Hier presenteren we een protocol voor het evalueren van de synergetische activiteit van fosfomycine in combinatie met ceftriaxon, meropenem en gentamicine tegen carbapenemresistente Escherichia coli-isolaten met behulp van de agarverdunningsmethode. Synergie werd waargenomen met meropenem en gentamicine, maar niet met ceftriaxon.
Reviewartikel
Protocol voor agarverdunningsanalyse van Osfomycine-gebaseerde antibioticacombinaties tegen carbapenemresistente Escherichia coli
Opent in een nieuw tabblad
In dit artikel
Samenvatting
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Samenvatting
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Door de beperkte behandelmogelijkheden voor carbapenemresistente enterobacteralen hebben combinatietherapieregimes steeds belangrijker gewonnen. Deze studie had als doel fosfomycineresistentiesnelheden te onderzoeken en de in vitro synergetische interacties van fosfomycine in combinatie met meropenem, gentamicine en ceftriaxon te evalueren tegen carbapenem-resistente Escherichia coli-isolaten . Zestig carbapenem-resistente E. coli-stammen , geïsoleerd uit diverse klinische monsters (urine, bloed, aspiratie, wond, hersenvocht, endotracheale aspiratie) afkomstig van patiënten op klinische afdelingen en intensive care-afdelingen van Dicle University Medical Faculty Hospitals, werden in de studie opgenomen. Soortidentificatie werd uitgevoerd met een geautomatiseerd microbieel identificatiesysteem. Antibiotica-gevoeligheidstesten en bevestiging van carbapenemresistentie werden uitgevoerd door schijfdiffusie met ertapenem, imipenem en meropenem. Fosfomycineresistentie en interacties tussen antibiotica werden beoordeeld door agarverdunning. Daarnaast werden antibioticacombinaties geëvalueerd over seriële tweevoudige concentratiegradiënten met behulp van het agar-verdunningsgebaseerde protocol, en werden fractionele inhiberende concentratie-indices (FICI) berekend om synergie, onverschilligheid of antagonisme te bepalen. De resistentiepercentages waren 76,6% voor fosfomycine, 61,6% voor meropenem, 85,0% voor gentamicine en 98,3% voor ceftriaxon. Synergetische interacties werden waargenomen in 35% van de isolaten voor de fosfomycine–meropenem-combinatie, 33,4% voor de fosfomycine–gentamicine-combinatie en 1,7% voor de fosfomycine–ceftriaxon-combinatie. Antagonisme werd slechts in één isolaat in de fosfomycine–meropenem-combinatie aangetroffen. Combinaties van fosfomycine met meropenem en gentamicine toonden in vitro synergetische activiteit tegen carbapenem-resistente E. coli. Verdere in vitro studies zijn nodig om deze bevindingen te bevestigen.
Inleiding
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
De familie Enterobacterales bestaat uit een zeer diverse groep gramnegatieve bacillen, waarvan vele van aanzienlijk klinisch belangzijn 1. Onder hen is Escherichia coli de meest geïsoleerde soort in klinische microbiologische laboratoria en wordt het sterk geassocieerd met infecties die bijna alle orgaansystemen aantasten, waaronder urineweginfecties, wondinfecties, longontsteking bij immuungecompromitteerde patiënten, gastro-enteritis en neonatale meningitis. Het is ook een belangrijke oorzaak van gramnegatieve sepsis en door endotoxine gemedieerde septische shock. Naast de menselijke geneeskunde is E. coli ook een belangrijk veterinair pathogeen dat respiratorische en systemische infecties veroorzaakt bij verschillende diersoorten, waaronder paarden, waardoor het gastheergebied van E. coli-pathogenese wordt uitgebreid tussen menselijke en dierlijke gastheren2,3,4.
Extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producerende enterobacterales, met name E. coli en Klebsiella pneumoniae, zijn in verband gebracht met verhoogde sterfte, langdurige ziekenhuisopname en hogere zorgkosten. Het wijdverbreide gebruik van antibiotica is een belangrijke drijfveer van multidrug resistentie (MDR) onder deze organismen1. Resistentiemechanismen omvatten de productie van carbapenemase, ESBL's, aminoglycoside-modificerende enzymen (AME's), mutaties die quinolonresistentie geven, en veranderingen in porine- en effluxsystemen. Bij E. coli en Klebsiella pneumoniae is resistentie voornamelijk plasmid-gemedieerd, wat horizontale genoverdracht faciliteert. Dergelijke resistentiekenmerken worden ook steeds vaker gerapporteerd bij E. coli van dierlijke oorsprong, waaronder rundvleesisolaten, wat het One Health-concept ondersteunt en wijst op een potentieel zoönotisch transmissierisico 2,3.
Carbapeneems worden beschouwd als laatste-lijn middelen voor ernstige multiresistente infecties. Echter, carbapenemresistente enterobacteralen (CRE) zijn uitgegroeid tot een groot wereldwijdgezondheidsprobleem. Deze resistentie wordt voornamelijk gemedieerd door carbapenemasen, waaronder klasse B metallo-beta-lactamasen, die bijdragen aan uitgebreid geneesmiddelresistente en panresistente fenotypes5.
MDR E. coli-stammen beperken de therapeutische opties aanzienlijk en bemoeilijken infectiebeheer. Dit onderstreept de noodzaak van alternatieve behandelstrategieën zoals combinatietherapieën om de klinische uitkomsten te verbeteren. Bovendien worden deze resistente stammen steeds vaker gerapporteerd, niet alleen in klinische omgevingen, maar ook uit voedingsbronnen zoals zuivelproducten. Dit verbreedt de epidemiologische context van verspreiding van antimicrobiële resistentie en ondersteunt combinatietherapie als mogelijke strategie om de verspreiding en klinische impact te beperken 6,7. Aminoglycosiden, tigecycline en polymyxines zijn veelgebruikte therapeutische middelen bij MDR-infecties8. Fosfomycine heeft ook activiteit aangetoond tegen ESBL-producerende E. coli, met name bij urineweginfecties9.
Fosfomycine, voor het eerst ontdekt in 1969, remt de vroege bacteriële celwandsynthese en is opnieuw opgedoken als veelbelovend middel in combinatietherapie10. Synergetische effecten tussen fosfomycine en aminoglycosiden of β-lactamen zijn gerapporteerd in MDR-organismen11,12. Daarnaast is fosfomycine geëvalueerd in grote klinische cohorten, wat effectiviteit aantoont bij ernstige infecties wanneer het alleen of in combinatieregimeswordt gebruikt. De meeste eerdere studies omvatten echter heterogene bacteriële populaties, en gegevens die specifiek carbapenem-resistente E. coli behandelen, blijven beperkt.
Standaard antimicrobiële gevoeligheidstestmethoden omvatten agarverdunning, bouillonverdunning en schijfdiffusie. Agarverdunningsgebaseerde combinatietests maken kwantitatieve beoordeling van antimicrobiële interacties mogelijk door MIC's te bepalen en FICI's te berekenen. Alternatieve methoden zoals time-kill en gradientdiffusie leveren dynamische of vereenvoudigde interactiegegevens, maar kunnen verschillen in reproduceerbaarheid en standaardisatie13,14. Dit protocol is het meest geschikt voor gecontroleerde in-vitro evaluatie van gedefinieerde antibioticacombinaties. Het weerspiegelt echter niet volledig in vivo farmacokinetische aandoeningen15. Onder deze wordt agarverdunning beschouwd als een referentiemethode voor MIC-bepaling; het gebruik ervan bij het evalueren van fosfomycinecombinatie-activiteit tegen carbapenemresistente E. coli blijft echter beperkt.
Deze studie biedt een systematische evaluatie van fosfomycine-gebaseerde combinaties tegen klinisch bevestigde carbapenemresistente E. coli-isolaten . Er werd een gestandaardiseerde agarverdunningscheckerboardbenadering gebruikt, waarbij directe vergelijkende interactiegegevens werden gegenereerd onder gecontroleerde in vitro omstandigheden.
