Efficiënte isolatie van vetweefselstamcellen en adipocyten uit varkensvet vetweefsel

Samenvatting

Hier presenteren we een standaardmethode om effectief stamcellen en adipocyten van vetweefsel te isoleren, gekenmerkt door >90% vermindering van verwerkingstijd, hoge cellevensvatbaarheid en brede compatibiliteit.

Samenvatting

Adipose-afgeleide stamcellen (ADSC's) zijn uitgegroeid tot ideale zaadcellen in regeneratieve geneeskunde vanwege hun overvloedige bronnen, minimaal invasieve oogst, multi-lineage differentiatiepotentieel en immunomodulerende eigenschappen. Hun toepassingen omvatten weefselreparatie, ziektemodellering en celtherapie; echter, efficiënte isolatie van ADSC's met hoge levensvatbaarheid blijft cruciaal voor het bevorderen van onderzoek en klinische vertaling. Conventionele isolatiemethoden, zoals enzymatische vertering gecombineerd met mechanische dissociatie via pipetten, worden beperkt door lange verwerkingstijden (1–3 uur), slechte cellevensvatbaarheid (vaak <70%) en aanzienlijke variabiliteit per batch, wat de experimenten later in gevaar brengt.

Hier presenteren we het SoniConvert-systeem (een mechanisch golfgebaseerd celscheidingssysteem), dat mechanische golf- en enzymatische vertering combineert om deze uitdagingen aan te pakken. Het systeem integreert een op microprocessor gebaseerde besturingsunit die mechanische golfgemedieerde dissociatie reguleert via digitale feedback, samen met een weefselspecifiek losmakend reagens geoptimaliseerd voor vetweefsel (5–15 minuten incubatie). Deze benadering maakt snelle omzetting van weefsel naar een single-cell suspension mogelijk, waarbij mechanische dissociatie in 3–9 seconden wordt voltooid.

Het systeem biedt drie voordelen: (1) ultrasnelle verwerking, waarbij het kernisolatieproces—van enzymatische vertering tot initiële celfractiescheiding—in ongeveer 30 minuten wordt voltooid (>90% reductie vergeleken met conventionele methoden); (2) behoud met hoge levensvatbaarheid, waarbij trypanblauwe kleuring de cellen van 80–95% bevestigt, wat traditionele protocollen overtreft; en (3) brede compatibiliteit, aangezien de resulterende single-cell suspenties voldoen aan de eisen voor primaire celkweek, flowcytometrie, cytotoxiciteitstests en de constructie van vetorganoïden. Door de verwerkingstijd te verkorten, de celintegriteit te verbeteren en variabiliteit te beperken, biedt dit systeem een praktisch platform voor vetgerelateerd onderzoek.

Inleiding

Vet-afgeleide stamcellen (ADSC's), een cruciale subset van mesenchymale stamcellen (MSC's) die uit vetweefsel worden geïsoleerd, vertonen aanzienlijk therapeutisch potentieel dankzij hun toegankelijkheid, minimaal invasieve oogst, robuuste proliferatieve capaciteit, multilineage-differentiatiepotentieel en krachtige paracriene en immunomodulerende eigenschappen 1,2,3,4 . Deze eigenschappen hebben ADSC's gepositioneerd als veelbelovende kandidaten voor regeneratieve geneeskunde, weefseltechnologie en immunotherapie. De translationele bruikbaarheid van ADSC's hangt echter af van het vermogen om functioneel intacte, hoogzuivere populaties te isoleren—een proces dat technisch uitdagend blijft. De unieke biologie van vetweefsel brengt twee belangrijke obstakels met zich mee: (1) het hoge lipidengehalte van adipocyten maakt ze vatbaar voor scheuren tijdens mechanische verwerking, waarbij vrije lipiden vrijkomen die de stromale vasculaire fractie (SVF) besmetten en de levensvatbaarheid van cellen aantasten, wat ^5,6 oplevert; en (2) de structurele complexiteit van het weefsel, bestaande uit fascia, endotheelcellen, immuuncellen en bloedcomponenten⁷, bemoeilijkt de scheiding van vetcellen. Deze beperkingen onderstrepen de dringende noodzaak van een efficiënte, snelle en levensvatbaarheidsbehoudende methode om hoogwaardige ADSC's en adipocyten te isoleren, die even cruciaal zijn voor downstream-toepassingen zoals het modelleren van metabole ziekten en celgebaseerde therapieën.

