Synthese, hemoglobine-inkapseling en biorthogonale PEGylatie in hiërarchisch poreuze uiO-66-nanodeeltjes voor zuurstofafgiftetoepassingen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de synthese, hemoglobine-inkapseling en oppervlakte-PEGylatie van hiërarchisch poreuze UiO-66-nanodeeltjes die ontworpen zijn voor zuurstofafgifte. De procedure combineert defectengineering met rekbevorderde biorthogonale conjugatie om zeer doorlatende en fysiologisch stabiele dragers te genereren die geschikt zijn voor biomedische toepassingen.

Samenvatting

Hemoglobine-gebaseerde zuurstofdragers (HBOC's) zijn een belangrijk platform voor zuurstofafgifte om hypoxie in verschillende biomedische contexten te verminderen. Vrij hemoglobine (Hb) is echter onstabiel en vasoactief buiten rode bloedcellen. Hier presenteren we een reproduceerbaar, schaalbaar stapsgewijs protocol voor het vervaardigen van hiërarchisch poreuze UiO-66 nanodeeltjes (HP-UiO-66 NP's) die Hb inkapselen en worden gestabiliseerd door bioorthogonale polyethyleenglycol (PEG) schillen. Hiërarchische mesoporositeit wordt geïntroduceerd door modulatie van dodecaanzuur en daaropvolgende zuurwas, wat resulteert in HP-UiO-66-NH₂ NP's met behouden kristalliniteit en gecombineerde type I/IV N₂ isothermen. Oppervlakteamines worden omgezet in aziden (HP-UiO-66-N₃ NP's), waardoor katalysatorvrije strain-promoted alkyne-azide cycloaddie (SPAAC) Hb@HP-UiO-66-PEG NP's kan produceren. De workflow omvat: i) defectengineering van UiO-66-NH₂ NP's, ii) verwijdering van modulatoren, iii) azide-installatie, iv) Hb-lading in gebufferde waterige media, en v) SPAAC-gemedieerde PEGylatie. Kritieke experimentele parameters, standaard faalmodi en probleemoplossingsstrategieën worden in elke fase gedetailleerd om de reproduceerbaarheid tussen laboratoriums te verbeteren. Het protocol is geschikt voor gramschaalproductie van HP-UiO-66-NH₂ NP's per batch. Encapsulatie-efficiënties van ~35% (laadinhoud ~24 wt%) voor Hb worden verkregen onder milde omstandigheden, met redispergeerbare NP's met een hydrodynamische diameter van ~140 nm en lage polydispersie na PEGylatie. Uitgebreide fysisch-chemische karakterisering verifieert de integriteit van het kader, mesoporositeit, succesvolle oppervlaktechemie en een diffuse PEG-corona tot ~12 nm breed. Functionele assays tonen reversibele zuurstof- en deoxygenatie van ingekapseld Hb, wat wijst op het behouden zuurstoftransportvermogen. PEGylatie verbetert de colloïdale en structurele stabiliteit in zoutoplossing, HEPEES en serum aanzienlijk, waardoor fosfaat-geïnduceerde afbraak wordt voorkomen die bij niet-PEGyleerde tegenhangers wordt waargenomen. Door gedetailleerde probleemoplossingsbegeleiding, video-ondersteunde visualisatie van kritieke stappen en scale-up overwegingen te integreren, biedt dit modulaire protocol een robuuste en toegankelijke route naar metal-organische framework-gebaseerde HBOC's. De strategie is gemakkelijk aan te passen aan andere biomacromoleculen of enzymen die beschermende maar toegankelijke microomgevingen vereisen voor therapeutische afgifte.

Inleiding

Voldoende zuurstofvoorziening is cruciaal voor effectieve therapie en weefselgenezing in diverse biomedische omgevingen¹. Bij trauma en chirurgische bloedingen kan ernstig zuurstoftekort levensbedreigend zijn, wat de noodzaak van veilige bloedvervangers benadrukt wanneer donorbloed^{niet beschikbaar is}. In de oncologie beperken hypoxische tumorgebieden de effectiviteit van zuurstofafhankelijke behandelingen, en aanvullende zuurstoftoediening kan de therapeutische werkzaamheid aanzienlijk verbeteren 3,4,5,6. Zuurstof speelt ook een centrale rol bij wondgenezing, waarbij een verhoogde zuurstofbeschikbaarheid angiogenese en weefselherstel^{bevordert 7}. Evenzo kunnen zuurstofdragers bij ischemische aandoeningen en orgaantransplantatie hypoxische schade verminderen en de levensvatbaarheid en herstel van weefsels verbeteren ^8,9.

Synthetische hemoglobine (Hb)-gebaseerde zuurstofdragers (HBOC's) vormen een veelbelovende benadering om hypoxie¹⁰ te verminderen. Hb buiten rode bloedcellen (RBC's) is echter van nature instabiel en dissocieert snel in dimers, wat nefrotoxiciteit, oxidatieve schade en vasoconstrictie kan veroorzaken door stikstofoxide-skraap¹¹. Om deze uitdagingen te beperken, zijn encapsulatiestrategieën ontwikkeld om Hb te stabiliseren binnen biocompatibele nanodragers zoals liposomen¹², polymeromen¹³ en polymere nanodeeltjes (NP's)14,15,16,17. Hoewel deze systemen de stabiliteit van Hb verbeteren, blijft het bereiken van een hoge inkapselingsefficiëntie terwijl de oorspronkelijke zuurstofbindende functie behouden blijft, een uitdaging¹⁸. Daarnaast kan oxidatieve omzetting naar methemoglobine en heemlekkage de zuurstoftransportprestaties¹⁹ aantasten. Snelle clearance en voortijdige Hb-lekkage beperken de circulatietijd en klinische translatie verder²⁰.

Metaal-organische frameworks (MOF's) zijn recentelijk uitgegroeid tot veelzijdige nanoplatforms voor de levering van geneesmiddelen en biomacromoleculen dankzij hun kristallijne architectuur, grote oppervlakte en instelbare porositeit²¹. MOF's bestaan uit metalen knooppunten die zijn gecoördineerd met organische linkers, en maken moleculaire diffusie en structurele aanpassing mogelijk, waardoor ze aantrekkelijk zijn voor biomedische toepassingen. De meeste MOFs hebben echter voornamelijk microporeuze holtes (<2 nm), die de postsynthetische inkapseling van macromoleculen zoals eiwitten, nucleïnezuren of enzymen 22,23,24,25 sterk beperken. Een benadering om deze beperking te overwinnen is in situ biomimetische mineralisatie, waarbij biomoleculen fungeren als nucleatiecentra tijdens MOF-groei, zoals aangetoond bij ZIF-8 en ZIF-90 26,27,28. Ondanks de effectiviteit vereist deze strategie milde synthesecondities, die het bereik van compatibele MOF-chemieën^beperken.

UiO-66, een zirkonium-gebaseerde MOF die is opgebouwd uit Zr₆O₄(OH)₄ octaëdrische knooppunten en 1,4-benzeendicarboxyllaat (BDC) linkers, valt op door zijn uitzonderlijke chemische stabiliteit en biocompatibiliteit³¹. Het robuuste frame weerstaat ontbinding in waterige en fysiologische omgevingen, waardoor het ideaal is voor biomedische toepassingen³². Desalniettemin beperkt de intrinsieke microporeuze structuur het nut ervan voor biomacromolecuul-inkapseling. Hb, met een moleculaire dimensie van ~5 nm, kan niet worden opgenomen in de interne poriën van ongerepte UiO-66. Dienovereenkomstig hebben slechts een beperkt aantal studies UiO-66 onderzocht in Hb-gerelateerde systemen, waarbij de MOF's voornamelijk worden gebruikt voor oppervlakgebaseerde Hb-detectie in plaats van voor framework-encapsulatie^33,34. Daardoor blijven UiO-66-gebaseerde platforms voor Hb-encapsulatie relatief onderontwikkeld.