Daarom test de huidige studie de hypothese dat fosfomycine in combinatie met meropenem, gentamicine of ceftriaxon in vitro synergetische activiteit vertoont tegen CRE E. coli-isolaten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Review en perspectief
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Goedkeuring voor deze studie werd verkregen van de Non-Interventional Clinical Research Ethics Committee van de Faculteit Geneeskunde van Dicle University (Besluit nr: 100, datum: 01.01.2021).
Het onderstaande protocol beschrijft een gestandaardiseerde agarverdunningscheckerboardmethode voor het evalueren van fosfomycinecombinatiesynergie tegen carbapenem-resistente E. coli-isolaten .
Verzameling isolaten
Tussen 15-02-2021 en 15-12-2021 werden in totaal 60 carbapenem-resistente E. coli-stammen opgenomen, geïsoleerd uit diverse klinische monsters (urine, bloed, aspiratie, wond, cerebrospinaal vocht en endotracheale aspiratie) verkregen van opgenomen patiënten in Dicle University Medical Faculty Hospitals. De identificatie werd uitgevoerd met behulp van een MALDI-TOF massaspectrometriesysteem. Wanneer meerdere isolaten van dezelfde patiënt werden gevonden, werd alleen het eerste isolaat opgenomen. Monsters van poliklinieken en patiënten die minder dan 48 uur waren opgenomen, werden uitgesloten. Alle carbapenemresistente E. coli-isolaten die voldeden aan de vooraf gedefinieerde inclusiecriteria tijdens de studieperiode werden achtereenvolgens opgenomen; Daarom werd de steekproefgrootte bepaald door het totale aantal beschikbare beschikbare isolaten, en werd er geen a priori steekproefgrootteberekening uitgevoerd. E. coli ATCC 13846 en E. coli ATCC 25922 werden gebruikt als kwaliteitscontrolelijnen. Kwaliteitscontrolestammen werden parallel getest met klinische isolaten onder identieke agarverdunningsomstandigheden. Alle runs werden geëvalueerd door twee onafhankelijke waarnemers. De resultaten van de kwaliteitscontrolestammen toonden verwachte groeiremmende patronen in alle experimenten, en er werden geen buiten-bereik of ongeldig resultaat waargenomen.
Alle procedures waarbij klinische isolaten betrokken zijn, werden uitgevoerd onder biosafety level 2 (BSL-2) omstandigheden. Er werd passende persoonlijke beschermingsmiddelen (labjas, handschoenen en oogbescherming) gebruikt en alle manipulaties vonden plaats in een gecertificeerde biologische veiligheidskast.
Soortidentificatie en antimicrobiële vatbaarheidstesten
Carbapenemresistentie- en antimicrobiële gevoeligheidstests werden uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerd microbiële identificatie- en gevoeligheidstestsysteem. Carbapenemweerstand die door het systeem werd gedetecteerd, werd bevestigd door schijfdiffusietests met ertapenem-, imipenem- en meropenemschijven. Zonediameters werden geïnterpreteerd volgens EUCAST-breakpoints16,17 (Tabel 1). Alle isolaten werden bewaard in tryptische sojabouillon met 20% glycerol en opgeslagen bij −20 °C.
Tabel 1: Zonediameter-breekpunten voor carbapeneems bepaald voor E. coli door schijfdiffusietest (DDT). Interpretatiecriteria voor schijfdiffusie gebruikt voor carbapenem-gevoeligheidstesten. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Bloedkweekflessen geschikt voor pediatrische en aerobe monsters werden geïncubeerd in een geautomatiseerd bloedkweeksysteem. Positieve flessen werden subcultureerd op EMB agar, 5% schapenbloedagar en Sabouraud Dextrose Agar.
Urine- en endotracheale aspiratiemonsters werden gekweekt met kwantitatieve methoden, terwijl andere monsters werden verwerkt met semi-kwantitatieve methoden. Endotracheale aspirate monsters werden geëvalueerd met Gram-kleuring, en alleen monsters met een Bartlett-score > 0 en een Murray-score > 3 werden als significant beschouwd en omvatten18.
