Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In Vivo Calciumbeeldvorming met een miniaturiseerde microscoop in de hypothalamus om sociale gedragingen bij muizen te begrijpen

995 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70401

⸱

20 maart 2026

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Westlake University, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft in vivo calciumbeeldvorming van hypothalamische neuronen met behulp van een miniaturiseerde microscoop (miniscoop) bij vrij handelende muizen tijdens sociale toestandmanipulatie (sociale isolatie en sociale hereniging). Deze methode maakt beeldvorming mogelijk met enkelneuronresolutie van de hypothalamische activiteit die sociale behoefte en sociale verzadiging vertegenwoordigt, waardoor mechanistische studies van sociale homeostase mogelijk zijn.

Samenvatting

Sociaal gedrag bij gewervelden wordt streng gereguleerd via hypothalamische circuits. Moleculair gedefinieerde hypothalamische neurontypen zijn recent vastgesteld om sociale behoeften op een homeostatische manier te coderen. Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol voor het uitvoeren van in vivo calciumbeeldvorming in de hypothalamische mediale preoptische kern (MPN) met behulp van een kopgemonteerde miniaturisatiemicroscoop (miniscoop) bij vrij functionerende muizen. Deze methode maakt longitudinale opnames mogelijk van neuronale populatiedynamiek tijdens sociale isolatie en hereniging, waardoor mechanistische studies van sociale behoefte en sociale verzadiging bij de resolutie van één neuron mogelijk zijn. Specifiek ontvangen volwassen muizen stereotaxische injecties van een adeno-geassocieerd virus (AAV) dat een genetisch gecodeerde calciumindicator in het MPN tot expressie brengt, gevolgd door implantatie van een gradient-index (GRIN) lens en een miniscoopbasisplaat. Na herstel zijn muizen gewend aan de miniscoopbeeldvorming en worden ze onderworpen aan geplande sociale isolatie en hereniging, waarbij neuronale activiteiten worden gefotografeerd. Calciumsignalen worden gesynchroniseerd met het gedrag van dieren voor verdere analyse. Dit protocol biedt uitgebreide richtlijnen voor in vivo calciumbeeldvorming met miniscoop in de muishypothalamus tijdens sociaal gedrag. Het kan gemakkelijk worden aangepast voor beeldvorming in andere diepe hersengebieden en in verschillende gedragscontexten. Deze benadering overbrugt cellulaire neurale activiteit en sociaal gedrag, waardoor ons begrip van de neurale basis van complex gedrag bij vrij bewegende dieren wordt vergroot.

Inleiding

Het vermogen om sociale banden te onderhouden is fundamenteel voor het overlevenvan dieren 1,2,3. Langdurige sociale isolatie veroorzaakt angst, cognitieve tekorten en metabole veranderingen, terwijl hereniging sociale betrokkenheid en sociale behoeften herstelt 4,5,6. De waargenomen herstel van sociaal gedrag na kortdurende sociale isolatie suggereert de aanwezigheid van een homeostatisch mechanisme7, analoog aan de regulatie van honger 8,9 of dorst 10,11,12. De neurale substraten die sociale homeostase begeleiden zijn echter slecht begrepen.

Recent onderzoek heeft aangetoond dat verschillende hypothalamische neuronale populaties respectievelijk sociale behoefte en sociale verzadiging coderen.7. In vivo calciumbeeldvorming heeft aangetoond dat een populatie genetisch gedefinieerde glutamaterge neuronen in de mediale preoptische kern (MPN) actief wordt tijdens isolatie (MPNIsolation neuronen), terwijl een andere populatie GABAerge neuronen actief wordt bij reünie (MPNReunion neuronen). Optogenetische activatie van MPNIsolation-neuronen bootst een sociale isolatietoestand na, en optogenetische activatie van MPNReunion-neuronen verzwakt sociale rebound, wat wijst op hun tegengestelde rollen bij het reguleren van sociale behoefte. Deze populaties interageren wederkerig en verbinden zich met hersenbrede neurale circuits, waardoor een feedbackloop ontstaat die sociale behoeften dynamisch moduleert.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol met als overkoepelend doel onderzoekers in staat te stellen calciumdynamiek in diepe hersenen te registreren bij enkelneuronresolutie bij vrij bewegende muizen tijdens ethologisch relevante sociale gedragingen zoals sociale isolatie en hereniging13. De combinatie van deze beeldvormingstechniek met ethologisch relevante sociale paradigma's biedt een ongekende kans om de neurale representatie van verschillende sociale toestanden te onderzoeken. De reden voor het ontwikkelen van deze aangepaste methode komt voort uit de noodzaak om te visualiseren hoe sociale behoefte en verzadiging dynamisch worden weergegeven in diepe hersenstructuren zoals het MPN. Hoewel het gebruik van de miniscoop eerder is beschreven 14,15,16, vereist het gebruik ervan tijdens onbeperkte sociale interacties, met name die tussen isolatie en hereniging, specifieke technische en gedragsmatige aanpassingen om optische stabiliteit te behouden, bewegingsartefacten te minimaliseren en naturalistische gedragsexpressie te waarborgen.

