Methodenartikel

Protocol voor single-cel dissociatie, RNA-sequencing en isolatie van myoepitheelcellen en fibroblasten uit de verouderde klieren van het klieren van het lakcrimale en speeksel.

DOI:

10.3791/70441

⸱

24 april 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Scripps Research Institute

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om verouderde muistraanklieren te dissociëren om levensvatbare individuele cellen te verkrijgen voor single-cell RNA-sequencing. Sequentiële enzymatische vertering en voorzichtige behandeling behouden de celintegriteit, wat hoogwaardige suspenties oplevert die geschikt zijn voor celtype-specifieke isolatie en transcriptomische analyse van verouderingsgerelateerde veranderingen in traanklierpopulaties.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veroudering van de traanklier (LG) wordt geassocieerd met verminderde traanafscheiding en chronische ontsteking, wat bijdraagt aan droge ogenziekte. Leeftijdsgerelateerde LG-veranderingen omvatten infiltratie van immuuncellen, cellulaire schade, lipidenophoping in acinaire cellen, extracellulaire matrixafzetting en ductale dilatatie. Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) biedt een krachtige benadering om cellulaire heterogeniteit en transcriptieveranderingen tijdens veroudering te profileren; het genereren van levensvatbare single-cel suspensies uit verouderd LG-weefsel is echter technisch uitdagend vanwege verhoogde fibrose, cellulaire fragiliteit en lipidenophoping. Deze studie presenteert een geoptimaliseerd, reproduceerbaar protocol voor de efficiënte dissociatie van oude muizen-LG's en de isolatie van meerdere celtypen, geschikt voor downstream scRNA-seq-analyse. Belangrijk is dat dit protocol ook toepasbaar is op jonge traanklieren, conjunctiva en andere exocriene weefsels. De workflow hanteert een stapsgewijze enzymatische dissociatiestrategie met Collagenase IV, Dispase II en DNase I voor de initiële weefselvertering, gevolgd door Accutase om de resterende celclusters te dissocieren en een laatste DNase I-behandeling om een schone single-cell suspension te verkrijgen. Om celschade te minimaliseren wordt alle plasticware vooraf bekleed met PBS die boviene serumalbumine bevat, en wordt weefselverwerking uitgevoerd onder gecontroleerde temperatuur- en roeromstandigheden. Rode bloedcel lyse en sequentiële filtratie via meerdere zeven verbeteren de celzuiverheid verder. Celtype-specifieke isolatie wordt bereikt met behulp van reportermuislijnen gecombineerd met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Met behulp van Acta2GFP - en PdgfraEGFP-muizen hebben we met succes myoepitheliale cellen en fibroblasten geïsoleerd, respectievelijk na immunokleuring met een EpCAM-antilichaam. FACS maakte de scheiding mogelijk van de EpCAM⁺/αSMA⁺ myoepitheliale populatie, terwijl EGFP⁺-cellen van PdgfraEGFP-muizende fibroblastpopulatie vormden. Dit protocol levert hoogwaardige, levensvatbare single-cell suspensies uit verouderde LG's en kan gemakkelijk worden aangepast aan andere fibrotische of verouderende exocriene weefsels die zachte dissociatie en gerichte celisolatie vereisen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De traanklier (LG) is een exocriene tubuloacinaire klier die verantwoordelijk is voor het afscheiden van de waterige laag van de traanfilm. Gedurende het leven worden het hoornvliesoppervlak en de LG blootgesteld aan bacteriële en virale infecties, wat kan leiden tot systemische verstoring van epitheelcellen, het inducteren van chronische ontstekingsreacties, infiltratie van immuuncellen in de LG en een gebrek aan regeneratie. Veroudering gaat gepaard met een verhoogde incidentie van chronische ontstekingsziekten1. Onder deze is droge ogen (DED) een van de tien meest voorkomende oorzaken van visuele beperking wereldwijd en draagt het een belangrijke bijdrage aan verminderde onafhankelijkheid, mobiliteit en dagelijks functioneren bij de oudere bevolking2. Een primaire oorzaak van DED is LG-disfunctie3.

Met toenemende leeftijd ondergaan de muis en menselijke LG uitgesproken structurele en functionele veranderingen, waaronder acinaire celatrofie, ductale dilatatie, immuuncelinfiltratie, fibrose en lipidenafzetting 4,5,6,7. Deze degeneratieve veranderingen gaan ook gepaard met chronische ontsteking van de LG en weefselfibrose 3,5,8,9. Ondanks de duidelijke associatie tussen veroudering en LG-pathologie, blijven de moleculaire en cellulaire mechanismen die deze veranderingen aandrijven slecht begrepen.

