Meting van uitlaatfaciliteit en oogconformiteit in ex vivo muizenogen met behulp van een spuitpompsysteem

Samenvatting

Door analytische benaderingen van gevestigde drukgecontroleerde perfusiemethoden te integreren, werd een eenvoudig, goedkope spuitpompsysteem geoptimaliseerd voor het beoordelen van de uitstroomfaciliteit en oogcompliance in muizenogen.

Samenvatting

Het handhaven van de intraoculaire druk (IOP) op een geschikt en stabiel niveau is essentieel voor de ooggezondheid. De biomechanische eigenschappen van het trabeculaire meshwork (TM), het Schlemm-kanaal (SC) en de gehele corneosclerale schil spelen een cruciale rol in de IOP-homeostase. Uitstroomfaciliteit (C) is een belangrijke parameter voor het evalueren van de effectiviteit van TM en SC bij het afvoeren van waterig humor, terwijl oculaire compliance (φ) de elasticiteit van de corneosclerale schaal en de tijdelijke uitstroom via TM en SC weerspiegelt. Eerder werd een eenvoudig, kosteneffectief spuitpompsysteem ontwikkeld om C te beoordelen. Het gebruik van eenvoudige lineaire regressie voor in vivo data-analyse heeft echter beperkingen bij het karakteriseren van TM- en SC-functies. In deze studie werd het spuitpompsysteem geoptimaliseerd door analytische benaderingen toe te passen die zijn ontwikkeld voor gevestigde drukgestuurde oculaire perfusiesystemen. De gemeten C- en φ-waarden in ex vivo ogen werden vergeleken met eerder gepubliceerde perfusiesysteemwaarden en kwamen overeen met die gerapporteerde bereiken. Samenvattend vergemakkelijkt dit eenvoudige, goedkope spuitpompsysteem de evaluatie van de biomechanische eigenschappen van TM en SC.

Inleiding

Het handhaven van een geschikt en stabiel niveau van intraoculaire druk (IOP) is essentieel voor de ooggezondheid¹. Aanhoudende verhoging van IOP is de primaire risicofactor voor glaucoom ^2,3. Langdurige IOP-fluctuaties over maanden of jaren dragen ook bij aan gezichtsverlies ^4,5. Recente studies identificeerden een andere vorm van IOP-fluctuatie, tijdelijke fluctuaties veroorzaakt door dagelijkse activiteiten, die ook de progressie van glaucoom kunnen versnellen ^6,7. Zo vertoonden een 46-jarige man met een geschiedenis van 20 jaar ooglidwrijving en een 52-jarige man die al 10 jaar zijn ogen wreef, beiden versnelde schade aan de oogschijven ^8,9. Deze bevindingen benadrukken het belang van tijdige, passende reacties op de veranderingen in IOP om het risico op gezichtsverlies te minimaliseren.

IOP wordt gereguleerd door de balans tussen de productie van waterig humor (AH) en de afwatering^ervan. AH verlaat het oog voornamelijk via de conventionele en uveosclerale banen¹¹. Bij zowel normale als glaucomateuze ogen is het conventionele pad bestaande uit het trabeculaire gaaswerk (TM) en het Schlemm-kanaal (SC) de belangrijkste bron van uitstroomweerstand die de IOP-homeostase 12,13,14 beïnvloedt. Daarom zijn de biomechanische eigenschappen van TM en SC essentieel voor het oog om zich aan te passen aan veranderingen in IOP 15,16,17.

Recente technologische vooruitgang heeft een nauwkeurigere beoordeling van de AH-uitstroom mogelijk gemaakt. Invasieve benaderingen, zoals zwaartekracht-gebaseerde perfusie en het spuitpompsysteem, zijn ontwikkeld om de uitlaatfaciliteit (C) te berekenen, die aangeeft hoe TM en SC de stationaire uitstroom^reguleren 18,19,20,21,22,23,24. Niet-invasieve methoden, zoals tonografie²⁵ en fluorofotometrie²⁶, zijn klinisch gebruikt om C te bepalen bij patiënten met glaucoom. De meeste benaderingen zijn echter niet in staat om specifiek de functie van TM en SC te beoordelen. Bijvoorbeeld, in het spuitpompsysteem worden stationaire debietsnelheid en drukgegevens aangepast met eenvoudige lineaire regressie, en wordt de helling geïnterpreteerd als een drukafhankelijke C. Deze berekende C bij levende muizen kan echter niet nauwkeurig de AH-uitstroomcapaciteit weergeven via het conventionele pad, omdat deze wordt beïnvloed door AH-secretie, uveosclerale uitstroom en episclerale veneuze druk, zoals beschreven in de Goldmann-vergelijking.

