Methodenartikel

Kleinschalige dissectie en antilichaamkleuring van oog-antenne en vleugelbeeldschijven van Drosophila melanogaster

144 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70434

⸱

15 mei 2026

 , 
1Department of Developmental and Cell Biology, Charlie Dunlop School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een efficiënt protocol voor beeldende schijfdissectie en antistofkleuring dat zuinig is met reagentia en het hanteren van imaginale schijven in kleine aantallen vergemakkelijkt.

Samenvatting

Drosophila imaginaire schijven worden al lange tijd bestudeerd als modellen van epitheelontwikkeling, patroonvorming en regeneratie. Het labelen en beelden van antilichamen van gedissecteerde imaginaire schijfjes is belangrijk om eiwitexpressiepatronen te visualiseren als markers van ontwikkelings- en fysiologische processen. Deze methode van imaginaire schijfdissectie en labeling werd oorspronkelijk ontwikkeld voor immuno-elektronenmicroscopie van oog-antenne imaginaire schijven door Tomlinson en Ready. Met behulp van platen met 60 microwells en door weefsels tussen oplossingen te verplaatsen in plaats van oplossingen, is individuele aandacht voor weefselmonsters mogelijk met zeer weinig verspilling. Zelfs enkele imaginaire schijven kunnen worden verwerkt. De methode vereist slechts kleine hoeveelheden antilichamen en andere reagentia. Als voorbeeld van de toepassing van de methode op andere kleine weefsels laat het artikel ook zien hoe vleugelimaginaire schijfjes met dezelfde methode kunnen worden ontleed en gelabeld. Een vergelijkbare benadering kan worden toegepast op elk klein weefsel van vergelijkbare afmetingen, en ook op andere histochemische en labelingprocedures naast antistofkleuring.

Inleiding

Drosophila imaginale schijven zijn voorloperweefsels die tijdens de embryogenese worden opzij gezet en binnen de larve groeien zonder te differentiëren, en bijdragen aan de volwassen epidermale structuren tijdens hetpopstadium 1. Hun studie heeft veel inzichten opgeleverd in ontwikkelingspatroonmechanismen, waarbij de oog- en vleugeldiscusschijven bijzonder goed zijn bestudeerd 2,3,4,5,6. Immunohistochemie is bijzonder nuttig om ruimtelijke en temporele patronen van genexpressie in imaginaire schijven te onderzoeken, evenals om celgedrag te karakteriseren, waaronder celdeling en celdood.

Om te voldoen aan de extra eisen van elektronenmicroscopische analyse van antilichaam-gelabelde oogbeeldschijven, ontwikkelden Tomlinson en Ready een kleinschalig protocol dat bijzonder zuinig is met reagentia en een zeer hoge mate van betrouwbaarheid en maatwerk biedt. Hun methode wordt in druk beschreven, maar er is geen video beschikbaar 3,8,9. De methode is gemakkelijk aangepast voor het labelen van andere imaginaire discs (of ander weefsel) en kan worden toegepast op vleugel-imaginale discs naast oog-antenne imaginale discs.

De antilichaamlabeling van Drosophila-imaginale schijven volgt het algemene omtrek dat van toepassing is op elk weefsel10 (Figuur 1). Het weefsel moet worden ontleed en gefixeerd voordat het wordt incubeerd, met antilichamen die specifiek zijn voor eiwitten van belang. Nadat het ongebonden antilichaam is afgespoeld, wordt een gelabeld (vaak fluorescerend) secundair antilichaam toegevoegd, dat bindt aan het primaire antilichaam, dat op zijn beurt gebonden is aan het eiwit van belang in het gefixeerde weefsel. Na het wassen om het ongebonden secundaire antilichaam te verwijderen, kan het weefsel worden gemonteerd voor microscopisch onderzoek en kunnen de eiwitten van belang worden gevisualiseerd. Er zijn veel algemene beschrijvingen van dit proces beschikbaar en kunnen worden toegepast op imaginaire schijven en ander Drosophila-weefsel 11. Hier wordt een protocol gegeven voor de Tomlinson & Ready-methode, waarbij weefselmonsters individueel tussen kleine incubatieputten op een microwellplaat worden overgebracht en bij elke stap door een stereomicroscoop worden waargenomen (Figuur 2). Deze methode werkt het beste voor het kleuren van kleinere aantallen weefsels tegelijk (tientallen monsters) en is niet ideaal voor grote batches (dus honderden). Deze aanpak vereist slechts kleine oplossingsvolumes van 13 μL in elke put en kan dus met zeer weinig antistoffen worden uitgevoerd. Omdat er minimaal weefselverlies is, is er geen minimale steekproefgrootte, en zelfs enkele imaginaire schijven kunnen betrouwbaar worden verwerkt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Het maken van het transferinstrument

