Isolatie en zuivering van het pancreaseiland door Lewisratten met behulp van enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntscheiding

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde methode voor chirurgische oogst, enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntzuivering van Lewis rat-pancreaseilandjes, waardoor hoogopbrengst- en hoogzuiverheidspreparaten mogelijk zijn voor direct gebruik in transplantatie- of in vitrostudies .

Samenvatting

Pancreaseilandjes zijn essentieel voor zowel klinische eilandtransplantatie als preklinische studies die gericht zijn op het begrijpen van de mechanismen en progressie van diabetes. De vooruitgang op deze gebieden wordt echter vaak beperkt door de beschikbaarheid van hoogwaardige eilandjes, omdat opkomende therapeutische strategieën grotere, schonere en meer gestandaardiseerde voorbereidingen vereisen. Dit artikel presenteert een hoogdoorvoer, gestandaardiseerd protocol voor chirurgische oogst, enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntzuivering van alvleeskliereilandjes van Lewis-ratten. De methode combineert intraductale alvleesklierperfusie met een gedefinieerde enzymmengsel, gezamenlijke vertering van meerdere alvleesklieren en dichtheidsgebaseerde scheiding om de opbrengst te maximaliseren, waarbij fragmentatie wordt geminimaliseerd en routinematig handmatig plukken nodig is. De opbrengst van eilandjes wordt gekwantificeerd met twee complementaire benaderingen: een traditionele aliquot-gebaseerde telmethode die vaak wordt gebruikt in klinische omgevingen, en een semi-geautomatiseerde geheel voorbereidende beeldvormingsmethode. In een representatieve isolatie van 12 alvleeskliertjes leverde handmatig tellen ongeveer 3.300 eilandjesequivalenten (IEQ) en 2.700 absolute eilandjes per alvleesklier op (~39.600 totale IEQ), met een grootteverdeling van 62% (50-100 μm), 17% (100-150 μm), 10% (150-200 μm), 5% (200-250 μm) en 6% (>250 μm). Ter vergelijking: de geautomatiseerde analyse van de hele voorbereiding rapporteerde 16.350 totale IEQ (1.362 IEQ/alvleesklier), wat de inherente variabiliteit in aliquot-gebaseerde kwantificering benadrukt. Preparaten hadden een zuiverheid van 98% door dithizonekleuring, en de levensvatbaarheid van eilandjes bleef op 98% in vitro op dag 3 en 7 na isolatie. Functionele beoordeling door statische glucose-gestimuleerde insulinesecretie toonde een 10-voudige toename van insulineafgifte na een stimulatie van 1 uur met 16,7 mM glucose. Al met al biedt dit protocol een reproduceerbare en efficiënte aanpak voor het genereren van hoogzuivere, functioneel intacte eilandpreparaten die direct kunnen worden gebruikt zonder extra schoonmaak. Eilandjes behouden een robuuste functie in cultuur tot zeven dagen, wat flexibiliteit biedt voor grootschalige in vitro assays en in vivo transplantatiestudies.

Inleiding

Een transplantatie van het pancreaseilandje is een haalbare strategie om endogene insulineproductie te herstellen bij personen met type 1 diabetes (T1D)¹. Naast T1D is de eilandjesbiologie steeds relevanter voor type 2 diabetes (T2D), een aandoening die wordt gekenmerkt door progressieve β-celdysfunctie en -verlies, evenals voor patiënten die een gedeeltelijke of totale pancreatectomie ondergaan vanwege chronische pancreatitis, alvleeskliertumoren of traumatisch letsel. In deze contexten is toegang tot hoogwaardige eilandjes essentieel voor het bevorderen van cellulaire therapieën, het modelleren van β-celfalen, het bestuderen van eilandje-immuun- en eilandje-stromale interacties, en het ontwikkelen van opkomende regeneratieve benaderingen². Daarom zijn robuuste en reproduceerbare isolatieprocedures voor eilandjes cruciaal om zowel mechanistisch onderzoek als translationele ontwikkeling te ondersteunen bij een breed scala aan pancreas-endocriene aandoeningen.

Hoewel eilandjes minder dan 2% van de alvleeskliermassa uitmaken, spelen ze een onevenredig belangrijke rol in de glucosehomeostase. Hun intrinsieke kwetsbaarheid voor hypoxie, enzymatische oververtering, oxidatieve stress en mechanische afschuiving maakt hen bijzonder gevoelig voor isolatie-gerelateerde schade ^3,4,5. Zelfs subtiele afwijkingen in temperatuur, zuurstofvoorziening of weefselhantering kunnen de koppeling tussen β-celstimulus en -secretie verstoren of apoptose veroorzaken, vanwege beperkte antioxidantenverdediging en een hoge metabole vraag ^6,7. Daarom leggen de meeste conventionele protocollen de nadruk op snel downstream gebruik, meestal binnen 24-48 uur na oogst in zowel klinische als experimentele omgevingen 8,9,10,11,12. Hoewel dit "direct-use"-kader achteruitgang minimaliseert, beperkt het de experimentele flexibiliteit, belemmert het longitudinale studies en bemoeilijkt het de inspanningen om voldoende eilandjes te verzamelen voor grote in vitro assays of in vivo transplantatie-experimenten.

Onder knaagdiermodellen worden Lewis-ratten veel gebruikt voor eilandjesonderzoek vanwege hun inteelt genetische achtergrond, stabiel immuunprofiel en reproduceerbare fysiologische kenmerken¹⁴. Afhankelijke verschillen in eilandjesopbrengst, responsiviteit en veerkracht zijn goed gedocumenteerd. De Groot et al. toonden aan dat Lewis-ratteneilandjes superieure glucose-gestimuleerde insulinesecretie vertonen vergeleken met andere stammen, wat hun geschiktheid voor functionele, metabole en transplantatiestudies onderstreept¹⁵. Aanvullend onderzoek heeft hun betrouwbaarheid voor immunologisch en allo-/xenotransplantatieonderzoek bevestigd 14,15,16. Echter, tussen laboratoria blijft variabiliteit in eilandjesopbrengst, zuiverheid en functie een belangrijke belemmering. Veel van deze variabiliteit ontstaat door inconsistenties in enzymmengsel, intraductale perfusietechnieken, alvleesklierbehandeling, verteringstiming en zuiveringsstrategie¹⁷.

Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een reproduceerbaar, stapsgewijs protocol ontwikkeld voor chirurgische oogst, enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntzuivering van pancreaseilandjes van Lewis-ratten. Deze workflow is geoptimaliseerd om de opbrengst te maximaliseren, fragmentatie te minimaliseren en de functionele levensvatbaarheid te behouden. Belangrijk is dat het duidelijke benchmarks vastlegt, waaronder eilandjesequivalenten (IEQ), levensvatbaarheid in de tijd, zuiverheid en door glucose gestimuleerde insulinesecretie, die onderzoekers in staat stellen om betrouwbaar te onderscheiden tussen succesvolle en suboptimale isolaties 18,19,20. Door zowel de opbrengst als de levensduur te verbeteren, vergroot het protocol de experimentele flexibiliteit en kan het het aantal benodigde donordieren verminderen, wat een ethischer en schaalbaarder experimenteel ontwerp ondersteunt.

In tegenstelling tot veel traditionele benaderingen toont de huidige methode aan dat Lewis-ratteneilandjes tot 7 dagen in cultuur kunnen worden gehouden met behoud van levensvatbaarheid en functie, waardoor hun bruikbaarheid voor uitgebreide in vitro-studies wordt vergroot. Het protocol bevat bovendien een gestroomlijnde, gepoolde verwerkingsstrategie die tot 30 alvleesklieren in één batch kan verwerken, wat een uniforme vertering mogelijk maakt en de variabiliteit tussen monsters vermindert. Met een endocriene zuiverheid van 98% elimineert de procedure de noodzaak van arbeidsintensief handmatig plukken en verkleint het de kans op microbiële besmetting. In vergelijking met enkelstaps- of bulkdigestiemethoden die vaak onzuivere of mechanisch aangetaste preparaten produceren¹³, levert deze high-throughput workflow betrouwbaar grote aantallen schone, transplantatiekwalitatieve eilandjes op die geschikt zijn voor in vitro assays, metabole profilering en in vivo transplantatiestudies.