Om deze beperking aan te pakken, berekenden Millar et al. de AH-instroom, conventionele uitstroom en de uveosclerale uitstroom in hetzelfde muisoog door meerdere constant-flow metingen op basis van de aanname van afwezige AH-instroom, geen episclerale veneuze druk en ongewijzigde uveosclerale uitstroom na euthanasisatie²². In 2016 rapporteerden Sherwood et al. dat de uveosclerale uitstroom 0 is in ex vivo ogen bij 0 mmHg, en beantwoordden vervolgens dezelfde vraag door een machtswetmodel te introduceren met iPerfusie (een drukgestuurd perfusiesysteem hierna het perfusiesysteem genoemd)²⁷. De methodologische vooruitgang heeft de verschillende rollen van TM en SC verduidelijkt, waardoor het begrip van hun fysiologische functies bij het behouden van een stabiele AH-uitstroom wordt vergroot.

Daarnaast is de tijdelijke respons van TM en SC op IOP-fluctuaties essentieel voor het handhaven van IOP-homeostase. Om deze beweging te volgen, ontwikkelden Xin et al. fasegevoelige optische coherentietomografie (OCT), die observatie mogelijk maakt op een tijdschaal van^{seconden 28}. Driedimensionale seriële blokvlak-scanning elektronenmicroscopie kan deze beweging op ultrastructureel niveau²⁹ onderzoeken. Beeldgebaseerde methoden schatten echter alleen de biomechanische eigenschappen van TM en SC en leveren geen daadwerkelijke waarden van tijdelijke AH-afvoer op. In 2019, na de ontwikkeling van iPerfusion, berekenden Sherwood et al. oculaire compliance (φ) als een belangrijke indicator van zowel corneosclerale elasticiteit als de transiënte respons van TM en SC³⁰. Deze vooruitgang biedt een kwantitatieve parameter om het voorbijgaande gedrag van TM en SC te beoordelen als reactie op IOP-fluctuaties.

Op basis van deze vooruitgang in het beoordelen van TM- en SC-functies verbeterde deze studie het spuitpompsysteem door het power-law model voor C-berekening te integreren en nieuwe methodologieën te integreren om φ te berekenen. Deze metingen werden vergeleken met gepubliceerde gegevens verkregen met het perfusiesysteem om te beoordelen of het geoptimaliseerde spuitpompsysteem geschikt is voor het beoordelen van de uitlaatfaciliteit en oogcompliance in ex vivo muizenogen.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visueel onderzoek en de richtlijnen voor de laboratoriumzorg en het gebruik van dieren van het Qingdao University Medical Center (QDU-AEC-2022069).

1. Dierselectie en -hantering

1. Gebruik muizen van 5 maanden met een genetische achtergrond van 50% C57BL/6 en 50% BALB/c. Beschouw seks niet in het experimentele ontwerp.
2. Houd muizen onder een licht-donkercyclus van 12 uur per 12 uur bij 23 ± 2 °C en een luchtvochtigheid van 50 ± 5%.

2. IOP-meting

1. Verdoof muizen met 2,5% isofluraan en 80% (vol/vol) zuurstof in een afgesloten kamer gedurende 3,5 minuten.
   VOORZICHTIG: Isoflurane is een vluchtig verdovingsmiddel. Voer anesthesie uit in een goed geventileerde ruimte of een geschikt containmentsysteem.
2. Zet muizen over naar een bedieningsplatform. Houd de anesthesie met een masker nog eens 30 seconden.
3. Voer alle metingen uit tussen 9:00 en 12:00. Noteer drie metingen per oog. Bereken de gemiddelde waarde voor elk datapunt.