  1. Gebruik een tang om ~2,5 cm wolfraamdraad met een diameter van 0,005" door te snijden. Gebruik een tang om één uiteinde van de draad tot een haak of lus te vormen (Figuur 3). Steek het andere uiteinde in een naaldhouder. Dit wordt gebruikt om de schijven over te brengen met weinig of geen vloeistofoverdracht. De lus is misschien de makkelijkste van de twee te gebruiken, maar de haak transporteert minder vloeistof tussen de oplossingen.

2. Het ontleden en fixeren van oog-antenne imaginaire schijven

  1. Spoel de larven af met ~7,5 mL 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH7,2) in een petrischaal (60 mm diameter) om eventueel vliegmateriaal of ander vuil te verwijderen. Zie stap 6 voor de dissectie van vleugel-imaginaire schijven in plaats van oog-antenne-schijven. Beide imaginaire schijven bevinden zich in het voorste deel van het lichaam (Figuur 4).
    OPMERKING: PBS kan ook worden gebruikt in plaats van fosfaatbuffer in stappen 2.1–2.3.
  2. Breng de larven over naar een petrischaal met verse buffer.
    OPMERKING: Sommige werksters geven er de voorkeur aan om individuele larven in enkele bufferdruppels in een 60 mm petrischaal te dissectieren; Anderen gebruiken depressie-putslides.
  3. Houd tijdens het observeren onder een dissectiemicroscoop de larven ~50% van de weg naar beneden met een tang. Gebruik een tweede paar fijne pincetten om de mondhaakjes vast te pakken en te trekken. De oogantenneschijfjes komen eruit en zitten vast aan de monddelen. De hersenen kunnen ook aan de oogschijven blijven vastzitten.
  4. Gebruik het draadgereedschap om het gedissectiede weefsel over te brengen in een kleine petrischaal (35 mm diameter) met ~3 mL fixatief, bijvoorbeeld 3,7% formaldehyde in 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH7,2), gemaakt door 37% formaldehydevoorraadoplossing in de buffer te verdunnen.
    OPMERKING: Volg lokaal goedgekeurde veiligheidsprocedures voor het omgaan met formaldehyde. 3,7% formaldehyde is een eenvoudige fixatief die in veel gevallen bevredigend zal zijn, maar andere fixatieven kunnen optimaal zijn voor bepaalde antigenen. PBS of PEM (0,1 M PIPES pH 7,0, 2 mM MgSO4, 1 mM EGTA) kan worden gebruikt als fixatieve buffer in plaats van 0,1 M natriumfosfaat, of formaldehydeoplossing kan worden verkregen door het oplossen van vaste paraformaldehyde, in plaats van uit een geconcentreerde voorraadoplossing. Het fixatief paraformaldehyde-lysine-periodaat (PLP) combineert mildere eiwitfixatie met koolhydraatkruisbinding en behoudt membraanstructurenbeter 12. Het Drosophila-glycoproteïne Scabrous blijft bijvoorbeeld antigeen na PLP-fixatie, maar niet na formaldehydefixatie. Bereid PLP vers als volgt toe: (1) Voeg 2 g paraformaldehydepoeder toe aan 25 mL gedeïoniseerd water in een kegelvormige kolf in een dampkap en roer op laag vuur; (2) Dompel een pipet in een 50% natriumhydroxide-bouillon en breng een spoor van de vloeistof (veel minder dan één druppel) over aan het mengsel. De paraformaldehyde zou binnen enkele minuten moeten oplossen zonder dat de oplossing kookt. Los tijdens het afkoelen van de 8% formaldehydeoplossing 0,36 g lysine op in 10 mL gedeïoniseerd water, 7,5 mL 0,1 m natriumfosfaat pH 7,2, 2,5 mL 0,1 M Na2HPO4 en laat het op ijs staan. Meng 15 ml van deze koudgedempte lysineoplossing met 5 ml verse 8% formaldehyde en 50 mg natriumperiodaat in een 50 mL schroefbuis, meng door vortexen en gebruik wanneer vers.
  5. Na 15–20 minuten bij kamertemperatuur wordt het ontleden weefsel overgebracht in een andere petrischaal met 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,2).
    OPMERKING: PBS kan ook worden gebruikt in plaats van fosfaatbuffer. Fixatie op ijs kan de voorkeur hebben voor sommige antigenen, of wanneer men wenst is om de endogene fluorescentie van GFP of RFP in het weefsel af te beelden. PLP-fixatie is altijd 45 minuten op ijs.