Heel recent introduceerden we een hiërarchisch poreuze UiO-66 NP (HP-UiO-66 NP) die deze poriegroottebeperking overwint door mesoporeuze domeinen te integreren die Hb kunnen accommoderen, waardoor de functionele reikwijdte van UiO-66 voor HBOC-ontwikkeling³⁵ wordt uitgebreid. Hiërarchische porositeit wordt geïntroduceerd via defectengineering, specifiek door het gebruik van langeketen monocarbonzuur, zoals dodecanozuur (DA), als modulatoren tijdens synthese^36,37. Deze modulator concurreert met de BDC-ligand om coördinatie met Zr⁴⁺, wat leidt tot defectvorming en vergrote mesoporen. Het daaropvolgende verwijderen van de modulator levert HP-UiO-66 NP's op die coexisterende micro- en mesoporeuze domeinen bevatten, met afstembare poriegrootte via modulatorconcentratie of ketenlengte³⁶.

Hoewel de introductie van mesoporositeit de moleculaire toegankelijkheid verbetert, kan het ook de integriteit van het raamwerk in fosfaathoudende buffers in gevaar brengen. Fosfaationen kunnen coördineren met Zr-clusters, wat leidt tot gedeeltelijke of volledige structurele desintegratie^38,39. Daarom zijn strategieën voor oppervlakstabilisatie essentieel om colloïdale en chemische stabiliteit onder fysiologische omstandigheden^{te behouden 40}. In het algemeen kan MOF-oppervlaktestabilisatie worden bereikt door niet-covalente interacties (bijv. van der Waals-interactie en waterstofbruggen)⁴¹, coördinatie-interacties met blootgestelde metaalsites⁴², of covalente hechting aan organische linkers⁴³. Onder verschillende linkers is polyethyleenglycol (PEG) bijzonder aantrekkelijk vanwege de brede beschikbaarheid en minimale synthetische complexiteit⁴⁴. Belangrijk is dat PEG-oppervlaktemodificatie, vaak aangeduid als PEGylatie, verschillende gunstige eigenschappen geeft aan geneesmiddelafleveringssystemen, waaronder uitstekende biocompatibiliteit, verminderde niet-specifieke eiwitadsorptie en verminderde immuunherkenning en macrofagenopname^45,46. Gezamenlijk verminderen deze effecten immunogene responsen en verlengen ze de systemische circulatie⁴⁷.

Traditionele PEGylatietechnieken maken vaak gebruik van carbodiimide- of maleimidechemie, die doorgaans katalysatoren of reactieve intermediairen vereisen die gevoelige biomoleculen, zoals Hb, kunnen beschadigen. Om deze beperking te omzeilen, gebruiken we strain-promoted alkyne-azide cycloaddition (SPAAC), een katalysatorvrije, bioorthogonale reactie tussen azide- en dibenzylcyclooctyne (DBCO)-gefunctionaliseerde soorten mogelijk, waardoor site-specifieke conjugatie mogelijk is onder milde waterige omstandigheden^35,48. Deze aanpak zorgt voor efficiënte oppervlaktemodificatie zonder de ingekapselde Hb-functie in gevaar te brengen.

Voortbouwend op onze eerder gerapporteerde HP-UiO-66 NPs³⁵, die zich richtten op structureel ontwerp en biofunctionele validatie, legt het huidige protocol de nadruk op methodologische transparantie en reproduceerbaarheid door een gedetailleerde, stapsgewijze experimentele workflow te bieden met gedefinieerde parameterbereiken en kritieke afhandelingsoverwegingen. Probleemoplossingsrichtlijnen zijn opgenomen voor belangrijke fasen van synthese, Hb-encapsulatie en PEGylatie via SPAAC-chemie, wat uiteindelijk stabiele Hb@HP-UiO-66-PEG NP's oplevert (zie Figuur 1).

De workflow omvat: (i) defectengineering waarbij DA als modulator wordt gebruikt om amino-gemodificeerde HP-UiO-66-NH₂ NP's te synthetiseren; (ii) azidefunctionalisatie van oppervlakteaminegroepen; (iii) inkapseling van Hb onder milde, waterige omstandigheden; (iv) covalente PEG-conjugatie via SPAAC.

Voor elke belangrijke stap identificeert dit protocol veelvoorkomende experimentele uitdagingen, zoals deeltjesaggregatie, porie-collapse of inefficiënte oppervlaktefunctionalisatie, en biedt het praktische probleemoplossingsstrategieën om de reproduceerbaarheid tussen laboratoriums te verbeteren. Belangrijk is dat dit artikel uitgebreid aantoont dat de synthese van HP-UiO-66 NP's gemakkelijk schaalbaar is, waardoor betrouwbare productie op gramschaal per batch mogelijk is.

De laatste PEGylated nanocarriers vertonen een hoge colloïdale stabiliteit in zoutoplossing, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES) en serum, terwijl Hb de zuurstofbindende en afgiftecapaciteit^{van 35} behouden blijven. Analytische methoden zoals Fouriertransformatie infraroodspectroscopie (FTIR), kernmagnetische resonantie (NMR), poeder-röntgendiffractie (PXRD), stikstof (N₂) sorptie, zeta (ζ)-potentiaalanalyse, dynamische lichtverstrooiing (DLS), scanning elektronenmicroscopie (SEM) en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) bevestigen chemische transformatie, integriteit van het raamwerk, porositeit, nanoschaalmorfologie en succesvolle oppervlaktefunctionalisatie.

Door nadruk te leggen op reproduceerbaarheid, schaalbaarheid en operationele helderheid, ondersteund door video-gebaseerde visualisatie van technisch gevoelige stappen, biedt deze methodologie een reproduceerbare, robuuste en toegankelijke route om stabiele MOF-gebaseerde zuurstofdragers te fabriceren. Belangrijk is dat de aanpak modulair is en gemakkelijk aanpasbaar is aan andere biomacromoleculen of enzymen die een beschermde maar zuurstofdoorlatende microomgeving nodig hebben om functionaliteit te behouden. Daarom vertegenwoordigen Hb@HP-UiO-66-PEG NP's een veelbelovende stap richting de creatie van HBOC's die zuurstof efficiënt kunnen leveren terwijl ze resistent zijn tegen degradatie in biologische vloeistoffen.

Vanuit praktisch oogpunt kan deze strategie worden uitgebreid naar andere biomacromoleculen buiten Hb, mits zij afmetingen onder ongeveer 20 nm hebben, overeenkomend met de maximaal toegankelijke mesopore-grootte, en een of meer van de volgende kenmerken vertonen: (i) gevoeligheid voor harde chemische omstandigheden, wat milde synthese en oppervlaktemodificatie bevordert; (ii) een vereiste voor een gehydrateerde, zuurstofdoorlatende microomgeving om functionele activiteit te behouden; en (iii) vatbaarheid voor fosfaat-geïnduceerde MOF-degradatie, wat oppervlaktestabilisatie noodzakelijk maakt. De aanpak maakt gebruik van matige defectdichtheden om de toegankelijkheid van mesopore in balans te brengen met de integriteit van het raamwerk. Wanneer katalysatorvrije, locatie-specifieke oppervlaktemodificatie nodig is om de biomolecuulfunctie te behouden, biedt SPAAC-gebaseerde PEGylering duidelijke voordelen. Dit protocol is dan ook zeer geschikt voor efficiënte biomacromoleculaire belasting, functioneel behoud en langdurige colloïdale stabiliteit onder fysiologische omstandigheden, terwijl aanzienlijk grotere biomoleculen of systemen die extreme thermische of zuurstabiliteit vereisen, alternatieve MOF-platforms kunnen vereisen.

