Onderzoeksartikel

Isolatie en karakterisering van exosoomverrijkte extracellulaire blaasjes uit Denguevirus type 2 geïnfecteerde zoogdiercellen

DOI:

10.3791/70437

⸱

27 maart 2026

 ,  ,  ,  , 
1Medical Laboratory Science Program, Texas State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we de isolatie van exosoomverrijkte extracellulaire vesikels uit het Denguevirus type 2-geïnfecteerde celcultuursupernatant, gevolgd door karakterisering van de integriteit en grootteverdeling van de vesikels, en evaluatie op de afwezigheid van detecteerbaar infectieus virus door een plaque-assay onder gedefinieerde experimentele omstandigheden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosoomverrijkte EV's zijn blaasjes die uit verschillende celtypen worden vrijgegeven in extracellulaire vloeistoffen zoals plasma, urine, speeksel, celkweekmedia en andere lichaamsvloeistoffen. Hun diameters variëren van 30 nm tot 150 nm. Ze zijn betrokken bij verschillende cellulaire processen, waaronder cellulaire communicatie en immuunmodulatie tijdens infectie. Op basis van deze effecten zijn ze gebruikt om de pathogenese van verschillende virussen te bestuderen. Het is een uitdaging om exosoomverrijkte EV's te isoleren van virusgeïnfecteerde celsupernatanten met behulp van huidige zuiveringstechnieken. Dit komt grotendeels door de overlap in grootte tussen bepaalde virussen en exosoomverrijkte EV's. Hier streven we ernaar exosoomverrijkte EV's te zuiveren van Dengue type 2-geïnfecteerde celkweeksupernatant. Exosoomverrijkte EV's werden geïsoleerd met behulp van een commerciële exosoomisolatiekit. Voor de geïsoleerde exosoomverrijkte EV's in dit protocol werd geen infectieus virus gedetecteerd door een plaquetest onder de geteste omstandigheden. De gezuiverde, exosoomverrijkte EV's werden gekarakteriseerd met behulp van western blotting voor tetraspaninen, nanodeeltjesvolgingsanalyse en transmissie-elektronenmicroscopie voor groottebevestiging. We hebben aangetoond dat onze exosoomverrijkte EV's intact zijn en binnen het normale exosoomdiameterbereik van 30-150 nm vallen. Al met al biedt ons protocol een goedkope methode om exosoomverrijkte EV's te zuiveren uit virusgeïnfecteerde celcultuursupernatant, die kan worden gebruikt voor latere functionele assays.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosoomverrijkte EV's zijn nanogrote blaasjes die door elke cel in het lichaam worden vrijgegeven. Het zijn subtypen van extracellulaire blaasjes (EV's) van endocytische oorsprong. Exosoomverrijkte EV's werden voor het eerst ontdekt in reticulocytenkweekmedia1. In de afgelopen decennia zijn exosoomverrijkte EV's gezuiverd uit verschillende lichaamsvloeistoffen, waaronder bloed, urine, speeksel, moedermelk, zaadvocht en vruchtwater 2,3,4,5. Ze hebben een diameter die varieert van 30 nm tot 150 nm6. Hun afgifte in het extracellulaire compartiment vindt plaats via fusie van multivesiculaire lichamen (MVB's) met het celplasmamembraan. In de context van infecties en immuunrespons is bekend dat exosoomverrijkte EV's een specifieke reactie oproepen in zoogdiercellen. Dergelijke reacties omvatten de afgifte van cytokines of veranderingen in de vatbaarheid voor infectie 7,8,9.

De inhoud van exosoomverrijkte EV's wordt beïnvloed door verschillende factoren, met name het type en de staat van de cel die ze produceert10,11. Daarnaast bepaalt hun inhoud ook de effecten die ze hebben op naïeve ontvangercellen. Er worden momenteel verschillende methoden gebruikt om exosoomverrijkte EV's uit biologische vloeistoffen te isoleren. Veelvoorkomende methoden zijn differentiële ultracentrifugatie, precipitatie, immunoaffiniteitsvangst, grootte-uitsluitingschromatografie, magnetische isolatie en microfluïdische isolatie.

Differentiële ultracentrifugatie wordt beschouwd als een van de meest gebruikte technieken 12,13,14. De ultracentrifuge-zuiveringsmethode is duur en vereist aanzienlijke technische vaardigheid. Deze methode leidt ook tot een aanzienlijk verlies van EV's door meerdere ultracentrifugatiestappen. Ten slotte zijn de resulterende exosoomverrijkte EV's niet vrij van actieve virale deeltjes vanwege hun vergelijkbare fenotypische eigenschappen. Dit heeft het zuiveren van exosoomverrijkte EV's uit virusgeïnfecteerde celsupernatanten uitdagend. Het is daarom belangrijk om een geoptimaliseerd protocol te ontwikkelen om de niveaus van denguevirus (DENV) effectief te verlagen tot ondetecteerbare niveaus in de exosoomverrijkte EV-oplossing, omdat virussen vergelijkbare groottes en dichtheden delen met exosomen15,16.

In vergelijking met andere veelgebruikte technieken biedt dit protocol verschillende voordelen, waaronder een kortere zuiveringstijd, afhankelijkheid van goedkope en breed toegankelijke laboratoriumapparatuur, en de mogelijkheid om exosoomverrijkte EV's te isoleren zonder detecteerbare levende virale besmetting. Bovendien vereisen methoden zoals dichtheidsgradiëntcentrifugatie en magnetische isolatie voordelen kunnen bieden, waaronder een hogere opbrengst en hogere zuiverheid, maar vereisen deze methoden een initiële ultracentrifugatiestap. Het doel van dit artikel is om een methode te presenteren om exosoomverrijkte EV's te isoleren uit geïnfecteerde supernatanten zonder detecteerbaar infectieus virus door middel van plaque-assay onder de geteste omstandigheden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van exosoomvrije media

  1. Bevestig een 0,1 μm filter aan de ontvangerbasis binnen de Klasse II bioveiligheidskast (BSC).
  2. Giet het aseptisch geïnactiveerde foetale rundereserum (FBS) op het filter en sluit het aan op de vacuümpomp in de BSC.
  3. Herhaal stap 1.2 met de doorstroming nog twee keer.
  4. Bereid het volledige medium voor dat het 10% van de drievoudig gefilterde FBS, 1% penicilline/streptomycine en 1% L-glutamine bevat.
    OPMERKING: De drievoudige filtratiemethode wordt gebruikt om de noodzaak van instrumenten zoals een ultracentrifuge te vermijden.

2. Denguevirusinfectie van zoogdiercellen

  1. Laat Vero-cellen 's nachts groeien in een T75 cm2 kweekkolf in een weefselkweekincubator bij 37 °C met 5%CO2.
  2. Controleer de volgende dag of de cel tussen 70% en 80% confluent is en infecteer de cellen met 0,1 multipliciteit van infectie (MOI) DENV-2 in 5 mL volledig medium en incubeer bij 37 °C met 5%CO2 gedurende 2 uur.
  3. Na 2 uur verwijder je het supernatant en was je de kolf 3 keer met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  4. Voeg 50 mL complete media toe aan de kolf en incubeer bij 37 °C met 5%CO2 gedurende 4 dagen (net voordat je cytopathische effecten waarneemt).

3. Kit-gebaseerde exosoomzuivering

  1. Breng het celkweekmedium van de kolf over naar een 50 mL conische buis en centrifugeer op 200 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Breng het medium over naar een nieuwe conische buis. Voeg 125 μL EV-precipitatiereagens toe, gevolgd door 600 μL van de hars. Vortex 10 seconden en laat het 10 minuten in de BSC staan bij kamertemperatuur.
  3. Vortex nog 10 seconden en centrifugeren op ongeveer 450 × g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Overbrengen naar de BSC, het supernatant weggooien en 600 μL resuspension buffer op het pellet aanbrengen.
  4. Vortex 10 seconden en 15 minuten bij kamertemperatuur uitbroeden.
  5. Vortex nog 10 seconden en centrifugeren op ongeveer 25 × g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Breng het supernatant over in een filterspinkolom en centrifugeer op ongeveer 4.500 × g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Verzamel de doorstroming met intacte exosoomverrijkte EV's en bewaar deze bij -80 °C totdat deze klaar is voor gebruik.
  7. Bevestig dat de exosoomverrijkte EV vrij is van levend virus door een plaque-assay17 uit te voeren.
  8. Karakteriseer de exosoomverrijkte EV met behulp van elektronenmicroscopie voor grootte en nanodeeltjestracking analyse voor grootteverdeling en concentratie18.

4. Karakterisering van exosoomverrijkte EV door western blot

  1. Bepaal de eiwitconcentratie van het exosoomverrijkte EV met behulp van assays zoals BCA.
  2. Meng gelijke volumes exosoomverrijkte EV-oplossing en de RIPA-buffer en voeg 4x LDS-laadbuffer toe (4:1).
  3. Verwijder exosoomverrijkte EV-eiwitten met een 4-12% Bis-Tris gel.
  4. Breng de eiwitten over naar een nitrocellulosemembraan.
  5. Blok 1 uur met 5% magere melk opgelost in 1x TBS-Tween buffer op kamertemperatuur.
  6. Verdun de primaire antilichamen met 5% magere droge melk tot een verdunning van 1:1.1000 en onderzoek het membraan op exosoomeiwitten zoals CD63 en CD9 bij 4 °C gedurende de nacht.
  7. Verwijder het primaire antilichaam en was 5 x 5 minuten met 1x TBS-Tween buffer op een rocker.
  8. Verdun het secundaire antilichaam (anti-Rabbit IgG HRP) met magere droge melk tot een verdunning van 1:5.000 en incubeer het membraan met deze oplossing gedurende 1 uur op kamertemperatuur.
  9. Verwijder het secundaire antilichaam en was 5 x 5 minuten met 1x TBS-Tween buffer op een rocker.
  10. Ontwikkel het membraan met behulp van het ECL-detectiereagens en detecteer eiwitsignalen met behulp van het chemiluminescence imaging apparaat.