3. Blokkeren en incuberen met primaire antistoffen

  1. Weefsel overbrengen in een 35 mm petrischaal met ~3 mL NSG antilichaamwasbuffer voor blokkering. Incubeer de Petrischaal minimaal 15 minuten op ijs. NSG is 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,2), 0,1% saponine, 5% Normal Goat Serum. Wasbuffervoorraden worden gefilter-steriliseerd opgeslagen bij 4 °C.
    OPMERKING: Verschillende washbuffers kunnen optimaal zijn voor bepaalde antistoffen. Zo is saponine een mild, niet-ionisch detergent dat het plasmamembraan bijzonder oplost, terwijl andere detergenten de voorkeur kunnen hebben voor het detecteren van antigenen in de kern. Als verder voorbeeld is het antilichaam ontwikkeld tegen het nucleaire atonale eiwit ontwikkeld door Jarman et al.13 het meest immunoreactief in buffers die NP40 als detergent bevatten. Zie de Materiaaltabel voor recepten voor de alternatieve wasbuffers: PDT, PBT of NSG. Bij het gebruik van normaal serum als blokkerend eiwit zou dit idealiter afkomstig moeten zijn van de soort waarin het secundaire antilichaam wordt geproduceerd, bijvoorbeeld normaal geitenserum als geitensecundaire antilichamen worden gebruikt, of normaal ezelserum als ezelsecundaire antilichamen worden gebruikt. In de praktijk maakt dit weinig verschil.
  2. Verwijder ongewenst weefsel van de oogantenne-imaginaire schijf tijdens het blokkeren met fijne tangen, behalve de mondhaken. Laat de monddelen voorlopig vastzitten om de overdracht te vergemakkelijken.
    OPMERKING: Overbodig weefsel, bijvoorbeeld de hersenen, kan ook worden achtergelaten tot het monteren van de schuif (stap 5.4), zolang het niet interfereert met vlekken of zichtbaarheid.
  3. Tijdens het blokkeren bereid je een verdunning van 1:100 voor van mAb40-1a antistofoplossing in NSG, bijvoorbeeld 1 μL antilichaam in 100 μL NSG. Meng door te pipetteren, niet te vortexen.
    OPMERKING: mAb40-1a is een monoklonaal antilichaam dat is opgewekt tegen beta-galactosidase. De optimale antilichaamverdunning en wash buffer verschillen afhankelijk van de specifieke gebruikte antistoffen.
  4. Voeg 13 μL antilichaamoplossingen toe aan elk van maximaal zes putten in de eerste kolom van een minitray met 60 putten. Conische microwells met rechte zijden zijn belangrijk voor optische helderheid. Als meer dan zes putten nodig zijn, start dan een tweede minitray.
  5. Overbreng oogantenne-imaginaire schijven, bij voorkeur nog aan monddelen bevestigd, één voor één via de draadlus of haak naar de primaire antistofoplossing.
    OPMERKING: Het aantal imaginaire schijven dat aan elke put kan worden toegevoegd, hangt af van het antilichaam. Te veel weefsel kan sommige antilichamen zo uitputten dat de etikettering afneemt. 5 paren per put is meestal voldoende. Zo kunnen ~60 schijven gemakkelijk worden gelabeld met behulp van de 6 rijen microtiterplaten met 60 putjes. Voor elke rij kunnen verschillende antilichamen worden gebruikt. Of antistofoplossingen hergebruikt kunnen worden, vereist empirisch onderzoek voor elk geval; Het is geen routine in ons laboratorium.
  6. Sluit het bord met het deksel en sluit het af met parafilm om verdamping te beperken. Broeden 4 uur op ijs of op 4 °C tot een nacht. Schommelen is niet nodig.
    OPMERKING: De optimale tijd en temperatuur van antistofincubatie hangen af van het antilichaam. In veel gevallen is 1–2 uur op kamertemperatuur voldoende, maar sommige antilichamen geven na incubatie bij 4 °C betere resultaten, en het kan vaak handig zijn om 's nachts bij 4 °C te incuberen. In zeer weinig gevallen kunnen primaire antistofincubaties van 2–3 dagen optimaal zijn. Het afsluiten van het microwell-deksel is alleen nodig voor incubaties langer dan ~4 uur.