Protocol

Alle procedures zijn goedgekeurd door de Houston Methodist Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, protocol #IS00007362) en uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en de Animal Welfare Act.
OPMERKING: De materialen en instrumenten die gedurende het protocol worden gebruikt, zijn te vinden in de Materiaallijst.

1. Voorbereiding voorafgaand aan oogst en isolatiedag

1. Bereid de volgende oplossingen voor onder aseptische omstandigheden in een bioveiligheidskast (zie Tabel 1) en bewaar alle oplossingen bij 4 °C tot gebruik.
   Penicilline-streptomycine spoeloplossing (Pen-Strep).
   Wasmedia.
   Afkoelbuffer.
   Eilandjescultuurmedia.
   Krebs-buffer.
2. Steriliseer gereedschap en apparatuur via autoclaven.
   1. Chirurgisch pakket voor het oogsten van de autoclaaf van de pancreas: chirurgische gordijnen, gaas, rattandweefselpincet, platte tang, fijn gebogen tang, één huidschaar, microdissectieschaar, twee kleine hemostaten en één gebogen hemostaat.
      OPMERKING: Autoclaaf twee alvleesklieren oogst chirurgische pakketten als er twee chirurgische operators zijn.
   2. Autoclaaf pancreas reinigingspakket chirurgie: fijn gebogen pincet en micro-dissectie schaar.
   3. Autoclave: een vel aluminiumfolie van 30 cm x 30 cm.
   4. Autoclaaf 1-6 bekers van 600 mL en 1 L, afhankelijk van het aantal te verwerken alvleesklieren (zie Tabel 2).
   5. Autoclaaf één 500 μm zeef.
   6. Autoclaaf twee 14 G spinale naalden, voor het geval er één verstopt raakt door onverteerd alvleesklierweefsel.
   7. Autoclave: één spuitbuis voor elke benodigde 50 mL spuit (zie Tabel 3).
3. Maak het waterbad klaar voor de spijsvertering.
   1. Vul het waterbad, uitgerust met een orbitale shaker, met autoclaved ultrazuiver water totdat het 3/4 inch boven het niveau van het platform ligt.
   2. Voeg 3 mL antimicrobiële oplossing toe en houd het deksel gesloten om besmetting te minimaliseren.

2. Voorbereidingen op de oogst- en isolatiedag

1. Maak gradiëntspuiten klaar.
   1. Verwijder eilandjesgradiëntoplossingen van 1,108 g/cm³, 1,096 g/cm³ en 1,069 g/cm³, bereid en gebruikt in de volgende stappen en "Eilandzuivering" stap 5.2, uit 4 °C-opslag, en laat ze in evenwicht komen tot kamertemperatuur (ongeveer 1 uur).
      OPMERKING: Het vereiste gradiëntvolume verschilt door het aantal alvleesklieren dat verwerkt moet worden; raadpleeg Tabel 3 om voldoende ontdooide volumes van geselecteerde gradiënten te waarborgen.
   2. Voorlaad en label de 50 mL spuiten met gradiënten van 1,096 g/cm³ en 1,069 g/cm³.
      1. Meng de dichtheidsgradiëntoplossingen van 1,069 en 1,096 g/cm³ intensief.
      2. Laad de juiste volumes, afhankelijk van Tabel 3, in 50 mL spuiten die zijn voorzien van chirurgische slangen en een 16 G naald.
      3. Na het vullen sluit je de naalden af om de sterieliteit te behouden en leg je de spuiten apart voor volgend gebruik in stap 5.5 van "Eilandzuivering".
   3. Houd een gradiënt van 1,108 g/cm³ op kamertemperatuur tot later gebruik.
2. Maak werkend dissociatiemedium (WDM) enzymoplossing, laad het in spuiten voor perfusie en autoclaveerde bekers.
   1. Werk onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast en houd alle oplossingen op ijs.
   2. Ontdooide aliquots van collagenase, thermolysine en DNase I op ijs.
   3. Verdun enzymreagentia in een steriele 1 L beker met WDM om de volgende eindconcentraties te bereiken: collagenase 0,15 mg/mL, thermolysine 5 μg/mL en DNase I 0,1 mg/mL (Tabel 2).
   4. Meng WDM voorzichtig met een draaiende beweging 10 keer. Niet mengen met een pipet; behoud de enzymactiviteit door zachtjes te draaien.
   5. Eén voor één, laad je 10 mL van de WDM-enzymoplossing in elke 10 mL spuit met een 16 G naald voor snelle vulling, en vervang dan door een afgesloten naald van 25 G X 1/2" inch voor latere alvleesklierperfusie.
   6. Wikkel geladen spuiten in autoclaven aluminiumfolie en leg ze op ijs tot gebruik.
   7. Doseer overtollige WDM gelijkmatig in steriele 600 mL bekers om de geoogste alvleesklieren vast te houden volgens Tabel 2. Bedek elke beker met steriel aluminiumfolie en leg deze op ijs (Tabel 2).
3. Bereid celkweekwerkruimte voor.
   1. Zet de orbitale waterbadshaker aan, ingesteld op 130 rpm en 37 °C. Laat het zo tijdens het oogsten van de alvleesklier.
   2. Plaats de volgende items onder UV-licht in de bioveiligheidskast voor verdere sterilisatie.
      Steriele 500 μm zeef.
      Steriele 1 L beker.
      Spuitpomp.
   3. Zorg ervoor dat de celkweekincubator is ingesteld op 25 °C 5%_CO2.
   4. Stel de centrifuge in op 4 °C, met acceleratie en vertraging op 9.
4. Verzamel materialen voor oogst en ga naar de operatiekamer.
   1. Aangewezen alvleesklierreiniger:
      1. Verzamel één grote ijsemmer om het vereiste aantal 600 mL WDM-bekers en de alvleesklierspoelingsoplossing te bevatten (zie Tabel 1 en Tabel 2).
      2. Verzamel 1 steriele petrischaal voor elke 6 alvleesklieren die verwerkt moeten worden.
      3. Verzamel 1 steriele micro-dissectieschaar en 2 kleine, gebogen gevoelige tangen.
   2. Aangewezen alvleesklieroogster:
      1. Verzamel een steriel oogstoperatiepakket.
      2. Verzamel steriele chirurgische handschoenen.
      3. Verzamel een ijsbak met voorgeladen 10 mL WDM-spuiten die zijn afgesloten in autoclaveerde aluminiumfolie.
5. In de operatiekamer bereid je het alvleesklieroogststation voor.
   1. Zet de glazen kralensterilisator aan om chirurgische instrumenten te steriliseren door ze 1 minuut in de sterilisator te dompelen tussen elk dier. Instrumenten kunnen snel worden gekoeld door onderdompeling in steriele 1x PBS.
   2. Plaats een absorberend pad onder het gezichtsveld van de microscoop voor bloed of gelekt WDM-enzymoplossing.
   3. Stel de microscoop in op een totale vergroting van 6,3x tussen de oculaire en het objectief.
   4. Open het operatiepakket en doe steriele chirurgische handschoenen aan met behulp van aseptische techniek.
   5. Ga door met chirurgische oogst.
6. In de operatiekamer bereid je het alvleesklierreinigingsstation voor.
   1. Giet genoeg Pen-Strep-oplossing om de helft van een 100 mm Petrischaal (ongeveer 6 mL) te vullen om de geïsoleerde alvleesklieren onder te dompelen en op ijs te leggen.
   2. Open het operatiepakket en doe steriele chirurgische handschoenen aan met behulp van aseptische techniek.
7. In de operatiekamer bereid je de euthanasiekamer voor.
   1. Plaats reservoirbakken in een lege, schone en opnieuw afsluitbare rattenkooi.
   2. Vul schalen halfvol met isoflurane.
   3. Zet de geperforeerde bak bovenop de reservoirs om morsen te voorkomen terwijl ratten erin worden geplaatst.
   4. Sluit de bovenkant van de kamer af met het deksel van de kooi.
8. Ga verder met het oogsten van de alvleesklier.