Er zijn momenteel verschillende gevestigde methoden beschikbaar voor het isoleren van vetcellen, waaronder enzymatische vertering, explantcultuur en mechanische scheiding ^8,9,10. Enzymatische vertering, de meest gebruikte methode, gebruikt collagenase om extracellulaire matrix (ECM)-componenten af te breken, waardoor ingekapselde stamcellen vrijkomen. Deze methode omvat doorgaans het hakken van weefsels, collagenase-vertering (37 °C, 1–2 uur), SVF-isolatie via centrifugatie en zuivering van hechtende kweek. Hoewel effectief voor de afbraak van ECM, kent enzymatische vertering aanzienlijke nadelen: een verlengde verwerkingstijd (in totaal 3–4 uur), afhankelijkheid van grote monstervolumes en risico's op enzymatische cytotoxiciteit of batch-tot-batch variabiliteit door dierlijke collagenases—die allemaal de klinische vertaling belemmeren. Explantcultuur, die gebruik maakt van stamcelmigratie uit weefselfragmenten, levert cellen op met bewaarde levensvatbaarheid maar lijdt aan een lage doorvoer en vertraagde celherstel (7–10 dagen). Mechanische dissociatie, die afhankelijk is van fysieke verstoornis (bijv. oscillatie, afschuiving), verkort de verwerkingstijd maar ondermijnt vaak de celintegriteit, wat leidt tot verminderde levensvatbaarheid en onzuivere populaties. Gezamenlijk slagen deze methoden er niet in efficiëntie, zuiverheid en levensvatbaarheid te verzoenen—cruciale criteria voor celisolatie van klinische kwaliteit. Daarom stellen we een nieuwe methode voor om vetcellen (adipocyten en ADSC's) te isoleren, waarbij enzymatische vertering wordt gecombineerd met mechanische golfgemedieerde dissociatie¹¹. Deze aanpak bereikt twee belangrijke vooruitgang: (1) tijdsefficiëntie: door vooraf geoptimaliseerde, diervrije enzymcocktails te combineren met laagfrequente mechanische golven, wordt de totale verwerkingstijd verkort van 3–4 uur naar ~30 minuten (Figuur 1); (2) levensvatbaarheidsbehoud: zachte mechanische dispersie minimaliseert adipocytenruptuur en lipideafgifte. Belangrijk is dat de 30 minuten tijdsbestek verwijst naar de kernisolatieworkflow (vertering, mechanische dissociatie, filtratie en initiële centrifugatie) om ruwe adipocyt- en SVF-fracties te verkrijgen; optionele downstream zuiveringsstappen, zoals rode bloedcellen (RBC) lyse, vereisen extra verwerkingstijd.

Onze geoptimaliseerde methode voor het isoleren van vetcellen toont aanzienlijk potentieel voor toepassing in meerdere onderzoeks- en klinische domeinen. In fundamenteel onderzoek vertonen de verkregen cellen met hoge levensvatbaarheid uitzonderlijke prestaties in adipogene en osteogene differentiatiestudies, wat een betrouwbare celbron biedt voor toepassingen in weefseltechnologie. In de translationele geneeskunde hebben klinische studies het therapeutisch potentieel van ADSC's aangetoond bij de behandeling van aandoeningen zoals artrose¹², hart- en vaatziekten¹³, multiple sclerose¹⁴ en inflammatoire darmziekte (IBD)/de ziekte van Crohn¹⁵. De snel geïsoleerde ADSC's dienen als ideale bouwstenen voor het construeren van vetweefselorganoïden en het implementeren van celtherapietoepassingen, wat onderzoek naar geneesmiddelenscreening en ziektemodellering aanzienlijk vooruit helpt. Bovendien zijn hoogwaardige single-cell suspensies geschikt voor single-cell RNA-sequencing. Concluderend creëert deze geïntegreerde aanpak een robuust technologisch platform voor vetweefsel, dat zowel fundamenteel onderzoek als klinische toepassing in regeneratieve geneeskunde ondersteunt.

Protocol

Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Reglementen voor het Beheer van Zaken betreffende Proefdieren (Ministerie van Wetenschap en Technologie, China, herzien in maart 2017), en goedgekeurd door de Commissie Ethiek en Welzijn van de Landbouwuniversiteit van Sichuan (Toestemmingsnummer: 20230089). Dit protocol vereist het gebruik van het SoniConvert-systeem, een commercieel verkrijgbaar apparaat voor mechanische golfondersteunde weefseldissociatie (hierna aangeduid als het mechanische dissociatiesysteem). Het protocol is geoptimaliseerd voor varkensvetweefsel, en de afhankelijkheid van deze gespecialiseerde apparatuur is een belangrijke beperking.

1. Verzameling en voorbereiding van vetweefsel

1. Preoperatieve desinfectie en haarverwijdering
   1. Euthanaser het varken door een intraveneuze overdosis pentobarbital natrium (100 mg/kg lichaamsgewicht). Bevestig de dood vóór weefselafname.
   2. Breng steriel gaas aan dat is doordrenkt met 2% jodoforen voor spiraaldesinfectie van de varkensrug, die 15 cm vanaf de middenlijn uitsteekt. Laat het 30 seconden drogen.
   3. Gebruik een steriel scheermes om het haar te scheren vanaf een gebied van 16 cm × 8 cm. Zorg ervoor dat al het haar uit het operatiegebied wordt verwijderd.
   4. Veeg de achterkant 2x af met 75% ethanol met steriel gaas.
2. Verzameling vetweefsel
   1. Maak een dwarsdoorsnede van 20 cm langs de dorsale middenlijn met een steriel scalpel.
   2. Tilt de rand van de incisie op met een steriele pincet. Dissectie langs het natuurlijke vlak tussen het vetweefsel en de dermis om een volledige bovenste laag van subcutane vetweefsel (ULB) van ongeveer 2–3 mm dik te verkrijgen.
   3. Spoel de ULB één keer af in ijskoude, steriele zoutoplossing en plaats het in een steriele kweekschaal (Figuur 2).

Figuur 2: Verzameling van pig ULB voor celisolatie. (A) Illustratie van de structuur van vetweefsel op de rug van varkens; (B) Sneedplaats van Bama-minivarken; (C) Presentatie van rugvetweefsel, pigback subcutane vetlaag bevat twee lagen, de bovenste laag (ULB) en de binnenste laag (ILB); (D) Verzamelde ULB. Afkorting: ULB = bovenste laag van de rug; ILB = binnenste laag van de rug. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Pauzepunt: Het verzamelde vetweefsel kan korte tijd in ijskoude, steriele zoutoplossing of D-Hanks-oplossing bij 4 °C worden bewaard voordat verdere dissectie wordt uitgevoerd.
OPMERKING: Het doel is het verzamelen van de ULB. Vermijd het toevoegen van de onderste laag van rug subcutane vetweefsel (ILB) tijdens de dissectie.

3. Vetweefseldissectie en reiniging
   1. Voeg 10 ml ijskoude D-Hanks Buffer toe voor elke 1,8 g weefsel aan de schaal en zorg ervoor dat het weefsel volledig ondergedompeld is.
   2. Identificeer en verwijder alle zichtbare bloedvaten uit het weefsel met behulp van een steriele chirurgische schaar. Verwijder bindweefsel en fibrotische componenten. Gooi de verwijderde materialen weg in aangewezen biohazard-containers.
      OPMERKING: Wees uiterst voorzichtig bij het hanteren van scherpe voorwerpen; Snijd altijd van het lichaam af en gooi gebruikte messen en schaaren direct na gebruik in scherpe bakjes weg.
   3. Spoel het weefsel in de D-Hanks Buffer af om restbloed en vuil te verwijderen.
      OPMERKING: Voor monsters met overmatig hematoom, vervang de buffer 1–3 keer indien nodig om visuele helderheid te bereiken. Houd alle dissectiestappen op ijs om de levensvatbaarheid van het weefsel te behouden.
4. Vetweefselmechanische dissociatie
   1. Breng 1,8 g van de gespoelde weefselfragmenten over in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 mL. Voeg 800 μL van A-type Tissue Dissociation Buffer (A-Buffer) toe aan de buis.
   2. Met steriele oogscharen snijdt u het weefsel in de buis in kleine stukjes van ongeveer 1–2 mm³ groot.
      OPMERKING: Als er aanzienlijke lipidenlekkage wordt waargenomen tijdens of na het fijnhakken, was het weefsel dan opnieuw met 1 ml voorgekoelde D-Hanks-oplossing voordat je overgaat tot enzymatische vertering om lipiden uit gebroken adipocyten te verwijderen. Deze stap behoudt de integriteit van adipocyten voor downstream analyse.

2. Celisolatie en homogenisatie

1. Enzymatische verwerking
   1. Voeg 200 μL van het A-type weefseldissociatiemiddel (A-type oplossing) toe aan een nieuwe microcentrifugebuis. Draai en schud de buis voorzichtig met de hand 3 keer om de inhoud te mengen en ervoor te zorgen dat de vetfragmenten volledig in de dissociatieoplossing zijn ondergedompeld.
   2. Controleer of de buisdop goed gesloten is. Plaats de buis in een metalen bad van 37 °C en laat het 5–10 minuten incuberen.
      OPMERKING: Houd de oplossing in de gaten totdat deze troebel wordt en de weefselfragmenten gedeeltelijk verteerd lijken. De A-type oplossing bevat collagenase en neutrale protease. Draag nitril handschoenen, een laboratoriumjas en veiligheidsbril bij het hanteren. Vermijd huidcontact; Als er blootstelling is, spoel dan onmiddellijk 15 minuten met veel water. A-Buffer wordt niet verwijderd na toevoeging van A-Type Solution.
2. Ultrasonisch geassisteerde mechanische dissociatie
   1. Breng de gedeeltelijk verteerde vetweefselfragmenten samen met de omringende buffer van de microcentrifugebuis over in een steriele 1,5 mL microcentrifugebuis die is bestemd voor het mechanische dissociatiesysteem.
   2. Voer het vooraf ingestelde programma uit voor vetweefsel in het mechanische dissociatiesysteem om mechanische dissociatie uit te voeren met behulp van een 200 Hz sinusgolf.

3. Filtratie om een single-cell suspension te verkrijgen

1. Filtratie en centrifugatie
   1. Verzamel de celsuspensie en voer deze door een 200 μm celzeef in een nieuwe 50 mL centrifugebuis om grote resten en onverteerde weefselklonten te verwijderen.
   2. Voeg 5 ml voorgekoelde (4 °C) D-Hanks-oplossing toe aan de zef. Spoel de zeef twee keer af met de D-Hanks-oplossing om de celopbrengst te maximaliseren.
   3. Centrifugeer de gefilterde celsuspensie bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
      Pauzepunt: Na centrifugatie kan de celsuspensie onmiddellijk worden verwerkt of korte tijd op ijs worden gehouden voordat de laag wordt gescheiden.
   4. Adipocytenverzameling: Om de adipocyten te verzamelen, aspiratief en verwijder je de supernatante lipidenlaag met een steriele pasteurpipet, waarbij 1 ml buffer overblijft om de adipocytlaag te beschermen. Verzamel de tweede laag voor downstream analyse van de adipocyten. Vermijd het verstoren van de derde en vierde laag.
   5. SVF (stromale vasculaire fractie) verzameling: Na het verwijderen van de bovenste lagen wordt de onderste pellet met de stromale vasculaire fractie (SVF) voorzichtig opnieuw opgehangen in 1 mL D-Hanks/PBS. Suspendeer de celpellet voorzichtig opnieuw in 1 mL D-Hanks/PBS om een celconcentratie van 2–5 × 10^{6 cellen} /mL te bereiken.
      OPMERKING: Idealiter kunnen na centrifugeren vier lagen worden waargenomen: de lipidenlaag aan de bovenkant; de tweede laag bevat adipocyten; de derde is de hydrofiele bufferlaag; en de onderste laag is de SVF, die stamcellen bevat (Figuur 1).
2. RBC-lyse
   1. OPMERKING: Als de celpellet een significant rood tintje vertoont, wat wijst op besmetting met rode bloedcellen, voer dan een rode bloedcel-lyse uit.
      Sussief de celpellet opnieuw in 1–3 mL rode bloedcel (RBC) lysisbuffer met een P1000-pipet met brede boringen. Broed 15 minuten op ijs met af en toe mengen.
   2. Koel alle oplossingen en centrifugerotors vooraf tot 4 °C om de metabole activiteit tijdens de verwerking te minimaliseren.
   3. Centrifugeer op 500 × g gedurende 10 minuten op 4 °C. Aspireer het supernatant volledig.
   4. Was de cellen nogmaals door de pellet opnieuw te suspenderen in 5 mL voorgekoelde D-Hanks-oplossing en centrifugeer op 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
3. Definitieve ophanging
   1. Suspendeer de eindcelpellet opnieuw in D-Hanks/PBS voor downstream toepassingen.

4. Downstream toepassingen en analyse

1. SVF-cellevensvatbaarheid en celopbrengstbeoordeling
   1. Bereid de SVF-celsuspensie voor die is verkregen in een 1,5 mL microcentrifugebuis. Houd de suspense op ijs tot gebruik.
   2. Meng 10 μL SVF-celsuspensie met 10 μL 0,4% Trypan Blue-oplossing in een steriele microcentrifugebuis van 0,5 mL. Pipetteer voorzichtig 3 keer omhoog en omlaag om een gelijkmatige menging te garanderen.
      OPMERKING: De uiteindelijke concentratie Trypan Blue in het mengsel is 0,2%. Vermijd het toevoegen van luchtbellen tijdens het mengen, omdat deze de automatische celtelling kunnen verstoren.
      Breng 10 μL van het gekleurde celmengsel over naar een telglaasje dat geschikt is voor de geautomatiseerde celteller. Zorg ervoor dat het monster de kamer volledig vult zonder overloop.
   3. Steek de telglijbaan in de celteller. Selecteer het type Trypan Blue assay en pas indien nodig het celconcentratiebereik aan.
   4. Druk op de Count-knop om automatisch celtellen te starten. Het instrument maakt beelden van de telkamer en onderscheidt automatisch levende cellen van dode cellen.
   5. Noteer het percentage cellevensvatbaarheid en tel het totale aantal levensvatbare cellen dat op het instrumentscherm wordt weergegeven. Voer drie onafhankelijke metingen uit voor elk monster en bereken de gemiddelde levensvatbaarheid en de celopbrengst per gram vetweefsel.
      OPMERKING: Maak na elk gebruik de telglaa-slide en de laadpoort van het instrument schoon met 70% ethanol om kruisbesmetting tussen monsters te voorkomen.
2. Observatie van adipocytenmorfologie
   1. Kleur de geïsoleerde adipocyten met 5 μg/mL Hoechst voor kernen en 1 μM BODIPY voor lipiden in D-Hanks/PBS gedurende 15 minuten bij 37 °C.
      Pauzepunt: Na het kleuren moeten de monsters snel worden afgebeeld; indien nodig kunnen ze bij 4 °C korte tijd voor de microscopie worden beschermd tegen licht.
   2. Gebruik een zelfgemaakt, adipocytenvriendelijk glassysteem met slide-cover voor de preparatvoorbereiding om te voorkomen dat de cellen worden samengedrukt.
   3. Bekijk de kernen (gekleurd met Hoechst) en lipidedruppels (gekleurd met BODIPY) onder een fluorescentiemicroscoop.
      OPMERKING: Door de grote omvang (20–300 μm) en het hoge lipidengehalte zijn adipocyten fragiel, drijven ze vaak en stapelen ze zich op in meerdere lagen, waardoor conventionele montagemethoden ongeschikt zijn voor heldere microscopische observatie (Figuur 3A). Om dit aan te pakken werd een zelfgemaakt, adipocytvriendelijk montagesysteem ontwikkeld met standaard slides en coverslips (Figuur 3B).
3. Zuivering van stromale vasculaire componenten en morfologische observatie van ADSC's
   1. Zaad de vers geïsoleerde SVF in een T25-celkweekfles met 5 mL DMEM, aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Incubeer bij 37 °C met 5% CO₂.
   2. Na 48 uur was je de kolf voorzichtig twee keer met vooropgewarmde PBS om niet-hechtende cellen te verwijderen. Voeg verse kweekmedium toe en ga door met incuberen.
   3. Vervang het kweekmedium elke 2–3 dagen. Monitor de celmorfologie en samenvloeiing onder een omgekeerde microscoop.
   4. Wanneer de cellen 80–90% confluentie bereiken (meestal na 7–10 dagen), scheid je de cellen af met 0,25% trypsine-EDTA gedurende 3–5 minuten bij 37 °C. Neutraliseer met kweekmedium en verzamel de celsuspensie.
   5. Voer Trypan Blue-kleuring uit om de levensvatbaarheid van de cel te detecteren voordat FACS wordt gedetecteerd en sorteerd.
   6. Observeer de morfologie van de gezuiverde gekweekte ADSC's onder een optische microscoop.
   7. Filter de verzamelde celsuspensatie door een 70 μm celzeef om eventuele resterende aggregaten te verwijderen. Sussen de cellen in PBS met 2% FBS opnieuw voor FACS-analyse.
   8. Kleur de cellen met fluorochroom-geconjugeerde antilichamen tegen CD73, CD90, CD11b en CD45 gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker.
   9. Was de cellen twee keer met een kleuringsfilter en sussen opnieuw in PBS met 2% FBS.
   10. Voer flowcytometrische analyse uit met een 70 μm nozzle bij 20 psi en een debiet onder 3,0.
   11. Sluit celafval uit door de hoofdpopulatie te gateren met behulp van voor-verstrooide gebied (FSC-A) en zij-verstrooiingsgebied (SSC-A) parameters.
   12. Verwijder doublets via FSC-A versus FSC-H gating en selecteer de levensvatbare singletpopulatie voor downstream analyse.
   13. Analyseer geactiveerde cellen op basis van de expressie van oppervlaktemarkers. Gebruik CD73 en CD90 als positieve markers en CD11b en CD45 als negatieve markers om het ADSC-fenotype te verifiëren.
   14. Observeer de morfologie van de verrijkte en gekweekte ADSC's onder een optische microscoop. Kenmerkende spoelvormige, fibroblastachtige morfologie wijst op succesvolle ADSC-verrijking.
4. ADSC adipogene differentiatie
   1. Zaad de derde generatie ADSC's met een dichtheid van 1 × 10⁴ cellen/^cm2. Wanneer celconfluentie ongeveer 90% bereikt, start adipogene inductie.
   2. Bereid het adipogene inductiemedium voor met behulp van het gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) van Dulbecco met een hoog glucosegehalte dat 10% foetaal rundserum (FBS), 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 1 μM dexamethason, 10 μg/mL insuline en 1 μM rosiglitazon bevat.
   3. Na 3 dagen inleiding vervang je het medium door onderhoudsmedium en vervang je de oplossing elke 2 dagen.
   4. Na 14 dagen inductie kleurt u de cellen met Oil Red O en observeert u de lipidendruppels onder een omgekeerde microscoop.
5. ADSC-osteogene differentiatie
   1. Wanneer celconfluentie 80–90% bereikt, begint de osteogene inductie. Formuleer het osteogene inductiemedium met een high-glucose DMEM dat 10% FBS, 10 mM β-glycerofosfaat, 50 μg/mL ascorbinezuur, 10 μM calcitriol en 1 μM dexamethason bevat.
   2. Vervang het medium elke 2–3 dagen en zet het inductieproces ongeveer 14 dagen voort.
   3. Kleur de cellen met 2% Alizarin Red S (pH 5,2) en observeer ze onder een omgekeerde microscoop.
6. Organoïde constructie en identificatie
   1. Bereid een single-cel suspension van ADSC's voor in een compleet kweekmedium en pas de celconcentratie aan op 2 × 10⁴ cellen/20 μL.
   2. Draai het deksel van een 100 mm kweekschotel om en doseer 20 μL druppels celsuspensie op het binnenoppervlak van het deksel.
   3. Voeg steriele PBS toe aan de bodem van de schaal om de luchtvochtigheid te behouden, dek het deksel zorgvuldig af en bevrucht de hangende druppels onder standaard kweekomstandigheden.
   4. Let dagelijks op de druppels en laat de cellen zich samenvoegen en sferoïden vormen gedurende 6 dagen.
   5. Verzamel de sferoïden voorzichtig met een pipet en breng ze over in voorgekoelde Matrigel op ijs.
   6. Inbed de sferoïden in Matrigel en plat het mengsel in kweekplaten voordat je het onder standaard kweekomstandigheden incubeert.
   7. Vervang het medium regelmatig en monitor de groei van organoïden tot dag 18–28, wanneer de structuren compact en volwassen worden.
   8. Fixeer de organoïden met 4% paraformaldehyde, permeabiliseer ze met 0,1% Triton X-100, en blokkeer niet-specifieke binding met 5% BSA.
   9. Incubeer de monsters met primaire antilichamen tegen CD73, CD90, CD11b en CD45, en incubeer ze vervolgens met de bijbehorende fluorescerende secundaire antilichamen.
   10. Kleur de organoïden met Hoechst en BODIPY om respectievelijk kernen en lipidedruppels te visualiseren en observeer de gekleurde monsters onder een fluorescentiemicroscoop.
       OPMERKING: Voer celsortering en alle manipulaties uit met open culturen, inclusief zaaien, voeding en kleuringsvoorbereiding, onder strikte aseptische omstandigheden in een bioveiligheidskast.

Resultaten

Figuur 1: Schematische illustratie van het door vetweefsel afgeleide celisolatieproces. Het diagram toont de traditionele methode en de huidige methode als illustratieve workflows. Er zijn drie hoofdstappen bij het isoleren van vetcellen: de eerste is voorbehandeling; de tweede is het dissociëren van vetweefs...

Discussie

De huidige studie introduceert een nieuwe geïntegreerde benadering voor het isoleren van vetweefselafgeleide cellen (voornamelijk adipocyten en ADSC's) die kritieke beperkingen van conventionele methoden aanpakt. Door weefselspecifieke enzymatische losmaking te combineren met precisie-mechanische golfdissociatie, bereikt dit systeem snelle (totale verwerkingstijd ~30 min), hoge levensvatbaarheid (80–95%) en reproduceerbare celisolatie.

Conventionele enzymatisc...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
A Type Tissue Dissociation Kit	Docsense	TM001	Bevat A Type Tissue Dissociation Agent (A-Type Solution) en A Type Tissue Dissociation Buffer (A-Buffer).
Adipogenic Differentiation Medium Kit	OriCell	GUXMD-90031	Gebruikt voor adipogene differentiatie, inclusief high-glucose Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (ongemodificeerd) en onderhoudsmedium
Alizarin Red S	OriCell	A5533ALIR-10001	Mineralisatiekleuring voor osteogene differentiatie(pH 5.2)
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	L-Ascorbinezuur, getest voor celkweek, voor osteogene inductie
Bama minipigs	Chengdu Dossy Experimental Animals Co.,Ltd		Een jaar oud, mannelijk, SPF-graad dieren die worden onderhouden volgens gestandaardiseerde vaccinatie-, ontwormings- en schoonmaakprocedures.https://www.cd-dossy.cn/animalpl_detail/12606067609851863 04.html
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad Laboratories	1450011	Automatische celteller voor levensvatbaarheid en opbrengstbeoordeling
BODIPY	Thermo Fisher Scientific	D3922	Neutraal lipidestijn
BSA (5%)	Sigma-Aldrich	A9418	Bovien serumalbumine, gelyofiliseerd poeder, voor blokkering
Calcitriol	Sigma-Aldrich	C9756	1α,25-Dihydroxyvitamin D3, voor osteogene inductie
cell sieve (70 μm)	Corning	352350	Falcon 70 μm celzevener, steriele, voor FACS-voorbereiding
cell strainer (200 μm)	pluriSelect	43-50200-03	pluriStrainer, PET-masche, past op 50 mL buizen, steriele
centrifuge tube (50 mL)	Corning	352098	Falcon 50 mL hoge helderheid kegelbuis, steriele, polypropyleen
Counting slide (for Bio-Rad TC20)	Bio-Rad Laboratories	1450011	Dual-kamer telplaat voor TC20 geautomatiseerde celteller
culture dish (100 mm)	Corning	430167	Steriele polystyreen schaal, voor hangende druppel organoïdvorming
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902	≥98%, voor adipogene en osteogene inductie
D-Hanks Balanced Salt Solution or PBS	Gibco	10010015	Voorgekoeld tot 4 °C, pH 7.4.
DMEM	Gibco	11965084	Dit wordt gebruikt voor verse geïsoleerde SVF-kweek
DNase I	Beyotime	D7073	Optioneel, aanbevolen als er clumping wordt waargenomen.
ethanol	Sigma-Aldrich	459836	75% voor oppervlaktedesinfectie.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	A4736201	Tet systeem goedgekeurd, Amerikaanse oorsprong, steriele
Flow Cytometer	BD Biosciences	BD FACSCanto II	3 lasers (405 nm, 488 nm, 633 nm), 8 fluorescentiekanalen, voor oppervlaktemarker analyse (CD73, CD90, CD11b, CD45), voldoet aan 70 m mondstukvereiste bij 20 psi
fluorescence microscope	Olympus		Invert of rechtopstaand model in staat om FITC en DAPI filter sets.
Fluorescent secondary antibodies	Thermo Fisher Scientific	A-11001 (anti-muis), A-11008 (anti-konijn)	Alexa Fluor geconjugeerd, voor immunofluorescentie
Fluorochrome-conjugated antibodies (CD73, CD90, CD11b, CD45)	BD Biosciences	561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45)	Voor flowcytometrische analyse van ADSC fenotype
Hoechst	Thermo Fisher Scientific	H3570	Kernkleuring voor levende/dode celbeoordeling.
IBMX	Sigma-Aldrich	I5879	≥99% (HPLC), voor adipogene inductiemedium
Ice-cold sterile saline	Baxter	2F7124	0,9% natriumchloride-injectie, USP, voor het spoelen van weefsel
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	Recombinant, uitgedrukt in gist, voor adipogene inductie
iodophor	Sigma-Aldrich	25104	2% desinfectieoplossing.
Matrigel	Corning	354230	Met verminderde groeifactoren, fenolroodvrij, voor het inbedden van sferoïden
Metal Bath	Servicebio	SMB-H	Gebruikt voor incubatie bij 37 °C.
Oil Red O	OriCell	OILR-10001	Lipidekleuring voor adipocytendifferentiatie
optical microscope	Olympus		Standaard helderveldmicroscoop met 10x–40x objectieven.
Osteogenic Differentiation Medium Kit	OriCell	GUXMD-90021	Gebruikt voor osteogene differentiatie, inclusief high-glucose Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (ongemodificeerd) en onderhoudsmedium
P1000 pipette with wide-bore tips	Beckman Coulter	B01113	Biomek P1000 Span-8 wide bore tips, steriele
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Fisher Scientific	J61899	Waterige oplossing, voor het fixeren van organoïden
pasteur pipette	Corning	7095S-5C	Steriele, wegwerp.
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070063	10.000 U/mL penicilline, 10.000 μg/mL streptomycine, steriele
Pentobarbital sodium	Hikma Pharmaceuticals USA Inc.	242