geïnduceerde AD-achtige modelgroep. Deze resultaten geven aan dat triptolide de abnormale ophoping van autofagie-gerelateerde eiwitten die door Aβ1-42 worden geïnduceerd, verzwakte. Daarentegen verhoogde LY294002 cobehandeling de LC3-II/I-verhouding en de p62-expressie vergeleken met alleen triptolidebehandeling, wat suggereert dat PI3K-remming het effect van triptolide op autofagie-gerelateerde eiwitveranderingen verzwakte (Figuur 4).

Over het geheel genomen leverde de controlegroep het basis-gedrags-, histologische en moleculaire profiel, terwijl de door Aβ1-42 geïnduceerde AD-achtige modelgroep bevestigde dat intracerebroventriculaire toediening van Aβ1-42 cognitieve stoornissen, hippocampusneuronale beschadiging, Aβ-afzetting, verminderde remmende synapse-geassocieerde eiwitten, veranderingen in PI3K/Akt/GSK-3β signalering en accumulatie van autofagie-gerelateerde eiwitten veroorzaakte. De vergelijking tussen de door Aβ1-42 geïnduceerde modelgroep en de met triptolide behandelde groep toonde aan dat triptolide deze afwijkingen gedeeltelijk omkeerde. De vergelijking tussen de met triptolide behandelde groep en de groep met LY294002 plus triptolideco-behandeling toonde verder aan dat de remming van PI3K de effecten van triptolide verzwakte. Deze resultaten ondersteunen de werkhypothese dat triptolide veranderingen moduleert in hippocampale Gephyrine, Collybistine en autofagie-gerelateerde eiwitten in een Aβ1-42-geïnduceerd AD-achtig model via een PI3K/Akt/GSK-3β-geassocieerd mechanisme.

BESCHIKBAARHEID GEGEVENS:

Alle ruwe gegevens die nodig zijn om de bevindingen van deze studie te reproduceren, worden verstrekt als Aanvullend Bestand 1 en Aanvullend Bestand 2. Deze omvatten de originele western blot- en gelbeelden, niet-bijgesneden blotgegevens, ruwe numerieke waarden gebruikt voor statistische analyses, en de gegenereerde grafieken. (Aanvullend Dossier 1 en Aanvullend Dossier 2) Deze bestanden leveren de ruwe gegevens ter ondersteuning van de kwantitatieve resultaten die in Figuur 1–4 worden gerapporteerd.