3. Alvleesklieroogst

1. Plaats ratten één voor één in de euthanasiekamer bovenop het dienblad voor een snelle isoflurane-overdosis.
   OPMERKING: De euthanasietijd die de rat nodig heeft, varieert, vooral naarmate de isofluraan verdampt.
2. Controleer het ontbreken van pols en ademhaling bij elke rat.
3. Bevestig euthanasie met een secundaire methode die de buikholte niet verstoort (bijvoorbeeld een hartpunctie).
   OPMERKING: Andere primaire euthanasiemethoden zijn acceptabel; Echter, een isoflurane-overdosis heeft de voorkeur, omdat snelle euthanasie de hypoxie van eilandjes minimaliseert.
4. Spray de buikvacht van elke rat met 70% ethanol om los haar in het operatieveld te verzachten en te voorkomen.
5. Plaats de geëuthanaseerde rat op rugligging onder de microscoop met het hoofd distaal van de operator. Zorg ervoor dat de bovenbuikholte onder het microscoopgezichtsveld ligt.

Figuur 1: Chirurgische blootstelling en intraductale perfusie van de rattenalvleesklier. Illustratie van de belangrijkste stappen in blootstelling en perfusie van de alvleesklier via de Oddi-sluiter. (A) Geëuthanaseerde Lewis-rat met open buikholte. (Aa) Klemplaatsing van de gemeenschappelijke galgang en levervene. (B) Vergrote weergave van de duodenum met hemostaten die het gebied van de sluitspier van Oddi markeren. (Bb) Perfusienaald geplaatst in het hoofdkanaal van de alvleesklier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Oogst de alvleesklier (rol van alvleesklieroogster):
   1. Maak een "V-vormige" incisie met een huidschaar, beginnend bij de symfyse van de schaamstreek naar elke laterale ribbenkast om toegang te krijgen tot de buikholte (zie Figuur 1A).
   2. Trek de dunne en dikke darm terug naar de linkerkant van het dier met een platte tang om de buikholte "werkruimte" te ontruimen.
   3. Vouw de twaalfvingerige darm uit met de platte tang en gebogen hemostaten. Zorg ervoor dat de gemeenschappelijke galweg en de hepatische portaalader in het gezichtsveld van de microscoop liggen.
   4. Trek de levercephalad terug en klem de gemeenschappelijke galweg en levervena af met behulp van de gebogen hemostaten. Klem 1-2 mm van de lever af (zie Figuur 1Aa).
      OPMERKING: Stappen 3.6.1-3.6.4 en 3.6.8 kunnen worden uitgevoerd via directe visualisatie. Gebruik de microscoop voor alle andere stappen om een delicaat weefselmanipulatie te garanderen.
   5. Onder het zicht van de microscoop wordt de inhoud in de duodenum voorzichtig gemobiliseerd met de platte tang en platte hemostaten om de sluitspier van Oddi te zuiveren.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de inhoud van de duodenum wordt verplaatst van de beoogde plek voor naaldinbreng.
   6. Isoleer het gebied rond de sluitspier van Oddi door het duodenum voorzichtig met de platte hemostaten ongeveer 5 mm van elke zijde van de sluitspier af te klemmen. Zorg voor minimale compressie om de weefselintegriteit te behouden (zie Figuur 1B).
   7. Met een steriele WDM-spuit steek je de naald voorzichtig door de wand van de duodenum, steek deze door de sluitspier van Oddi en breng je hem in het hoofdkanaal van de alvleesklier voor perfusie (zie Figuur 1Bb).
      1. Zodra de naald door de sluitspier van Oddi gaat, met constante druk, perfuser 7-10 mL WDM in de alvleesklier met een snelheid van ongeveer 500 μL/s totdat de alvleesklier volledig is opgezwollen.
         OPMERKING: Zorg ervoor dat de afschuining omhoog staat en de naald parallel aan de alvleesklierbuis staat om trauma te minimaliseren. Begin direct met injecteren na het inbrengen. Dit helpt de sluitspier en het kanaal te verwijden, waardoor de naald verder kan verplaatsen. De alvleesklier wordt als volledig opgezet beschouwd wanneer de staart van de alvleesklier, die zich nabij de milt bevindt, zichtbaar doorbloed raakt.
   8. Verwijder de alvleesklier door deze voorzichtig los te maken van omliggende structuren in de volgende volgorde: milt, maag, dikke darm, duodenum en mesenterium.
      OPMERKING: Gebruik een stomp dissectie om weefselschade te minimaliseren. Ga sequentieel te werk om de anatomische oriëntatie te behouden en de spanning op de vaat- en ductale verbindingen te verminderen.
      1. Verwijder beide platte hemostaten uit de twaalfvingerige darm.
      2. Gebruik de platte tang om het splenopancreasligament (verbindt de alvleesklier en milt) af te klemmen en geef zachte grip.
      3. Met behulp van de fijn gebogen dissectietang mobiliseer en scheid je zorgvuldig de alvleesklier van de aangrenzende miltaanhechtingen.
      4. Maak de alvleesklier los van de maag door het alvleesklierweefsel op te tillen met fijne gebogen pincetten en zachte tegentractie toe te passen met platte pincetten.
      5. Vervolgens breng je met de platte pincet stevige grip uit om de dikke darm uit de alvleesklier te verwijderen.
      6. Til de dunne darm op met de platte pincet en snijd de mesenterie uit de alvleesklier met de fijn gebogen pincet.
      7. Til voorzichtig de doorbloede alvleesklier op met de platte pincet en gebruik de fijne snedschaar om eventuele resterende aanhechtingen aan bindweefsel los te maken.
   9. Breng de verwijderde alvleesklier onmiddellijk over in een petrischaaltje met ijskoude spoeloplossing en ga direct verder met het oogsten van de volgende alvleesklier, terwijl de alvleesklierreiniger begint met het reinigen van de alvleesklier.
7. Maak de alvleesklier schoon (rol van pancrea-reiniger):

Figuur 2: Reiniging van de doorbloede rat alvleesklier. Sequentiële visualisatie van de alvleesklier vóór en na verwijdering van niet-essentieel weefsel. (A) Perfuseerde alvleesklier direct na dissectie, met aangrenzend vetweefsel, lymfeklieren en bindstructuren zichtbaar. (B) Perfuseerde alvleesklier met belangrijke anatomische herkenningspunten gelabeld. (C) Alvleesklier gereinigd na verwijdering van overtollig weefsel, met het uiteindelijke uiterlijk vóór de spijsvertering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Gebruik de fijn gebogen pincet en fijne dissectieschaar om zorgvuldig lymfeklieren, vetweefsel, mesenterie en grote bloedvaten van de doorbloede alvleesklier te verwijderen, indien aanwezig (zie Figuur 2).
2. Breng de gereinigde alvleesklier over in een steriele beker van 600 mL met 25 mL koude WDM. Bedek de beker met steriele aluminiumfolie om de schoonheid te behouden tussen de overgang van de chirurgische werkruimte naar de celcultuurwerkruimte.
   1. Vervang de spoeloplossing in de Petrischaal elke 6 alvleesklieren om besmetting te voorkomen.
   2. Noteer het moment waarop de eerste alvleesklier op ijs wordt gelegd. Dit zal worden gebruikt om de tijd van kou-ischemie te documenteren.

8. Zodra alle alvleesklieren zijn aangeschaft en gereinigd, kun je snel doorgaan naar de verteringsfase in de celkweekruimte.

4. Vertering van de alvleesklier

1. Pauzeer de omwentelingen van de orbitale shaker en beveilig de bedekte beker(s), met alvleesklieren, in de aangewezen houders van het waterbad.
2. Start snel de orbitale shaker opnieuw ingesteld op 130 rpm en start een timer van 10 minuten voor de verteringstijd (zie Figuur 3A).
   OPMERKING: Noteer dit punt als het einde van de periode van kou-ischemie. Registreer elke eilandoogst met de bijbehorende totale kou-ischemietijd in een laboratoriumrecord.
3. Na 5 minuten draai je de beker handmatig met de klok mee en vervolgens tegen de klok in om de weefseldissociatie te bevorderen.
4. Na 8 minuten haal je de afschrikoplossing uit de koude opslag en breng deze over in de bioveiligheidskast voor later direct gebruik (zie Tabel 1).
5. Na 10 minuten breng je bekers snel over en dompel ze onder in ijs om de enzymactiviteit te vertragen (zie Figuur 3B).
   OPMERKING: Vanaf dat moment behandel je alle weefsels, cellen en oplossingen op ijs om ze te behouden tot stap 4.20 bij gebruik van dichtheidsgradiënten bij kamertemperatuur.
6. Breng de buitenkant en de tray van de beker over in een bioveiligheidskast.
7. Voeg een afkoelbuffer toe in een verhouding van 1:1 met de oplossing in de beker om de vertering te stoppen (ongeveer 75-100 mL per beker).
8. Aspireer en verdrijf de weefselsuspensie voorzichtig en herhaaldelijk met een 50 mL spuit voorzien van een 14 G spinale naald om grote weefselfragmenten te dissociëren (zie Figuur 3C).
9. Breng de vering over naar 200 mL conische buizen.
10. Spoel de beker met 5 ml wasmedium en giet het over in de 200 ml conische buis met het eilanddigest om eventueel resterende digest op te vangen.
11. De centrifuge verteert bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zorg voor het gebruik van geschikte centrifugeflessenadapters en kussens voor de veiligheid.
12. Giet het supernatant voorzichtig over en suspendeer de pellet opnieuw in 100 mL wasmedium met dezelfde 14 G spinale naald als voorheen.
13. Filter de suspensie door een steriele 500 μm zeef die over een steriele 600 mL beker wordt geplaatst om groot, onverteerd weefsel te verwijderen.
    OPMERKING: Als de perfusie en reiniging van de alvleesklier optimaal worden uitgevoerd, blijft er minimaal vetweefsel en geen niet-doorbloede alvleesklier bovenop het zeef.
14. Spoel de zeef af met 10 ml wasmedium om vastgeklemd weefsel terug te halen.
15. Breng het filtraat over in nieuwe 200 mL conische buizen.
16. Centrifugeer op 200 × g gedurende 5 minuten op 4 °C.
17. Decant het supernatant en het pelletje opnieuw ophangen in 100 mL wasmedium met een 10 mL serologische pipet.
    OPMERKING: Zorg voor minimaal celverlies door pipettoppen vooraf te bevochtigen met een buffer die FBS bevat voordat je aan eilandjes wordt blootgesteld.
18. Centrifugeer op 600 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
19. Aspireer voorzichtig het supernatant om een droge pellet te verkrijgen.
20. Stel de centrifugetemperatuur in op 22 °C ter voorbereiding op gradiëntafscheiding.
    OPMERKING: Dit kan worden versneld door de centrifuge 15 minuten op 2000 x g te laten draaien bij 22 °C, zonder monsters.

5. Zuivering van eilandjes

1. Raadpleeg Tabel 3 om het aantal 50 mL conische buizen te bepalen.
   OPMERKING: Raadpleeg Tabel 3 om het totale pelletvolume gelijkmatig te verdelen, zodat ongeveer 2-3 mL pelletdigest over elke gradientbuis wordt verdeeld. Als later een zwakke isletband-scheiding wordt waargenomen, gebruik dan extra gradiëntbuizen om de scheidingsresolutie te verbeteren.
2. Maak een 10 mL serologische pipettip vooraf nat met de dichtheidsgradiëntoplossing van 1,108 g/cm³ om te voorkomen dat eilandjes aan het binnenoppervlak van de tip blijven hechten.
3. Suspendeer elke weefselpellet opnieuw in 15 mL van 1,108 g/cm³ gradiëntoplossing per 2 mL pelletvolume met behulp van de voorbevochtigde 10 mL serologische pipet. Ondanks dat het totale volume meer dan 10 mL bedraagt, zorgt de kleinere pipetbreedte voor een gecontroleerder mengen en efficiënte pelletdissociatie. Meng voorzichtig tot het uniform is.
4. Doseer voorzichtig 15 mL van de celsuspensie in de bodem van elke 50 mL conische buis, waarbij je contact met de buiswanden vermijdt om een schone gradiënt te garanderen.
5. Met behulp van voorgespannen gradientspuiten worden achtereenvolgens 10 mL van een 1,096 g/cm³ gradiënt overliggend gelegd, gevolgd door 10 mL met een gradiënt van 1,069 g/cm³.
6. Doseer elke gradiënt met een snelheid van 5 mL/min met een spuitpomp, waarbij de 16 G naaldtip tegen de binnenwand van de buis wordt geplaatst om gradiëntmenging te voorkomen.
7. Centrifugeer de buizen op 700 × g gedurende 15 minuten bij 22 °C, met de centrifugeversnelling ingesteld op 3 en vertraging op 0 om gradiëntmenging te voorkomen.
   OPMERKING: Gezien de verlengde vertragingstijd duurt de gehele centrifugatiecyclus ongeveer 45 minuten. Houd de tijd nauwlettend in de gaten, want eilandjes moeten snel worden verzameld om gradiëntmenging en mogelijke celschade te voorkomen. Indien nodig, bereid tegengewichtbuis(s) voor op gewicht, niet op volume, om rekening te houden met dichtheidsverschillen. Na het verwijderen van de buizen zet je de centrifuge terug op 4 °C, en acceleratie en vertraging op 9 voor toekomstige stappen.
8. Na centrifugatie identificeer je de eilandlaag die zich bevindt op de grensvlakken tussen de 1,069-1,096 g/cm³ en 1,096-1,108 g/cm³ gradiëntlagen (zie Figuur 3D).
9. Aspireer en verwijder zorgvuldig het weefsel dat in de bovenste laag is verzameld met een Pasteur-pipet, vooraf nat gemaakt met wasmedium.
10. Maak een andere Pasteur-pipet nat, verzamel de eilandlaag en breng deze over in een voorgekoelde 200 mL conische buis met 5 mL wasmedium.
11. Verhoog het voorgekoelde 200 mL conische buisvolume naar 200 mL met wasmedium.
12. Centrifugeer op 600 × g gedurende 5 minuten en giet het supernatant over.
13. Suspendeer de pellet opnieuw in 30 mL wasmedium met een vooraf bevochtigde 10 mL serologische tip.
14. Breng de ophanging over naar een nieuwe 50 mL conische buis met een voorbevochtigde 10 mL serologische tip voor betere eilandjepelletering.
15. Spoel dezelfde 200 mL conische buis af met 20 mL wasmedium en breng over naar de 50 mL conische buis met de resterende eilandjes.
16. Centrifugeer de 50 mL conische met eilandjes en wasmedium op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
17. Dekanteer het supernatant en suspendeer de eilandpellet opnieuw in 50 mL eilandjescultuurmedium (zie Tabel 1).
    OPMERKING: Verwijder 100 μL aliquots tijdens deze stap als je eilandjes telt met de handmatige kwantificatiemethode.
18. Gelijkmatig opdelen in niet-weefsel-gekweekte 100 mm Petrischalen, waarbij één bord wordt gebruikt voor elke vijf Lewis-rattenpancreases die worden verwerkt.
    1. Bereken het totale benodigde mediavolume van het eilandje met behulp van de formule (aantal alvleesklieren ÷ 5 × 10 mL).
    2. Suspendeer de eilandpellet opnieuw in de helft van het berekende mediavolume en verdeel de suspensie vervolgens gelijkmatig over het vastgestelde aantal platen.
    3. Spoel de 50 mL conische buis met resterende eilandjes met de resterende helft van het berekende medium en pipette deze was over dezelfde platen om een eindvolume van 10 mL per schotel te bereiken (zie Figuur 3E).
19. Incubeer 's nachts bij 25 °C in 5% CO₂. Voeg elke 24 uur 3 ml eilandjescultuurmedium toe aan de zijkant van elke petrischaal en draai het vervolgens voorzichtig om het medium aan te vullen.
20. Ga verder met het tellen van eilandjes (stap 6).

Figuur 3: Vertering en zuivering van geïsoleerde eilandjes door de alvleesklier. Representatieve beelden van de opeenvolgende stappen van de vertering van de opgehoopte alvleesklier tot de zuivering van het eilandje. (A) Gepoolde doorbloede alvleesklieren vóór enzymatische vertering. (B) Gefragmenteerde alvleesklier na enzymatische spijsvertering. (C) Uniforme weefselsuspensie, post-mechanisch. (D) Dichtheidsgradiëntbuizen vóór centrifugatie (links) en na centrifugatie (rechts), met zichtbare eilandband bij het gradiëntinterface omcirkeld. (E) Brightfield-afbeelding van dag 0-eilandjes direct na verzameling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Eilandjes tellen

1. Verzamel handmatige kwantificatie van eilandjes.
   1. Tijdens stap 5.16 haal je drie 100 μL aliquots van de eilandophanging uit met een 200 μL pipet en normale 200 μL tips.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de eilandjes gelijkmatig in het medium worden opgehangen door middel van pipetmenging wanneer aliquots worden genomen voor meting.
   2. Plaats elke aliquot in een eigen 2 mm × 2 mm raster Petrischaal met 1 mL 1× PBS.
   3. Tel eilandjes onder een omgekeerde microscoop, waarbij je ze catalogiseert op diameter met een viculair retikellens-inzetstuk.
      OPMERKING: Niet alle eilandjes zullen rond zijn; Houd je tijdens het tellen aan horizontale of verticale metingen.
   4. Bereken het totale aantal eilandjesequivalenten van 150 μm met behulp van de gestandaardiseerde conversietabel (zie Tabel 4).
      OPMERKING: Vergelijk de IEQ van elk monster. Als de IEQ van de aliquots met meer dan 30% verschilt, ga dan verder met het gemiddelde van de meest vergelijkbare aliquots.

7. Veiligheidsmaatregelen

1. Voer alle chirurgische en weefselbehandelingen uit onder aseptische omstandigheden in een bioveiligheidskast wanneer dat passend is. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder veiligheidsbril, laboratoriumjassen, handschoenen en chirurgische mondkapjes, bij het hanteren van reagentia en weefsels.
2. Voer alvleesklieroogst uit onder steriele omstandigheden met voldoende chirurgische instrumenten en persoonlijke beschermingsmiddelen. Behandel isoflurane en andere anesthetica volgens de richtlijnen van de instelling om inhalatieblootstelling te voorkomen.
3. Verwijder dierlijk weefsel, scherpe voorwerpen en biologisch gevaarlijk afval in overeenstemming met de institutionele bioveiligheidsprotocollen. Houd enzymatische reagentia en biologische materialen op ijs, tenzij anders gespecificeerd, om activiteit en levensvatbaarheid te behouden.

Resultaten

De volgende resultaten vertegenwoordigen een typische isolatie van eilandjes uitgevoerd met de beschreven methode, waarbij twaalf Lewis-rattenpancreases parallel worden verwerkt.

Opbrengst- en grootteverdeling

Handmatige aliquottelling en IEQ-conversie

Twee onafhankelijke 100 μL aliquots werden verkregen uit de gemengde eilandjes-suspensie, zoals beschreven in sectie "Eilandtelling," stap 6.1, en geteld met diameter-bins (50-100 μm, 100-150 μm, 150-200 μm, 200-250 μm, 250-300 μm, 250-300 μm). Tellingen werden omgezet naar eilandjesequivalenten (IEQ; referentie 150 μm) met behulp van standaard equivalentietabellen en geëxtrapoleerd naar het totale ophangvolume (zie Figuur 4A). Over de testisolatie (n = 12) was het rendement 3330 IEQ/alvleesklier met een mediane eilanddiameter in de 50-100 μm bin. Repliceer aliquots met 18,8% per bak (variatiecoëfficiënt), wat wijst op matige variatie maar verwacht met handmatige telmethoden. Over de voorgaande 14 eilandjesisolaties leverde deze methode gemiddeld 1353 (SD 607) IEQ/alvleesklier op.

Geautomatiseerde kwantificatie van volledige platen

Om handmatige IEQ te benchmarken, werden brightfield-beelden op D1 met een microscoop gemaakt en gestitched om whole-dish composieten te genereren (4× objectief; 1/100 s belichting). Geautomatiseerde groottebepaling en objectkwantificatie werden uitgevoerd met Fiji en codering met een vooraf gedefinieerde drempelgrootte van 50-600 μm. Beelden werden eerst voorbewerkt om achtergrondvariatie te verminderen en de contrastuniformiteit te verbeteren. Eilandjesstructuren werden geïdentificeerd op basis van intensiteitsverschillen ten opzichte van omringend weefsel, wat resulteerde in binaire objectmaskers. Aangrenzende of gedeeltelijk aanrakende eilandjes werden gescheiden om onderschatting van het aantal objecten te voorkomen. Objecten buiten het gespecificeerde groottebereik werden uitgesloten om puin en niet-eilandweefsel te verwijderen. Voor elk behouden object werden morfometrische parameters zoals oppervlakte en x- en y-as diameters geëxtraheerd. Eilandjes werden vervolgens gebunt op diameter, en IEQ werd berekend door het aantal eilandjes in elke grootte te vermenigvuldigen met de bijbehorende conversiefactor. Geautomatiseerde dimensionering leverde in totaal 98.832 objecten op, met gemiddelde x- en y-as diameters van respectievelijk 117 μm en 116 μm, en een geschatte totaal van 16.350 IEQ, wat sterk correleerde met handmatige IEQ gemeten bij D0 (Spearman r = 0,937, p = 0,0048; zie Figuur 4A-C).

Eilandcelafscheiding

Volledige plaatbeelden werden 2 uur na zuivering en opnieuw op dag 1 (D1) gemaakt, waarbij dezelfde methodologie werd gebruikt in "Geautomatiseerde kwantificatie van hele platen" om vroege eilandstabilisatie ("afscheiding") te evalueren. De objecttellingen veranderden met 0,9% en IEQ met -6,11% van 2 uur naar D1 (zie Figuur 4D). Gepaarde vergelijking van eilanddiameters tussen D0 en D1 toonde een statistisch significante mediane afname van 2 μm (Wilcoxon tekentest, p = 0,0136, n = 2820). De kleine omvang van deze verandering zal echter waarschijnlijk niet biologisch of klinisch betekenisvol zijn.

Figuur 4: Kwantitatieve beoordeling van de verdeling van eilandjesgrootte, correlatie en vroege uitwerpsel. Grafische samenvatting van eilandmetingen verkregen via handmatige en geautomatiseerde analyses. (A) Dag 0 (D0) eilandgrootteverdeling gebaseerd op handmatige kwantificering over gestandaardiseerde eilandequivalente IEQ-grootte bakken. (B) Dag 1 (D1) eilandgrootteverdeling bepaald door geautomatiseerde beeldgebaseerde metingen over dezelfde gestandaardiseerde IEQ-groottebakken. (C) Correlatie van tellingen tussen handmatige D0- en geautomatiseerde D1-kwantificatie over IEQ-grootte bins. (D) Boxplot van de verdeling van eilanddiameters tussen D0 en D1 voor geautomatiseerde metingen van dezelfde plaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Zuiverheid (endocrien versus exocriene inhoud)

Dithizone (DTZ) kleuring

Op D1 werd een aliquot van eilandjes (n = 451) 30 seconden bij kamertemperatuur met DTZ gekleurd en onmiddellijk met brightfield-microscopie (4× objectief; 1/20 s belichting) in beeld gebracht. In Fiji werden achtergrondpixels verwijderd zodat het resterende pixelgebied overeenkwam met het totale eilandjesoppervlak. DTZ-negatieve exocriene weefselregio's, geïdentificeerd door donkerder kleurcontrast, werden handmatig geselecteerd met een lasso-instrument, en het gebied van elk interessegebied werd automatisch in pixels geregistreerd. Endocriene zuiverheid werd berekend als het percentage DTZ-positieve pixels ten opzichte van het totale aantal eilandjespixels, wat een zuiverheid van 98,56 ± 0,38% opleverde (Figuur 5A).