Voor wondmonsters werd de gramkleuringsevaluatie uitgevoerd volgens het Q-scoresysteem; monsters met een Q-score hoger dan 0 werden opgenomen:19.
Bacteriële isolaten werden geïdentificeerd door Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight massaspectrometrie. Een score van ≥2,0 werd als betrouwbaar beschouwd voor identificatie op geslachts- en soortniveau, terwijl scores tussen 1,7 en 2,0 een betrouwbare identificatie op geslachtsniveauaangaven op 20,21. Alleen isolaten met scores van ≥2,0 werden opgenomen.
Bepaling van fosfomycine-gevoeligheid met behulp van de agar-verdunningsmethode
Volgens het Europees Comité voor Antimicrobiële Gevoeligheidstesten (EUCAST) wordt de agarverdunningsmethode aanbevolen om de fosfomycinegevoeligheid te bepalen bij leden van de Enterobacterales-familie16.
Bereiding van fosfomycine en andere antibiotische werkingsmiddelen
Voor de agarverdunningsmethode werd poedervormig fosfomycinedinatriumzouthydraat gebruikt, en steriel gedestilleerd water om de verdunning te creëren. Voor elk antibioticum waren acht verschillende verdunningen gepland, variërend van 4 keer onder en 3 keer boven de door EUCAST bepaald MIC-limiet.
Een fosfomycine-voorraadoplossing (met 2560 μg/mL fosfomycine) werd bereid door 51,2 mg steriel fosfomycine-disodium op te lossen, berekend met de volume/gewicht/potentieformule (Volume (mL) = Gewicht (mg) × Potentie (μg/mg)/ Concentratie (μg/mL)) en gewogen onder steriele omstandigheden, in 20 mL steriel gedestilleerd water. De uiteindelijke concentratie was gepland op 256 μg/mL, als gevolg van een tienvoudige verdunning van de voorraadoplossing bij toevoeging van MHA.
Dienovereenkomstig werden verdunningsbereiken bepaald voor fosfomycine (2-256 μg/mL), meropenem en gentamicine (0,125–16 μg/mL) en ceftriaxon (0,0625–8 μg/mL).
Verdunningen werden bereid door seriële tweevoudige verdunningen in steriele kegelvormige buizen met 10 mL steriel gedestilleerd water. In totaal werden 7 seriële tweevoudige verdunningen uitgevoerd in de buizen totdat een concentratie van 2 μg/mL was bereikt. De resterende 10 mL in de laatste buis werd weggegooid. Dit resulteerde in acht verschillende antibioticaconcentraties: 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4 en 2 μg/mL.
Dezelfde methode als fosfomycine werd gebruikt voor de andere antibiotica om de eerste voorraadoplossing te bereiden. 1,6 mg poedervormig antibioticum werd gewogen op ceftriaxon en 3,2 mg op meropenem en gentamicine met behulp van een precisieweegschaal. Voor elk antibioticum werden zeven verdunningen uitgevoerd. Zo werden acht verschillende concentraties van antibiotica-verdunningen verkregen voor meropenem, gentamicine en ceftriaxon (Figuur 1).
Figuur 1: Bereidingsstappen van fosfomycine-verdunningsoplossingen. Seriële verdunningsstappen worden gebruikt om werkconcentraties te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Bereiding van agarmedium
Kation-afgestelde Mueller-Hinton Agar (CAMHA) werd bereid volgens de instructies van de fabrikant. Het werd gesteriliseerd op 121 °C en 1 atm gedurende 15–20 minuten met behulp van een autoclave, waarna het in een waterbad op 45–55 °C werd gehouden.
Alle biologische materialen werden gesteriliseerd door autoclaving bij 121 °C gedurende 15–20 minuten voordat ze werden afgevoerd. Afval met antibiotica werd afgevoerd volgens institutionele protocollen voor bioveiligheid en chemisch afval.
Kritieke stap: Houd de agartemperatuur tussen 45–55 °C vóór antibiotica. Overmatige hitte kan de fosfomycine-activiteit verminderen en de MIC-resultaten beïnvloeden.