4. Wassen en incuberen met secundair antilichaam

  1. Voeg na elke antistofput 13 μL NSG-buffer toe aan de volgende drie kolommen putten, aangezien de monsters drie keer worden gewassen. Breng de monsters achtereenvolgens 5 minuten in elke put om te wassen.
  2. Tijdens het wassen bereid je een verdunning van 1:200–400 voor van fluorescerend geconjugeerde secundaire antilichamen in NSG-buffer, bijvoorbeeld 0,5 μL antilichaam in 100 μL NSG. Meng door te pipetteren, niet te vortexen. Centrifugeer de secundaire antilichaamvoorraadoplossing gedurende 60 seconden (op maximale snelheid) voordat ze worden verdund, omdat antilichaamaggregaten zich niet specifiek aan het weefseloppervlak kunnen binden.
    OPMERKING: De optimale secundaire antistofverdunning kan per fabrikant verschillen. Alexa- of cyanine-geconjugeerde antilichamen zijn beschikbaar met aftrek voor andere soorten om meervoudige etikettering te vergemakkelijken.
  3. Voeg 13 μL van de secundaire antilichaamoplossing toe aan de volgende (5e) kolom van putten.
  4. Steek monsters over in het secundaire antilichaam met behulp van de lus of een haak.
  5. Sluit het bord met het deksel en sluit het af met parafilm om verdamping te beperken. Breng 4 uur 's nachts op ijs.
    OPMERKING: De optimale tijd en temperatuur van antistofincubatie hangen af van het antilichaam. In veel gevallen is 1–2 uur op kamertemperatuur voldoende, maar sommige antilichamen geven na incubatie bij 4 °C betere resultaten, en het kan vaak handig zijn om 's nachts bij 4 °C te incuberen. Het afsluiten van het microwell-deksel is alleen nodig voor incubaties langer dan ~4 uur.

5. Wassen en monteren van weefsel voor microscopie

  1. Bereid de volgende drie kolommen putten voor na de secundaire antilichaamput met 13 μL NSG. Breng de monsters 5 minuten door elke put.
  2. Breng de monsters over in een laatste wash in de9e put met 13 μL 0,1M natriumfosfaatbuffer (pH 7,2). Deze buffer wash is noodzakelijk wanneer wash-buffers componenten bevatten die neerslaan in het montagemedium.
  3. . Voeg 13 μL montagemedium toe aan de laatste (10e) kolom van putten. Het montagemedium wordt gemaakt door 2% n-propylgallaat op te lossen in 75% glycerol en 25% 0,1 M natriumfosfaatbuffer, pH 7,2. Bereid elke week een nieuw montagemedium voor door de onderdelen op een roterend platform te mengen. Laat eventuele luchtbellen verdwijnen voordat je ze gebruikt.
    OPMERKING: Montagemateriaal is ook commercieel beschikbaar.
  4. Pipette 20 μL montagemedium op een schoon microscoopobjectglas. Breng monsters over in het medium op de dia. Dit is een laatste kans om ongewenst weefsel te verwijderen. Kuttige monddelen moeten van oogantenneschijven worden verwijderd.
  5. Om monsters zo te rangschikken dat ze niet afdrijven wanneer het dekselglas wordt gelegd, gebruik je het draadgereedschap om monsters uit de hoofddrop van de montage te trekken. Laat voorzichtig een schoon #1,5 dikke glas van 22 mm x 40 mm op de slede zakken met een tang, zonder luchtbellen te introduceren.
  6. Laat de slides 1 uur in een kartonnen schuifhouder staan zodat het montagemedium kan bezinken. Vermijd het verstoren van de glaasjes, want de fragiele monsters kunnen beschadigd raken als het afdekglas beweegt.
  7. Zodra het afdekglas is bezonken, sluit je de randen af met nagellak. Beweeg of druk niet op het afdekglas terwijl je dit doet. Laat nagellak minstens 1 uur drogen voordat je de beeldvorming neemt.
    OPMERKING: Helaas gebruiken de meeste cosmetische nagellak tegenwoordig oplosmiddelen die niet gelijkmatig op glazen glaasjes verspreid zijn en niet nuttig zijn, dus moet wetenschappelijke nagellak worden aangeschaft.
  8. Bewaar de dia's op 4 °C. Monsters kunnen normaal gesproken worden gefotografeerd en maandenlang opnieuw gefotografeerd.
    OPMERKING: Dia's kunnen ook worden opgeslagen bij -20 °C.