3. Systeemopstelling (Figuur 1)

1. Sluit een 100 μL spuit aan op een spuitpomp.
2. Verbind de spuit met een doorstroomdruksensor.
3. Verbind de sensor met een dataverzamelingssysteem.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de druksensor en ooghouder op dezelfde hoogte zijn uitgelijnd om drukartefacten te voorkomen.
4. Vul het systeem met 1× fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder alle luchtbellen.
5. Plaats het oog in een houder met een ronde uitsparing (4–6 mm diameter). Zorg ervoor dat het oog stabiel is tijdens de cannulatie. Plaats de druksensor en ooghouder op dezelfde hoogte.
   OPMERKING: Misalignment kan drukmetingsfouten veroorzaken. Het STL-ontwerpbestand voor de aangepaste ooghouder wordt verstrekt als Supplemental File 1.

4. Softwarewerking

1. Druksensorkalibratie
   1. Open de data-acquisitiesoftware. Laad het kalibratie-installatiebestand. Selecteer de kalibratiefunctie .
   2. Verbind het systeem met een waterreservoir op twee gedefinieerde hoogtes.
   3. Invoer gemeten en werkelijke drukken met behulp van de conversie:
      1 cm H₂O = 0,735 mmHg
2. Pompopstelling
   1. Open de module-instellingen. Laad het configuratiebestand van de regelaar.
   2. Selecteer het pompapparaat. Voer de maximale debiet en de spuitdiameter in.
3. Gegevensopname
   1. Begin met opnemen.
   2. Stop met opnemen na elke drukstap.
   3. Voer de volgende drukwaarde in.
   4. Herstart de opname.

5. Naaldvoorbereiding

1. Trek een glazen micropipet volgens een vastgesteld protocol⁸.
2. Slijp de punt tot een binnendiameter van 80–100 μm. Poets de naaldpunt.
   VOORZICHTIG: Behandel glazen naalden voorzichtig om letsel te voorkomen.
3. Bevestig de naald op een micromanipulator. Sluit de naald aan op de druktransducer.
4. Vul de naald met PBS.
5. Plaats de naaldtip op dezelfde hoogte als de druksensor.
6. Weerstandmeting
   1. Oefen een druk van 1 mmHg uit. Noteer de debietsnelheid.
   2. Bereken naaldweerstand:
      
   3. Gebruik naalden met een weerstand tussen 0,01 en 0,5 mmHg/(μL/min).

6. Systeemfaciliteit en naleving

1. Meting van faciliteiten
   1. Perfusie het systeem met PBS. Sluit het systeem af met een driewegklep.
   2. Oefen drukstappen van 6, 8, 10, 12, 14 en 16 mmHg toe.
   3. Noteer P en Q 10 minuten bij elke stap. Bereken gemiddelde waarden van de laatste 5 minuten.
   4. Voer lineaire regressie uit. Interpreteer de helling als een systeemfaciliteit.
2. Validatie
   1. Herhaal de metingen 3 keer.
   2. Bevestig dat de systeemfaciliteit minder dan 0,2 nL/min/mmHg is.
3. Conformiteitsmeting
   1. Breng een 35 cm siliconen buis in het systeem.
   2. Meet de naleving met en zonder Teflonbuis.
   3. Bereken volumeverandering met behulp van een discrete-volume methode¹⁴.
   4. Bepaal systeemconformiteit als 4 nL/mmHg.
4. Gevoeligheidscontrole
   1. Bevestig dat de detecteerbare systeemcompliance groter is dan 9,9 nL/mmHg.

7. Enucleatie

1. Euthanaseer muizen met_CO2 bij een debiet van 0,7 L/min gedurende 3 minuten.
   VOORZICHTIG: CO2-euthanasie moet de institutionele richtlijnen volgen om humane eindpunten te waarborgen.
2. Dissectie de extraoculaire spieren en oogzenuwen met steriele instrumenten. Enucleeer de oogballen.
3. Monteer onmiddellijk één oog in de houder bij 35,5 °C.
4. Bewaar het tegenoverliggende oog op 4 °C.
5. Meet beide ogen met hetzelfde systeem.