Levensvatbaarheid en functionele prestaties

Glucose-gestimuleerde insulinesecretie (GSIS)

Op elk tijdstip (D1, D3, D7) werden 15 maatjes met de maat gekozen en geplaatst in individuele putten van een 24-put plaat, viervoudig voorbereid. De eilandjes werden geïncubeerd bij 37 °C 5%_CO2 in een Krebs-buffer onder een laag-hoog-laag glucosestimulatieprotocol: eerst bij lage glucose (2,8 mM, 60 min), gevolgd door hoge glucose (16,7 mM, 60 min, zie Tabel 1). Aan het einde van elke incubatieperiode werden de effluentfracties verzameld en de insulineconcentraties werden gekwantificeerd met behulp van een ratteninsuline-ELISA-test. De stimulatie-indices werden berekend als de verhouding van insulinesecretie tijdens hoge tot lage glucoseomstandigheden. De stimulatie-indices waren respectievelijk 9,37, 8,34 en 6,7 op dag 1, 3 en 7, zonder significante verschillen (Figuur 5B).

Levend/Dood kleuring

Bij D1, D3 en D7 werden 15 eilandjes met de hand geplukk en bevlekt met de Live/Dead levensvatbaarheidskit volgens de instructies van de fabrikant. Kort gezegd werden eilandjes 30 minuten geïncubeerd in de Live/Dead-kleuringsoplossing bij 25 °C, waarna ze onder consistente microscoopinstellingen werden gefotografeerd om vergelijkbaarheid over tijdstippen te waarborgen (4X objectief; 1/30 s belichting, Texas Red en GFP-filters). De levensvatbaarheid werd gekwantificeerd met een Python-script dat scikit-image gebruikte voor isletsegmentatie en fluorescentiemeting. Eilandjes werden geïdentificeerd door het combineren van de groene en rode fluorescentiekanalen, het toepassen van Li's drempelmethode om een binair masker te genereren, en het gebruik van waterscheidingssegmentatie om aanrakende eilandjes te scheiden. Objecten werden per gebied gefilterd om puin en artefacten uit te sluiten. Voor elk eilandje werd de levensvatbaarheid berekend als het percentage van de live geïntegreerde dichtheid (groene pixels) ten opzichte van de totale geïntegreerde dichtheid (groen plus rode pixels). De resultaten toonden een levensvatbaarheid van 68 ± 9% bij D1, 98,2 ± 0,6% bij D3 en 100% bij D7. Een positief controlemonster behandeld met 70% ethanol gedurende 10 minuten vertoonde 2,7 ± 7,2% levensvatbaarheid (zie Figuur 5C-F).

Figuur 5: Beoordeling van de zuiverheid, levensvatbaarheid en functionele responsiviteit van eilandjes. Representatieve beelden en kwantitatieve samenvattingen van geïsoleerde eilandjeskenmerken in de tijd. (A) Representatief 10× brightfield-beeld van eilandjes gekleurd met dithizone (DTZ), met roodgekleurde endocriene eilandjes en ongekleurd exocrien weefsel. (B) Glucose-gestimuleerde insulinesecretie (GSIS) waarden van een hoge glucose/lage glucose (HG/LG) stimulatie-index voor dag 1, 3 en 7. (C-E) Levende/dode fluorescentiebeelden van eilandjes op dag 1 (C), dag 3 (D) en dag 7 (E). (F) Levende/dode fluorescentiebeeld van positief gecontroleerde eilandjes behandeld met ethanol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

(A) Wasmedium
Component	Eindconcentratie	Bedrag (mL)
RPMI 1640	-	500 mL
Foetaal Bovin Serum	10%	50 mL
Pen-strep (10.000 U/mL)	1%	5,5 mL
HEPES	25 mM	12,5 mL uit 1M-standaard
L-glutamine	2 mM	5 mL uit 200 mM voorraad
(B) Eilandjescultuurmedia
Component	Eindconcentratie	Hoeveelheid (mL of g)
RPMI 1640, Geen glucose	-	500 mL
Foetaal Bovin Serum	10%	50 mL
Pen-strep (10.000 U/mL)	1%	5,5 mL
HEPES	20 mM	11 mL uit 1M standaard
Natriumpyruvaat	1 mM	5,5 mL uit 100 mM standaard
Glucose	5,5 mM	2,75 mL uit 200 g/L voorraad
(C) Penicilline-Streptomycine spoeloplossing
Component	Eindconcentratie	Hoeveelheid (mL of g)
Zoutoplossing, 0,9%	-	500 mL
Penicillin' Streptomycine (10.000 U/mL)	2%	10 mL
(D) Afkoelbuffer
Component	Eindconcentratie	Hoeveelheid (mL of g)
HBSS	-	500 mL
Foetaal Bovin Serum	20%	100 mL
HEPES (1 M)	2.50%	2,5 mL
(E) Krebs Buffer
Component	Eindconcentratie	Hoeveelheid (mL of g)
dH2O	-	975 mL
NaCl	115 mM	6,72 g
NaHCO3	24 mM	2,02 g
KCl	5 mM	0,3728 g
HEPES (1 M)	25 mM	25 mL
MgCl2	1 mM	0,0952 g
BSA	0.10%	1 g
CaCl2	2,5 mM	0,2775 g

Tabel 1: Oplossingslijst. Samenstellings- en bereidingsdetails voor alle oplossingen die gedurende het isolatie- en zuiveringsprotocol van het eilandje worden gebruikt. Elke subsectie vermeldt componenten, eindconcentraties, voorbereidingsvolumes en catalogusnummers. (A) Wasmedium, gebruikt voor het spoelen en wassen van het weefsel tijdens de spijsvertering en zuivering. (B) Islet Culture Media, gebruikt voor het onderhoud en de levensvatbaarheid van eilandjes na isolatie. (C) Penicilline-Streptomycine Spoeloplossing, gebruikt om geoogste alvleesklieren te steriliseren en te spoelen. (D) Quenching Buffer, gebruikt om enzymatische vertering te beëindigen en de levensvatbaarheid van cellen te behouden. (E) Krebs Buffer, gebruikt tijdens glucose-gestimuleerde insulinesecretie (GSIS) assays.

Aantal alvleesklieren	Collagenase (15,38 mg/mL)	Thermolysine (1 mg/mL)	DNAse (100 mg/mL)	Werkpuffer	600 mL Bekers om te gebruiken	Volume/Beaker
30	4,5 mL	2,25 mL	450 μL	450 mL	5	25 mL
24	3,6 mL	1,8 mL	360 μL	360 mL	4	25 mL
20	3 mL	1,5 mL	300 μL	300 mL	3	25 mL
16	2,4 mL	1,2 mL	240 μL	240 mL	2	25 mL
12	1,8 mL	0,9 mL	180 μL	180 mL	2	25 mL
10	1,5 mL	0,75 mL	150 μL	150 mL	2	25 mL
Laatste conclusie.	0,15 mg/mL	5 mg/mL	0,1 mg/mL

Tabel 2: Spijsverteringsenzymoplossing per hoeveelheid alvleesklier. Volumes collagenase, thermolysine en DNase I nodig om het Working Dissociation Medium (WDM) voor te bereiden op verschillende aantallen ratpancreases. De uiteindelijke concentraties van elk enzym staan onderaan de tabel vermeld.

Aantal alvleesklieren	Nummer 50 mL buizen	Volume/spuit	Aantal spuiten van 1.096	Aantal spuiten van 1.068
30	10 buizen	50 mL	2	2
24	8 buizen	40 mL	2	2
20	6 buizen	30 mL	2	2
16	4 buizen	40 mL	1	1
12	4 buizen	40 mL	1	1
10	2 buizen	20 mL	1	1

Tabel 3: Gradiëntbelasting per alvleesklierhoeveelheid. Aantal 50 mL conische buizen en bijbehorende gradiëntvolumes die nodig zijn voor de zuivering van eilandjes, gebaseerd op het aantal verwerkte alvleesklieren.