Figuur 1: Triptolide verbeterde gedeeltelijk het ruimtelijke leren en geheugentekorten bij Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige muizen. (A) Ontsnappingsvertraging tijdens de 6-daagse plaatsnavigatiefase van het Morris waterdoolhof. (B) Vertegenwoordigende zwemtrajecten tijdens de probe-proef. (C) Aantal overgangen over de oorspronkelijke perronlocatie na het verwijderen van het perron. (D) Percentage van de tijd die tijdens de probe-proef in het doelkwadrant wordt doorgebracht. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. De ontsnappingslatentie werd geanalyseerd door tweerichtings-repeated-measures ANOVA, en de probe-trialgegevens werden geanalyseerd met een eenrichtings-ANOVA-test. Ctr, controlegroep; AD, Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige modelgroep; TP, met triptolide behandelde groep; LY, LY294002 plus triptolide-co-behandeling groep. n = 6 per groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Triptolid-verzwakte hippocampale neuronale schade en Aβ-afzetting bij Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige muizen. (A) Representatieve hematoxyline- en eosine kleurbeelden van hippocampale doorsneden uit elke groep. Schaalbalk = 50μm. (B) Representatieve Aβ immunohistochemische kleuringsbeelden en kwantitatieve analyse van Aβ-positieve afzetting in de hippocampus. Schaalbalk = 50μm. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Statistische analyse werd uitgevoerd met een eenrichtingstest van ANOVA. Ctr, controlegroep; AD, Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige modelgroep; TP, met triptolide behandelde groep; LY, LY294002 plus triptolide-co-behandeling groep. n = 3 per groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Triptolide herstelde hippocampale gephyrine en collybistine-expressie en moduleerde PI3K/Akt/GSK-3β-geassocieerde signalering in Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige muizen. (A) Representatieve Western blot-beelden en kwantitatieve analyse van totale gephyrin- en gefosforyleerde gephyrinexpressie in hippocampale lysaten van elke groep. (B) Representatieve Western blot-beelden en kwantitatieve analyse van Collybistin, PI3K, Akt, gefosforyleerd Akt, GSK-3β en gefosforyleerd GSK-3β in hippocampale lysaten. Collybisine en PI3K werden genormaliseerd tot β-actine. Gefosforyleerd Akt en gefosforyleerd GSK-3β werden respectievelijk gekwantificeerd als p-Akt/Akt en p-GSK-3β/GSK-3β verhoudingen. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Statistische analyse werd uitgevoerd met een eenrichtingstest van ANOVA. Ctr, controlegroep; AD, Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige modelgroep; TP, met triptolide behandelde groep; LY, LY294002 plus triptolide-co-behandeling groep. n = 3 per groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Triptolide-verzwakte autofagie-gerelateerde eiwitafwijkingen in de hippocampus van Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige muizen. Representatieve Western blot-beelden en kwantitatieve analyse van LC3-I/II en p62-expressie in hippocampale lysaten uit elke groep. De LC3-II/I-verhouding werd berekend door de intensiteit van de LC3-II-band te delen door de intensiteit van de LC3-I-band, en de expressie van p62 werd genormaliseerd naar β-actine. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Statistische analyse werd uitgevoerd met een eenrichtingstest van ANOVA. Ctr, controlegroep; AD, Aβ1-42-geïnduceerde AD-achtige modelgroep; TP, met triptolide behandelde groep; LY, LY294002 plus triptolide-co-behandeling groep. n = 3 per groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Ongeknipte Western blot-afbeeldingen. De banden die voor kwantificering worden gebruikt worden aangegeven, en molecuulgewichtmarkers worden getoond waar beschikbaar. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend Bestand 2: Ruwe numerieke waarden gebruikt voor statistische analyses in dit artikel. Dit bestand bevat de ruwe numerieke datasets die zijn gebruikt om de kwantitatieve grafieken in Figuur 1–4 te genereren, waaronder gedragsmetingen van het Morris-waterdoolhof, Aβ-immunohistochemiekwantificering en Western blot-densitometriewaarden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De centrale mechanistische suggestie van deze studie is dat door Aβ1-42 geïnduceerde pathologie PI3K/Akt-signalering onderdrukt, de remmende fosforylering van GSK-3β vermindert, de fosforylering van gephyrine bevordert, de expressie van hippocampale Gephyrine en Collybistine vermindert, en bijdraagt aan de accumulatie van autofagie-gerelateerde eiwitten, terwijl triptolide deze veranderingen gedeeltelijk tegengaat via een PI3K/Akt/GSK-3β-geassocieerde route. Deze studie toont aan dat door Aβ1-42 geïnduceerde AD-achtige pathologie gepaard gaat met verminderd ruimtelijk leren en geheugen, hippocampale neuronale beschadiging, verhoogde Aβ-afzetting, verminderde expressie van Gephyrine en Collybistan, verbeterde gefyrinfosforylering, veranderde PI3K/Akt/GSK-3β signalering en ophoping van autofagie-gerelateerde eiwitten. Triptolide keerde deze gedrags-, histologische en moleculaire afwijkingen gedeeltelijk om, terwijl LY294002 de effecten ervan verzwakte. Deze bevindingen ondersteunen een model waarin triptolide hippocampale inhiberende, synapse-geassocieerde eiwitten beschermt, ten minste gedeeltelijk, via PI3K/Akt/GSK-3β-gemedieerde regulatie van gephyrinfosforylering en veranderingen in autofagie-gerelateerde eiwitten. Het moet worden opgemerkt dat het Aβ1-42 intracerebroventriculaire injectiemodel voornamelijk Aβ-geïnduceerde neurotoxiciteit en AD-achtige pathologie weerspiegelt, in plaats van de volledige chronische, multifactoriële progressie van menselijk AD²¹.