Toevoeging van G6P aan het medium
Om de fosfomycine-gevoeligheid te bepalen, raadt EUCAST aan om 25 μg/mL glucose-6-fosfaat (G6P) toe te voegen aan agar- en bouillonmedia5. Voor elke liter agar werd 25 mg G6P opgelost in 20 mL MHA, gefilterd om te steriliseren en vervolgens gemengd in de hoofdbatch van agar.
Bereiding van agar-verdunningsplaten
Om de monotherapie MIC-waarden voor fosfomycine, meropenem, gentamicine en ceftriaxon te bepalen, werd per verdunning één Petriplaat gebruikt (bijvoorbeeld 8 verdunnings voor fosfomycine, variërend van 2–256 μg/mL). De antibioticaconcentraties werden op de platen genoteerd.
Voor de combinatiestudie werden de concentraties fosfomycine en het andere onderzochte antibioticum op de platen genoteerd (bijv. fosfomycine 256 μg/mL en meropenem 32 μg/mL). Er werden dus 64 platen voorbereid voor elke combinatie, en de concentratie fosfomycine en het andere gebruikte antibioticum werd op de platen genoteerd. In totaal werden 32 meropenem-gentamicinetri-platen voorbereid voor monotherapie en 192 voor combinatie. Een standaardtekening met 56 kleine vierkanten van 1 cm werd gemaakt op een marmeren oppervlak. Alle platen werden direct op deze tekening geïntecteerd. Daarom werden lezen en inoculatie gestandaardiseerd (Figuur 2 en Figuur 3).
Figuur 2: Standaarddiagram gemaakt voor inoculatie- en leesdoeleinden. Gestandaardiseerd schema gebruikt voor inoculatie en evaluatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Evaluatiemethode van agar-verdunningsplaten. Beoordeling van bacteriële groei voor MIC-bepaling. F = fosfomycine; M = meropenem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Twee milliliter antibioticaoplossing werden gemengd met 18 mL gesmolten CAMHA om de uiteindelijke werkconcentratie te verkrijgen. Dit medium, bereid volgens de bijzetting van de fabrikant, werd gekoeld tot 45−55 °C in een warmwaterbad. Er werd één deel (2 mL) van het antibioticummengsel gebruikt, en 9 delen (18 mL) MHA werden gemengd in de petrischaaltjes (het antibioticum was verdund met 1/10). Het uiteindelijke agarplaatvolume werd gestandaardiseerd tot ongeveer 20 mL per plaat (18 mL agar + 2 mL antibioticaoplossing), en de uiteindelijke antibioticaconcentraties werden berekend na verdunning. Op deze manier werden antibioticaconcentraties bereikt in de agarverdunningsplaten (2–256 μg/mL voor fosfomycine, 0,0625–8 μg/mL voor ceftriaxon, en 0,125–16 μg/mL voor meropenem en gentamicine). Platen die uit het medium werden gemaakt zonder antibioticaoplossing werden gebruikt als groeicontrole (Figuur 4). De mengsels bestaande uit medium en antibioticaoplossing werden bij kamertemperatuur laten stollen.
Figuur 4: Controlemedium zonder antibioticumoplossing. Medium zonder antibiotica wordt gebruikt om de levensvatbaarheid van bacteriën te bevestigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Kritieke stap: Ongelijkmatige agardiepte of onvoldoende mengen van antibiotica kan leiden tot onnauwkeurige MIC-interpretatie en valse interactieresultaten.
Bereiding en inoculatie van isolaten
Eerder opgeslagen zuivere stammen werden bij kamertemperatuur op 5% schapenbloedagar gedropt en 16–24 uur geïncubeerd bij 37 °C. Kolonies uit verse culturen werden opgehangen in steriele zoutoplossing, en een troebelheid van 0,5 McFarland werd bereikt met een optische lezer.
