$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle procedures zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van Guangzhou Miles Biotechnology Co., Ltd., het goedkeuringsnummer is IACUC-MIS2023045.
Oprichting van het SUI Rat Model
In totaal werden 20 vrouwelijke Sprague-Dawley (SD) ratten, in de leeftijd van 6–8 weken, gebruikt om een model van bekkenbodemletsel te maken, waarmee een bevalling werd gesimuleerd. Om vaginale ballondilatatie (VBD) te induceren, werden de ratten verdoofd via intraperitoneale injectie van ketamine (75 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg). Een leeggelezen 10 Fr Foley-katheter werd voorzichtig in het midden van de vaginale kanaal geplaatst, waarna de ballon werd opgeblazen met 3 mL steriele zoutoplossing. De ballon werd 4 uur op zijn plaats gehouden om de langdurige mechanische rek van de bekkenbodemspieren en de compressie van de pudenduszenuw die bij de bevalling hoort, na te bootsen. De modelperiode was 7 dagen. Op de 8e dag werden 6 dieren willekeurig geselecteerd voor urodynamisch onderzoek.
De succesvolle vaststelling van het model werd bevestigd door urodynamisch onderzoek en de meting van serum lactaat dehydrogenase (LDH)-niveaus, die dienen als indicatoren van spierletsel. Na bevestiging van succesvolle modellering werden SUI-ratten willekeurig verdeeld in een schijn-opererende groep en een behandelgroep, met vijf ratten per groep. Tegelijkertijd werden vijf normale SD-ratten als controlegroep aangeleverd. In de schijngroep werden acupunctuurnaalden ingebracht bij de acupunkturen BL23 (6 mm lateraal van het L2 spineuze uitsteekselen) en GB30 (achter het heupgewricht) zonder elektrische stimulatie. In de elektroacupunctuurgroep werden dezelfde acupunkturen gestimuleerd met een elektroacupunctuurapparaat, volgens de standaard klinische behandelmethode. Het elektroacupunctuurapparaat was ingesteld op een 1 Hz schaars-dichte golfvorm bij 2 V. Elke interventie duurde 30 minuten per dag gedurende 10 opeenvolgende dagen. Alle dieren werden dagelijks gemonitord en onder standaard laboratoriumomstandigheden gehuisvest. Aan het einde van het experiment werd urodynamisch onderzoek uitgevoerd op de dieren in elke groep. Vervolgens werd elke groep ratten verdoofd met een mengsel van 3% isoflurane en 1,0 L/min zuurstof. Nadat de ratten het bewustzijn verloren, werd de isofluranconcentratie aangepast naar 5% en werden monsters genomen nadat de ratten aan ademhalingsfalen waren overleden.
Urodynamische tests
Na isoflurane-geïnduceerde anesthesie werden de dieren in rugligging geplaatst en vastgezet. Een middenlijn incisie in de onderbuik onthulde de blaas18. Een epidurale katheter werd geïmplanteerd via een fistel van 2 mm diameter bij de blaaskoepel, 0,5–1,0 cm naar voren in het lumen geplaatst en vastgezet met een 11-0 hechting via de purse-string-techniek. De katheter was aangesloten op een drukmonitoringsysteem en werd geperfuseerd met 37 °C methyleenblauw gekleurde zoutoplossing bij 10 mL/u via een microspuitpomp, met gelijktijdige intravesicale drukmeting. De maximale blaascapaciteit werd berekend als het product van de infusieduur (het interval tussen infusiestart en de eerste druppel urethrale vloeistof) en de debietsnelheid. De lekpuntdruk (LPP) werd bepaald door de piek intravesicale druk direct na het abrupte loslaten van handmatig toegepaste buikcompressie te registreren. Alle parameters werden verkregen met behulp van een urodynamisch analysesysteem, met drievoudige metingen per metriek. Alle monsters werden willekeurig gecodeerd en op een single-blind wijze geanalyseerd door drie onafhankelijke operators, die elk één meting uitvoerden. De resultaten van de drie onafhankelijke metingen werden gebruikt voor statistische analyse.
Meet het serumlactaatdehydrogenase (LDH)-niveau
Op postoperatieve dag 7 werd ongeveer 1 ml volbloed uit de staartader van elke rat gehaald. De verzamelde monsters werden 1 uur op kamertemperatuur gelaten om de vorming van stolsels mogelijk te maken, waarna ze 15 minuten werden gecentrifugeerd op 2.000 × g. Ongeveer 0,5 mL supernatant werd zorgvuldig als serum verzameld. De serumlactaatdehydrogenase (LDH)-niveaus werden kwantitatief bepaald met behulp van een D-lactaat dehydrogenase assay kit volgens de protocollen van de fabrikant.