6. Het ontleden en fixeren van de imaginale schijven van de vleugel

  1. Om vleugel-imaginaire discs te dissecten in plaats van oog-antenne imaginaire discs, volg je de onderstaande stappen in plaats van stappen 2.3–2.5 hierboven.
  2. Onder een dissectiemicroscoop grijp je de larvale monddelen met fijne pincetten. Met een microdissectieschaar snijd je de larven 30%–40% van de voorkant doormidden.
  3. Keer het voorste deel van de larve om door het open, afgesneden uiteinde van de larven te spreiden met een tweede paar tangen en het hoofd en de monddelen erdoorheen te duwen, vergelijkbaar met het omkeren van een sok
  4. Gebruik een tang om de omgekeerde voorste larven in een fixatiemiddel over te brengen in een kleine petrischaal (35 mm diameter) met ~2,5 mL fixatief, bijvoorbeeld 3,7% formaldehyde in een 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,2), gemaakt door 37% formaldehydevoorraadoplossing te verdunnen in PBS.
    OPMERKING: Indien gewenst kunnen omgekeerde karkassen worden overgebracht naar 400 μL fixatiemiddel in een microfugebuis, wat de fixatie in een dampkap vergemakkelijkt. Dezelfde fixatieve opties die beschikbaar zijn voor oog-imaginaire schijffixatie gelden ook voor vleugelschijffixatie (zie OPMERKING bij stap 2.4). De optimale fixatie en voor het labelen van oog-antenne imaginaire schijven is meestal hetzelfde voor vleugelschijven.
  5. Na 15–20 minuten bij kamertemperatuur wordt het ontleden weefsel overgebracht in een andere petrischaal met 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,2).
    OPMERKING: Dezelfde washbufferopties die beschikbaar zijn voor oog-imaginale schijffixatie gelden ook voor vleugelschijffixatie (zie OPMERKING bij stap 2.4). De optimale washbuffer voor het labelen van oogantenne-imaginaire schijven is meestal hetzelfde als voor vleugelschijven.
  6. Verwijder vleugelschijven van de larven met fijne pincetten. Als het nog aanwezig is, kunnen de kleinere haltere- en beenschijf nu worden verwijderd of aan de vleugelschijfjes blijven bevestigd om overdracht te vergemakkelijken.
    OPMERKING: De vleugelschijven zijn mogelijk niet goed zichtbaar in het karkas totdat het vetlichaam of ander weefsel wordt weggetrokken (identificeer altijd een weefsel voordat je het verwijdert). De vleugelschijven zijn de grootste imaginaire schijven en zijn aan de lichaamswand bevestigd, nauw verbonden met de luchtpijp. Ze hebben een druppelvormige vorm, zoals de omtrek van South America1 (Figuur 4).
  7. Ga verder met stappen 3–5 zoals hierboven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De Tomlinson and Ready-procedure levert regelmatig uitstekende resultaten op antistofkleuring. Hier zijn drievoudig gelabelde oog-, antenne- en vleugel-imaginaire schijven geïllustreerd. In Figuur 5A is een derde-instar oog-antennale imaginale schijf drievoudig gelabeld om de transcriptiefactor Senseless (blauw), neurale progenitormarker Elav (rood) en anti-GFP-labeling van celklonen die RNAi expressie voor het Ocho-transcript (groen) tot expressie ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Antilichaamkleuring van Drosophila-weefsels met 60-well-conische bronplaten met de Tomlinson- en Ready-methode levert uitstekende resultaten op en is zeer betrouwbaar, aangezien elke imaginaire schijf wordt gevolgd onder de dissectiemicroscoop bij elke manipulatie. De methode vereist slechts kleine hoeveelheden antilichaamreagentia en wisselt oplossingen bij elke stap vollediger uit, omdat monsters worden overgedragen met zeer weinig bijbehorende vloeistof. Het is vooral geschik...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