De agarverdunningsmethode vereiste een bacterieel inoculum van ongeveer10,4 CFU per vlek. Een McFarland-waarde van 0,5 bevat ongeveer 10à 8 CFU/mL bacteriën. Een bacteriële dichtheid van 107 CFU/mL werd bereikt door de oplossing 1:10 te verdunnen met steriele zoutoplossing.
2 μL van elke bacteriële suspensie werd uit de buis gehaald met een automatische pipet. Dit volume komt overeen met ongeveer 2 × 10,4 CFU per spot. De inoculatie werd uitgevoerd op gerichte gebieden van het agaroppervlak, beginnend bij de plaat met de laagste fosfomycineconcentratie en doorgegroeid naar de hoogste.
Daarom werd de inoculatie gedefinieerd als CFU per vlek, waarbij elk inoculatiepunt ongeveer 10 à4 CFU bevatte. De inoculatie van elke bacteriële suspensie was binnen 15 minuten voltooid.
Voordat de fosfomycine-bevattende platen werden geïnëntificeerd, werd een groeicontroleplaat geïënënt om te controleren op besmetting. De inoculatie mocht drogen bij kamertemperatuur. De incubatie vond plaats bij 35–37 °C gedurende 16–24 uur onder aerobe omstandigheden, en troebelheid werd gemeten met een gekalibreerde densitometer.
Een overmatige inoculumdichtheid kan leiden tot achteruitgaande groei en moeilijkheden bij het bepalen van het eindpunt. Pas de troebelheid opnieuw aan naar 0,5 McFarland en herhaal de inoculatie als er confluente groei optreedt.
Combinatietesten
De poedervormige antibiotica meropenem, fosfomycine, gentamicine, ceftriaxon en glucose-6-fosfaat werden gebruikt.
De hoeveelheden antibiotica werden berekend met behulp van de formule volume/gewicht/potentie. Na het bereiden van de basisoplossingen werden antibioticaoplossingen bereid bij concentraties van drie dubbelvoudige verdunningen boven en vier dubbele verdunningen onder het gevoelige MIC-bereik. Verdunningsbereiken werden berekend als 2–256 μg/mL voor fosfomycine, 0,0625–8 μg/mL voor ceftriaxon, en 0,125–16 μg/mL voor gentamicine en meropenem (Tabel 2, Tabel 3 en Tabel 4).
Tabel 2: Bereiding van antibioticaoplossingen voor de combinatie van fosfomycine-gentamicine. Voorbereidingsstappen en concentraties gebruikt voor voorraad en werkoplossingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Bereiding van antibioticaoplossingen voor de combinatie van fosfomycine-meropenem. Voorbereidingsstappen en concentraties gebruikt voor voorraad en werkoplossingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 4: Bereiding van antibioticaoplossingen voor de combinatie van fosfomycine-ceftriaxon. Voorbereidingsstappen en concentraties gebruikt voor voorraad en werkoplossingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
In deze studie werden afzonderlijke fosfomycine-stockoplossingen bereid voor monotherapie- en combinatie-experimenten om verschillen in uiteindelijke verdunningsfactoren tijdens agar-gebaseerde tests te compenseren. Voor monotherapie-experimenten werd een standaardvoorraadoplossing gebruikt, terwijl een aangepaste voorraadoplossing met hogere concentratie werd gebruikt voor combinatie-experimenten om de extra verdunning tijdens het voormengen van antibiotica te compenseren.
Standaardoplossingen werden voorbereid als de eerste stap voor seriële verdunning. Voor fosfomycine werd 256 mg poeder nauwkeurig gewogen met een analytische balans onder steriele omstandigheden en opgelost in 50 mL steriel gedestilleerd water met continue menging (magnetische roerder) totdat volledige oplossing was bereikt, wat resulteerde in een uiteindelijke concentratie van 5120 μg/mL fosfomycinedisodium. Afzonderlijke standaardoplossingen van gentamicine, meropenem en ceftriaxon werden bereid.
