De beoordeling van lymfedrainage met ICG nabij-infraroodbeeldvorming en echografie na een breuk

Samenvatting

Dit protocol beoordeelt lymfedrainage na een fractuur door indocyanine green (ICG) nabij-infrarood beeldvorming te combineren met echografie om de opruiming van plantaire ICG en de vergroting van de lymfeklier van de popliteale lymfeklier bij muizen te kwantificeren.

Samenvatting

Traumatische fracturen gaan vaak gepaard met een verminderde lymfedrainagefunctie. Verminderde lymfedrainage en vergroting van de lymfeklier na een fractuur wijzen op voortdurende, dynamische processen van de acute ontstekingsrespons en de rekrutering van immuuncellen. Dit artikel beschrijft een methode waarbij 6 μL 0,2 mg/mL indocyanine groen intradermaal werd geïnjecteerd in het plantaire gebied van muizen die een schijn- of tibia-fractuuroperatie ondergingen. Nabij-infraroodfluorescentiebeeldvorming kwantificeerde het plantaire ICG-signaal op 0 uur en 24 uur om de 24 uur clearancesnelheid te berekenen als een uitlezing van muislymfedrainage. Tegelijkertijd werd echografie gebruikt om de popliteale lymfeklieren (PLN's) in 3D te reconstrueren, hun volumes te vergelijken en de door breuk veroorzaakte vergroting te beoordelen.  De resultaten toonden aan dat na een fractuur de lymfatische clearancesnelheid significant afnam, de fluorescentieintensiteit van ICG in het plantaire gebied aanzienlijk hoger was en het volume van de PLN's significant vergrootte.  In vergelijking met eerdere methoden om het lymfestelsel te meten, zoals histopathologische secties of lymfoscintigrafie, die vaak niet in vivo, dynamische en continue observatie bereiken, toont deze methode hoge stabiliteit en reproduceerbaarheid. Opmerkelijk is dat het dynamische in vivo monitoring van lymfedrainagefunctie mogelijk maakt, en biedt robuuste technische ondersteuning voor het onderzoeken van veranderingen in lymfatische reflux in fracturmodellen.

Inleiding

Traumatische fracturen veroorzaken vaak aanzienlijke weefselschade en zwelling, wat het risico op complicaties zoals infectie, necrose en botonbinding^{verhoogt 1,2}. Grzegorz Szczesny et al. toonden aan dat dysfunctie van lymfedrainage, die leidt tot weefseloedeem, in verband wordt gebracht met vertraagde genezing³. Studies geven aan dat tijdens het genezingsproces van de breuk, naast het herstel van botweefsel, ook het lymfestelsel op de breukplaats een belangrijke rol speelt. Lymfevaten zijn niet alleen verantwoordelijk voor het afvoeren van interstitiële vloeistof en het voorkomen van^zwelling, maar ook voor het reguleren van migratie van immuuncellen en het verwijderen van metabolisch afval. In de vroege stadia van een breuk kunnen pro-inflammatoire factoren zoals TNF-α, IL-1, IL-6 en Macrophage Colony-Stimulating Factor (MCSF) lymfatische endotheelcellen^beschadigen, wat leidt tot pathologische veranderingen zoals degeneratie, oedeem en fibrose⁶. Relevante studies hebben aangetoond dat lymfatische endotheelcellen aanwezig zijn in bot en periost, evenals in omliggende vet- en spierweefsels. Bovendien speelt lymfedrainage ook een rol bij het reguleren van het micro-milieu van het hematoom na een breuk; effectieve lymfedrainage bevordert het overleven van osteoblasten en de proliferatie van mesenchymale stamcellen in het beenmerg (BMSC's)⁷. Tijdens een fractuur zijn de pro-inflammatoire factoren (TNF-α, IL-1 en IL-6) en groeifactoren (TGFβ1 en PDGF) geproduceerd door immuuncellen op de beschadigde locatie belangrijke regulerende factoren voor osteoblastapoptose en BMSC-proliferatie⁸. Hüseyin Arslan en andere wetenschappers hebben het negatieve effect van lymfoedeem op osteoblasten bevestigd. Deze onderzoeksresultaten benadrukken de belangrijke rol van lymfedrainage bij het genezen van fracturen. Recente ontwikkelingen in ICG nabij-infrarood (NIR) fluorescentiebeeldvorming hebben het mogelijk gemaakt om niet-invasieve, realtime waarneming van lymfatische stromingsdynamiek in zowel diermodellen als mensen^te realiseren ^9,10,11. Deze techniek maakt een kwantitatieve evaluatie mogelijk van de contractiliteit van lymfevaten, de afvoersnelheid en de^{integriteit van} de wegen. Een studie met muismodellen van artritis en ontsteking heeft aangetoond dat ICG-NIR-beeldvorming kan onderscheiden tussen acute en chronische lymfatische reacties, waarbij verschillende drainagepatronen tijdens weefselletsel en herstel worden benadrukt. Bovendien is aangetoond dat NIR-lymfatische beeldvorming effectief is voor het monitoren van functioneel herstel na handmatige lymfedrainage en voor het evalueren van de effectiviteit van lymfatisch gerichte therapieën. Ultrascopie biedt een complementaire kwantitatieve methode voor het beoordelen van de morfologie en het volume van drainage van lymfeklieren, evenals weefseloedeem die samenhangt met een verstoorde lymfatische drainage. De integratie van NIR-fluorescentiebeeldvorming met echografie maakt gelijktijdige beoordeling van lymfefunctie en anatomische veranderingen mogelijk, wat een multimodale benadering biedt voor het onderzoeken van lymfatische dynamica in vivo. Ondanks de groeiende erkenning van de cruciale rol van lymfatische disfunctie bij posttraumatische genezing, ontbreken gestandaardiseerde en reproduceerbare methoden voor het beoordelen van lymfedrainage na fracturen nog steeds aan gestandaardiseerde en reproduceerbare methoden. Veel huidige beeldvormingsmethoden zijn invasief, missen voldoende ruimtelijke resolutie of slaagen er niet in om de lymfestroom dynamisch te monitoren. Daarom wordt verwacht dat het ontwikkelen van een protocol dat ICG-NIR en echografie combineert deze methodologische tekortkoming zal aanpakken en een effectief instrument zal bieden voor het beoordelen van lymfatisch herstel en de bijdrage ervan aan botherstel.

Deze studie presenteert een innovatief kader dat ICG-NIR fluorescentiebeeldvorming combineert met hoogresolutie echografie om lymfedrainage na tibiafracturen bij muizen te beoordelen. Deze aanpak maakt semi-kwantitatieve analyse van drainage-efficiëntie mogelijk en meet het volume van lymfeklieren tijdens het fractuurgenezingsproces. Het heeft ook enkele beperkingen. Ten eerste wordt ICG-NIR voornamelijk gebruikt om oppervlakkige lymfevaten te evalueren, en de beeldvormingscapaciteit voor diepere structuren is beperkt. Ten tweede, hoewel veranderingen in het volume van de lymfeklier enige informatie geven, ontbreken ze aan specificiteit en kunnen ze directe functionele metingen niet volledig vervangen. Deze methodologie heeft een aanzienlijk translationeel potentieel en verbetert ons begrip van lymfefunctie bij botregeneratie.

Protocol

De dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het Shanghai Model Organisms Center (Goedkeuringsnummer NMB-SMP-IACUC-01-0002-R02-03). C57 mannelijke muizen met een fracturemodel (6–8 weken oud) werden in deze studie gebruikt. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Preoperatieve zorg

1. Gewoonlijk aan de muizen minstens een week met ad libitum. Toegang tot voedsel en water. Wijs de dieren willekeurig toe aan de breuk- of schijngroep met behulp van een computergegenereerde randomisatielijst.
2. Plaats de muizen op een verwarmingskussen van dieren en houd een constante temperatuur van 37 °C aan.
3. Zet de gasanesthesiemachine aan en plaats de muis 5 minuten in de inductiekamer met 2%–3% isofluran.
4. Na inleiding schakel je over op 1%–2% isoflurane en houd je de anesthesie vast via een neuskegel tot het einde van de procedure.

2. Experimentele procedure

OPMERKING: Standaardiseer de anesthesie-instellingen, ICG-dosering en -volume, injectieplaats en -diepte, blootstellingstijd, ROI-definitie en echoscanparameters over alle sessies om de variabiliteit tussen dieren te minimaliseren.

1. NIR-ICG beeldvorming
   OPMERKING: De stapsgewijze procedure voor ICG nabij-infraroodbeeldvorming is weergegeven in Figuur 1.
   1. Weeg 0,2 mg indocyanine green (ICG), breng het over in een microcentrifugebuis van 1,5 mL en los het op in 1 mL PBS om een 0,2 mg/mL ICG-oplossing te bereiden. Wikkel de buis in met aluminiumfolie om hem tegen licht te beschermen.
   2. Zet het imagingsysteem aan en open FluoBeam v1.46. Stel de camerahoogte aan waar nodig.
   3. Bevochtig een wattenstaafje met 75% ethanol en desinfecteer het plantaire oppervlak van de gemodelleerde achterpoot.
   4. Met een 10 μL microspuit aspireer 6 μL van de ICG-oplossing. Steek de naald ongeveer 1 mm in het plantaire oppervlak en injecteer de oplossing met een constante snelheid totdat het volledige volume is toegediend.
   5. In de software activeer je zowel de "camera"- als de "laser"-functies. Klik op "wijzigen" om een nieuwe map aan te maken en deze als savemap in te stellen. Houd de belichtingstijd identiek voor beeldopname op 0 uur en 24 uur.
   6. Plaats de muis onder de camera in buikligging met het gemodelleerde achterbeen gecentreerd in het gezichtsveld. Zorg ervoor dat het gemodelleerde achterbeen in het gezichtsveld is gecentreerd.
   7. Stel de belichtingstijd in op 30 ms en houd deze identiek voor zowel de 0 uur als de 24 uur afbeeldingen. Maak beelden van dezelfde plantaire injectie-ROI 0 uur en 24 uur na injectie om de ICG-signaalintensiteit te meten. Houd de belichtingstijd identiek op 0 uur en 24 uur.
   8. Wanneer de lymfevaten van het achterpoot duidelijk zichtbaar zijn in het gezichtsveld, klik dan op "foto" om de beelden vast te leggen.
   9. Na beeldverwerving exporteer je de data en gebruik je beeldanalysesoftware om de fluorescentieintensiteit op 0 uur en 24 uur te kwantificeren, en bereken vervolgens de fluorescentieklaringssnelheid.
   10. Open de beeldanalysesoftware.
   11. Importeer de fluorescentiebeelden door op Bestand → Openen te klikken en open de 0 uur plantaire afbeelding die overeenkomt met hetzelfde dier en dezelfde onderzoeksdag (en open daarna de overeenkomende 24-uursafbeelding).
   12. Selecteer Ovaal en klik vervolgens op Bewerken → Selectie → Specificeren; stel Breedte = 30 en Hoogte = 30 in, kies Ovaal en klik op OK.
   13. Plaats de cirkel boven een achtergrondgebied.
   14. Klik op Analyze → Measure en registreer de Gemiddelde waarde in het Resultatenvenster als fluorescentieintensiteit op 0 uur achtergrond (FI0hbg).
   15. Plaats de cirkel boven de doelobservatielocatie, klik op Analyseren → Meten en noteer de Gemiddelde waarde in het Resultatenvenster als FI0h.
   16. Bereken de gecorrigeerde fluorescentieintensiteit bij 0 uur als gecorrigeerd FI0h = FI0h − FI0hbg.
   17. Open het overeenkomende 24-uursbeeld en herhaal stappen 3–7 om gecorrigeerde FI24h te verkrijgen.
   18. Bereken de clearancesnelheid met behulp van de achtergrondgecorrigeerde fluorescentieintensiteit als volgt: clearance rate = [(FI0h − FI0hbg) − (FI24h − FI24hbg)] / (FI0h − FI0hbg) × 100%.
2. B-mode ultrascopie
   OPMERKING: De stapsgewijze procedure voor echografie en lymfeklierafbakening wordt weergegeven in Figuur 2.
   1. Zet het echosysteem aan, sluit de transducer aan en positioneer de muis zodat de achterpoot duidelijk zichtbaar is. Onder continue narcose plaats je de muis in de buikligging op de beeldvormingsstage, met het hoofd van de operator af georiënteerd en de staart naar de operator toe. Buig de knie zodat de popliteale fossa omhoog en iets lateraal wijst, en plaats de transducer boven de deuk van de popliteale fossa.
   2. Breng ultrageluidskoppelingsgel aan op het gemodelleerde achterpoot.