Gefirine en Collybistine zijn centrale componenten van de remmende synaptische organisatie. Gephyrine verankert remmende neurotransmitterreceptoren op postsynaptische plaatsen, terwijl Collybistine gephyrinclustering en membraanlokalisatie bevordert. Verminderde expressie van deze eiwitten kan daarom de remmende synaptische stabiliteit verstoren en bijdragen aan een verminderde functie van het hippocampusnetwerk⁸. In deze studie verminderde Aβ1-42 de expressie van hippocampale Gephyrine en Collybistine, terwijl triptolide beide eiwitten herstelde. De toename van gefosforyleerde gefirine biedt een plausibbel mechanisme voor gefyrinverlies, aangezien fosforylering bij Ser270 in verband is gebracht met gefyrine-verspreiding, verminderde clustervorming en eiwitdestabilisatie. De parallelle vermindering van PI3K-expressie, Akt-fosforylering en remmende fosforylering van GSK-3β suggereert dat Aβ1-42 de PI3K/Akt-signalering verzwakt en mogelijk de GSK-3β-activiteit verhoogt, wat consistent is met een verhoogde gefirrinfosforylering. Omgekeerd herstelde triptolide de fosforylering van Akt, verhoogde de remmende fosforylering van GSK-3β en verminderde de gefirinefosforylering, terwijl LY294002 deze effecten verzwakte. Deze resultaten suggereren dat triptolide de expressie van gephyrine en collybistine kan behouden via PI3K/Akt/GSK-3β-geassocieerde regulatie van gephyrinfosforylering. Omdat echter volledige hippocampale lysaten werden gebruikt, weerspiegelen deze bevindingen veranderingen in hippocampale eiwitabundantie en fosforylering in plaats van direct bewijs van synaptische lokalisatie^22,23.

Autofagie-gerelateerde afwijkingen kunnen ook bijdragen aan de moleculaire veranderingen die in dit model worden waargenomen. Autofagie is belangrijk voor neuronale proteostase, maar verstoorde autofagische afbraak bij AD kan leiden tot de ophoping van autofagosomen en pathologische eiwitsubstraten^24,25. In de huidige studie verhoogde Aβ1-42 zowel de LC3-II/I-ratio als de p62-expressie, wat wijst op ophoping van autofagosoom-geassocieerde LC3-II en autofagie-gerelateerde substraten. Triptolide verminderde beide markers, terwijl LY294002 dit effect gedeeltelijk omkeerde, wat suggereert dat triptolide de autofagie-gerelateerde eiwitaccumulatie via een PI3K/Akt-afhankelijk mechanisme kan verminderen. Samen met de veranderingen in Gephyrine, Collybisine en PI3K/Akt/GSK-3β signalering, breiden deze bevindingen het begrip van de neuroprotectieve effecten van triptolide verder dan ontstekingsremmende of algemene neuroprotectieve werking, wat suggereert dat triptolide ook invloed kan hebben op remmende synapse-geassocieerde scaffold-eiwitten, kinase-signalering en proteostase-gerelateerde routes in Aβ-geassocieerde AD-achtige pathologie²⁶.

Verschillende cruciale stappen bepalen het succes en de reproduceerbaarheid van dit protocol. Ten eerste moet de aggregatietoestand van Aβ1-42 zorgvuldig worden gecontroleerd en geverifieerd vóór injectie, omdat peptidevoorbereiding een sterke invloed kan hebben op pathologische uitkomsten. Ten tweede is nauwkeurige stereotaxische injectie in de laterale ventrikels essentieel; reflux, verkeerde plaatsing van de naald of een te hoge injectiesnelheid kunnen leiden tot variabele blootstelling aan Aβ en inconsistente gedrags- of histologische uitkomsten. Ten derde vereist het testen van het Morris-waterdoolhof stabiele visuele aanwijzingen, een constante watertemperatuur en monitoring van de zwemsnelheid om motorische beperkingen als verstorende factor uit te sluiten. Ten vierde moet histologische en immunohistochemische kwantificering worden uitgevoerd met behulp van vooraf gedefinieerde hippocampale interessegebieden en geblindeerde analyse. Ten slotte zijn de resultaten van Western blot afhankelijk van gelijke eiwitbelasting, geschikte gelconcentratie, efficiënte overdracht en het gebruik van niet-bijgesneden blotbeelden om de bandspecificiteit te bevestigen.