NEB bedankt Andrew Tomlinson voor het delen van de methode en Lucy Firth voor de verfijningen. Wij danken Abhishek Bhattacharya voor het bijdragen van Figuur 5A. Wij danken Joyner Cruz, Jonathan Gonzalez, Chelsea Nguyen en Jensen Northrup. Het onderzoek in het laboratorium van de auteurs wordt gefinancierd door subsidies van de NIH (GM120451 en CA284362). Figuur 2 en Figuur 4 zijn gemaakt met Biorender.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DinatriumfosfaatFisher7558-79-4Na2HPO4 - natriumfosfaat dibasisch watervrij. Andere hydratatiestaten kunnen worden gebruikt, maar veranderen het molecuulgewicht
Pincet: Dumont #5 Biologie pincetFine science tools11252-20Stijl: #5
          Tipvorm: Recht
            Lengte: 11cm
          Autoclave veilig: Ja
          Tips: Biologie
         Tipafmetingen:
         0,05 x 0,02mm
          Legering / Materiaal: Inox
FormaldehydeFisherBP531-500Moleculair biologie-kwaliteit, 37% formaldehyde. 500ml
Formaldehyde FixatiefFisherBP531-5003,7% formaldehyde in 0,1M natriumfosfaat buffer pH7,2 gemaakt door verdunning van 37% stock.
GlycerolFisher BioreagentsBP229-1
IJsGebruikersvoorkeur
L-Lysine, 98%ThermoscientificJ62225.22
mAb40-1DHSB40-1a-sAnti-beta galactosidase
MicrocentrifugebuizenUSA scientific1615-55201,5mL buizen om monsters te houden.
MicrodissectiescharenFine Science Tools15003-085mm snijrand, rechte punt, 8,5cm
MononatriumfosfaatFisher7558-80-7NaH2PO4 - natriumfosfaat monobasisch watervrij. Als u een gehydrateerde vorm gebruikt, zou het gewicht dat nodig is om een 0,1M-oplossing te maken veranderen.
Montagemedium75% glyceroloplossing in 0,1M natriumfosfaat buffer pH7,2 met 2,5% n-propylgallaat. Meng door omkering om bellen te minimaliseren.
NSG0,1M natriumfosfaat buffer pH7,2, 0,1% saponine, 5% NGS
n-propylgallaatMP Biomedicals210274780
Nail PolishTed Pella, Gekocht van FisherNC0381432Voor het afdichten van slides
NaaldhouderFisherNC0099380Voor microdissectie naalden. Holle roestvrij staal; handvatlengte: 4 3/4" lang
Nunc Microwell MiniTraysThermo Scientific12565155MicroWell MiniTray voor serologische toepassingen. Aantal putjes 60
ParafilmStatLabPM996StatLab ParaFilm M Zelfafsluitende flexibele film
ParaformaldehydePolysciences, Inc.00380-250
10x PBSGebruikersvoorkeurBereid 800 mL gedistilleerd water in een geschikte container.
          Voeg 1,37M natriumchloride toe aan de oplossing.
           Voeg 26,8mM kaliumchloride toe aan de oplossing.
           Voeg 101mM natriumfosfaat dibasisch toe aan de oplossing.
         Voeg 18,0mM kaliumfosfaat monobasisch toe aan de oplossing.
         Pas de oplossing aan de gewenste pH aan (meestal pH ≈ 7,4).
         Voeg gedistilleerd water toe tot het volume 1 L is.
PBTGebruikersvoorkeur0,1M natriumfosfaat buffer pH7,2, 0,1% bovien serumalbumine, en 0,2% Triton X-100.
PDTGebruikersvoorkeur0,1M natriumfosfaat buffer (pH = 7,2), 0,3% deoxycholaat, en 0,3% Triton x-100
PetrischaalFalconCorning 351007Petrischaal; 60mm; niet behandeld
PetrischaalFalconCorning 351008Petrischaal; 35mm; niet behandeld
TangGebruikersvoorkeur
PLPn/a2% paraformaldehyde 1,35% lysine in 0,05M natriumfosfaat buffer pH7,2
Secundaire AntilichamenJackson ImmunoResearch715-545-1510,5mg Alexa Fluor 488 Ezel Anti-Muis IgG.
SlidedekselsVWR48393-172VWR Coverglass #1.5 22x40 (CASE)
SlidesFisher125442Fisher Glass Slides 10bx/CS
NatriumdeoxycholaatThermo Fisher Sci89904Natriumdeoxycholaat Detergent; 5mg
NatriumperiodaatSigma Aldrich71859-25GNatriumperiodaat – 25 gram
Natriumfosfaatbuffer0,1M NaPO4 buffer pH 7,2. Meng 28ml van 0,1M anhydrisch mononatriumfosfaat stock (11,998g NaH2PO4 tot 1