8. Kanulatie

1. Naaldinbrengen
   1. Steek de naald onder een hoek van 45° door het centrale hoornvlinst.
   2. Breng de naald naar een diepte van 0,3–0,5 mm in de voorste kamer.
2. Validatie
   1. Stabiliseer het systeem. Bevestig de drukfluctuatie ≤ 0,4 mmHg gedurende de laatste 5 minuten.

9. Oculaire C_r

1. Stabiliseer het oog op 8 mmHg gedurende 30 minuten.
2. Oefen drukstappen van 6, 8, 10, 12, 14 en 16 mmHg toe.
3. Breng een laatste stap toe bij 8 mmHg.
4. Dataverzameling
   1. Stel de maximale debiet in op 4 μL/min.
   2. Noteer P en Q 10 minuten bij elke stap.
5. Analyse
   1. Plot P–T en Q–T krommen. Bereken de gemiddelde waarden van de laatste 5 minuten.
   2. Pas gegevens aan op het machtswetmodel²⁷:
      
6. Definieer C_r (na aftrekking van systeemfaciliteit) als oculaire uitstroomfaciliteit.
7. Stel P_r = 8 mmHg.
8. Definieer β als de niet-lineaire coëfficiënt.

10. Oculaire Φ_r

1. Analyseer P–T- en Q–T-curven tijdens drukverhogingen. Identificeer de toename van de doorstroming tot Q _max en de daaropvolgende vertraging.
2. Bereken de volumeverandering tussen t_p en t_max met de discrete-volume methode³⁰.
3. Pas gegevens aan op de aangepaste Friedenwaldvergelijking³⁰:
   
4. Stel P_r = 13 mmHg. Definieer Φ_r (na aftrekking van systeemcompatibiliteit) als oculaire compliance Φ_r,eye en γ als materiaalparameter.

Resultaten

De prestaties van het geoptimaliseerde spuitpompsysteem werden geëvalueerd door C en φ bij muizen van 5 maanden oud te vergelijken met eerder gepubliceerde waarden uit drukgecontroleerde oculaire perfusiestudies. De normaliteit van de datasets in Figuur 2F werd beoordeeld met behulp van de Shapiro–Wilk-test, en statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met een tweezijdige gekoppelde Student's t-test.

Zoals weergegeven in

Discussie

Deze studie presenteert een geoptimaliseerd spuitpompsysteem voor het schatten van de uitstroomfaciliteit en oogcompliance in muisogen, met waarden die overeenkomen met die gerapporteerd met drukgecontroleerde oculaire perfusiesystemen. De huidige aanpak verbetert de nauwkeurigheid van metingen op basis van spuiten, terwijl een eenvoudige en toegankelijke experimentele opstelling behouden blijft. Deze combinatie van methodologische verfijning en toegankelijkheid kan bredere adoptie in la...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagens	1× PBS Buffer	Thermo Fisher Scientific	10010023
Isofluraan	Shenzhen Rewoode Life Sciences Co., Ltd., China	R640
Materiaal	100 μL hoge precisie spuit	Hamilton	1710
Boorsilicaatglas	Sutter, Novato, CA	BF100-50-10
Veelvoudig steriel spuit	Fenglin Medical Devices Co., Ltd. Jiangxi, China	10 ml
Druksensor	IcuMedical	PX26-015G
Siliconen buis	Runze Fluid Co., Ltd, Nanjing, China	N/A
Transparante PTFE buis	Runze Fluid Co., Ltd, Nanjing, China	N/A
Apparatuur	Flaming/Brown pijpjestrekker	Sutter, Novato, CA	P-97
Manuele micromanipulator	World Precision Instruments (WPI)	M3301
Metaalbad	Beaver Biology, Suzhou, China	2016C
MicroForge	Narishige Scientific Instrument Lab., Tokyo, Japan	MF830
Micropijpje slijpmachine	MPInstrument Co., Ltd., Wuhan, China	KDG-02
PZMIII Stereo Zoom Binoculaire Microscoop	World Precision Instruments (WPI)	PZMIII
Spuit-pomp	World Precision Instruments (WPI)	AL-1000