In vergelijking met vezelfotometrie biedt de op miniscoop gebaseerde benadering cellulaire resolutie, waardoor onderscheiden kan worden van verschillende functionele neurontypen binnen hetzelfde gebied. Het maakt langdurige opnames mogelijk van vrij interacterende dieren, wat essentieel is voor het bestuderen van sociaal gedreven neurale dynamiek. Eerdere studies met één-fotonmicro-endoscopie richtten zich grotendeels op de cortex of dorsale hippocampus tijdens ruimtelijke of sensorische taken 14,15,16. Ons protocol breidt deze vooruitgang uit naar diepere subcorticale gebieden tijdens complexe sociale gedragingen, en biedt een sjabloon voor het onderzoeken van affectieve toestandscircuits onder naturalistische omstandigheden.

Het protocol is geoptimaliseerd voor hersengebieden tot ~5 mm diep, met behulp van GRIN-lensimplantatie en genetisch gecodeerde calciumindicatoren. Belangrijke overwegingen zijn chirurgische precisie, lensplaatsing, gedragsparadigma-ontwerp en gerelateerde data-analyse. Deze methode kan worden aangepast aan andere diepe hersengebieden en gedragscontexten. Dit protocol begeleidt gebruikers door alle kritieke fasen: chirurgische voorbereiding, virale toediening, lensimplantatie, gedragsontwerp, miniscoopbevestiging, beeldvorming en data-analyse (Figuur 1A-E). We verwachten dat deze toegankelijke, gedetailleerde workflow de studie van diepe-hersenneurale populaties over een breed scala aan naturalistische gedragingen mogelijk zal maken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures zijn goedgekeurd door de dierenethiekcommissie van Westlake University met het dierenprotocol #25-076-LD-9. Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Laboratory Animal Resources aan de Westlake University. Alle apparatuur en materialen die in dit protocol worden gebruikt, zijn vermeld in de Materiaallijst.