Proteomische profilering en bio-informatica analyse
Er werd een kwantitatieve proteomische analyse uitgevoerd op urethrale gladde spierweefsels geïsoleerd uit model- en behandelgroepen. Eiwitten werden geïdentificeerd uit massaspectrometrie-ruwe gegevens met behulp van Proteome Discoverer 2.4 met een drempel van 1% valse ontdekkingsrate. Bio-informatische analyse van differentieel tot expressie gebrachte eiwitten (DEPs) werd uitgevoerd met R-gebaseerde pakketten: differentiële expressieanalyse werd uitgevoerd met het limma-pakket (|log2FC| > 1, aangepast p < 0,05), genontologie (GO) verrijkingsanalyse en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) routeanalyse werden uitgevoerd met het clusterProfiler-pakket, waarbij verrijkte termen/routes als significant werden beschouwd bij aangepaste p < 0,05 en q-waarde < 0,2; Hiërarchische clustering werd gevisualiseerd met het Pheatmap-pakket. Een eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerk werd opgebouwd met behulp van de STRING-database (v11.5, betrouwbaarheidsscore > 0.7).
Hematoxyline-eosine-kleuring
Gladde spierweefsels van ratten waren vastgezet in 4% paraformaldehyde en ingebed in paraffine. Seriële secties (5 μm dikte) werden voorbereid met een microtoom en gekleurd met een gestandaardiseerde H&E-kleurset. Morfologische evaluatie werd uitgevoerd met bright-field microscopie bij 40×–400× vergroting, met focus op de structurele integriteit van spierweefsel, inflammatoire celinfiltratie en matrixremodellering.
Massons Trichrome beitsing
Volgens het experimentele protocol dat door de ethische commissie is goedgekeurd, hebben we op de tiende dag van de behandeling monsters van de dieren genomen. Rattenspierweefsels waren vastgesteld in 4% paraformaldehyde en paraffine-ingebed. Seriële secties (5 μm dik) werden gesneden met een roterend microtoom. Gedeparaffiniseerde secties werden gekleurd met Massons tricroom. Gekleurde secties werden gefotografeerd onder een helderveldmicroscoop met 100× vergroting.
Westelijke verplettering
Totale eiwitten werden uit het gladde spierweefsel van ratten geëxtraheerd door mechanische verstoring in de RIPA-lysebuffer, die bij lage temperatuur werd gehandhaafd en werd aangevuld met proteaseremmers. De lysaten werden geklarificeerd door centrifugatie bij 10.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C, en het eiwithoudende supernatant werd verzameld voor analyse. De eiwitconcentratie werd bepaald met een bicinchonininezuur (BCA) assay waarbij runderserumalbumine als kalibratiestandaard werd gebruikt. Gelijke hoeveelheden eiwit (30 μg) werden geladen op 10% of 12% SDS–polyacrylamide gels en gescheiden onder reducerende omstandigheden. Na elektroforese werden eiwitten overgebracht op PVDF-membranen met een poriegrootte van 0,22 μm. Membranen werden 1 uur lang geïncubeerd in 3% BSA bij kamertemperatuur om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren, gevolgd door nachtelijke incubatie bij 4 °C waarbij primaire antilichamen GAPDH, MYL1, TNNI2, TNNT1, TNNT3 en MYLPF herkennen. Na drie keer wassen met TBST werden HRP-gelabelde secundaire antilichamen 2 uur bij kamertemperatuur aangebracht. Signaaldetectie werd uitgevoerd met een chemiluminescente substraat en beelden werden vastgelegd met een luminescentiebeeldvormingssysteem. Kwantificering van eiwitexpressie werd uitgevoerd door densitometrische analyse, waarbij GAPDH als interne referentie diende.
Kwantitatieve real-time PCR (qPCR)
Weefselmonsters werden gelyseerd met een volledig RNA-extractie-reagens, en RNA werd geïsoleerd volgens de instructies van de fabrikant die bij de RNA-extractiekit werden geleverd. Gen-specifieke primers werden ontworpen met speciale software (Tabel 1) en hun specificiteit werd geverifieerd via BLAST-analyse (≥18 bp homologie, Tm = 58–62 °C). RNA werd vervolgens omgekeerd getranscribeerd met een reverse transcriptiekit, en de expressie van het doelgen werd gedetecteerd met een SYBR Green qPCR-detectiekit.
Statistische analyse
Statistische vergelijkingen tussen twee groepen werden uitgevoerd met een onafhankelijke steekproeven t-test, terwijl verschillen tussen meerdere groepen werden geëvalueerd met eenrichtings-ANOVA gevolgd door Bonferroni post hoc-analyse. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) of gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Een waarde van p < 0,05 werd beschouwd als indicatief voor statistische significantie.