Single-cell RNA-sequencing maakt uitgebreide profilering van celpopulaties en hun transcriptieveranderingen tijdens deleeftijd van 10 jaar mogelijk. Deze aanpak maakt onbevooroordeelde identificatie van verschillende celtypen en toestanden binnen de traanklier mogelijk, waarbij wordt onthuld hoe veroudering genexpressieprofielen, immuuncelinfiltratie en epitheel-mesenchymale interacties verandert.

Momenteel zijn er talrijke methoden voor weefseldissociatie beschikbaar, waaronder mechanische dissociatiemethoden11 en protocollen waarbij warme enzymatische vertering bij 37 °C met enzymen zoals collagenase, dispase of trypsine12 betrokken zijn. Verschillende dissociatiestrategieën zijn beschreven voor een breed scala aan weefsels, waaronder lever-, long-, nier-, hart- en meerdere tumortypes 13,14,15. Het bereiden van levensvatbare single-cel suspensies uit verouderd traanklierweefsel blijft echter technisch uitdagend vanwege verhoogde fibrose en cellulaire fragiliteit. Ook, zoals we eerder hebben gerapporteerd, kan het herstel van fragiele acinaire cellen uitdagend zijn, omdat dissociatie-gerelateerde veranderingen in membraanpermeabiliteit de afgifte van omgevings-RNA uit deze grote, secretoire cellen kunnen verhogen, wat bijdraagt aan achtergrondsignalen in downstream single-cell datasets16. Hoewel verschillende studies scRNA-seq atlassen van verouderende traanklieren hebben gerapporteerd, is de kwaliteit van deze datasets beperkt door suboptimale dissociatiemethoden, wat resulteert in een lagere opbrengst van epitheelcellen dan van stromale populaties. Hier presenteren we een gedetailleerd, geoptimaliseerd protocol voor de efficiënte dissociatie van verouderde muis LG en de isolatie van verschillende celpopulaties voor downstream scRNA-seq en bulk RNA-seq analyses (Figuur 1). Deze benadering biedt een krachtig hulpmiddel om de moleculaire mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan ouderdomsgebonden traanklierdisfunctie.

Het protocol maakt het mogelijk om hoogwaardige, levensvatbare single-cell suspensies uit verouderde traanklieren te genereren, wat een betrouwbare basis biedt voor uitgebreide transcriptomische analyses. Het maakt gedetailleerde identificatie en moleculaire karakterisering mogelijk van diverse celpopulaties, waaronder myoepitheliale cellen, fibroblasten en andere epitheel- en stromale celtypen die leeftijdsgebonden veranderingen ondergaan. De geoptimaliseerde workflow behoudt celintegriteit en minimaliseert door stress veroorzaakte transcriptie-artefacten, waardoor een nauwkeurige weergave van in vivo cellulaire toestanden wordt gegarandeerd. Bovendien is de methodologie breed toepasbaar en kan worden aangepast aan andere exocriene klieren of fibrotisch weefsel, waarbij gentle tissue dissociatie en nauwkeurige isolatie van verschillende celpopulaties cruciaal zijn voor downstream single-cell studies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven zijn uitgevoerd volgens protocollen goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van The Scripps Research Institute (protocol nr. 08-0123; goedgekeurd op 29 augustus 2023). De dierenverzorging van The Scripps Research Institute is geaccrediteerd door de Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International (AAALAC). Muizen werden onderhouden volgens een standaard 12 uur licht/12 uur donkere cyclus, waarbij voedsel en water ad libitum werden verstrekt. PdgfraEGFP en Acta2GFP transgene muislijnen werden gebruikt voor experimenten. De gedetailleerde informatie over muislijnen is te vinden in de sectie "Materiaaltabel".