Er moeten verschillende beperkingen worden overwogen. Ten eerste reproduceert het Aβ1-42 injectiemodel niet de chronische progressie, tau-pathologie, vasculaire veranderingen of neuro-immuuncomplexiteit van menselijke AD. Ten tweede, hoewel mannelijke en vrouwelijke muizen gelijk verdeeld waren over groepen, was de studie niet ondersteund voor geslachtsgestratificeerde analyse²⁷. Ten derde kunnen hele hippocampale lysaten niet bepalen of veranderingen in Gephyrin en Collybistine specifiek optreden bij remmende synapsen. Ten vierde blijft het voorgestelde PI3K/Akt/GSK-3β–Gephyrine-mechanisme associatief, omdat GSK-3β-activiteit en gephyrine Ser270-fosforylering niet direct werden gemanipuleerd. Ten slotte zijn LC3-II/I en p62 statische Western blot-uitlezingen en kunnen ze dynamische autofagische flux niet volledig definiëren. Toekomstige studies moeten gebruik maken van synaptosomale fractionering, immunofluorescentie co-lokalisatie met remmende postsynaptische markers, GSK-3β gain- of -verlies-benaderingen van functie, Gephyrin Ser270 mutante constructies en lysosomale inhibitor-gebaseerde fluxassays. Validatie in chronische transgene AD-modellen, tau-gerelateerde modellen en menselijk afgeleide neuronale systemen zal ook nodig zijn om te bepalen of deze route breed relevant is voor AD-pathologie¹⁴. Een verdere beperking is dat de aggregatietoestand van de exacte Aβ1-42-preparaat die werd gebruikt voor stereotaxische injectie niet onafhankelijk werd gevalideerd door Thioflavin T-fluorescentie, SDS-PAGE/Western blotting of transmissie-elektronenmicroscopie. Hoewel het peptide werd bereid met een langdurige incubatieprocedure van 37 °C die vaak wordt gebruikt om Aβ1-42-aggregatie te bevorderen, kan batch-tot-batch variatie in aggregatietoestand pathologische uitkomsten beïnvloeden. Toekomstige studies zouden deze workflow moeten valideren in chronische transgene AD-modellen, tau-gerelateerde modellen en door mensen afgeleide neuronale systemen. Aanvullende experimenten moeten directe validatie van de Aβ1-42 aggregatiestatus, de nauwkeurigheid van stereotaxische injecties met behulp van kleurstof- of anatomische verificatie, synaptosomale fractionering, immunofluorescentie co-lokalisatie met remmende postsynaptische markers, GSK-3β gain- of -verlies-benaderingen omvatten, Gephyrin Ser270 mutantexperimenten en lysosomale inhibitor-gebaseerde autofagische fluxassays. Dose-respons- en veiligheidsstudies van triptolide zijn ook nodig voordat translationele toepassingen kunnen worden overwogen