   3. Draai de transducer zodat de hoek parallel blijft aan de lengteas van het achterpoot.
   4. Stel de scanafstand in op 4 mm en de stapgrootte op 0,04 mm. Identificeer de popliteale lymfeklier op de afbeelding op basis van de anatomische locatie.
   5. Stabiliseer de muis door de staart en de gemodelleerde achterpoot met beide handen vast te houden. Beweeg het dier niet terwijl de transducer scant.
   6. Neem beelden. Identificeer de popliteale lymfeklier als een kleine ovale of licht boonvormige knobbel met een intermediaire tot lage echogeniteit, iets lager dan die van het omliggende vet, en duidelijk afgebakend van de aangrenzende donkerdere, gestreepte spier.
   7. Exporteer de beelden naar 3D-reconstructiesoftware voor driedimensionale beeldverwerking.
   8. Na het voltooien van de 3D-scan op de ultrageluidsbeeldconsole sla je de scan op als een 3D-dataset en registreer je de dier-ID, groepscode en tijdstip (0 uur / 24 uur).
   9. Exporteer de ruwe gegevens van de acquisitieconsole naar de analysecomputer, waarbij de oorspronkelijke mappenstructuur ongewijzigd blijft; Gebruik voor elk dier op elk tijdstip één map wanneer mogelijk.
   10. Open de 3D-reconstructiesoftware.
   11. Klik op "Studeren" om de module te openen en selecteer "Importeren."
   12. Klik op de datamap , controleer de gegevens die geïmporteerd moeten worden, en dubbelklik om deze te openen.
   13. Selecteer in de weergavemodus "Beeldverwerking" → "Laden in 3D" → "Transversale weergave" → "Volumemeting" → "Start."
   14. Controleer of de slice-oriëntatie en stapparameters ("voxel/spacing") overeenkomen met de acquisitie-instellingen.
   15. Gebruik het muiswiel of de schuifschuif om van het proximale uiteinde naar het distale uiteinde te scrollen en identificeer het eerste stuk waarin het PLN voorkomt (het verschijnt meestal als een ovale of bonenvormige structuur, licht hypoechoïsch ten opzichte van het omliggende vet, met een relatief duidelijke grens).
   16. Begin met het overtrekken van de eerste snede waarin de PLN verschijnt door met de linkermuisknop te klikken om de contour te starten.
   17. Volg een gesloten contour punt voor punt langs de rand van de lymfeklier, waarbij de contour zo dicht mogelijk bij de buitenste capsule blijft en het omliggende vet of vaatlumen wordt vermeden.
   18. Gebruik het muiswiel om naar de snede te gaan die de maximale doorsnede van de PLN toont, en herhaal Stap 10 om de tweede contour te voltooien.
   19. Gebruik het muiswiel om naar de slice te gaan net voordat de PLN verdwijnt, en herhaal Stap 10 om de derde contour te voltooien.
   20. Klik op "Finish" om het 3D-gesegmenteerde volume te genereren en de volumemeting uit te voeren.
   21. Noteer het PLN-volume (mm³) in het resultaatpaneel.
   22. Selecteer in het meetresultatenpaneel "Exporteren" en exporteer de resultaten als een .csv of .xls bestand.
   23. Selecteer het bestandstype en exporteer de afbeelding als TIFF Image Area (.tif).
   24. Houd blinding tijdens analyse aan door alleen de diercode en tijdstip te tonen, zonder de groepstoewijzing (fracture/sham) te tonen, totdat alle volume-extractie is voltooid en de groepen zijn gedecodeerd voor statistische analyse.
3. Statistische analyse met behulp van statistische analysesoftware
   1. Selecteer Nieuwe Tabel & Grafiek, kies Gegroepeerd.
   2. Stel het gegevensinvoerformaat in op Invoer replicatieve waarden, gestapeld in subkolommen.
   3. Voer de ruwe waarden in voor 1 / 7 / 14 en Schijn / Breuk. - Open de grafiek.
   4. Verander het grafiektype naar Verstrooiing (individuele waarden) + gemiddelde + foutbalken.
   5. Formatteren de assen: stel de Y-as in en verander de titel van de as.
   6. Klik op Analyseren en voer een tweerichtings-ANOVA uit.
   7. Vergelijk Sham met Fracture op elk tijdstip.
   8. Voeg de significantieresultaten toe aan de grafiek.