1. Algemene overwegingen

  1. Volg NIH Universele Voorzorgsmaatregelen17 bij het hanteren van biogevaarlijke materialen en dierlijk weefsel. Voer al het werk van dieren uit volgens goedgekeurde IACUC-protocollen en de aangewezen dierbioveiligheidsniveaus.
  2. Volg de standaard laboratoriumveiligheidspraktijken door mondpipetten te vermijden, het gebruik van scherpe middelen te minimaliseren, een biologische veiligheidskast te gebruiken voor aerosolproductieprocedures, het dragen van geschikte PBM, het verwijderen van scherpe voorwerpen in prikbestendige containers en het correct labelen en ontsmetten van al biologisch gevaarlijk afval vóór verwijdering.
  3. Decontaminateer routinematig werkoppervlakken en apparatuur met geschikte desinfectiemiddelen (bijv. 10% bleekmiddel).
  4. Voer alle centrifugatiestappen uit bij 4 °C in een voorgekoelde gekoelde centrifuge om de cellevensvatbaarheid te behouden en temperatuurgeïnduceerde stress te minimaliseren.
  5. Optimaliseer de instellingen voor de flowcytometer en celsorter voor de specifieke instrumentconfiguratie en pas parameters aan voor elk antilichaam-fluorofoorconjugaat met behulp van geschikte controlemonsters. Gebruik dezelfde cytometer en sorteerinstrument, met vaste, geoptimaliseerde instellingen, gedurende een experimentele reeks om variabiliteit te minimaliseren.
  6. Bereid geselecteerde oplossingen tot één dag van tevoren voor en bewaar ze correct tot gebruik. Bereid alle oplossingen voor onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast.
  7. Houd oplossingen met Ca2++/Mg2+ gescheiden van buffers die EDTA bevatten om chelatie tijdens enzymatische stappen te voorkomen. Alle benodigde reagentia voor deze procedure worden weergegeven in de Materiaaltabel.

2. Plasticwaren

  1. In steriele omstandigheden kun je voorbekleding van schaaltjes, buisjes en spuiten met 1x PBS + 1% BSA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT). Aspiraat en houd alles steriel tot gebruik.
  2. Voorlaag pipettoppen. Aspireer en doseer 1x PBS + 1% BSA drie keer met elke tip om het binnenoppervlak te coaten. Plaats de gecoate tips terug in de steriele tip box en laat ze een nacht drogen in een steriele couveuse. Gebruik deze voorgecoate tips de volgende dag tijdens de celisolatieprocedure.

3. Oplossingen en buffers

  1. DNase I Stock (5 mg/mL)
    1. Bereid 150 mM NaCl uit de 5M NaCl-kolf en filter de oplossing steriel.
    2. Voeg 1 M CaCl₂ toe aan de gefilterde 150 mM NaCl-oplossing om een eindconcentratie van 5 mM CaCl₂ te verkrijgen.
    3. Suspenseer 100 mg DNase I opnieuw in 20 ml van 150 mM NaCl / 5 mM CaCl₂ buffer om een 5 mg/mL DNase I stockoplossing te verkrijgen.
    4. Bereid 500 μL aliquots voor en bewaar deze tot 6 maanden bij −20 °C. Vermijd herhaalde vries-dooicycli om verlies van enzymactiviteit te voorkomen.
  2. Verteringsmedium
    1. De dag voor het experiment bereid je de medium base mix door DMEM/F12 te mengen met 0,5% BSA en filter je het.
    2. Voeg 1M HEPES en 1M CaCl₂ toe aan het basismedium DMEM/F12 / 0,5% BSA om uiteindelijke concentraties van respectievelijk 15 mM en 3 mM te verkrijgen.
    3. Voeg vlak voor gebruik alle volgende enzymen toe: Collagenase IV (1 mg/mL; 125 U/mL), Dispase II (2,5 mg/mL; 1,25 U/mL) en DNase I (20 U/mL; 0,05 mg/mL uit de 5 mg/mL voorraad).
  3. Blokkeringsmedium 1 (BM1)
    1. Voeg 1M HEPES en 0,5M EDTA toe aan 1x HBSS om de uiteindelijke concentraties van respectievelijk 15 mM en 3 mM te verkrijgen.
  4. Blokkeringsmedium 2 (BM2)
    1. Voeg FBS en 1M HEPES toe aan DMEM/F12 om uiteindelijke concentraties van respectievelijk 10% en 15 mM te verkrijgen.
  5. Medium voor DNase-behandeling
    1. De dag voor het experiment bereid je het basismedium voor door 1x HBSS te mengen met 0,5% BSA en filter je het.
    2. Voeg 1M HEPES, 1M CaCl₂ en 1M MgCl₂ toe aan het basismedium 1x HBSS / 0,5% BSA om de uiteindelijke concentraties van respectievelijk 10 mM, 1,5 mM en 2 mM te verkrijgen.
    3. Voeg vlak voor gebruik DNase I (200 U/mL; 0,5 mg/mL uit de 5 mg/mL bouillon) toe aan het voorbereide mengsel.
  6. Blokkeringsmedium 3 (BM3)
    1. Gebruik hetzelfde gefilterde basismedium 1x HBSS / 0,5% BSA en voeg 1M HEPES en 0,5M EDTA toe om uiteindelijke concentraties van respectievelijk 10 mM en 1 mM te verkrijgen.
  7. Blokkeringsmedium 4 (BM4)
    1. Gebruik hetzelfde gefilterde basismedium 1x HBSS / 0,5% BSA en voeg 1M HEPES toe om de uiteindelijke concentraties van 10 mM te verkrijgen.
  8. FACS-buffer
    1. De dag voor het experiment bereid je het basismedium voor door 1x DPBS te mengen met 0,5% BSA en filter je het.
    2. Voeg 1M HEPES en 0,5M EDTA toe aan 1x DPBS / 0,5% BSA om de uiteindelijke concentraties van respectievelijk 25 mM en 1 mM te verkrijgen.
  9. Medium voor scRNAseq (MSC)
    1. De dag voor het experiment bereid je het medium voor door 1x DPBS te mengen met 0,4% BSA en filter je het.