1. Virusinjectie-operatie

  1. Plaats de muis in een anesthesie-inductiekamer met 2-3% isoflurane.
    OPMERKING: Een succesvolle inductie van anesthesie wordt bevestigd door het ontbreken van een teenknijpreflex en de aanwezigheid van gelijkmatige, diepe ademhaling.
  2. Na 2-3 minuten, of zodra de rechtstaande reflex verloren is, zet je het dier snel over op het stereotaxische instrument. Zet de neus vast in de neuskegel van de anesthesie en houd de anesthesie met 1-1,5% isofluraan gedurende de hele operatie (Figuur 1B). De zuurstofstroom is doorgaans ingesteld tussen 0,8 en 1,2 L/min.
    OPMERKING: Monitor de ademhalingsfrequentie en andere fysiologische signalen van het dier. Als de ademhalingsfrequentie van het dier stijgt en het snorharen en andere tekenen van wakker worden vertoont, verhoog dan de isofluranconcentratie tot 2-3%.
  3. Bevestig de snijtanden van de muis via de snijtand van het stereotaxische instrument. Draai de neusklem aan om de kop te fixeren.
  4. Steek voorzichtig twee oorbenen in de externe gehoorgangen totdat ze stevig rusten, zodat het hoofd stabiel en stijve is (Figuur 1B).
    OPMERKING: (1) Verkeerde plaatsing die nekweefsels samendrukt, kan ademhalingsproblemen of onstabiele fixatie veroorzaken. (2) Als het dier tekenen vertoont van zware ademhaling of worsteling tijdens fixatie, laat dan onmiddellijk de oorbalken los en herplaats ze, aangezien dit wijst op mogelijke compressie van de luchtwegen. (3) Zorg dat beide oorbeulen op dezelfde hoogte zijn. Dit is essentieel voor de latere nauwkeurige waterpasbaarheid van de schedel.
  5. Breng oogzalf aan op beide ogen van de muis om te voorkomen dat de ogen uitdrogen.
  6. Verwijder hoofdvacht met ontharingscrème. Veeg het gebied grondig af met 75% ethanoldoekjes om de resterende crème en haar te verwijderen.
  7. Desinfecteer de blootgestelde huid met 75% ethanoldoekjes en betadine. Met fijne chirurgische schaar maakt je een sagittale incisie in de middenlijn door de hoofdhuid. Trek de huid terug om de schedel volledig bloot te stellen boven het doelgebied van de hersenen. Maak het schedeloppervlak voorzichtig schoon met een wattenstaafje om het periost te verwijderen.
    OPMERKING: Het blootleggen van een voldoende groot deel van de schedel is noodzakelijk om een stevige anker voor het tandcement te bieden, wat zorgt voor langdurige stabiliteit van het implantaat.
  8. Bevestig een glazen pipet op de stereotaxische houder voor het meten van het schedeloppervlak. Onder een stereomicroscoop plaatst u de pipetpunt op de bregma (de kruising van de sagittale en coronale hechtingen) en stelt deze in als oorsprong (X = 0, Y = 0, Z = 0, Figuur 1C).
  9. Beweeg de pipettip naar posities ±2 mm lateraal ten opzichte van de bregma en pas het schedelniveau aan totdat het hoogteverschil tussen deze twee punten binnen ±0,03 mm is.
  10. Vervolgens verplaats je de pipet naar de lambda (het snijpunt van de sagittale en lambdoïde hechtingen) en pas je de anteroposterior helling aan totdat het hoogteverschil tussen bregma en lambda binnen ±0,03 mm is (Figuur 1C).
    OPMERKING: (1) Een voorafgaande visuele beoordeling en aanpassing van de schedel kan het fijne nivelleringsproces aanzienlijk stroomlijnen. (2) Het drogen van het oppervlak van de schedel met perslucht vóór het egaliseren verbetert de zichtbaarheid van de schedelhechtingen.
  11. Gebruik een handboor met een 0,8 mm boorkop om een craniotomie te maken boven het doelgebied van de hersenen (bijvoorbeeld bij C57BL6/J-muizen). De coördinaten liggen bij anterieur-posterior (AP) 0 mm, mediaal-lateraal (ML) 0,3 mm en dorsaal-ventral (DV) -4,8 mm om het MPN-gebied te targeten; voor FVB/NJ-muizen wordt de craniotomie uitgevoerd bij AP +0,4 mm-+0,5 mm, ML 0,3 mm en DV -4,8 mm) (Figuur 1C).
    OPMERKING: In geval van bloeding verhoog tijdelijk de isofluranconcentratie tot 2-2,5%. Gebruik een steriele katoenen tip of een hemostatische spons om het bloed op te nemen, en breng daarna direct steriele zoutoplossing aan. Breng de isofluraan na hemostase terug naar het onderhoudsniveau (1-1,5%) en verwijder overtollig vocht.
  12. Na een craniotomie voert u stereotaxische injectie uit van het virus dat de calciumindicator uitdrukt in het beoogde hersengebied.
  13. Verdun het AAV-hSyn-jGCaMP7f, een adeno-geassocieerd virus dat wordt gebruikt om een genetisch gecodeerde calciumindicator in neuronen tot expressie te brengen en om neuronale activiteit via calciumsignalen in beeldvorming mogelijk te maken, tot een uiteindelijke titer van ongeveer 5 × 10¹² virale genomen per milliliter vóór injectie.
  14. Vul eerst een glazen pipet met minerale olie en daarna met de virale oplossing, zodat er geen luchtbellen zijn. Plaats de pipet op de doelcoördinaten op het oppervlak van de schedel en laat deze langzaam zakken tot de doeldiepte.
  15. Injecteer het virus eenzijdig met een langzame, constante snelheid (bijv. 30 nL/min), met een totaalvolume van 400 nL7, om te zorgen voor de infectie van voldoende neuronen in het MPN-gebied. Deze hoeveelheid kan worden aangepast aan specifieke groottes van hersengebieden en of er verdere beperkingen bestaan, zoals het Cre-loxP-systeem.
  16. Na voltooiing laat je de pipet 10-15 minuten op zijn plaats om voldoende virale diffusie te faciliteren en reflux langs het injectiepad te minimaliseren, voordat deze langzaam wordt teruggetrokken.
    OPMERKING: (1) Virale aliquoten met passende en consistente titers zijn cruciaal voor een succesvolle en consistente expressie bij dieren. Te hoge titer kan neurotoxiciteit veroorzaken, terwijl onvoldoende titer leidt tot zwakke expressie en een slechte signaal-ruisverhouding voor beeldvorming. (2) Langzame injectiesnelheid en voldoende wachttijd voordat de pipet wordt teruggetrokken zijn cruciaal om weefselschade te minimaliseren en virale reflux te voorkomen, zodat precieze en robuuste virale expressie in het doelgebied wordt gegarandeerd.
  17. Na de virusinjectie naai je de huid boven de schedel met opneembare hechtingen.
  18. Subcutane injectie direct na de operatie carprofen (5 mg/kg) voor pijnstiller, met voortdurende monitoring en extra toediening indien nodig gedurende de volgende 3 dagen.
  19. Houd de muis individueel na de virusinjectieoperatie minstens 2-3 weken om voldoende herstel en virale expressie bij het dier mogelijk te maken.
    OPMERKING: GRIN-lensimplantatie (Sectie 2) kan op dezelfde dag als de virale injectie worden uitgevoerd of 2-3 weken na de virale injectie. In dit protocol beschrijven we de tweestapsmethode, waarmee de onderzoeker de virale expressie tijdens de implantatie van de GRIN-lens kan beoordelen.