Protocol

1. Hb-extractie (verwachte duur: 2 dagen)

OPMERKING: De extractie van Hb uit commercieel verkrijgbaar rundvleesbloed (SSI Diagnostica A/S, Hillerød, DK) wordt uitgevoerd volgens ons eerder gerapporteerde protocol⁴⁹.

1. Breng rundvleesbloed (meestal 10 mL per extractie) over in een 50 mL conische centrifugebuis. Voeg een gelijk volume van 0,9% (w/v) zoutoplossing toe om het bloed te verdunnen en de viscositeit te verminderen. Keer voorzichtig meerdere keren om totdat een homogene suspensie is verkregen.
2. Centrifugeer het verdund bloed op 1.500 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Na centrifugatie verschijnt er een heldere gele supernatant (plasma) boven een dichte rode pellet (RBC's). Als volledige pelleting niet wordt bereikt, wordt de centrifugatie indien nodig voortgezet.
3. Dek voorzichtig de plasmalaag en gooi weg zonder de pellet te verstoren. Voeg verse zoutoplossing (10 mL) toe, suspendeer de rode bloedcellenpellet opnieuw door een zachte inversie en herhaal de centrifugatiestap onder identieke omstandigheden. Voer in totaal twee wasrondes uit om plasma-eiwitten en bloedplaatjes te verwijderen.
   OPMERKING: Het wasproces is cruciaal om zuivere rode bloedcellen vrij te krijgen van plasmaverontreinigingen die de extractie van tolueen verder stroomafwaarts kunnen verstoren.
4. Na de tweede wasbeurt gooi je het supernatant weg en suspendeer je het gereinigde RBC-pelletje opnieuw in een mengsel van tolueen, ultrazuiver water en zoutoplossing in een volumeverhouding van 1:0,4:1. Meng bijvoorbeeld 10 ml tolueen, 4 ml ultrazuiver water en 10 ml zoutoplossing in een 50 ml scheidingstrechter voordat je de pellet toevoegt.
5. Sluit de trechter af en keer voorzichtig meerdere keren om de fasen te mengen. Plaats de trechter 's nachts op 4 °C (~12-16 uur) om volledige fase-scheiding mogelijk te maken. De tolueenfase extraht de lipidemembranen, waardoor een heldere waterige fase overblijft die verrijkt is met Hb.
6. De volgende dag verzamel je voorzichtig de onderste waterige laag met de stopkraan van de scheidingsschoorsteen. Deze laag is transparant en donkerrood.
7. Breng de waterige Hb-oplossing over in centrifugebuizen en draai op 8.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C om eventueel resterende celafval of geëmulgeerd materiaal te verwijderen.
8. Filter het supernatant door een diatomeeënfrit met een vacuümfiltratiesysteem. Breng alleen een zacht vacuüm toe (vermijd hoge negatieve druk die schuimvorming of eiwitdenaturatie kan veroorzaken).
9. Verzamel het filtraat dat stroma-vrij Hb bevat. Bewaar deze voorraad op ijs als het direct wordt gebruikt, of aliquot (~1 mL) en vries in bij −80 °C voor langdurig gebruik.
   OPMERKING: Hb-aliquots kunnen enkele maanden ingevroren worden opgeslagen zonder detecteerbare degradatie.
10. Kwantificeer de Hb-concentratie met een bicinchoninezuur-eiwittest volgens het protocol van de fabrikant, waarbij puur rundvlees Hb als kalibratiestandaard wordt gebruikt. Pas de uiteindelijke Hb-voorraad aan op de gewenste werkconcentratie (meestal 20 mg ^mL-1 in HEPES-buffer, pH 7,4).
    OPMERKING: Verwacht een heldere, rode Hb-oplossing zonder cellulair materiaal.
11. Optioneel: meet de UV-vis absorptiespectra (375-700 nm) van geëxtraheerd Hb om het zuurstofbindings- en afgiftevermogen te beoordelen. Neem het initiële UV-visspectrum op. Voeg natriumdithioniet toe en spoel met N_2-gas gedurende 10 minuten om zuurstof vrij te maken en registreer het spectrum van zuurstofarm Hb. Vervolgens spoel je 10 minuten met lucht om weer zuurstof te krijgen en neem je het spectrum opnieuw op.
    OPMERKING: De aanwezigheid van karakteristieke Soret- en Q-banden van zuurstofgeholpen (~412 nm voor Soret-band; ~541 en ~577 nm voor Q-banden) en zuurstofgedroogde (~430 nm voor Soret-band; ~557 nm voor Q-band) Hb na zuivering met lucht en N₂, respectievelijk, geeft aan dat Hb functioneel blijft (Aanvullende Figuur 1).
    VOORZICHTIG: Ga voorzichtig met tolueen om in een dampkap terwijl je passende persoonlijke beschermingsmiddelen draagt, waaronder een labjas, veiligheidsbril en handschoenen. In de huidige studie werden alle tolueenhoudende afvalvloeistoffen verzameld en afgevoerd als organisch chemisch vloeibaar afval in aangewezen containers (Groep C), gelabeld als "tolueen en mengsel", in overeenstemming met de richtlijnen van het Deense Ministerie van Milieu. De bijbehorende documentatie voor afvalverwerking is verstrekt in Aanvullend Dossier 1.

2. Fabricage van HP-UiO-66-NH₂ NP's (verwachte duur: 3 dagen)

VOORZICHTIG: HCl (37%) is corrosief; Hanteer hem in een afzuigkap met een labjas, zuurbestendige handschoenen en passende oogbescherming. Voeg langzaam zuur toe en vermijd het inademen van dampen.