Eilanddiameterbereik (μm)	Eilandje Deeltjesnummer (AI)	IEQ-conversiefactor	IEQ per bereik
50-100	a	* 0.167	a * 0,167
101-150	b	* 0.648	b * 0,648
151-200	c	* 1.685	c * 1,685
201-250	d	* 3.500	d * 3.500
251-300	e	* 6.315	e * 6,315
301-350	f	* 10.352	f * 10,352
> 350	g	* 15.833	g * 15,833

Tabel 4: Eilandjesequivalentieconversie. Omzetting van eilanddiameterbereiken naar gestandaardiseerde eilandjesequivalenten (IEQ). De tabel geeft de waargenomen eilanddiameter-bins, het aantal eilanddeeltjes per bereik, de bijbehorende IEQ-conversiefactor voor elk groottebereik en de resulterende IEQ-bijdrage per bereik.

Discussie

Dit protocol beschrijft een high-throughput aanpak voor het isoleren en zuiveren van alvleeskliereilandjes van Lewis-ratten. Het succes van de methode hangt af van verschillende cruciale stappen die samen de integriteit en functie van het eilandje behouden. Daartoe behoren de precieze en volledige intraductale perfusie van de alvleesklier, de zorgvuldige reiniging van de doorgepompte alvleesklier en de exacte enzymatische verteringstijd. Consistente perfusie van het hele orgaan is cruciaal om een uniforme opzet van de alvleesklier te bereiken en een gelijkmatige verdeling van de collagenase-thermolysine-DNase-mix te waarborgen, die respectievelijk de extracellulaire matrix verteert, de enzympenetratie verbetert en de door DNA gemedieerde viscositeit^{verlaagt 21,22}. Onderperfusie kan leiden tot onvolledige weefselvertering en verlies van een aanzienlijk deel van de eilandjes, omdat het onderverteerde weefsel met de zeef wordt weggefilterd. Evenzo kan onvoldoende verwijdering van vet- of vaatweefsel vóór de spijsvertering niet-endocriene onzuiverheden introduceren die de zuiverheid verlagen. Ten slotte leidt langdurige vertering tot desegregatie van eilandjes door overmatige extracellulaire matrixbreuk, terwijl suboptimale vertering onverteerd weefsel oplevert dat resistent is tegen mechanische vertering via de spinale naald. Deze stappen vormen de meest voorkomende technische valkuilen en moeten zorgvuldig worden gemonitord tijdens training en optimalisatie.

Hoewel deze methode specifiek is ontworpen voor Lewis-ratten, kan deze waarschijnlijk worden aangepast aan andere stammen of soorten door een kleine heroptimalisatie van verteringstijd en enzymverhouding 23,24,25,26. Sommige laboratoria kiezen ervoor de verhouding van collagenase, thermolysine en DNase I in het Working Dissociation Medium (WDM) aan te passen om de opbrengst te optimaliseren voor hun specifieke enzymbatch of weefselkenmerken. Om dit te doen, kunnen laboratoria zorgvuldig de stapsgewijze handleiding van de fabrikant volgen voor enzym- en weefseloptimalisatie en in alle gevallen het toevoegen van componenten zoals 0,1 M EDTA, cysteïne, mercaptoethanol, proteaseremmers, serum of albumine vermijden, omdat deze collagenase, thermolysine en DNase 1 enzymactiviteit²⁷ kunnen remmen. Hoewel er geen definitieve werktijd voor het enzymmengsel vóór dissociatie is gepubliceerd, tonen eerdere gegevens aan dat langdurige koude conservatie van alvleeskliers een nadelige invloed heeft op de opbrengst en functie van eilandjes²⁸. Empirisch hebben we vastgesteld dat in ons protocol succesvolle isolaties consequent werden bereikt wanneer de totale kou-ischemietijd, gedefinieerd als het interval tussen het plaatsen van de eerste alvleesklier op ijs voor reiniging en het overbrengen naar het 37 °C waterbad, onder de 1,5 uur werd gehouden. Verdere optimalisatie van deze parameter kan gerechtvaardigd zijn, afhankelijk van de eindgebruikerapplicatie.

Ondanks zijn robuustheid kent dit protocol verschillende praktische en technische beperkingen. Ten eerste zijn de enzymmix (collagenase, thermolysine en DNase I) en dichtheidsgradiënten essentieel voor efficiënte weefseldissociatie en isolatie van eilandjes, maar brengen aanzienlijke kosten met zich mee. Onze keuze van enzymcombinatie werd geïnformeerd door de structurele kenmerken van de pancreas-extracellulaire matrix en de noodzaak om effectieve weefseldissociatie in balans te brengen met het behoud van de integriteit van het eilandje. Elke enzymatische component vervult een eigen rol: collagenase richt zich op fibrillaire en basale membraancollageen om eilandjes te bevrijden; Thermolysine, een neutrale protease, splitst niet-collageenmatrixeiwitten en cel-cel adhesiemoleculen, waardoor de benodigde collagenase-blootstelling wordt verminderd; en DNase I minimaliseert viscositeit veroorzaakt door DNA dat vrijkomt uit gelyseerde cellen 29,30,31. Hoewel goedkopere formuleringen van spijsverteringsenzymen commercieel verkrijgbaar zijn, varieert hun zuiverheid en kan deze de enzymatische prestaties^{aantasten 13,23}. Aangezien collagenase uit bacteriële culturen wordt geïsoleerd, verminderen aanvullende zuiveringsstappen de endotoxineverontreiniging, maar verhogen de kosten aanzienlijk^{met 13,23}.

Voor collagenase raden we preparaten aan met een activiteit van ongeveer 2.000 tot 4.000 Wünsch-eenheden per fles, wat effectieve dissociatie bij matige dosering ondersteunt en langdurige spijsvertering vermijdt. Opmerkelijk is dat de mix een evenwichtige verhouding van collagenase klasse I tot klasse II moet bevatten, wat overeenkomt met een collagenase II/totale collagenasefractie van ongeveer 0,3-0,5. Deze verhouding zorgt voor sterke collagenolytische activiteit terwijl overmatige afbraak van niet-collageeneuze extracellulaire matrix wordt beperkt. Daarnaast moet het collagenasemengsel worden aangevuld met een matig niveau van neutrale proteaseactiviteit (ongeveer 150.000-250.000 eenheden) en DNase, om reeds genoemde redenen.

Vanuit het oogpunt van kwaliteitscontrole moet elke batch documentatie bevatten van een lage endotoxinelast (≤50 EU/mg eiwit), een hoge enzymzuiverheid (≥85% door HPLC) en bevestigde lot-to-lot activiteit, aangezien de zuiverheid en samenstelling van enzymen sterk kunnen variëren per fabrikant. Ten slotte kunnen variaties in lotsamenstelling de consistentie van de vertering en de opbrengst van eilandjes beïnvloeden, waardoor de uitvoering van perceelspecifieke interne validatie noodzakelijk is. Dergelijke validatie kan worden bereikt door de gestandaardiseerde verteringsvoorwaarden in dit protocol te volgen en vervolgens de verteringsefficiëntie en eilandjesmorfologie te beoordelen. Indicatoren van suboptimale enzymprestaties zijn onder andere onvolledige weefseldissociatie, eilandjes met onregelmatige of ruwe randen, of de noodzaak van overmatige mechanische afschuiving om de scheiding te bereiken, in welk geval titratie van de verteringstijd noodzakelijk kan zijn.