2. GRIN-lensimplantatie

  1. Herhaal stappen 1.1-1.10 om de craniotomie weer te openen. Krab het schedeloppervlak met een scalpel voor een betere grip op tandcement in stap 2.8. Voor de nieuwe craniotomie moet de diameter iets groter zijn dan die van de GRIN-lens (meestal ~1 mm) om een soepele implantatie mogelijk te maken. Verwijder na het boren zorgvuldig alle botresten van de bot.
  2. Om weefselcompressie tijdens de implantatie van de GRIN-lens te beperken, plaats je een glazen pipet in het doelgebied van de hersenen en beweeg je de pipet langzaam middelzijdig om een incisie te creëren. Deze micro-cut is ~1 mm lang om ruimte te creëren voor het implanteren van de GRIN-lens (Figuur 2A).
    OPMERKING: Deze stap is cruciaal voor het succes van het hele protocol.
  3. Voordat je de GRIN-lens implanteert, desinfecteer je de lens met 75% ethanol, was hem daarna met steriele zoutoplossing en veeg hem voorzichtig schoon met lensweefsel.
  4. Houd de GRIN-lens vast met een lenshouder en bevestig de miniscoop bovenop de lens.
  5. Plaats de hele assemblage bij de bregma en stel alle coördinaten op nul (d.w.z. X = 0, Y = 0, Z = 0). Plaats het vervolgens op de doelcoördinaten X-Y boven de craniotomie.
  6. Maak het schedeloppervlak vochtig met steriele zoutoplossing. Laat de GRIN-lens heel langzaam zakken in het hersenweefsel met een snelheid van ongeveer 100 μm/min totdat deze het doel bereikt (Figuur 2B).
    OPMERKING: (1) Als de implantatie van de GRIN-lens 2-3 weken na virale injectie wordt uitgevoerd, zet tijdens het inbrengen van de lens de miniscoop aan om realtime fluorescentieveranderingen te observeren. Naarmate de lens het doelgebied nadert, wordt het totale fluorescentiesignaal in het gezichtsveld helderder, en deze verandering kan direct in realtime uit het signaalhistogram worden afgelezen met behulp van de beeldvormingssoftware (Figuur 2C, D). (2) Wees voorzichtig om bloedingen tijdens de innesteling te voorkomen, omdat bloedstolsels de signaalkwaliteit aanzienlijk verminderen. (3) Als bloedingen onvermijdelijk en ernstig zijn, haal dan de GRIN-lens terug, maak de lens schoon en implanteer deze opnieuw nadat het bloeden is gestopt.
  7. Na de lensimplantatie droog je het schedeloppervlak grondig door restvloeistof op te nemen en met perslucht te blazen.
  8. Breng voorzichtig tandcement aan om de GRIN-lens aan de schedel te bevestigen en bouw een volledige hoofdkap die de blootliggende schedel bedekt (Figuur 2B). Wees voorzichtig dat het cement niet in contact komt met de omliggende spierweefsels. Maak dan voorzichtig de lenshouder los en verwijder de houder samen met de miniscoop.
    OPMERKING: (1) Meng tandcement in een gekoelde plaat op ijs om het stollingsproces te vertragen en meer werktijd te bieden. (2) Er wordt aanbevolen een headbar achter de lens te worden toegevoegd om de muis vast te houden tijdens de miniscoopaansluiting. (3) Wees zeer voorzichtig om geen cement aan te brengen op de lenshouder of miniscoop.
  9. Bereid de tweecomponenten siliconenlijm voor door de twee vloeistoffen met elkaar te mengen. Breng het aan op de bovenkant van de GRIN-lens om een beschermende afdichting tegen stof en krassen te vormen tijdens de herstelperiode.
  10. Na de implantatie van de GRIN-lens moet de muis individueel worden ondergebracht om mogelijke schade aan de lens door zijn kooigenoten tijdens het herstel te voorkomen.