5. Karakterisering van exosoomverrijkte EV's door transmissie-elektronenmicroscopie

  1. Voeg 5 μL exosoommonsters toe aan de 200 mesh koperen roosters met formvar en koolstofcoating en laat het aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
  2. Kleur het rooster met 1% waterige uranylacetate gedurende 60 seconden en laat het aan de lucht drogen.
  3. Maak de afbeelding vast met de TEM bij 80 kV18.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We analyseerden de geïsoleerde exosoomverrijkte EV zoals beschreven in het protocol met behulp van een plaque-assay om te bepalen of we actieve DENV-2-deeltjes in het mengsel konden detecteren. Zoals weergegeven in Figuur 1, werden er onder de geteste omstandigheden geen plaques gedetecteerd in vergelijking met de positieve controle. Deze resultaten geven aan dat het infectieuze virus onder de detectiedrempel van de plaque-as...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recente vooruitgang in onderzoek naar infectieziekten heeft aangetoond dat exosoomverrijkte EV's die vrijkomen uit virusgeïnfecteerde naïeve cellen een cruciale rol spelen bij het moduleren van de immuunresponsvan de gastheer 7,8,9. De exosoomverrijkte EV's kunnen ofwel de immuunafweer versterken door een passende antivirale respons te bevorderen, of, omgekeerd, het ontwijken van het virale immu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door een onderzoeksbeurs van de American Society for Clinical Laboratory Science (ASCLS) en het Research Enhancement Program (REP) fonds van Texas State University

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti Rabbit IgG-HRP linked antibodyCell Signaling7074SSecundaire antistof
CD63Cell Signaling52090SPrimaire antistof
CD9Cell Signaling13174SPrimaire antistof
Cell culture media exosome purification kitNorgen60600Exosoom zuiveringskit
Dengue virus 2ATCCVR-1584Virus
DMEMFisher scientific11-995-073Kweekmedium
EMEMATCC30-2003Kweekmedium
FEI Talos F200X Transmission Electron MicroscopeThermofisher Scientific
Fetal Bovine EerumNeuromicsFBS002Media Supplement
Nano particle tracking analyzerParticle Metrix
Vero cellsATCCCCL-81Zoogdiercellijn

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation: Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes). J Biol Chem. 262 (19), 9412-9420 (1987).
  2. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J Transl Med. 9, 86(2011).
  3. Lässer, C., et al. RNA-containing exosomes in human nasal secretions. Am J Rhinol Allergy. 25 (2), 89-93 (2011).
  4. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).
  5. Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  6. Hessvik, N. P., Llorente, A. Current knowledge on exosome biogenesis and release. Cell Mol Life Sci. 75 (2), 193-208 (2018).
  7. Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected cells stimulate production of pro-inflammatory cytokines through trans-activating response (TAR) RNA. J Biol Chem. 291 (3), 1251-1266 (2016).
  8. Fleming, A., et al. The carrying pigeons of the cell: Exosomes and their role in infectious diseases caused by human pathogens. Pathog Dis. 71 (2), 109-120 (2014).
  9. Olanrewaju, A. A., Hakami, R. M. The messenger apps of the cell: Extracellular vesicles as regulatory messengers of microglial function in the CNS. J Neuroimmune Pharmacol. 15 (3), 473-486 (2020).
  10. Tauro, B. J., et al. Two distinct populations of exosomes are released from LIM1863 colon carcinoma cell-derived organoids. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 587-598 (2013).
  11. Pallet, N., et al. A comprehensive characterization of membrane vesicles released by autophagic human endothelial cells. Proteomics. 13 (7), 1108-1120 (2013).
  12. Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circ Res. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  13. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  14. Ter-Ovanesyan, D., et al. Framework for rapid comparison of extracellular vesicle isolation methods. Elife. 10, e70725(2021).
  15. Sampey, G. C., et al. Exosomes and their role in CNS viral infections. J Neurovirol. 20 (3), 199-208 (2014).
  16. Jeppesen, D. K., et al. Reassessment of exosome composition. Cell. 177 (2), 428-445.e18 (2019).
  17. Shi, L. Z., et al. N-butanol extract of Glycyrrhizae radix et rhizoma inhibits dengue virus through targeting envelope protein. Pharmaceuticals (Basel). 16 (2), 263(2023).
  18. Alem, F., et al. Exosomes originating from infection with the cytoplasmic single-stranded RNA virus Rift Valley fever virus (RVFV) protect recipient cells by inducing RIG-I mediated IFN-β response that leads to activation of autophagy. Cell Biosci. 11 (1), 220(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Exosome Enriched EVsExtracellular VesiclesDengue VirusVirus Infected CellsExosome IsolationCell Culture SupernatantWestern BlottingNanoparticle TrackingTransmission Electron MicroscopyImmune Modulation

Gerelateerde artikelen