3. Postoperatieve zorg

1. Aan het einde van het experiment plaats je de muis op een warmtekussen en laat je hem herstellen van de narcose.
2. Houd de toestand goed in de gaten en als er geen afwijkingen worden waargenomen, breng hem dan terug naar de kooi voor verdere huisvesting.

4. Evaluatie

OPMERKING: Laat een onderzoeker die blind is voor groepstoewijzing beeldverwerving en kwantitatieve analyses uitvoeren, en houd alle datasets gecodeerd totdat de statistische analyses zijn afgerond.

1. NIR-ICG beeldvorming
   1. Gebruik beeldanalysesoftware om relatieve kwantitatieve analyse van fluorescentieintensiteit uit te voeren in ICG-beelden die van muismatjes zijn verzameld.
      OPMERKING: De berekeningsformule voor de clearance rate van ICG in muisvoetmatjes is als volgt:
      Zuiveringspercentage (%) = [(FI_0h – FI_24h) / (FI_0h)] × 100%
   2. Gebruik dezelfde methode om de clearanceratio voor elke meting vast te leggen en analyseer de relatie tussen lymfatische clearancesnelheid en tijd met behulp van statistische analysesoftware.
2. B-mode ultrascopie
   1. Analyseer B-modus en driedimensionale beelden met behulp van 3D-reconstructiesoftware om het PLN-volume te bepalen.
   2. Beoordeel veranderingen in lymfedrainage en lymfekliervolume in de loop van de tijd door spreidingsdiagrammen te maken met statistische analysesoftware.
3. Statistische analyse
   1. Analyseer herhaalde metingen die zijn verkregen op dag 1, 7 en 14 met tweerichtings-herhaalde metingen ANOVA.

Resultaten

Op dag 1, 7 en 14 na het vaststellen van het fracturemodel was de 24-uur plantaire ICG-fluorescentieintensiteit (FI_24h) in de fracturegroep consequent hoger dan die in de nepoperatiegroep (Figuur 3). Relatieve kwantitatieve analyse van de ICG-fluorescentieintensiteit uit verzamelde plantaire beelden toonde aan dat de lymfatische ICG-clearancesnelheid in de fractuurgroep significant lager was dan die in de schijnchirurgiegroep (p < 0,05) (...