Voor seriële tweevoudige verdunningen werden zeven steriele conische buizen met 25 mL steriel gedestilleerd water voorbereid. Uit de standaardoplossing werd 25 mL overgebracht in de eerste buis met behulp van een verstelbare pipet, gevolgd door sequentiële overdracht in volgende buizen om dubbele seriële verdunningen te bereiken. Elke buis werd na elke overdrachtsstap grondig gemengd met een vortexmixer gedurende 5–10 seconden. Uit de eindbuis werd 25 mL weggegooid om gelijke volumes te behouden. Op deze manier werd een verdunningsreeks verkregen, wat een laagste concentratie van 40 μg/mL opleverde, en in totaal werden acht verschillende fosfomycineconcentraties bereid.
Dezelfde procedure werd toegepast voor gentamicine, meropenem en ceftriaxon. Door verschillen in doelconcentratiebereiken werden echter 16 mg gentamicine en meropenem (voor een bereik van 0,125–16 μg/mL) en 8 mg ceftriaxon (voor een bereik van 0,0625–8 μg/mL) apart gewogen en opgelost in 50 mL steriel gedestilleerd water onder aseptische omstandigheden bij kamertemperatuur. Herhaalde tweevoudige verdunningen werden uitgevoerd zoals hierboven beschreven. De uiteindelijke laagste concentraties waren 2,5 μg/mL voor gentamicine en meropenem, en 1,25 μg/mL voor ceftriaxon. Voor elk antibioticum werden acht buisjes met 25 mL van verschillende concentraties voorbereid. Omdat fosfomycine in combinatie met drie antibiotica is getest, zijn er in totaal 24 fosfomycine-verdunningsbuizen (8 × 3) voorbereid.
Voor agarvoorbereiding werd 18 mL Mueller–Hinton-agar aangevuld met glucose-6-fosfaat (25 μg/mL) voorgekoeld tot 45–50 °C en in steriele Petrischalen gedoseerd. Vervolgens werden 1 ml fosfomycineoplossing en 1 ml van de tweede antibioticumoplossing toegevoegd met steriele pipetten. De platen werden zachtjes gemengd door cirkelvormige rotatie om homogene verdeling te garanderen en lieten bij kamertemperatuur stollen. Door gelijke hoeveelheden menging en agartoevoeging werden de antibioticaconcentraties ongeveer 9 keer verlaagd.
Voor combinatietests werd 1 mL van de laagste fosfomycineconcentratie (40 μg/mL) gecombineerd met 1 mL van elk van de acht gentamicinedundigies (2,5–320 μg/mL), vervolgens toegevoegd aan aparte petrischalen en zachtjes gemengd. Dezelfde procedure werd herhaald voor de volgende fosfomycineconcentratie (80 μg/mL) en werd stapsgewijs doorgegaan tot 5120 μg/mL, waarbij alle mogelijke concentratiecombinaties werden getest. Voor elke overdracht werd een nieuwe steriele pipettip gebruikt om kruisbesmetting te voorkomen. In totaal werden 64 petri-gerechten (8 × 8 combinaties) bereid voor de fosfomycine–gentamicine-combinatie (Tabel 5).
De identieke procedure werd toegepast op fosfomycine in combinatie met meropenem en ceftriaxon, wat resulteerde in 64 platen per antibioticumcombinatie (Tabel 6 en Tabel 7).
Tabel 5: Ordening van de combinatie fosfomycine-gentamicine op MHA-medium. Rangschikking van antibioticaconcentraties op Mueller–Hinton-agar. FF = fosfomycine; GN = gentamicine. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 6: Rangschikking van de combinatie van fosfomycine-meropenem op MHA-medium. Rangschikking van antibioticaconcentraties op Mueller–Hinton-agar. FF = fosfomycine; MEM = meropenem. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 7: Rangschikking van de combinatie fosfomycine-ceftriaxon op MHA-medium. Rangschikking van antibioticaconcentraties op Mueller–Hinton-agar. FF = fosfomycine; CRO = ceftriaxon. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Na het bereiden van de antibioticummengsels werd 18 mL gesmolten Mueller–Hinton-agar (45–50 °C) aan elke plaat met 1 mL van het antibioticummengsel toegevoegd, zodat de temperatuurcondities de antibiotische werking niet aantastten. Dit resulteerde in een ongeveer 9-voudige verdunning van de oorspronkelijke antibioticaoplossing.