3. Installatie van de bodemplaat

  1. Twee tot drie weken na de implantatie van de GRIN-lens wordt de basisplaat geplaatst. Verdoof en fixeer de muis in het stereotaxische instrument zoals hierboven beschreven.
  2. Verwijder de siliconenafdichting van de bovenkant van de GRIN-lens en maak het lensoppervlak voorzichtig schoon met een stuk lensweefsel.
  3. Bevestig de basisplaat aan de miniscoop. Bevestig de volledige microscoop-basisplaat op de stereotaxische manipulatorarm via een houder.
  4. Verbind de miniscoop met de dataverzamelbox en zet de live beeldvorming aan.
  5. Lijn het miniscoopobjectief en de geïmplanteerde GRIN-lens uit door de manipulator fijn af te stellen om een precieze optische coaxiale uitlijning tussen de miniscoop en de GRIN-lens te bereiken.
  6. Plaats het miniscoopobjectief zo dat het parallel staat aan het bovenoppervlak van de GRIN-lens en zorg ervoor dat de rand van de hele GRIN-lens in het beeldvenster is opgenomen met een perfect cirkelvormig beeld, en dat het midden van de lens in het midden van het beeldvenster ligt.
  7. Verlaag de miniscoop tot een optimale werkafstand om heldere beelden te maken van neuronen in het doelfocal vlak.
  8. Gebruik tandcement om de basisplaat te overbruggen en te inkapselen op de bestaande cementkap (Figuur 2B).
    OPMERKING: (1) Een cruciale stap is het verhogen van de miniscoop met een kleine, empirisch bepaalde afstand (ongeveer 50-100 μm) vóór de definitieve fixatie om te compenseren voor mogelijke verschuiving van het focale vlak veroorzaakt door cementkrimp tijdens de stolling. (2) Wees uiterst voorzichtig om te voorkomen dat het tandheelkundige cement contact maakt met delen van de miniscoop die na installatie van de bodemplaat moeten worden losgemaakt.
  9. Nadat het tandcement volledig is gestild, maak je de houder los, koppel je de microscoop voorzichtig van de basisplaat en schroef je direct een dop op de basisplaat om de optische interface te beschermen.
  10. Houd de muis individueel 3-5 dagen na de installatie van de basisplaat en breng de muis daarna minstens 1 week met zijn kooigenoten voordat je de sociale toestand manipuleert (bijvoorbeeld sociale isolatie).

4. Habituatie en het instellen van beeldvormingsparameters

  1. Wenne de geïmplanteerde muizen aan tijdelijke hoofdsteun voor de miniscoopbevestiging en aan de beeldvormingsopstelling 2-3 keer voorafgaand aan formele beeldvormingssessies.
  2. Om de miniscoop op de bodemplaat te monteren, bind je het hoofd van de geïmplanteerde muizen vast, verwijder je de basisplaatkap en koppel je de miniscoop via een magneetinterface aan de basisplaat. Draai vervolgens de zijschroef vast om de miniscoop vast te zetten. Voer 10 minuten calciumbeeldvorming uit, waarbij het dier vrij beweegt in de opnamearena of kooi.
  3. Introduceer prikkels, zoals een zachte aanraking en een nieuwe muis, tijdens deze pilot-imagingsessie. Analyseer de gegevens (zie details in sectie 6) om te controleren of signalen van één neuron kunnen worden geëxtraheerd. Bepaal tijdens habituatie de optimale beeldinstellingen door het focale vlak van de miniscoop over de werkafstand aan te passen om het aantal waargenomen neuronen en de beeldscherpte te maximaliseren.
  4. Stel het verlichtingsvermogen in op ~10% van de maximale waarde en de sensorversterking op ~10-20% van de maximale waarde om heldere signalen zonder verzadiging te krijgen. Beeld met een ruimtelijke resolutie van 1280 x 800 en een bemonsteringsfrequentie van 20 Hz. Sla deze instellingen op voor elk dier en gebruik deze instellingen opnieuw tijdens de volgende beeldsessies.

5. Sociale gedragstests voor miniscoop calciumbeeldvorming

  1. Sociale herenigingstest (Figuur 3A)
    1. Isoleer de met de miniscoop geïmplanteerde muis 1, 3 of 5 dagen voorafgaand aan de beeldvorming. Voer calciumbeeldvorming uit tijdens de basislijn, reünie en herisolatie.
    2. Basislijn: Sluit de muis aan op de miniscoop en neem 10 minuten op, waarin de muis geïsoleerd blijft.
    3. Reünie: Voeg een voormalige kooigenoot toe aan de opnamekamer en neem 10 minuten op.
    4. Herisolatie: Verwijder de kooigenoot na de 10 minuten durende hereniging en beeld nog eens 10 minuten tijdens de herisolatie.
  2. Sociale isolatietest (Figuur 3B)
    1. Isoleer de met de miniscoop geïmplanteerde muis gedurende 6 uur en neem aan het begin van elk uur calciumsignalen op gedurende 15 minuten.
    2. Voeg een voormalige kooigenoot toe aan de opnamekamer en neem 10 minuten op aan het einde van de hele beeldvormingssessie om neuronen te identificeren die significant gemoduleerd zijn door sociale hereniging (zie details in secties 6 en 7).
      OPMERKING: (1) Dit specifieke beeldvormingsschema wordt gebruikt om signaalfotobleaching te minimaliseren en het monitoren van neuronale activiteit tijdens de eerste 6 uur van sociale isolatie mogelijk te maken. (2) De miniscoop is gedurende de hele procedure verbonden. (3) Deze benadering maakt het mogelijk om hetzelfde neuronale ensemble gedurende de gehele beeldvormingssessie te volgen. (4) Voedsel en hydrogel worden verstrekt tijdens de beeldvorming.

6. Gegevensvoorverwerking

  1. Importeer ruwe beeldvormingsvideo's in de dataverwerkingssoftware.
  2. Ruimtelijk en temporeel downsamplen van de originele video wanneer nodig om de rekenkracht voor het analyseren van de data te verminderen.
    OPMERKING: Voor deze analyse worden ruwe beeldgegevens vastgelegd met een ruimtelijke resolutie van 1280 x 800 bij 20 Hz; Haal ruimtelijk een sample van de video met een factor 4 en temporeel naar beneden met een factor 2.
  3. Pas een ruimtelijk banddoorlaatfilter toe met de globale gemiddelde subtractie om de hoogfrequente ruis en de laagfrequente achtergronddrift te verminderen.
  4. Corrigeer bewegingsartefacten met behulp van het bewegingscorrectie-algoritme in de dataverwerkingssoftware. Inspecteer visueel de bewegingsgecorrigeerde film om stabiele neuronale somata en minimale residuele bewegingsartefacten te waarborgen.
  5. Klik op de knop "Cellen identificeren" en kies "CNMFe" in de lijst om calciumactiviteitssporen van individuele neuronen te extraheren met het CNMF-E17 (Constrained Non-negative Matrix Factorization for microEndoscopic data) algoritme.
  6. Klik op de liniaalknop in de dataverwerkingssoftware en meet de soma diameters (in pixels) van representatieve neuronen. Voer de gemiddelde grootte in in het vakje "Gemiddelde celdiameter (pixels)". Klik vervolgens op de knop Toepassen om CNMF-E uit te voeren.
  7. Pas de initialisatie-instellingen van CNMF-E aan wanneer celdetectie onvoldoende is, overmatige niet-celcomponenten verschijnen of oversegmentatie optreedt.
  8. Inspecteer alle geëxtraheerde componenten en accepteer of verwerp ze op basis van celmorfologie en biologisch plausibele calciumdynamiek. Sluit componenten met onregelmatige en stekelige vormen uit. Sluit ruis of bewegingsartefact-gedomineerde sporen uit.
    OPMERKING: (1) Figuur 2E en 2F tonen twee geaccepteerde neuronen met duidelijke morfologie van neuronen evenals de typische calciumtransiënten. (2) Figuur 2G en 2H tonen twee afgestoten neuronen met uitgesproken basisfluctuaties en het ontbreken van typische calciumtransiënten.
  9. Exporteer fluorescentiesporen van geaccepteerde neuronen uit de dataverwerkingssoftware voor downstream identificatie van sociaaltoestandgemoduleerde neuronen (Sectie 7).

7. Identificeer neuronen die door sociale toestand gemoduleerd zijn

  1. Gebruik MATLAB of Python om de vooraf bewerkte data verder te analyseren.
  2. Lijn calciumactiviteitssporen van de geaccepteerde neuronen af op gedragstijdstempels.
  3. Vind het tijdstip van sociale hereniging in de gedragsvideo. Voor elke neuron verdeel je activiteit in een periode van 300 seconden vóór de reünie en een periode van 300 seconden voor de reünie.
  4. Voor elke neuron kwantificeert u de calciumactiviteitsverdelingen tijdens de isolatie- en reünieperiodes.
  5. Voer de Receiver Operating Characteristic (ROC) analyse18 uit om het vermogen van neuronale activiteit te evalueren om onderscheid te maken tussen isolatie- en reünietoestanden, wat een AUC-waarde oplevert die het oppervlak onder de ROC-curve berekent.
  6. Beoordeel de statistische significantie met behulp van een permutatietest. Voor elke neuron worden calciumactiviteitswaarden circulair over gedragstoestanden verdeeld in 1 s tijdbins gedurende 1.000 keer om een nulverdeling van AUC-waarden te genereren. Neuronen met waargenomen AUC-waarden die het 95e percentiel van hun geschudde nulverdeling overschrijden, worden als significant gemoduleerd door de sociale toestand beschouwd.
  7. Classificeer de significant gemoduleerde neuronen op basis van de modulatierichting. Classificeer de neuronen die door reünie worden geremd als de Isolatieneuronen en geactiveerd door reünie als de Reünieneuronen (Figuur 4).

8. Verificatie na het experiment

  1. Perfuser de muizen en voer een standaard histologie uit om de GRIN-lenstrack en virale expressie te verifiëren (zie een voorbeeld van histologische beeldvorming in Figuur 2I).
  2. Gebruik de 4% PFA om de hele muiskop samen met het implantaat te bevestigen, en verwijder dan de GRIN-lens om een duidelijke lensbaan te visualiseren.
    OPMERKING: Neem alleen de gegevens van de dieren met correcte doelstelling op.

9. Probleemoplossing & praktische tips

  1. Bevestig een kopstang met tandbeton achter de miniscoop om het monteren en verwijderen van de miniscoop te vergemakkelijken.
    OPMERKING: De head-bar mag niet te lang zijn en kan in een licht gekantelde hoek worden geplaatst om verstoring van sociaal gedrag te voorkomen.
  2. Plaats de geïmplanteerde muizen individueel gedurende de herstelperiode na de operatie gedurende minstens een week. Dit geeft de muizen genoeg tijd om te herstellen en voorkomt schade aan het implantaat door andere muizen.
  3. Breng de geïmplanteerde muizen weer met hun eerdere cagemates zodra ze volledig hersteld zijn. Controleer en draai regelmatig de kapjes aan. Bereid wat extra deksels voor en vervang die wanneer ze verloren gaan tijdens het onderhoud van het dier.
  4. Controleer de calciumsignalen 3-4 weken nadat het GCaMP-virus is geïnjecteerd. Als de signalen te zwak of onduidelijk zijn, verbetert een langere herstelperiode soms de kwaliteit van de signalen.
  5. Wees voorzichtig met de lensoppervlakken aan de kant van de GRIN-lens of de miniscoop. Houd de lenzen schoon en vrij van krassen. Bedek de lens als je het niet gebruikt.
  6. Pas voor de beeldvorming de lengte van de signaalkabel zo aan dat het dier hoeken van de beeldomgeving kan bereiken en kort genoeg voor soepele sociale interacties.
  7. Bescherm de kabel met een laag stevig materiaal wanneer nodig om bijten door andere muizen tijdens sociale interacties te voorkomen. Controleer regelmatig de signaalkabel om te controleren of deze verdraaid is door intensieve sociale interactie.
  8. Om hetzelfde neuronale ensemble te identificeren uit opeenvolgende beeldvormingssessies (bijvoorbeeld in Figuur 3B), konden de ruwe beeldvormingsvideo's worden samengevoegd om calciumsporen te extraheren.
  9. Om meerdere signalen te synchroniseren, bijvoorbeeld de gedragsvideo's en de calciumsignalen, worden meestal gebruikgemaakt van gebruikelijke TTL-ingangen en gesynchroniseerde zaklampen om verschillende opnamebestanden uit te lijnen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Identificatie van neuronale populaties
We hebben het GCaMP-virus tot expressie gebracht en een GRIN-lens geïmplanteerd in de MPN van een C57BL/6J-muis. Na de operatie herstelde de muis individueel en werd minstens een week lang herenigd met zijn kooigenoten. De muis werd vervolgens drie dagen alleen ondergebracht voorafgaand aan de calciumbeeldvorming. Tijdens de beeldvorming werd eerst een isolatie-baseline van 10 minuten geregistreerd, gevolgd door een sociale reüni...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft een geïntegreerde benadering waarbij in vivo miniscoop calciumbeeldvorming wordt gecombineerd met sociale gedragsparadigma's om het activiteitsprofiel van hypothalamische neuronen te beoordelen. Het maakt langdurige calciumbeeldvorming met cellulaire resolutie mogelijk vanuit diepe hersenstructuren tijdens natuurlijke sociale interacties. De volgende secties bespreken de kritieke stappen, methodologische betekenis, beperkingen en toekomstige mogelijkheden...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs geven geen concurrerend financieel belang of belangenconflict aan. ChatGPT werd gebruikt in het manuscriptbewerkingsproces, met zorgvuldige, gedetailleerde proeflezen door alle auteurs.

Dankbetuigingen

We willen professor Catherine Dulac bedanken voor haar steun bij de initiële training van miniscoopexperimenten en Yang Sun voor zijn hulp bij het uitvoeren van de operatie. Dit werk werd ondersteund door de startfinanciering van Westlake University en de financiering van de NOMIS Foundation, het Tan-Yang Center for Autism Research aan Harvard University, de Jane Coffin Childs Medical Research Award aan D.L., en de Charles A. King Trust Postdoctoral Fellowship aan D.L. We danken alle leden van het Liu Lab voor hun opmerkingen over het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AAV2/9-hSyn-jGCaMP7f-WPRE-pATaitoolS0587-9Virale vectoren, Chirurgie
Absirbable Haemostatic Gelatin SpongeFUKANGSENFKS-AChirurgie
Betadine solution (10% iodinatedPovidone) 500mLHYNAUTQ13702855HNW002Chirurgie
Camera for behavioral videoDAHENGMER2-160-227-U3CGedrag
CarprofenMCEHY-B1227Chirurgie
Digital Stereotaxic InstrumentsRWD68803Chirurgie
Ethanol (75%)Sinopharm chemical reagent co.,Ld801769610Chirurgie
Eye OintmentFODUH37022025Chirurgie
Inscopix Data Processing Software (IDPS)Inscopix1000-006551Data-analyse
IsofluraneRWDR510-22-10Chirurgie
Kwik-Sil adhesive pack of 2World Precision InstrumentsKWIK-SILChirurgie
MicrodrillRWD78001Chirurgie
MP-1000 Micropipette PullerRWDMP-1000Chirurgie
Multi-function Animal Anesthesia SolutionsRWDTAIJI-IEChirurgie
Nanoliter Microinjection PumpRWDR-480Chirurgie
nVista 3.0 miniscopeInscopix1000-004323Beeldvorming
Opthalmic forcepRWDF12006-10Chirurgie
Operating ScissorsRWDS14001-15Chirurgie
ProView Implant KitInscopix1000-004238Chirurgie en Beeldvorming
Resin cement (Super-bond)Sun MedicalSuper bond C&BChirurgie
Set of 5 baseplate coversInscopix1050-004639Beeldvorming
Set of 5 baseplatesInscopix1050-004638Beeldvorming
Set of 5 GRIN lenses, 0.6mm diameter, 7.3mm lengthInscopix1050-004626Chirurgie en Beeldvorming
Stereotaxis MicroscopeMurziderMSD205AChirurgie
Sterile salineQIDUKELINR1B25071902Chirurgie

Referenties

  1. Beery, A. K. Frank Beach award winner: Neuroendocrinology of group living. Horm Behav. 107, 67-75 (2019).
  2. Krause, J., Ruxton, G. D. Living in groups. , Oxford University Press. (2002).
  3. Riters, L. V., Kelm Nelson, C. A., Spool, J. A. Why do birds flock? A role for opioids in the reinforcement of gregarious social interactions. Front Physiol. 10, 421(2019).
  4. Panksepp, J. B., Lahvis, G. P. Social reward among juvenile mice. Genes Brain Behav. 6 (7), 661-671 (2007).
  5. Matthews, G. A., Tye, K. M. Neural mechanisms of social homeostasis. Ann N Y Acad Sci. 1457 (1), 5-25 (2019).
  6. Lee, C. R., Chen, A., Tye, K. M. The neural circuitry of social homeostasis: Consequences of acute versus chronic social isolation. Cell. 184 (6), 1500-1516 (2021).
  7. Liu, D., et al. A hypothalamic circuit underlying the dynamic control of social homeostasis. Nature. 640 (8060), 1000-1010 (2025).
  8. Luquet, S., Perez, F. A., Hnasko, T. S., Palmiter, R. D. NPY/AgRP neurons are essential for feeding in adult mice but can be ablated in neonates. Science. 310 (5748), 683-685 (2005).
  9. Balthasar, N., et al. Leptin receptor signaling in POMC neurons is required for normal body weight homeostasis. Neuron. 42 (6), 983-991 (2004).
  10. Zimmerman, C. A., et al. Thirst neurons anticipate the homeostatic consequences of eating and drinking. Nature. 537 (7622), 680-684 (2016).
  11. Augustine, V., et al. Hierarchical neural architecture underlying thirst regulation. Nature. 555 (7695), 204-209 (2018).
  12. Allen, W. E., et al. Thirst-associated preoptic neurons encode an aversive motivational drive. Science. 357 (6356), 1149-1155 (2017).
  13. Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nat Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
  14. Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), (2017).
  15. Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. J Vis Exp. (162), (2020).
  16. Burrows, R., Ma, C. H., Sun, Y. J. Long-term imaging of identified neural populations using microprisms in freely moving and head-fixed animals. J Vis Exp. (203), (2024).
  17. Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. eLife. 7, e28728(2018).
  18. Britten, K. H., Shadlen, M. N., Newsome, W. T., Movshon, J. A. The analysis of visual motion: a comparison of neuronal and psychophysical performance. J Neurosci. 12 (12), 4745-4765 (1992).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Hypothalamische circuitssociale gedragsmuizenGRIN lensimplantatiestereotaxische injectiegenetisch gecodeerde calciumindicatorneuronale populatiedynamicasociaal ge soleerde muisgedragsneurowetenschap
In Vivo Calciumbeeldvorming met een miniaturiseerde microscoop in de hypothalamus om sociale gedragingen bij muizen te begrijpen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.