Discussie

Het protocol bevat verschillende gemakkelijk over het hoofd ziende details. Zo is de belichtingstijd niet vast en moet deze worden bepaald op basis van de specifieke fluorescentieintensiteit. De blootstellingstijd voor dezelfde groep muizen op 0 uur en 24 uur moet echter consistent blijven; anders kunnen de resultaten onbetrouwbaar zijn. Bij het gebruik van ultrasoon geluid voor observatie is het essentieel om de onderste ledematen van de muis volledig te bedekken met koppelingsmiddel, o...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10 Microliter Microsyringe	Hamilton Company	80330/00	De Hamilton 80330/00 microsyringe is een precisie-instrument met een 10L capaciteit, voorzien van een naald met een 26s gauge, 51 mm lengte en puntstijl 2. Het is ontworpen voor nauwkeurige levering van kleine volumes in chromatografie, monsterinjectie en analytische chemie toepassingen.
3D Ultrasound Vevo 3100 Imaging System		Vevo 2100	De Vevo 2100 is een hoogfrequent ultrageluidbeeldsysteem voor preklinisch onderzoek, dat realtime 3D-visualisatie van kleine dieren biedt. Het biedt superieure resolutie voor cardiovasculaire, oncologische en ontwikkelingsbiologische studies, geïntegreerd met Vevo LAB-software voor data-analyse.
75% Ethanol	Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.	G73537O	75% ethanol is een desinfectieoplossing die veel wordt gebruikt in laboratoria voor oppervlaktesterilisatie, reiniging van apparatuur en antisepsis. Het doodt effectief bacteriën, virussen en schimmels door eiwitdenaturatie en wordt vaak toegepast in biologische en klinische omgevingen.
Cotton Swab	Hebei Kangji Medical Equipment Co., Ltd.	20250303	Wattenstaafjes zijn steriele, absorberende applicators die worden gebruikt voor nauwkeurige monsterneming, het aanbrengen van oplossingen of het schoonmaken in medische, diagnostische en laboratoriumprocedures. Ze hebben houten of plastic stokjes met katoenen uiteinden voor hygiënische hantering.
Coupling Agent	Tianjin Jinya Technology Development Co., Ltd.	20241029	Koppelmiddel, ook wel ultrasone gel genoemd, is een watergebaseerd medium dat wordt gebruikt om de akoestische transmissie tussen de ultrasone transducer en de huid te verbeteren. Het elimineert luchtzakken voor heldere beeldvorming, is niet irriterend en wordt geleverd in een container van 250 ml voor medisch en diagnostisch gebruik.
Graphpad Prism	GraphPad Software	Prism 10	Een wetenschappelijke grafische en statistische analysesoftware die wordt gebruikt voor data-analyse, visualisatie en presentatie.
Image J	National Institutes of Health	ImageJ 1.54d	Een open-source, Java-gebaseerde afbeeldingsverwerkings- en analyseprogramma dat veel wordt gebruikt voor biologische en medische beeldanalyse.
indocyanine green	Dandong Yichuang Pharmaceutical Co., Ltd.	8305128	Indocyaangroen is een wateroplosbare anionische kleurstof die wordt gebruikt in medische diagnostiek voor het bepalen van de hartuitvoer, leverfunctie, leverbloedstroom en angiografie van het oog. Het wordt geleverd in flacons van 25 mg voor intraveneuze toediening en vertoont fluorescentie in het nabije infrarode spectrum voor beeldvormingsdoeleinden.
isoflurance	RWD	R650-IE	Isofluran is een inhalatiegeen algemeen anestheticum. Het heeft een kleine bloed/gas-verdelingscoëfficiënt. Bij gebruik voor dierlijke anesthesie kan het glad, snel en comfortabel anesthesie induceren, met een snelle hersteltijd, goede spierrelaxatie en geen opwindende effecten op het sympathische zenuwstelsel. De stofwisseling van isofluran in de lever is laag, dus het heeft weinig toxiciteit voor de lever en er zijn geen duidelijke bijwerkingen, zelfs bij herhaald gebruik. Om de nadelige effecten van anesthesiegassen op het milieu en laboratoriumpersoneel te voorkomen, wordt het aanbevolen om het samen met een gasrecuperatiesysteem te gebruiken.
Microbalance	Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd.	FA1004B	De FA1004B microbalance is een hoogprecisiegeanalytisch instrument dat is ontworpen voor nauwkeurig wegen van kleine monsters, met een afleesbaarheid tot 0,0001 g en geschikt voor laboratoriumtoepassingen die nauwkeurige metingen vereisen in onderzoek en kwaliteitscontrole.
Near-Infrared Imaging System	Olympus	MVX10	De Olympus MVX10 is een macro zoomfluorescentiemicroscoopsysteem geoptimaliseerd voor nabije infrarode beeldvorming. Het biedt hoogwaardige visualisatie van grote specimens met een breed zoombereik, geavanceerde optica voor diepe weefselpenetratie en compatibiliteit met fluorescentietechnieken in biologisch en materiaalonderzoek.
Vevo lab	\	Vevo LAB	Een beeldanalysesoftwarepakket dat wordt gebruikt voor het analyseren van Vevo-beeldgegevens, inclusief meting, berekening en rapportgeneratie.