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-Gephyrin antibody	12681	Peoteintech	Primaire antistof voor Western blot detectie van totaal Gephyrin.
Anti-phosphorylated-Gephyrin  antibody	147011	Synaptic Systems	Primaire antistof voor Western blot detectie van gefosforyleerd Gephyrin.
Anti-Collybistin antibody	ab316963	abcam	Primaire antistof voor Western blot detectie van Collybistin.
Anti-PI3K antibody	27921	Peoteintech	Primaire antistof voor Western blot detectie van PI3K.
Anti-Akt antibody	9272	Cell Signaling Technology	Primaire antistof voor Western blot detectie van totaal Akt.
Anti-phosphorylated Akt antibody	4060	Cell Signaling Technology	Primaire antistof voor Western blot detectie van gefosforyleerd Akt.
Anti-GSK-3β antibody	12456	Cell Signaling Technology	Primaire antistof voor Western blot detectie van totaal GSK-3β.
Anti-phosphorylated GSK-3β antibody	5558	Cell Signaling Technology	Primaire antistof voor Western blot detectie van gefosforyleerd GSK-3β.
Anti-β actin antibody	66009	Peoteintech	Ladingscontrole antistof voor Western blot normalisatie.
Anti-LC3 antibody	11972	Cell Signaling Technology	Primaire antistof voor Western blot detectie van LC3-I en LC3-II.
Anti-p62 antibody	5114	Cell Signaling Technology	Primaire antistof voor Western blot detectie van p62/SQSTM1.
Anti-Aβ1-42 antibody	ab150155	abcam	Primaire antistof voor detectie van Aβ1-42.
HRP-geconjugeerde secundaire antistof (anti-muis IgG)	7076S	Cell Signaling Technology	Secundaire antistof voor muis primaire antistoffen in Western blotting.
HRP-geconjugeerde secundaire antistof (anti-konijn IgG)	7074S	Cell Signaling Technology	Secundaire antistof voor konijn primaire antistoffen in Western blotting.
Anti-Aβ antibody	GT622,	Invitrogen,	Primaire antistof voor Aβ immunohistologie.
Aβ1-42	9001	Shanghai Duma Technology Co., Ltd.	Amyloid-β peptide gebruikt voor de bereiding van de aggregatie-inducerende injectieoplossing.
triptolide	BD9097	Shanghai Bide Pharmaceutical.	Testverbinding intraperitoneaal toegediend.
LY294002	ab120243	abcam	PI3K-remmer gebruikt voor de co-behandelingsgroep.
paraformaldehyde	P0099	Beyotime	Fixeermiddel voor transcardiale perfusie en weefsel post-fixatie.
xyleen	108298	Merck	Deparaffinisatie en weefsel-opruimingsreagens.
ethanol	100983	Merck	Rehydratie- en dehydratiereagens voor paraffine secties.
propyleenglycol	294004	Merck	Voertuigconstituent voor de bereiding van de geneesmiddeloplossing.
protease en fosfataseremmers	P1045	Beyotime	Lyse-bufferadditief gebruikt om eiwitten en fosforylatietoestanden te behouden.
RIPA lysebuffer	P0013	Beyotime	Lysebuffer voor totale eiwitextractie uit het hippocampaal weefsel.
EDTA antigeen retrievale buffer	ab93680	abcam	Warme-gemedieerde antigeen retrievale buffer voor immunohistologie.
pentobarbital natrium	P3761	Sigma	Anestheticum gebruikt voor chirurgie en weefselverzameling.
Geitenserum	ZLI-9056	ZSGB-BIO	Blockingreagens voor immunohistologie.
PVDF-membranen	ISEQ00010	Merck Millipore	Membran gebruikt voor Western blot overdracht.
Morris water maze	VX80	Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.	Gedragsapparaat en video-tracking systeem voor ruimtelijke leer- en geheugenbeoordeling.
chemiluminescentie beeldvormingssysteem	Doc™ XR+ 1708195	Bio-rad	Beeldvormingssysteem voor chemiluminescentie Western blot signaalverwerving.
stereotactische apparaat	/	Stoelting Technology Co., Ltd	Apparaat gebruikt voor stereotactische intraventriculaire injectie.
BCA eiwitbepalingskit	P0006	Beyotime	Colorimetrische bepalingskit voor totale eiwitconcentratiemeting.
microplate reader	Synergy2	Biotek	Absorptiemeter gebruikt voor BCA bepalingsmeting.
ImageJ	version 9.0.1	National Institutes of Health	Beeldanalysesoftware voor histologie, immunohistologie en Western blot densitometrie.
GraphPad Prism	version 8.5	GraphPad Software	Statistische-analyse en grafiekgenererende software.