Referenties

  1. Bate, M., Martinez Arias, A. The development of Drosophila melanogaster. , CSHL Press. 747-841 (1993).
  2. Tripathi, B. K., Irvine, K. D. The wing imaginal disc. Genetics. 220 (4), iyac020(2022).
  3. Baker, N. E., Li, K., Quiquand, M., Ruggiero, R., Wang, L. H. Eye development. Methods. 68 (1), 252-259 (2014).
  4. Treisman, J. E. Retinal differentiation in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).
  5. Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
  6. Held, L. I. J. Imaginal discs: The genetic and cellular logic of pattern formation. , Cambridge University Press. (2002).
  7. Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium. Developmental Biology. 120, 366-376 (1987).
  8. Rubin lab methods book. , Wellcome Collection. https://wellcomecollection.org/works/u7msrkak (1990).
  9. Rubin lab manual. , The Rubin Lab. https://www.yumpu.com/en/document/view/12357776/rubin-lab-manual-jfly-home-page (1990).
  10. Mitchison, T. J., Sedat, J. Localization of antigenic determinants in whole Drosophila embryos. Dev Biol. 99 (1), 261-264 (1983).
  11. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  12. Mclean, I. W., Nakane, P. K. Periodate-lysine-paraform-aldehyde fixative a new fixative for immunoelectron microscopy. J. Histochem. Cytochem. 22, 1108-1077 (1974).
  13. Jarman, A. P., Grell, E. H., Ackerman, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Atonal is the proneural gene for Drosophila photoreceptors. Nature. 369, 398-400 (1994).
  14. Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. Tie-dye: A combinatorial marking system to visualize and genetically manipulate clones during development in Drosophila melanogaster. Development. 140 (15), 3275-3284 (2013).
  15. Blanco, J., Cooper, J. C., Baker, N. E. Roles of c/ebp class bzip proteins in the growth and cell competition of rp ('minute') mutants in Drosophila. Elife. 9, e50535(2020).
  16. Jennings, B., Preiss, A., Delidakis, C., Bray, S. The notch signalling pathway is required for enhancer of split bhlh protein expression during neurogenesis in the Drosophila embryo. Development. 120 (12), 3537-3548 (1994).
  17. Kiparaki, M., Baker, N. E. Protocol for assessing translation in living Drosophila imaginal discs by o-propargyl-puromycin incorporation. STAR Protoc. 4 (4), 102653(2023).
  18. Spratford, C. M., Kumar, J. P. Dissection and immunostaining of imaginal discs from Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (91), e51792(2014).
  19. Yan, S. J., Li, W. X. Using Drosophila larval imaginal discs to study low-dose radiation-induced cell cycle arrest. Methods Mol Biol. 782, 93-103 (2011).
  20. Klein, T. Immunolabeling of imaginal discs. Methods Mol Biol. 420, 253-263 (2008).
  21. Phalle Bde, S. Immunostaining of whole-mount imaginal discs. Methods Mol Biol. 247, 373-387 (2004).
  22. Morimoto, K., Tamori, Y. Induction and diagnosis of tumors in Drosophila imaginal disc epithelia. J Vis Exp. (125), e55901(2017).
  23. Brown, N. L. Confocal microscopy methods and protocols. Methods in molecular biology. Paddow, S. W. , Humana Press. 75-91 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Imaginale schijven van Drosophilaoog antenne schijvenweefseldissectieeiwitexpressieepitheliale ontwikkelingimmunolabelinglabelen van klein weefsel60 microwellplaten

Gerelateerde artikelen