Vergelijkbare overwegingen gelden voor dichtheidsgradiënten. We kozen een polysucrose-gebaseerde gradiënt, een niet-ionisch, sterk hydrofiel sucrose-epichloorhydrinecopolymeer dat stabiele gradiënten vormt tot 1,2 g/mL en een lange staat van dienst heeft in eilandisolatie^32,33. Jodixanol is een goed gevalideerd alternatief, en studies op menselijke eilandjes tonen aan dat iodixanol-gebaseerde gradiënten het herstel van eilandjes kunnen verbeteren terwijl levensvatbaarheid en functie^{behouden blijven.} Toch zijn de gegevens van knaagdieren niet doorslaggevend, waarbij sommige studies betere uitkomsten met jodixanol melden en andere een betere levensvatbaarheid en functie aantonen met polysucrose-gebaseerde gradiënten^32,35. Cruciaal is dat het gebruik van commercieel geproduceerde, kwaliteitsgecontroleerde gradiëntoplossingen wordt aanbevolen om de reproduceerbaarheid in laboratoria te verbeteren. Polysucrose-gebaseerde gradiënten zijn breed beschikbaar bij optimale dichtheden voor isolatie van eilandjes, terwijl iodixanolgradiënten doorgaans worden gemaakt door interne verdunning, wat extra variabiliteit introduceert. Een tweede beperking is dat chirurgisch oogsten een hoog niveau van technische vaardigheid vereist, vooral voor intraductale perfusie via de Oddi-sluiter en snelle excisie van de alvleesklier. Zelfs kleine vertragingen of verkeerde uitlijning kunnen leiden tot weefselschade, lekkage, ongelijkmatige perfusie of langdurige warme ischemie, wat de opbrengst en levensvatbaarheid van eilandjes kan aantasten. Om deze beperking te verzachten, bevat het protocol gedetailleerde procedurele beschrijvingen en originele grafische hulpmiddelen met kleurgecodeerde anatomische herkenningspunten om het begrip te vergemakkelijken. Nieuwe operators worden aangemoedigd om zich vertrouwd te voelen met de perfusietechniek voordat ze volledige isolaties uitvoeren, en oefening op karkassen wordt aanbevolen voordat ze levend oogsten proberen.

Ten derde vereist dit protocol voor maximale efficiëntie gecoördineerd teamwerk. Tijdens het oogsten van de alvleesklier en enzymatische spijsvertering zijn doorgaans drie getrainde operators nodig: één die steriele chirurgie uitvoert, één die de alvleesklier onder steriele omstandigheden schoonmaakt, en één die dieren circuleert en inslapt onder niet-steriele omstandigheden. Na de vertering kunnen downstream zuiveringsstappen doorgaans door minder operators worden uitgevoerd zodra de vaardigheid is bereikt. Hoewel deze coördinatie een logistieke eis in het voorhoofd vormt, maakt het het mogelijk om veel eilandjes binnen relatief korte tijd van meerdere dieren te isoleren, wat de totale doorvoer verbetert ten opzichte van minder gecoördineerde workflows. Hoewel dit protocol technisch veeleisend en veeleisend is, zijn deze beperkingen gemeenschappelijk voor alle methoden voor isolatie van eilandjes. Door gestandaardiseerde verteringscondities, gestructureerde training en gecoördineerde uitvoering te benadrukken, kan deze high-throughput aanpak tijd en arbeid per isolatie verminderen en consistente, reproduceerbare resultaten opleveren wanneer uitgevoerd door een getraind team.

In vergelijking met conventionele isolatieprotocollen voor knaagdiereilandjes biedt deze methode aanzienlijke voordelen op het gebied van doorvoer, reproduceerbaarheid en consistentie. Traditionele digesties van één orgaan zijn sterk afhankelijk van handmatig plukken en leveren vaak variabele zuiverheid¹³ op. Daarentegen maakt ons protocol gebruik van pooled digestion en density-gradient purification, waardoor de voorbereidingstijd en variabiliteit tussen monsters aanzienlijk wordt verminderd, terwijl een hoge levensvatbaarheid en functionele responsiviteit behouden blijven. De geïsoleerde eilandjes werden uitgebreid gekarakteriseerd op morfologie (dithizonekleuring), levensvatbaarheid (levend/dood assay) en functie (glucose-gestimuleerde insulinesecretie), waarmee de robuustheid van de methode werd bevestigd. Gezamenlijk maakt deze gestandaardiseerde workflow het mogelijk om rijke, schone en functionele eilandjespreparaten te genereren die geschikt zijn voor downstream toepassingen, waaronder encapsulatie, transplantatie en microfysiologische modellering 38,39,40. Belangrijk is dat Lewis-ratteneilandjes die met deze techniek zijn geïsoleerd, diabetes hebben omgekeerd in preklinische modellen, wat de translationele relevantie van deze reproduceerbare en schaalbare benadering⁴¹ onderstreept.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
21 G x 2 in. BD PrecisionGlide Needle	BD	305129
500 µm Brass Frame and 304 Stainless Steel Screen, 3" Diameter x 1" Deep (Sieve number 35)	McMaster-Carr	34735K525
Air-Tite Sterile Syringes, Luer lock	Fisher Scientific	14-817-178
Biogel PI UltraTouch M	Mölnlycke	42665
Bonn Scissors; Straight; Sharp Points; 15 mm Blade Length; 3 1/2" Overall Length	Roboz	RS-5840
Braintree Scientific GERMINATOR 500 DRY STERIL	Fisher Scientific	NC9956482
Cell-IQ Series 5.8 cu.ft. CO2 Laboratory Incubator	PHCBI	MCO-170AICUVHL-PA
Corning 100 mm Not TC-treated Culture Dish	Corning	430591
Corning Fetal Bovine Serum, 500 mL, Regular, USDA Safety Tested (Heat Inactivated)	Corning	35011CV
Corning Islet Gradient 1.069 (density 1.069 g/cm3)	Corning	99-815-CIS	Vereist special verzoek van bedrijf
Corning Islet Gradient 1.096 (density 1.096 g/cm3)	Corning	99-691-CIS	Vereist special verzoek van bedrijf
Corning Islet Gradient 1.108 (density 1.108 g/cm3)	Corning	99-692-CIS	Vereist special verzoek van bedrijf
Covidien Tendersorb Underpads	Fisher Scientific	22-225-102
DNase I Grade II	Roche	10104159001
Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Fisherbrand Aluminum Foil, Standard-Gauge Roll	Fisher Scientific	01-213-100
Fisherbrand Nonwoven Gauze Sponges	Fisher Scientific	22-028-559
Fisherbrand Reusable Glass Heavy-Duty Low-Form Beakers	Fisher Scientific	FB101600
Fluorescence Mircoscope  BZ-X810	Keyence	BZ-X810
Glucose Solution	Gibco	A2494001
Halsey Micro Needle Holder	Fine Science Tools	12500-12
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Gibco	14025092
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Hemostatic Forceps Classic Crile 5-1/2 Inch Length	McKesson	1231217
Hudson (Ewald) Forceps	Roboz	RS-5238
Hypodermic Needle Monoject 1-1/2 Inch Length 16 Gauge Regular Wall Without Safety	McKesson	43481
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030081
Liberase T-Flex, Research Grade	Roche	5989132001
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Invitrogen	L3224
MATLAB software package	MathWorks	https://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML
NE-4000 Two Channel Programmable Syringe Pump	SyringePump	NE-4000-US
NEEDLE, HYPO STR DISP 27GX1/2"(100/BX) EXLINT	McKesson	408877
Nunc Cell Culture/Petri Dishes	Thermo-Scientific	174926
Olympus CKX41 Inverted Phase Contrast Microscope	Olympus	CKX41-B
PBS, pH 7.4	Gibco	10010023
Penicillin‚ Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
RPMI 1640	Gibco	11875093
RPMI 1640, no glucose	Gibco	11879020
Sodium Pyruvate (100 mM)	Gibco	11360070
Sodium Pyruvate (100 mM stock)	Gibco	11360070
Sorval ST 16R	Thermo-Scientific	75004381
Stainless steel 304 syringe needle	Milipore Sigma	Z117013-1EA
SURGICAL DRAPE, DISPOSABLE, 36 IN X 100 YD	Covetrus	10408
Surgical Scissors - ToughCut	Fine Science Tools	14054-13
Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated Delicate 1.3 mm Tip Width	Roboz	RS-8120
Thermo Scientific Nunc 200mL Centrifuge Tube	Thermo-Scientific	14-962-17
Thermo Scientific Nunc Centrifuge Bottle Adapters and Cushions	Thermo-Scientific	12-565-283B
TSDUB15 15L Dubnoff Shaking Water Bath	Fisher Scientific	300610298
TX-400 4 x 400 mL Swinging Bucket Rotor	Thermo-Scientific	75003181
Tygon S-50-HL	Tygon	AAXoooo3
Ultra Sensitive Rat Insulin ELISA kit	Crystal Chem	90060