4. Weefseloogst en microdissectie (~ 40 - 50 min)

  1. Verdoof de muis met isofluraan en euthanace door cervicale dislocatie volgens de institutionele richtlijnen van de IACUC.
  2. Gebruik fijne tangen en schaar om de huid tussen oog en oor in te snijden en trek deze voorzichtig terug om de traanklier bloot te leggen.
  3. Om de klier te isoleren, tilt u deze iets op met een dof getipte pincet en scheid voorzichtig het omliggende bindweefsel door het voorzichtig in een cirkelvormige beweging weg te trekken. De grenzen van de traanklier zijn duidelijk zichtbaar, waardoor gemakkelijk te scheiden is van aangrenzende weefsels, waaronder de parotisklier.
  4. Breng de traanklier (elke klier weegt ongeveer 10-25 mg, afhankelijk van het gewicht, geslacht en leeftijd van de muis) over in een 35 mm petrischaal met 2 mL koude 1x PBS op ijs. Verwijder onder een dissectiemicroscoop het resterende vet en pel voorzichtig de bindweefselcapsule af met twee pincetten.
  5. Bevestig cellabeling door een klein weefselfragment onder een fluorescentiemicroscoop te onderzoeken en het verwachte rapporterings- of fluorescentiesignaal te verifiëren voordat je overgaat tot enzymatische vertering.
  6. Plaats een steriele 35 mm petrischaal op ijs en voeg 800-1000 μL koude 1x PBS (volume aangepast aan kliergrootte) toe aan het midden van de schaal. Breng één traanklier over in de 1x PBS.
  7. Met twee steriele scalpels fijnhakken de klier fijn in kleine fragmenten totdat deze een zachte, pastaachtige consistentie krijgt. Zorg ervoor dat de weefselfragmenten tijdens het hakken in PBS blijven staan, maar laat ze niet vrij over het gerecht drijven.
  8. Verzamel weefselfragmenten aan één kant van de schaal, aspiratief rest-PBS en was fragmenten met 1 mL vers, koud PBS.
  9. Breng gewassen weefselfragmenten over in een 6-wells plaat met 2 mL per put voorverwarmd verteringsmedium. Houd de plaat op ijs totdat alle monsters zijn verwerkt.

5. Eerste enzymatische vertering (~1,5 - 2 uur)

  1. Incubeer de plaat in een schudbad bij 37 °C, 60 toeren per minuut gedurende 30 minuten.
  2. Tritureer het weefsel voorzichtig 15 keer met een breedboring van 1 mL punt, en plaats de plaat dan terug in het schudbad bij 37 °C, 60 rpm voor nog eens 30 minuten.
  3. Tritureer het monster voorzichtig 10 keer met een gewone 1 mL tip, en plaats het bord daarna terug in het schudwater bij 37 °C, 60 rpm voor nog eens 30 minuten.
  4. Tritureer het monster voorzichtig 10 keer en breng de celsuspensie over in 2 mL Dolphin microcentrifugebuizen.
  5. Voeg 1 ml koud BM1 toe aan elke put van de plaat om het resterende verteringsmedium met resterende cellen op te vangen. Plaats de plaat op ijs tot de volgende stap.
    OPMERKING: Als er op dit moment nog grote celclusters of weefselfragmenten worden waargenomen, verleng dan elke incubatiestap met nog eens 10-20 minuten. Overschrijd het aangegeven aantal trituratiepasses niet (maximaal 10-15 zachte passages), aangezien extra mechanische stress de levensvatbaarheid van de cel zal aantasten.

6. Beëindiging van enzymatische activiteit en primaire wasbeurten (~ 15 min)

  1. Centrifugeer de buizen met de celsuspensie op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  2. Verwijder het supernatant. Breng de BM1 uit elke put van de oorspronkelijke plaat (met restcellen) over in de bijbehorende buis en suspendeer de celpellets voorzichtig opnieuw.
  3. Spoel elke put af met nog eens 600 μL koude BM1 en combineer de wash met de bijbehorende buis om alle resterende cellen te verzamelen.
  4. Voorzichtig de celsuspensie opnieuw ophangen, opnieuw centrifugeren op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, en het supernatant weggooien.

7. Accutase- en DNase-behandeling (~ 30 - 35 min)

  1. Voeg 1 ml Accutase toe aan de celpellets en suspenseer voorzichtig opnieuw. Incubeer de buis slechts 5-10 minuten bij 37 °C en 60 toeren.
    OPMERKING: Leg de buis op zijn zij tijdens de incubatie om te voorkomen dat cellen zich vestigen en aan de bodem blijven plakken.
  2. Tritureer voorzichtig 10 keer met een pipettip van 1 mL.
  3. Voeg 1 mL koud BM2 toe om de enzymatische reactie te beëindigen door de Accutase te verdunnen.
  4. Centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten op 4 °C en gooi het supernatant weg.
  5. Suspendeer de cellen opnieuw in het medium voor de behandeling van DNase, waarbij de buis tot aan de bovenkant gevuld wordt.
  6. Incubeer 10 minuten bij RT, en keer na 5 minuten zachtjes weer ophangen.
  7. Ondertussen pre-nate een 70 μm celzeef met 1 mL BM3 geplaatst over een 15 mL conische buis.
  8. Breng de celsuspensie over op de zef.
  9. Spoel de originele afzuigbuis af met 1 ml BM3 en spoel de spoeling over op dezelfde zeef.
  10. Was de zeef met nog eens 5 ml BM3.

8. Celtelling en levensvatbaarheidscontrole

  1. Neem 10 μL van de gefilterde celsuspensie in BM3 en meng met 10 μL Trypan Blue. Bepaal de celconcentratie en levensvatbaarheid met behulp van Trypan Blue-uitsluiting en kwantificeer dit met handmatig tellen of een geautomatiseerde celteller (bijv. Countess 3 Automated Cell Counter). Ga alleen verder als de levensvatbaarheid voldoet aan de vereiste drempel voor downstream toepassingen (meestal ≥70-80%).
    OPMERKING: Houd bij het berekenen van het verbruik rekening met het totale volume ~7-9 mL nu in de 15 mL buis.
  2. Ga verder volgens de downstream applicatie. Voor scRNA-seq, ga door naar sectie 9. Voor flowcytometrie-gebaseerde celsortering, ga door naar sectie 10.
    OPMERKING: De scRNA-seq workflow omvat RBC-lyse en magnetische verwijdering van dode cellen om vuil en omgevingsRNA te verminderen en de datakwaliteit te verbeteren. Deze stappen kunnen echter de celtyperepresentatie vertekenen door bij voorkeur fragiele of zeldzame epitheelpopulaties te treffen, waaronder acinaire cellen. Voor flowcytometrie-gebaseerde sortering werden deze stappen weggelaten om herstel te maximaliseren en celoppervlakte-epitopen te behouden. De selectie van de workflow moet daarom worden geleid door experimentele doelen, waarbij de datakwaliteit prioriteit krijgt voor scRNA-seq of celherstel en de haalbaarheid voor sortering en downstream toepassingen.

9. Voorbereiding van cellen voor scRNA-seq (~ 1 - 1,5 uur)

  1. Maak 1x rode bloedcellenoplossing door 10x oplossing te reconstitueren met milliQ water.
  2. Centrifugeer de 15 mL buis met de celsuspensie op 400 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
  3. Sussen de celpellet opnieuw in 5 mL 1x rode bloedcelbuffer en incubeer 5 minuten bij RT.
  4. Centrifugeer opnieuw op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
  5. Suspendeer de celpellet opnieuw in 2 mL koude BM4.
  6. Neem 10 μL gefilterde celsuspensie in BM4 en meng met 10 μL Trypan Blue om de celconcentratie en levensvatbaarheid te beoordelen.
  7. Maak de MACS 30 μm zeef vooraf nat met 1 mL 1x HBSS en filter de celsuspensie door de zeef in een 15 mL buis.
  8. Spoel de vorige verzamelbuis af met 2 ml koud BM4 en voer de wash door dezelfde zeef in de 15 ml buis.
  9. Was de zeef met een extra 10 mL koude BM4.
  10. Centrifugeer de 15 mL buis op 400 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en verwijder het supernatant volledig.
  11. Suspendeer de pellet voorzichtig opnieuw in 100 μL MACS-microkorrels en incubeer 15 minuten bij RT.
  12. Bereid ondertussen 1x Binding Buffer (BB) voor uit de Dead Cell Removal Kit met steriel dubbel gedestilleerd water.
  13. Was een MACS MS-kolom met 500 μL 1x BB om in evenwicht te komen.
  14. Voeg 400 μL BB toe aan het monster, suspendeer de cellen opnieuw met microkorrels en breng het volledige volume toe op de evenwichtige MS-kolom. Verzamel de doorstroomvloeistof in een 15 mL buis.
  15. Was de kolom vier keer met elk 500 μL BB, waarbij alle doorstroomfracties worden verzameld.
  16. Centrifugeer de verzamelde doorstroming op 400 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
  17. Sussie de cellen opnieuw in 400 μL MSC-buffer en breng de suspensie over op een 1,5 mL buis.
  18. Spoel de vorige tube af met 700 μL MSC-buffer en spoel de spoeling samen met het monster.
  19. Centrifugeer op 400 × g gedurende 5 minuten op 4 °C en gooi het supernatant weg.
  20. Suspendeer de celpellet opnieuw in een MSC-buffer met een brede loop tot een eindvolume van ongeveer 1,5 mL.
  21. Centrifugeer opnieuw op 400 × g gedurende 5 minuten op 4 °C en gooi het supernatant weg.
  22. Laat ~100 μL supernatant achter, suspendeer de pellet voorzichtig opnieuw en tel de cellen opnieuw door 6 μL cellen te mengen met 6 μL Trypan Blue.
  23. Pas het uiteindelijke volume aan met een MSC-buffer om 700-1200 cellen/μL te bereiken en tel cellen opnieuw om de celconcentratie te bevestigen.
  24. Zorg ervoor dat de levensvatbaarheid van de cel na rode bloedcel-lysis en verwijdering van dode cellen ≥ 70% is (meestal 70-95%) vóór het laden voor 10x chroomverwerking (Chromium Single Cell 3' Solution V3).
  25. Pas basale scRNA-seq kwaliteitscontrolecriteria toe: nUMI > 500, nGene > 200 en mitochondriale genfractie <15%. Gebruik een permissieve mitochondriale drempel (15%) om epitheelpopulaties met een hogere metabole activiteit te behouden. Neem alleen cellen op die aan alle QC-criteria voldoen in downstream analyses.
    OPMERKING: Deze kwaliteitscontrole-drempels zijn voorbeeldwaarden afgeleid uit onze datasets (Aanvullende Figuur 1) en zijn gerapporteerd in onze vorige publicatie18.

10. Voorbereiding van cellen voor flowcytometrie-gebaseerde celsortering (~ 1 - 1,5 uur)

  1. Voor flowcytometrie-gebaseerde isolatie van MEC's en fibroblasten werden respectievelijk PdgfraEGFP - en Acta2GFP-rapportagemuislijnen gebruikt om een nauwkeurige identificatie van elke populatie mogelijk te maken.
  2. Centrifugeer de 15 mL buis met celsuspensie op 400 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi supernatant weg.
  3. Sussief de celpellet opnieuw in een koude FACS-buffer tot een uiteindelijke concentratie van 5 x 10⁵ tot 2 x 106 cellen per 100 μL.
  4. Bereid de controles voor die nodig zijn voor FACS-compensatie: negatieve controle - ongekleurde cellen van een wildtypemuis, achtergrondfluorescentiecontrole - ongekleurde cellen van Acta2GFP- en PdgfraEGFP-muizen , enkelkleurige controle - cellen van een wildtypemuis individueel gekleurd met elk antilichaam dat in het experiment werd gebruikt.
    OPMERKING: Voor elk controlemonster gebruik minstens 1 × 10⁵ cellen die opnieuw worden gesuspendeerd in 100 μL FACS-buffer.
  5. Voeg FcBlock toe (1:100) en incubeer 5 minuten op ijs.
  6. Voeg CD326 (EpCAM)-APC monoklonaal antilichaam (1:100) of CD140a (PDGFRα) monoklonaal antilichaam toe (1:100). Incubeer 45 minuten op ijs, beschermd tegen licht.
  7. Suspendeer de cellen voorzichtig elke 15 minuten tijdens de antistofincubatie.
  8. Vul elke buis tot aan de bovenkant met een koude FACS-buffer en centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  9. Bereid de werkoplossing van FxCycle voor (1:1000) in de FACS-buffer.
  10. Repussing monsters in 1 mL en controles in 500 μL koude FACS-buffer met FxCycle.
  11. Breng alle monsters over naar FACS-buizen en bewaar ze op ijs, beschermd tegen licht.
  12. Ga direct naar de Flow Cytometry Core voor sortering. Verzamel gesorteerde cellen in FACS-buffer, kweekmedium, lysisbuffer of RNAlater, afhankelijk van de latere toepassingen.
    OPMERKING: Instrumentinstellingen (bijv. nozzlegrootte en druk) en gebeurtenissnelheden hangen af van de sorteerconfiguratie en de populatie van de doelcel; daarom wordt een voorlopige pilotrun aanbevolen om optimale parameters voor elk experiment te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het dissociëren van verouderde exocriene klieren is moeilijk vanwege lipidenophoping en uitgebreide ECM-afzetting. Oude klieren vertonen duidelijke lymfocytaire infiltratie en uitgesproken ductale dilatatie met intraluminaal materiaal, wat de structurele en inflammatoire veranderingen weerspiegelt die weefseldissociatie bemoeilijken. De traanklier is een exocrien orgaan dat bestaat uit drie hoofdtypen epitheelcellen: acinaire, ductale en myoepitheliale cellen. Acinaire cellen produceren ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier hebben we een significant verbeterd protocol geoptimaliseerd en geëvalueerd voor het genereren van single-cell suspensies uit exocriene weefsels, met de focus op de traanklier. Met deze aanpak genereerden we schone, hoogwaardige single-cell suspenties van zowel oude als jonge LG's, geschikt voor single-cell sequencing en andere downstream toepassingen.

Ondanks de beschikbaarheid van talrijke weefseldissociatieprotocollen was het noodzakelijk om deze te m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs geven aan dat zij geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk is ondersteund door het National Institute of Health, het National Eye Institute (NEI), VS, subsidies 5R01EY026202, R01EY035333; de National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) subsidies R01DE031044, 2R01DE014756, en de National Cancer Institute (NCI) subsidie 5R01CA271500.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materiaal
BSA Sigma-AldrichA4919
CaCl2 (1 M oplossing)BioVisionB1010-100
Collagenase IVSigma-AldrichC5138
Dead Cell Removal KitMiltenyi biotec130-090-101
Dead Cell Removal KitMiltenyi biotec130-090-101
Dispase IIRocheC756V28
DNase ISigma-AldrichDN25-100MG
DPBS Gibco, Thermo Fisher Scientific14190-144
Fetal Bovine Serum, ultra-low IgGGibco# 16250078
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Corning (Thermo Fisher Scientific)21-022-CV
HEPES (1 M oplossing)Sigma-AldrichH0887
IsofluraanoplossingCovertus# 11695067772
MACS® SmartStrainers (30 µm)Miltenyi biotec130-098-458
MACS® SmartStrainers (70 µm)Miltenyi biotec130-110-916
Medium/F12 (DMEM/F12)MilliporeDF-042-B
MgCl2 1MSigma-AldrichM1028-100ML
MS ColumnsMiltenyi biotec130-042-201
NaCl (5M stock)Invitrogen™AM9759
Phosphate Buffered Saline (PBS) tablettenSigma-AldrichP8920-500ML
Rode Bloedcel Lysis Solution (10×)Miltenyi biotec130-094-183
StemPro Accutase Gibco, Thermo Fisher ScientificA1110501
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco, Thermo Fisher Scientific15250061
Ultra-pure EDTA (0.5M, pH 8.0)Invitrogen15575020
Antilichamen
CD140a (PDGFRA) Monoklonaal Antilichaam (APA5), APC-eFluor™ 780, Rat / IgG2a, kappaeBioscience47-1401-82; RRID:AB_2784706
FcBlock (CD16/CD32 Fc blokker)BD Biosciences 553141; RRID:AB_394656
FxCycle™ Violet StainThermo Fisher ScientificF10347
Rat CD326 (EpCAM)-APC monoklonaal antilichaam (G8.8), rat IgG2a, kappaeBioscience17-579182; RRID:AB_2716944
Muizen
Acta2GFP Vriendelijk ter beschikking gesteld door Dr. Ivo KalajzicPMID: 18571490
PdgfraEGFP  - B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/JThe Jackson laboratoryRRID:IMSR_JAX:007669
Apparatuur
Invitrogen™ Countess™ 3 Automated Cell CounterFisher ScientificA49862; RRID:SCR_026963

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guo, J., et al. Aging and aging-related diseases: from molecular mechanisms to interventions and treatments. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 391(2022).
  2. Zhang, X., Wang, L., Zheng, Y., Deng, L., Huang, X. Prevalence of dry eye disease in the elderly: A protocol of systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 99 (37), e22234(2020).
  3. Donthineni, P. R., et al. Aqueous-deficient dry eye disease: Preferred practice pattern guidelines on clinical approach, diagnosis, and management. Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1332-1347 (2023).
  4. Yuksel, S., et al. Aging Affects Lipid Homeostasis in Lacrimal Glands by Upregulating Lipogenesis and Changing Its Specificity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (13), 1(2025).
  5. Galletti, J. G., et al. Ectopic lymphoid structures in the aged lacrimal glands. Clin Immunol. 248, 109251(2023).
  6. Delcroix, V., et al. Lacrimal Gland Epithelial Cells Shape Immune Responses through the Modulation of Inflammasomes and Lipid Metabolism. Int J Mol Sci. 24 (5), 4309(2023).
  7. Mauduit, O., et al. Spatial transcriptomics of the lacrimal gland features macrophage activity and epithelium metabolism as key alterations during chronic inflammation. Front Immunol. 13, 1011125(2022).
  8. Prasad, D., et al. Assessing the Independent and Combined Effects of Hyperosmolarity and Inflammatory Stress on Human Corneal Epithelial Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (13), 47(2025).
  9. Scholand, K. K., et al. Heterochronic Parabiosis Causes Dacryoadenitis in Young Lacrimal Glands. Int J Mol Sci. 24 (5), 4897(2023).
  10. Molla Desta, G., Birhanu, A. G. Advancements in single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics: transforming biomedical research. Acta Biochim Pol. 72, 13922(2025).
  11. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. J Vis Exp. (29), e1266(2009).
  12. Jankelow, A., Almeida-Porada, G., Atala, A., Sawyer, S. W., Porada, C. D. Recent advancements in tissue dissociation techniques for cell manufacturing single-cell analysis and downstream processing. Stem Cells Transl Med. 14 (11), szaf055(2025).
  13. Duong, A., et al. A Rapid Human Lung Tissue Dissociation Protocol Maximizing Cell Yield and Minimizing Cellular Stress. Am J Respir Cell Mol Biol. 71 (5), 509-518 (2024).
  14. Koenitzer, J. R., Wu, H., Atkinson, J. J., Brody, S. L., Humphreys, B. D. Single-Nucleus RNA-Sequencing Profiling of Mouse Lung: Reduced Dissociation Bias and Improved Rare Cell-Type Detection Compared with Single-Cell RNA Sequencing. Am J Respir Cell Mol Biol. 63 (6), 739-747 (2020).
  15. Ikeuchi, T., et al. Dissociation of murine oral mucosal tissues for single cell applications. J Immunol Methods. 525, 113605(2024).
  16. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  17. Kahwaji, N. Universal Precautions. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2024).
  18. Delcroix, V., et al. The First Transcriptomic Atlas of the Adult Lacrimal Gland Reveals Epithelial Complexity and Identifies Novel Progenitor Cells in Mice. Cells. 12 (10), 1435(2023).
  19. Mauduit, O., et al. A closer look into the cellular and molecular biology of myoepithelial cells across various exocrine glands. Ocul Surf. 31, 63-80 (2024).
  20. Zyrianova, T., Basova, L. V., Makarenkova, H. P. Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands. J Vis Exp. (148), e59602(2019).
  21. Montanari, M., et al. Automated-Mechanical Procedure Compared to Gentle Enzymatic Tissue Dissociation in Cell Function Studies. Biomolecules. 12 (5), 701(2022).
  22. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. J Immunol Methods. 425, 69-78 (2015).
  23. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  24. Reichard, A., Asosingh, K. Best Practices for Preparing a Single Cell Suspension from Solid Tissues for Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  25. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neurosci. 17 (1), 30(2016).
  26. Lai, T. Y., et al. Different methods of detaching adherent cells and their effects on the cell surface expression of Fas receptor and Fas ligand. Sci Rep. 12 (1), 5713(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Single Cell RNA SequencingLacrimal Gland DissociationMyoepithelial Cell IsolationFibroblast IsolationFlow CytometryAged Lacrimal GlandTissue DigestionCell SortingEpCAM ImmunostainingPDGFR Alpha Fibroblasts

Gerelateerde artikelen