1. Weeg ZrCl₄ (400 mg, 1,715 mmol) in een 250 mL rondbodemfles. Voeg langzaam DMF (80 mL) toe en ultrasonicaat gedurende 5 minuten om ZrCl₄ volledig op te lossen. Voeg DA (12 g, 60 mmol) toe en ultrasonicaat voor nog eens 30 minuten totdat een heldere, homogene oplossing is verkregen. Meet het totale oplossingsvolume met een gegradueerde cilinder en voeg DMF toe indien nodig om het uiteindelijke volume aan te passen tot 100 mL. DA fungeert als een competitieve modulator en introduceert gecontroleerde roosterdefecten.
   OPMERKING: Voeg DMF langzaam toe bij het oplossen van ZrCl₄, omdat het coördinatieproces exotherm is en lichte damp kan veroorzaken; Voer alle bewerkingen uit in een dampkap. Houd rekening met de volumetoename veroorzaakt door de opname van DA door een initiële volume van 80 mL DMF te gebruiken om ZrCl₄ en DA op te lossen, en pas het uiteindelijke volume pas na volledige oplossing aan te passen naar 100 mL om een nauwkeurige concentratiecontrole te garanderen.
2. Voeg 2-amino-1,4-benzeendicarbonzuur (BDC-NH₂, 155 mg, 0,857 mmol) toe aan dezelfde kolf en sonicaat nog eens 30 minuten. Ga door totdat een homogene lichtgele oplossing is verkregen.
3. Breng het mengsel over in een 150 mL met Teflon beklede autoclaaf of een drukvat met ronde bodem, geschikt voor solvothermische synthese. Sluit goed af en plaats het in een voorverwarmde dempoven op 120 °C gedurende 18 uur. Verstoor de reactor niet tijdens het verwarmen om ongecontroleerde nucleatie te voorkomen.
4. Na de reactie zet je de oven uit en laat je het vat natuurlijk afkoelen tot kamertemperatuur (~2 uur). Zie een fijne gele suspensie die gelijkmatig door het hele medium verschijnt.
5. Verzamel het product door centrifugatie (11.000 x g, 10 min, kamertemperatuur) en gooi het supernatant weg. Was de pellet drie keer met DMF (100 mL) onder dezelfde centrifugatieomstandigheden om overtollige ligand en niet-gereageerde DA te verwijderen. Als het product niet volledig gepelleteerd is, verleng dan de centrifugatietijd indien nodig.
6. Bereid een zuurverwijderingsoplossing voor bestaande uit DMF (100 mL) met 0,5 mL geconcentreerde HCl (37%). Dompel de gewassen pellet volledig onder in deze oplossing en verwarm hem 12 uur in een dempoven op 90 °C. Deze stap verwijdert de DA-modulator, waardoor mesopores binnen de structuur ontstaan.
7. Na 12 uur centrifugeer je (11.000 x g, 5 min, kamertemperatuur) en gooi je het supernatant weg. Herhaal de zuurbehandeling met een verse batch DMF met 0,5 mL HCl om volledige verwijdering van DA te garanderen. Als het product niet volledig gepelleteerd is, verleng dan de centrifugatietijd indien nodig.
8. Was de pellet achtereenvolgens met DMF, aceton en ethanol (100 mL, 11.000 x g, 5 min, kamertemperatuur) om eventueel residueel zuur en oplosmiddel te verwijderen. Als het neerslag niet volledig is gepelleteerd, verleng dan de centrifugatietijd indien nodig. Tussen elke wasbeurt verspreid je de pellet voorzichtig door vortexen of milde sonicatie.
9. Droog het product een nacht in een vacuümoven (140 °C) na omgevingsdroog in een afzuigkap. De uiteindelijke materialen (HP-UiO-66-NH₂ NP's) verschijnen als fijn geel poeder. Verwacht een typische opbrengst van ~428 mg.
10. Bevestig dat PXRD-pieken op 2θ = 7,3°, 8,4°, 25,7° scherp blijven (Figuur 2A), wat wijst op behoud van de kristallijne UiO-66-topologie. Controleer volledige verwijdering van DA door ¹H NMR na alkalische (2 M KOH in D₂O) vertering (geen methyleenpieken bij 1,2 ppm) (Figuur 2B).
11. Karakteriseer porositeit door N₂ adsorptie-desorptie bij 77 K⁵⁰. De kromme toont een gecombineerde Type I/IV-isotherm met een hystereselus (Figuur 2C), waarmee de vorming van mesopore wordt bevestigd.
    OPMERKING: Onvolledige hoogtemperatuurdroging of onvoldoende monstermassa leidt tot onnauwkeurige porositeitsmetingen met behulp van N₂ adsorptie-desorptie-isothermen; herhaal het vacuümdroogproces bij 140 °C en zorg dat het monstergewicht meer dan 100 mg is als het Brunauer−Emmett−Teller (BET)-gebied < 1.000 m^{2 g-1} is.
12. Optioneel: beoordeel de morfologie van NP's met behulp van SEM. HP-UiO-66-NH₂ NP's vertonen bolvormige morfologie met een smalle grootteverdeling van ~100 nm (Figuur 2D).
    OPMERKING: Verwacht HP-UiO-66-NH₂ NP's met zowel micro- als mesopores, geschikt voor latere Hb-encapsulatie.
13. De synthese van HP-UiO-66-NH₂ NP's kan worden opgeschaald door evenredig alle gebruikte reagentia en oplosmiddelen in stappen 2.1 - 2.9 te verhogen en meerdere parallelle solvotherme reacties uit te voeren. Door dezelfde molaire verhoudingen, concentraties, reactietemperatuur en reactietijd te behouden, en de hoeveelheden reagens en oplosmiddelen met 1,5 keer te verhogen, kunnen twee of meer 150 mL met Teflon beklede autoclaves of rondbodemdrukvaten gelijktijdig worden bediend, waardoor gramschaalproductie van HP-UiO-66-NH₂ NP's mogelijk wordt gemaakt (Figuur 3).
    OPMERKING: Behandel alle organische oplosmiddelen in een dampkap terwijl je een labjas, zuurbestendige handschoenen en passende oogbescherming draagt. Verzamel alle afvalvloeistoffen die DMF bevatten en doe deze als organisch chemisch vloeibaar afval in aangewezen containers (Groep C) met het label "DMF en mengsel" volgens de richtlijnen van het Deense Ministerie van Milieu. Afvaloplossingen met sporen van ZrCl₄ en HCl werden dienovereenkomstig behandeld. De bijbehorende documentatie voor afvalverwerking is verstrekt in Aanvullend Dossier 1.

3. Azide-functionalisatie van HP-UiO-66-NH₂ NP's (HP-UiO-66-N₃ NP's) (verwachte duur: 1 dag)

VOORZICHTIG: Trimethylsilylazide (TMSN₃) en tert-butylnitriet (tBuONO) zijn giftig en vluchtig. Voer alle stappen uit in een dampkap met een labjas, nitrilhandschoenen en oogbescherming.

1. Weeg HP-UiO-66-NH₂ NP's (50 mg) nauwkeurig af in een 25 mL rondbodemfles. Voeg THF (10 mL) toe en laat de ultrasonica 5 minuten lang uitbrengen om de deeltjes volledig te verspreiden. De ophanging wordt ondoorzichtig maar uniform.
   OPMERKING: Uniforme dispersie van NP's na sonicatie is cruciaal voor effectief contact met reactanten. Als de dispersie onvolledig is, verhoog dan het oplossingsvolume en herhaal de sonicatie.
2. Plaats de fles in een ijswaterbad (0 °C) op een magnetische roeraar die op 400 toeren per minuut staat. Voeg met een glazen spuit de BuONO(0,4 mL) druppelgewijs toe gedurende 5 minuten terwijl de temperatuur onder de 5 °C blijft.
3. Voeg onmiddellijk TMSN₃ (0,35 mL) druppelgewijs toe onder dezelfde koude omstandigheden. Er kan een milde bruisende spanning optreden, wat wijst op progressie in de nitrosatie. Wikkel het bad in aluminiumfolie om de reactie tegen licht te beschermen...
4. Blijf het reactiemengsel 's nachts (~16 uur) roeren in het ijswaterbad om volledige azidesubstitutie van aminegroepen op het MOF-oppervlak mogelijk te maken.
5. Verwijder het ijsbad en laat de suspensie kamertemperatuur bereiken. Centrifuge (11.000 x g, 5 min, kamertemperatuur) om de aangepaste NP's te verzamelen. Als het neerslag niet volledig is gepelleteerd, verleng dan de centrifugatietijd indien nodig.
6. Was de pellet grondig drie keer met THF (10 mL) en verzamel hem na elke wasbeurt door centrifugatie (11.000 x g, 5 min, kamertemperatuur). Volg dit met drie extra wasbeurten met aceton (10 mL), centrifugeren onder dezelfde omstandigheden, om restreagentia en bijproducten te verwijderen. Als het neerslag niet volledig is gepelleteerd, verleng dan de centrifugatietijd indien nodig.
7. Droog het product (HP-UiO-66-N₃ NP's) een nacht in een oven (140 °C) onder vacuüm na het buiten in een afzuigkap. Verwacht een typische opbrengst van ~45 mg.
8. Verifieer de chemische transformatie met FTIR-spectroscopie: een scherpe asymmetrische azide-rek verschijnt bij ~2122 ^cm-1 (Figuur 4A). De bandintensiteit correleert met de efficiëntie van oppervlaktesubstitutie.
   OPMERKING: Onvolledige conversie kan de volgende klikconjugatie belemmeren. Als de azideband zwak is, herhaal dan de functionalisatie met 2-voudige hoeveelheden van tBuONO en TMSN₃. Verwacht azido-terminated HP-UiO-66-N₃ NP's met behouden kristalliniteit en mesoporeuze architectuur (Figuur 4B-D), klaar voor Hb-encapsulatie en SPAAC PEGylatie.
   VOORZICHTIG: Verzamel alle afvalvloeistoffen die TMSN₃ bevatten, inclusief mengsels met andere reagentia (bijv. tBuONO en THF), in aangewezen groep O gevaarlijke afvalcontainers volgens de richtlijnen van het Deense Ministerie van Milieu. Label alle containers duidelijk om de aanwezigheid van TMSN₃ en de mengsels daarvan aan te geven. Relevante documentatie voor afvalverwerking wordt verstrekt in Aanvullend Dossier 1.

4. Hb-lading en kwantificatie (verwachte duur: 2 dagen)

1. Breng HP-UiO-66-N₃ NP's (5 mg) over in een 2 mL centrifugebuis, gevolgd door ~2 minuten sonicatie in 0,5 mL HEPES-buffer (20 mM, pH 7,4). Voeg 0,5 mL HEPES-buffer met Hb (20 mg ^mL-1) toe en draai de buis voorzichtig meerdere keren om om de NP's volledig te verspreiden.
2. Plaats de buis op een thermoshaker en incubeer bij kamertemperatuur (22-25 °C) onder 1.000 tpm en schud gedurende 2 uur.
3. Na incubatie centrifugeer je 13.500 x g gedurende 5 minuten op kamertemperatuur om de resulterende Hb@HP-UiO-66-N₃ NP's te pelleteren. Verzamel het supernatant zorgvuldig voor kwantificering van niet-gevangen Hb. Als het neerslag niet volledig is gepelleteerd, verleng dan de centrifugatietijd indien nodig.
4. Was de pellet voorzichtig met ultrazuiver water (1 mL) door op en neer te pipetten om losjes geadsorbeerd Hb te verwijderen, en herhaal de wasbeurt twee keer. Verzamel zorgvuldig het supernatant van elke wash voor kwantificering van niet-gevangen Hb. Suspendeer de uiteindelijke pellet opnieuw in 0,5 mL ultrazuiver water voor karakterisering. Bewaar monsters in de koelkast (4 °C) om oxidatie te voorkomen.
5. Bepaal niet-gevangen Hb in de verzamelde supernatanten met behulp van de natriumlaurylsulfaat (SLS)-Hb assay⁵¹. Pipetteer 10 μL van elk supernatant in een 96-put microplaat en voeg 100 μL SLS-reagens toe (0,6 mg ^mL-1 in ultrazuiver water). Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur in het donker, meet dan de absorptie bij 412 nm met een UV-vis spectrofotometer.
6. Bereid een standaardcurve voor met Hb-stockoplossingen (0-10 mg ^mL-1) in een HEPES-buffer om absorptiewaarden om te zetten in concentratie.
7. Bereken de inkapselingsefficiëntie (EE) en laadinhoud (LC) als:
   EE (%) = [(begin-Hb - supernatant Hb)/begin-Hb] × 100
   LC (%) = [(ingekapseld Hb)/(ingekapseld Hb + NP massa)] × 100
8. Om de Hb-encapsulatie op te schalen, incubeer je 100 mg NP's met 20 mL Hb-oplossing (10 mg mL⁻¹). Om de porositeit na de inkapseling te beoordelen, dompel je de resulterende NP's 24 uur in ethanol, droog ze vervolgens een nacht in een vacuümoven bij 140 °C, en registreer je de N₂ adsorptie-desorptie-isotherm om de porositeit te evalueren. De rode kleur van het poeder duidt op succesvolle inkapseling van Hb (Figuur 5A), en een duidelijke afname van de opname van N₂ bevestigt het succesvolle vullen van mesopores met Hb (Figuur 5B).
9. Meet ζ-potentiaal met een Zetasizer Nano ZS. De oppervlaktelading neemt af van ~+40 mV (HP-UiO-66-N₃ NP's) naar ~+20 mV (Hb@HP-UiO-66-N₃ NP's), wat consistent is met Hb-adsorptie (Figuur 5C).
10. Optioneel: verkrijgen van SEM-micrografie (Figuur 5D) en PXRD-diffractie (Figuur 5E) om morfologische integriteit en structurele stabiliteit te waarborgen.
11. Neem UV-visspectra op (375-700 nm) om de reversibele zuurstofbinding van de NP's te beoordelen. Voeg natriumdithioniet toe en spoel met N₂ gedurende 10 minuten om zuurstof vrij te geven, neem het spectrum op, spoel dan 10 minuten met lucht om herbinding mogelijk te maken, en neem het spectrum opnieuw op (Figuur 5F).
    OPMERKING: De aanwezigheid van karakteristieke Soret- en Q-banden van zuurstofgevoede (~412 nm voor Soret-band; ~541 en ~577 nm voor Q-banden) en zuurstofarm (~430 nm voor Soret-band; ~557 nm voor Q-band) Hb na zuivering met lucht en N₂, respectievelijk, geeft aan dat Hb functioneel blijft.
12. Verwacht uniforme rode Hb@HP-UiO-66-N₃ NP's die functioneel actief Hb bevatten met reversibel zuurstofgedrag.

5. Fabricage van Hb@HP-UiO-66-PEG NP's: PEGylatie via SPAAC (verwachte duur: 2 dagen)

1. Bereid een 2 mL centrifugebuis voor met Hb@HP-UiO-66-N₃ NP's (10 mg) verspreid in 0,5 mL ultrazuiver water. Voeg DBCO-PEG toe (Mw ~2.000, 20 mg in 0,5 mL ultrazuiver water) om een verhouding van 2:1 (w/w) van PEG tot NP's te bereiken. Draai voorzichtig vortex tot het volledig gemengd is.
2. Incubeer het mengsel op een thermoshaker bij kamertemperatuur en 1.000 tpm gedurende 1 uur, en breng het daarna over in een koelkast (4 °C) voor een reactie 's nachts (~16 uur). Deze katalysatorvrije SPAAC-klikreactie koppelt DBCO covalent aan de azidegroepen, waardoor stabiele triazoolverbindingen ontstaan.
3. Centrifugeer op 12.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de PEGyleerde Hb@HP-UiO-66-PEG NP's te pelletten. Als het neerslag niet volledig is gepelleteerd, verleng dan de centrifugatietijd indien nodig. Gooi het supernatant met niet-gereageerde PEG weg.
4. Was de pellet drie keer met ultrazuiver water (2 ml per stuk door omhoog en omlaag te pipetten) onder identieke centrifugatieomstandigheden. Dit zorgt voor het verwijderen van vrije PEG-ketens en kleine moleculaire bijproducten.
5. Susseer de gezuiverde Hb@HP-UiO-66-PEG NP's opnieuw in 2 mL ultrazuiver water en bewaar bij 4 °C.
   Het colloïd lijkt homogeen en licht opalescent, wat wijst op een goede verspreidingsstabiliteit.
6. Bevestig succesvolle PEGylatie met FTIR-spectroscopie (Figuur 6A): verdwijning van de azideband bij 2122 ^cm-1 en het verschijnen van PEG-afgeleide methyleen- (−CH₂−) en etherbindingssignalen (−O−) bij respectievelijk 2883 en 1097 ^cm-1.
7. Controleer met ¹H NMR (Figuur 6B) na alkalische vertering in 2 M KOH/D₂O; PEGyleerde monsters tonen een extra signaal bij δ = 3,53 ppm dat overeenkomt met de oxyethyleenprotonen van PEG.
8. Meet de hydrodynamische diameter en polydispersie-index (PDI) met DLS (Figuur 6C).
   Een toename van ~115 nm (PDI ~0,1) naar ~140 nm (PDI ~0,17) bevestigt oppervlaktecoating met een dunne polymeerlaag.
9. Optioneel: meet oppervlakte-ζ-potentiaal met een Zetasizer Nano ZS om het verwaarloosbare effect van oppervlakte-PEGylatie op de oppervlaktelading te verifiëren (Figuur 6D). Een kleine verandering na PEGylatie (van ~+20 mV naar ~+17 mV) duidt op minimale impact op oppervlaktelading.
10. Observeer morfologie met TEM (Figuur 6E). TEM toont een diffuse rand van ~10-12 nm rond de deeltjesrand die de PEG-corona vertegenwoordigt.
11. Voer zuurstofafgifte-assay uit met een zuurstofelektrode (Figuur 6F) om aan te tonen dat de Hb-functie intact blijft na PEGylering, vergelijkbaar met de niet-PEGyleerde vorm. Verwacht stabiele, roodbruin-verspreide Hb@HP-UiO-66-PEG NP's met sterke colloïdale stabiliteit en behouden zuurstofbindingscapaciteit, geschikt voor langdurige fysiologische tests.
12. Optioneel: voer zuurstofdissociatiecurves (ODC's) uit van vrije Hb en Hb die zijn ingekapseld in Hb@HP-UiO-66-PEG NP's om de partiële zuurstofdruk bij 50% Hb zuurstofsaturatie (p50) en Hill-coëfficiënt (Hill-n) (Figuur 7) te identificeren.

6. Beoordeling van de stabiliteit van de NP (Verwachte duur: 7 dagen)

1. Doseer Hb@HP-UiO-66-PEG NP's (~5 mg) in zeven centrifugebuizen van 2 mL. Voeg 2 mL van elk medium toe: ultrazuiver water, zoutoplossing (0,9% NaCl), HEPES (20 mM), muizenserum, menselijk plasma, Dulbecco's aangepaste Eagle's medium-high glucose (DMEM) en fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Zorg ervoor dat de doppen van de centrifugebuis stevig gesloten zijn om verdamping van het medium tijdens de incubatie te voorkomen. CD-1 muisserum en menselijk plasma worden gekocht bij Innovative Research (Novi, MI, VS).
2. Incubeer de monsters bij 37 °C in een thermoshaker bij 1.000 toeren per minuut gedurende maximaal 7 dagen.
3. Na 3 en 7 dagen verzamel je deeltjes door centrifugatie (12.000 g, 10 min, kamertemperatuur), was je één keer met ultrazuiver water en droog je voor PXRD (Figuur 8A). Als het neerslag niet volledig is gepelleteerd, verleng dan de centrifugatietijd indien nodig.
4. Bij 0, 24, 72 en 168 uur trek je aliquots (~50 μL) terug en verdun je ze 20 keer voor DLS-analyse (grootte en PDI) (Figuur 8B).
5. Optioneel: bereid SEM-monsters voor na 48 uur in PBS om de morfologie visueel te controleren (Figuur 8C).
   OPMERKING: Het verdunnen van de NP-suspensie (in PBS) met ultrazuiver water is essentieel voor SEM-analyse omdat dit achtergrondinterferentie van buffercomponenten vermindert en heldere beeldvorming van de NPs vergemakkelijkt.
6. Vergelijk het met niet-PEGylated Hb@HP-UiO-66-N₃ NP's onder identieke omstandigheden; het snelle verdwijnen van karakteristieke kristallijne reflecties en het verschijnen van brede amorfe verstrooiingskenmerken wijzen op instabiliteit zonder PEG-coating.
   OPMERKING: PEGyleerde monsters blijven na 7 dagen structureel intact in alle media, terwijl niet-PEGyleerde monsters binnen 24 uur in PBS of DMEM ontbinden.

7. Fysisch-chemische karakterisering (Verwachte duur: ~15 dagen)

OPMERKING: Deze sectie beschrijft de analytische methoden die nodig zijn om de morfologie, samenstelling, porositeit en Hb-integriteit van NP's te bevestigen. Deze karakteriseringstechnieken valideren gezamenlijk de reproduceerbaarheid van de synthese- en modificatieprocessen.

1. PXRD
   1. Droog ~5 mg van elk NP-monster een nacht in een vriezerdroger voordat je meet om geadsorbeerd vocht te verwijderen.
   2. Laad het monster op een vlakke siliciumhouder zonder achtergrond en plat voorzichtig met een schone glazen glaasje om een dunne, uniforme laag te vormen.
      OPMERKING: Vermijd te hard drukken, want dit kan de voorkeursoriëntatie-effecten veroorzaken.
   3. Registreer PXRD-patronen met een bench-difractometer uitgerust met Cu Kα-straling (λ = 1,5418 Å). Stel scanparameters in op 2θ = 4-50°, stapgrootte = 0,02°, dwell = 1 s per stap.
   4. Vergelijk de verkregen patronen met de gesimuleerde UiO-66-structuur die is gegenereerd met Mercury-software op basis van de eerder gerapporteerde kristalgegevens³¹. De aanwezigheid van scherpe pieken bij 7,3°, 8,4° en 25,7° duidt op kristallijne integriteit.
2. N₂ Adsorptie-Desorptie (BET-oppervlakte en poriegrootteverdeling)
   1. Ontgassen ~100 mg van elk NP-monster bij 140 °C onder vacuüm gedurende 24 uur met een Micromeritics Smart VacPrep-systeem met een zuiveringsultrazuiverheid N₂.
   2. Breng de ontgassde monsters onmiddellijk over naar de analysepoort van een Micromeritics Tristar oppervlakte-analyzer. Record N₂ isothermen bij 77 K binnen een relatieve drukrange (P/P₀) van 0-1.
   3. Bereken oppervlakten met de BET-methode volgens de uitgebreide Rouquerol-criteria⁵². Bereken poriegrootteverdeling via de niet-lokale dichtheidsfunctionaaltheorie die in de Micromeritics-software is geïmplementeerd.
   4. Genereer de adsorptie-/desorptiecurves en poriegrootteverdelingsplots met behulp van Origin 2022. Importeer de adsorptie-/desorptiegegevens in de software, met relatieve druk (P/P₀) op de X-as en het geadsorbeerde volume van N₂ op de Y-as.
   5. Plot de poriegrootteverdeling met poriebreedte als de X-as en incrementeel porievolume als de Y-as. Presenteer de resultaten als "Lijn + Symbool"-grafieken. Voer alle analyses uit met de standaard software-instellingen.
3. FTIR-spectroscopie
   1. Malen ~5 mg van elk gedroogd monster tot een fijn poeder met een schone agaatmortel. Plaats het poeder op het ATR-kristal van een ALPHA-P Bruker spectrometer⁵³.
   2. Verzamel spectra in het bereik van 4.000-400 ^cm-1 met een resolutie van 2 ^cm-1 .
   3. Identificeer karakteristieke toppen: Het verschijnen van de N_3-stretch op ~2122 ^cm-1 bevestigt azidevorming (Figuur 4A). Na PEGylatie observeer je respectievelijk de −CH₂− en C-O-C banden op ~2883 ^cm-1 en ~1097 ^cm-1, samen met het verdwijnen van de N_3-rek (Figuur 6A). Verwacht dat het verdwijnen van de azideband en het verschijnen van PEG-afgeleide methyleen- (−CH₂−) en etherbotsignalen (−O−) de voltooiing van de SPAAC-reactie bevestigen.
   4. Plot de FTIR-curves met Origin 2022. Importeer de ruwe gegevens in de software met X (golfgetal) en Y (transmissie) waarden. Genereer grafieken in "Line"-formaat met behulp van de standaardinstellingen van de software.
4. ¹H NMR
   1. Voeg ~10 mg NP's toe aan 0,5 mL van 2 M KOH in_D2Oin een glazen flesje, en verwarm op 80 °C gedurende 1-2 uur om het raamwerk te verteren.
   2. Centrifuge (12.000 x g, 10 min, kamertemperatuur) om de onopgeloste residuen te laten draaien. Breng het supernatant over naar een 5 mm NMR-buis.
   3. Neem ¹H NMR-spectra op op een 400 MHz Bruker Avance-spectrometer.
   4. Ken de karakteristieke chemische verschuivingen toe, inclusief de aromatische protonen van BDC-NH₂ (δ = 6-8 ppm) en PEG-signalen (δ = ~3,53 ppm, Figuur 6B), met behulp van de software van MestReNova. Analyseer de NMR-gegevens met behulp van de NMR-verwerkingsmodule van de software met de standaardinstellingen.
5. SEM
   1. Drop ~5 μL NP-suspensatie op een siliciumwafer; Laat het aan de lucht drogen in een stofvrije kast. Als er wordt opgeladen, sputter-coat dan met 5 nm goud.
   2. Afbeelding op een FEI Quanta 200 SEM met een versnellingsspanning van 10-20 kV.
   3. Analyseer de afbeeldingen met ImageJ. Importeer de originele TIFF-afbeeldingen met ingebedde schaalinformatie in de software en pas helderheid en contrast uitsluitend aan voor visualisatie. Pas geen extra verwerking toe die de dimensionale informatie kan beïnvloeden. Genereer de schaalbalken met de Analyse-functie van de software.
6. TEM
   1. Plaats ~5 μL NP-dispersie op een lacey-carbon Cu-rooster (300 mesh). Dep overtollig met filterpapier en droog bij omgevingsomstandigheden.
   2. Onderzoek onder een FEI Tecnai T20 G2 TEM bij 200 kV.
   3. Analyseer de afbeeldingen met ImageJ. Beeldverwerking volgt de procedures beschreven in Sectie 7.5.3.
7. DLS en ζ-Potential
   1. Verdun NP's ~20 keer in ultrazuiver water voor grootte en PDI-analyse; voor ζ-potentiaal, verdun in de HEPES-buffer (20 mM, pH 7,4).
   2. Meet met een Zetasizer Nano ZS bij 25 °C. Er worden minstens drie onafhankelijke monsters (n = 3) voorbereid, en elk monster wordt in drievoud gemeten.
   3. Plot de DLS- en ζ-potentieelgegevens met behulp van Origin 2022. Presenteer de intensiteitsgewogen deeltjesgrootteverdeling als "Line + Symbol"-grafieken en ζ-potentiaalresultaten als "Kolom"-grafieken. Rapporteer de gegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie (n = 3). Voer alle analyses uit met de standaardinstellingen van de software.
8. UV-vis spectroscopie voor Hb-functionaliteit
   1. Disperseer 3 mg vrij Hb of een overeenkomstige hoeveelheid NP's (d.w.z. met een equivalente hoeveelheid ingekapseld Hb) in 3 ml ultrazuiver water. Zet de ophangingen over op een kwartscuvet. Neem UV-visspectra op van 375-700 nm met een UV-2600 UV−vis spectrofotometer.
   2. Voeg een snufje natriumdithioniet toe aan de Hb-oplossing of NP-suspensie en spoel met N₂ gedurende 10 minuten om het monster te deoxygeneren. Registreer de verschuiving van de Soret-band van 412 naar 430 nm en de samenvoeging van Q-banden. Oxygeneer het monster opnieuw door 10 minuten lucht te laten bubberen om de omkering te observeren (Figuur 5F en Aanvullende Figuur 1).
   3. Plot de gegevens met Origin 2022. Presenteer de spectra als "Line"-grafieken, met golflengte op de X-as en absorptie op de Y-as.
9. Kwantificering van vrijgekomen zuurstof
   1. Disperseer 1 mg vrij Hb of een overeenkomstige hoeveelheid Hb@HP-UiO-66-N₃ en Hb@HP-UiO-66-PEG NP's (met een gelijkwaardige hoeveelheid ingekapseld Hb) in 600 μL ultrazuiver water. Doe de ophangingen over in 2 ml glazen flesjes en sluit deze stevig af met rubberen doppen.
   2. Steek voorzichtig de naaldprobe van de zuurstofelektrode via de rubberen kap in de suspensie om het opgeloste zuurstofgehalte te monitoren met een naaldtype_O2-meter .
   3. Voeg snel K₃[Fe(CN)₆] oplossing (10 wt% in 100 μL ultrazuiver water) toe aan de suspensie met een spuitnaald en registreer continu de verandering in zuurstofgehalte.
   4. Bereken de vrijgekomen zuurstof door de maximale waarde die na K₃[Fe(CN)₆] optelling wordt waargenomen af te trekken van de beginwaarde vóór de optelling. Normaliseer de verkregen waarden met de zuurstof die vrijkomt uit dezelfde hoeveelheid vrije Hb (Figuur 6F) met behulp van Origin 2022. Meet drie onafhankelijke steekproeven (n = 3) voor vrije Hb of elke NP.
      OPMERKING: Hb@HP-UiO-66-N₃ en Hb@HP-UiO-66-PEG NP's vertonen vergelijkbare zuurstofafgifte, waarbij elk ~60% van de zuurstof vrijkomt die vrij Hb vrijgeeft.
10. Meting van ODC's en berekening van p50 en Hill-n
    1. Bereid vrije rundvlees Hb of Hb@HP-UiO-66-PEG NP's voor bij een uiteindelijke Hb-concentratie van ~1 mg ^mL-1 in 3 mL HEPES-zout buffer (20 mM HEPES, 0,9% (w/v) NaCl, pH 7,4). Breng het monster over in een kwartscuvet uitgerust met een magnetische roerstang.
    2. Plaats de cuvette in een hemox-analyzer. Stel de meettemperatuur in op 37 °C en laat het systeem in evenwicht komen onder continu roeren totdat een stabiele basislijn is bereikt.
    3. Registreer ODC's door stapsgewijze deoxygenatie over een partiële drukreeks van 1-148 mmHg. Gebruik de vooraf geïnstalleerde Hemox-analyzersoftware om ODC's te meten en p50 en Hill-n te berekenen met de standaard analyse-instellingen. Meet drie onafhankelijke steekproeven (n = 3) per steekproef.
    4. Exporteer de verwerkte data en plot de ODC's met Origin 2022 in het standaard "Line"-grafiekformaat.

8. Reproduceerbaarheid en statistische analyse

1. Voer alle procedures uit die in dit protocol zijn beschreven minstens drie onafhankelijke keren. Rapporteer resultaten als typische uitkomsten die over deze herhalingen zijn waargenomen. Houd de belangrijkste experimentele parameters, zoals reactietijden en temperaturen, binnen een redelijk bereik om reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid voor andere gebruikers te waarborgen.
2. Presenteer structurele karakterisering (PXRD, N₂ adsorptie-desorptie, FTIR, ¹H NMR, SEM, UV-vis) als representatieve data voor kwalitatieve bevestiging zonder statistische analyse uit te voeren.
3. Rapporteer kwantitatieve metingen (DLS, ζ-potentieel, p50, Hill-n) als gemiddelde ± SD (n ≥ 3). Bepaal statistische significantie met behulp van ongepaarde tweezijdige Welch's t-test of eenrichtings-ANOVA, indien van toepassing. Geef significantieniveaus aan als ns (geen significant), * = p < 0,05, ** = p < 0,005, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001.

Resultaten

De succesvolle synthese van HP-UiO-66-NH₂ NP's werd bevestigd door PXRD (Figuur 2A), dat de karakteristieke diffractiepieken vertoonde bij 2θ = 7,3°, 8,4° en 25,7°, goed overeenkwam met de gesimuleerde UiO-66-structuur³⁶. De lichte piekverbreding ten opzichte van het gesimuleerde patroon werd toegeschreven aan de nanoschaalafmetingen van deeltjes en bevestigde het behoud van de kristallijne integriteit na synthese

Discussie

Dit protocol biedt een robuuste en reproduceerbare route om HP-UiO-66 NP's ontworpen voor Hb-encapsulatie en zuurstoflevering te synthetiseren, te functioneren en karakteriseren. Door een inside-out engineeringbenadering toe te passen, creëert dit werk een generaliseerbaar kader voor het ontwerp van MOF-NP's voor biomedische toepassingen, waaronder biomacromolecuul- en geneesmiddelafgifte. Hoewel het onderliggende materiaalconcept en functionele prestaties eerder zijn gerapporteerd, brei...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2-amino-1,4-benzenedicarboxylic acid	Merck Life Science A/S (Søborg, DK)	381071-25G
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid	Merck Life Science A/S (Søborg, DK)	H3375-100G
Acetone (99%)	VWR International (Søborg, DK)	23J244030
Bicinchoninic acid protein assay	Thermo Fisher Scientific (Roskilde, DK)	23235
Bovine blood	SSI Diagnostica A/S (Hillerød, DK)	77667
Centrifuge tube
Centrifuger	Thermo Fisher Scientific Inc (Massachusetts, US)	75009903	Megafuge ST Plus series
Deuterium oxide	Merck Life Science A/S (Søborg, DK)	151882
Dibenzocyclooctyne-polyethylene glycol	BroadPharm	BP-23949
Dodecanoic acid	Merck Life Science A/S (Søborg, DK)	L556-1KG
Dulbecco’s modified eagle’s medium−high glucose	Merck Life Science A/S (Søborg, DK)	11965092
Ethanol (100%)	VWR International (Søborg, DK)	24L044013
Fourier transform infrared spectroscopy	Bruker (Billerica, US)
Hemox analyzer	TSC Scientific Crp (PA, USA)
Human citrated plasma	TebuBio	SER-PLP25
Hydrochloric acid (37%)	Merck Life Science A/S (Søborg, DK)	320331-500ML
ImageJ software	National Institutes of Health (USA)		Version 1.47t
Lacey-carbon Cu grid (300 mesh)	Agar Scientific Ltd., (Stansted Essex, UK)	AGS166-3H
Magnetic stirrer	IKA-Werke GmbH & Co. KG (,DE)	Ident. No.: 0010011496
MestReNova sofeware	Mestrelab Research (Spain)		Version 12
Micromeritics Tristar surface area analyzer	Thermo Fisher Scientific Inc	ASAP 2020 Plus
Mini centrifuge	Eppendorf Nordic (Hørsholm, DK)	Catalog No. 5452000010
Mouse serum	Innovative Research (Novi, MI, US)	IGMSCD1SER10ML
Muffle furnace	Nabertherm GmbH (Bremen, DE)	Muffle furnace LE 6/11
N,N′-dimethylformamide (99.9%)	VWR International (Søborg, DK)	250131a008
Nanodrop 2000c equipment	Thermo Fisher
Nuclear magnetic resonance	Bruker (Billerica, US)
O2 meter	PreSens (Regensburg, Germany)
Origin 2022 software	OriginLab Corporation (MA, USA)		Version 2022
Oxygen sensor	PreSens (Regensburg, DE)	OXY-1 ST trace
Phosphate buffered saline	Merck Life Science A/S (Søborg, DK)	P4417-50TAB
Platereader	Tecan Group Ltd.  (Männedorf, CH)
Potassium hexacyanoferrate	Merck Life Science A/S (Søborg, DK)	60299-100G
Potassium hydroxide	Merck Life Science A/S (Søborg, DK)	221473-500G
Powder X-ray diffraction	Malvern Panalytical Ltd., (Malvern, UK)		Model: Malvern Panalytical Aeris Research 600W XRD for powder measurements (Released 2020)
Round bottom pressure vessel	Merck Life Science A/S (Søborg, DK)	SYNP170004-1EA
Scanning electron microscopy	FEI Company (Hillsboro, US)	Dual Beam FEI Helios Nanolab 600
sodium cloride	Merck Life Science A/S (Søborg, DK)	71376
Sodium dithionite	Merck Life Science A/S (Søborg, DK)	71699-250G
Sodium dodecyl sulfate	Merck Life Science A/S (Søborg, DK)	L4509-100G
Synthware™ round bottom pressure vessel	Merck Life Science A/S (Søborg, DK)	SYNP170003
Tert-butyl nitrite	Merck Life Science A/S (Søborg, DK)	20370-100ml-F
Tetrahydrofuran (99.7%)	VWR International (Søborg, DK)	201022A004
Thermoshaker	Grant Instruments (Cambridge) Ltd (UK)	PHMT-PSC18 (01012015020119)
Transmission electron microscopy	FEI Company (Hillsboro, US)	FEI Tecnai T20
Trimethylsilyl azide	Merck Life Science A/S (Søborg, DK)	155071-10G
TSC HEMOX DAQ System	TSC Scientific Crp (PA, USA)		Hemox analyzer software
Ultrosound sonicator	Branson Ultrasonics Corporation (Danbury, US)	SKU: 2410240003
UV-Vis spectrophotometer	Shimadzu (Kyoto, JP)
Vacuum oven	Thermo Fisher Scientific Inc (Massachusetts, US)
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical Ltd., (Malvern, UK)	Serial NO.MAL1188530
Zirconium(IV) chloride	Merck Life Science A/S (Søborg, DK)	357405-100G