Voor systematische evaluatie werden platen gerangschikt in een schaakbordformaat (tweedimensionale verdunning). De fosfomycineconcentraties waren georganiseerd langs de verticale as (rijen A–H), met de hoogste concentratie bij rij A en afnemende concentraties richting rij H. Het tweede antibioticum werd langs de horizontale as (kolommen 1–8) gerangschikt, met toenemende concentraties van kolom 1 tot kolom 8. Elke goed-equivalente positie vertegenwoordigde daarom een unieke combinatie van twee antibioticaconcentraties, waardoor een uitgebreide beoordeling van interactie-effecten mogelijk was.
Resultatenevaluatie
De resultaten van de minimale remmende concentratie werden geëvalueerd volgens de aanbevelingen van EUCAST v.11. Groeicontroleplaten toonden zichtbare bacteriële groei, terwijl steriliteitscontroleplaten (ongeïnënteerd) geen groei lieten zien. De MIC werd gedefinieerd als de laagste concentratie waarbij geen zichtbare groei plaatsvond. Voor combinatietests werden interactie-effecten geïnterpreteerd met behulp van FICI-waarden. Synergie werd gedefinieerd als FICI ≤ 0,5, onverschilligheid als > 0,5–4, en antagonisme als > 4. Voor fosfomycine werden MIC-waarden ≤ 32 μg/mL als vatbaar beschouwd, en die > 32 μg/mL als resistent. Voor gentamicine en meropenem (bij meningitisinfecties) werden MIC-waarden ≤ 2 μg/mL als vatbaar beschouwd, en die > 2 μg/mL als resistent. Voor meropenem (bij niet-meningitisinfecties) werden MIC-waarden ≤ 2 μg/mL als vatbaar beschouwd. Waarden > 8 μg/mL werden als resistent beschouwd, MIC ≤ 1 μg/mL voor ceftriaxon (voor niet-meningitisinfecties) als vatbaar, MIC ≤ 2 μg/mL voor ceftriaxon (voor meningitisinfecties) als vatbaar, en MIC > 1 μg/mL voor ceftriaxon (voor meningitisinfecties) als resistentbeschouwd 16.
Statistische analyse van de studiegegevens werd uitgevoerd met behulp van statistische software.
Statistieken: Categorische variabelen werden uitgedrukt als getallen en percentages. Pearsons chi-kwadraattest werd gebruikt voor vergelijkingen waarbij alle verwachte celtellingen ≥5 waren. Fishers exacte test werd gebruikt voor analyses met kleine steekproefgroottes of wanneer een verwachte celtelling <5 was. Specifiek werd de chi-kwadraattest gebruikt voor algemene vergelijkingen van fosfomycineresistentiesnelheden, terwijl Fishers exacte test werd gebruikt voor subgroepanalyses van synergetische, additieve en antagonistische interactiesnelheden als gevolg van lage-frequentieverdelingen in sommige combinaties. Een P-waarde ≤ 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Interpretatie-opmerking: Kleine afzonderlijke kolonies binnen inhibitiezones werden niet als groeiend beschouwd, tenzij ze samenvloeiend of reproduceerbaar waren bij herhaald testen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Conclusies
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
In totaal werden 60 carbapenemresistente E. coli-isolaten in de studie opgenomen. Alle isolaten werden verkregen van patiënten die werden opgenomen op intensive care-afdelingen of klinische afdelingen van de medische faculteitsziekenhuizen van Dicle University. Volwassen patiënten waren goed voor 83,3% van de gevallen, terwijl pediatrische patiënten 16,7% uitmaakten (Tabel 8 en Tabel 9). Multigeneesmiddelresistentie werd waargenomen in 80% (n = 48) van d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict hebben.
Dankbetuigingen
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Deze studie werd ondersteund door de Dicle University Scientific Research Projects Coordination Unit (DÜBAP) met projectnummer SBE.21.004.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen