Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Deze studie toont aan dat Shengdu Pingmu-formule constipatie bij ratten verlicht door het vochtgehalte en de darmvoortstuwing te verhogen. De effecten zijn geassocieerd met activatie van de PI3K/AKT-route, upregulatie van AQP3 en AQP8, en modulatie van de samenstelling van de darmmicrobiota.
Constipatie is een veelvoorkomende gastro-intestinale aandoening en huidige behandelingen hebben vaak beperkingen. Shengdu Pingmu-formule (SDPF), een aangepaste formulering afgeleid van de traditionele Chinese geneeskunde, is klinisch gebruikt om constipatie te behandelen, maar het werkingsmechanisme ervan blijft onduidelijk. Deze studie gebruikte UPLC-Q/TOF-MS-analyse om 188 verbindingen in SDPF te identificeren, waarvan 50 definitief bevestigd waren. In dierproeven verbeterde de behandeling met SDPF de darmvoortstuwing significant, verhoogde het fecale watergehalte en verkortte de tijd tot de eerste zwarte ontlasting. Netwerkfarmacologie en moleculaire dockinganalyses suggereerden de betrokkenheid van de PI3K/AKT-route, die vervolgens werd gevalideerd door waargenomen upregulatie van deze route en verhoogde expressie van AQP3 en AQP8 in het rectum. Bovendien toonde 16S rRNA-gensequencing aan dat SDPF de homeostase van darmmicrobiota herstelde door gunstige bacteriën zoals Lactobacillus en Bacteroides te verhogen, terwijl bacteriën die geassocieerd worden met ontstekingen werden verminderd. Gezamenlijk verlicht SDPF constipatie effectief via mechanismen die het PI3K/AKT-pad reguleren en de darmmicrobiota moduleren.
Constipatie is een wijdverspreide gastro-intestinale aandoening die wordt gekenmerkt door zeldzame stoelgang, spanning en harde ontlasting, en treft ongeveer 20% van de wereldbevolking met aanzienlijke sociaaleconomische gevolgen1. Chronische constipatie veroorzaakt niet alleen fysieke complicaties zoals aambeien, anale fissuren en ontlasting, maar draagt ook bij aan psychische stress, waaronder angst en depressie, watde kwaliteit van leven van patiënten ernstig aantast. Conventionele therapieën, waaronder osmotische laxeermiddelen en voedingsvezelsupplementen, leveren vaak suboptimale resultaten op vanwege beperkte effectiviteit, mogelijke bijwerkingen en risicoop afhankelijkheid. Traditionele Chinese Geneeskunde (TCM) biedt een holistische benadering, waarbij kruidenformuleringen en acupunctuur worden gebruikt om de darmmotiliteit te reguleren door de Qi-stroom en viscerale homeostasete herstellen. Het gebrek aan gestandaardiseerde protocollen en mechanistische duidelijkheid beperkt echter bredere klinische adoptie. Opkomend onderzoek benadrukt het potentieel van nieuwe interventies, zoals modulatie van darmmicrobiota en bioactieve TCM-afgeleide verbindingen, die de darmfunctie synergetisch kunnen verbeteren met minimale bijwerkingen5. Daarom biedt de ontwikkeling van een evidence-based integratieve therapie die TCM-principes combineert met moderne farmacotherapie veelbelovende mogelijkheden om de behandeling van constipatie te revolutioneren.
Slow transit constipatie (STC) is een essentieel pathologisch model in het fundamenteel onderzoek, dat effectief de kenmerkende motiliteitsstoornis van menselijke constipatie simuleert—significant vertraagde colonische transit6. Het dient als een "decoder" om de moleculaire mechanismen van constipatie te verduidelijken, waardoor onderzoekers pathologische veranderingen in rectaal weefsel7, het enterisch zenuwstelsel8, interstitiële cellen van Cajal9 en belangrijke signaalroutes10 direct kunnen onderzoeken, waardoor macroscopische symptomen worden overbrugt met cellulaire en moleculaire afwijkingen die buiten het bereik van klinische studies11 liggen. Internationaal omvatten gevestigde methoden voor de ontwikkeling van STC-rattenmodellen voornamelijk chemisch geïnduceerde benaderingen12, met name het gebruik van loperamide—een perifere opioïde receptoragonist die neuronale activiteit en acetylcholineafgifte onderdrukt om consequent een vertraagde transit binnen 5–7 dagen te induceren—en etiologie-nabootsende strategieën13, zoals langdurige, hoge dosis stimulant laxeermiddel, wat leidt tot colonische zenuwbeschadiging, melanosis coli, en daaropvolgend laxeermiddel-afhankelijke colonische traagheid. Het STC-rattenmodel biedt dus niet alleen een venster op de complexe etiologie van constipatie, maar dient ook als een cruciale brug die basismechanistische inzichten verbindt met klinische toepassingen.
De Shengdu Pingmu-formule (SDPF), bestaande uit Radix Paeoniae Alba (Baishao), Curcuma longa (Jianghuang), Rhizoma cibotii (Tanggouji), Siegsbeckia orientalis L. (Xixiancao) en Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian), is een aangepaste ziekenhuisbereiding die is afgeleid van de theorie van de traditionele Chinese geneeskunde en al lange tijd in onze afdeling wordt gebruikt voor aanverwante aandoeningen. Voorlopige klinische observaties uit ons ziekenhuis suggereerden dat SDPF de symptomen van constipatie kan verlichten (ongepubliceerde gegevens). Onderzoek heeft aangetoond dat de PI3K/AKT signaalroute betrokken is bij de regulatie van colonmotiliteit14, waarbij darmmicrobiota en hun metabolieten een cruciale rol kunnen spelen door enterische neurale en gladde spieractiviteiten te moduleren15. Desalniettemin blijven de precieze reguleringsmechanismen onvolledig begrepen. Wij stellen voor dat het PI3K/AKT-pad en de darmmicrobiota samen een essentiële as vormen voor het reguleren van de colonmotiliteit. Er wordt verondersteld dat de therapeutische effecten van TCM-formuleringen op colonische dysmotiliteit mogelijk samenhangen met modulatie van de PI3K/AKT-route en het herbalanceren van de microbiota-darmas. Deze studie vult deze kloof door een nieuwe, geïntegreerde hypothese voor te stellen en te testen: dat het PI3K/AKT-pad en de darmmicrobiota functioneren als een cruciale, onderling afhankelijke as voor de darmmotiliteit. Het primaire doel van dit werk is te bepalen of het therapeutische effect van SDPF op slow-transit constipatie wordt gemedieerd door de dubbele modulatie van deze as. Specifiek onderzochten we met behulp van een rattenmodel de effecten van SDPF op belangrijke PI3K/AKT signaalproteïnen, verschuivingen in de samenstelling van darmmicrobiota en de functie van colonische motiliteit. Door dit gecombineerde mechanisme te verduidelijken, levert dit onderzoek, naar onze kennis, het eerste experimentele bewijs voor een microbiota-PI3K/AKT-as als een geïntegreerd doelwit van TCM-gebaseerde interventie, waarmee een meer uitgebreide moleculaire basis wordt geboden voor de behandeling van colonische motiliteitsstoornissen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Richtlijn voor de Zorg en het Gebruik van Laboratoriumdieren (National Institutes of Health, herzien 2011) en goedgekeurd door de Ethics Review Board van de Shandong University of Traditional Chinese Medicine (Welfare Ethics License nummer: SDUTCM20250421238).
Voorbereiding van SDPF
Het kruidenmengsel bestaat uit Radix Paeoniae Alba (Baishao) 20 g, Curcuma longa (Jianghuang) 10 g, Rhizoma cibotii (Tanggouji) 10 g, Siegsbeckia orientalis L. (Xixiancao) 30 g, en Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian) 30 g. Deze combinatieverhouding werd bepaald op basis van klinische ervaring. De formule werd gewonnen door eerst te weken in gedeïoniseerd water in een vaste vloeistofverhouding van 1:9 (g/mL) gedurende 30 minuten, gevolgd door 60 minuten te koken. De resulterende oplossing werd onmiddellijk door gaas gefilterd en 5 minuten gecentrifugeerd op 4.500 × g om het supernatant op te vangen. Het residu werd vervolgens twee keer opnieuw gewonnen onder dezelfde omstandigheden (1:9 verhouding, gedeïoniseerd water) met een verkorte kooktijd van 30 minuten voor elke volgende extractie. De supernatanten van alle drie de extracties werden gecombineerd, geconcentreerd en vacuüm gevriesdroogd gedurende 5–7 dagen om het SDPF-poeder te verkrijgen, dat onder koeling werd opgeslagen voor verder gebruik.
Samenstellenanalyse van SDPF
Om vaste monsters te bereiden, werd een geschikte hoeveelheid gehomogeniseerd materiaal overgebracht in een 2 mL centrifugebuis, gecombineerd met 1 mL 70% methanol in water en 3 mm roestvrijstalen kralen, waarna deze 3 minuten in een geautomatiseerde molen werd verwerkt, gevolgd door 10 minuten vortexen. Vloeibare monsters werden verdund met puur methanol en 10 minuten in vortex gehouden. Vervolgens werden alle monsters gecentrifugeerd op 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C, en werden de resulterende supernatanten gefilterd door een 0,22 μm-filter. Voor instrumentele analyse werd 2-chlorofenylalanine (interne standaard, 100 μg/mL) in het filtraat verwerkt om een uiteindelijke concentratie van 1 mg/L te bereiken. De chromatografische scheiding werd uitgevoerd op een LC-MS-systeem uitgerust met een C18-kolom (1,8 μm × 2,1 mm × 100 mm), gehandhaafd op 30 °C, met een debiet van 0,3 mL/min. De mobiele fase bestond uit 0,1% mierenzuur in water (A) en zuiver acetonitril (B). Het injectievolume werd ingesteld op 2 μL en de autosampler bleef op 4 °C. Massaspectrometriedetectie werd uitgevoerd in zowel positieve als negatieve ionisatiemodi onder de volgende omstandigheden: verwarmingstemperatuur bij 325 °C, mantelgas bij 45 willekeurige eenheden, hulpgas bij 15 arb, veeggas bij 1 arb, elektrosprayspanning bij 3,5 kV, capillaire temperatuur bij 330 °C en S-lens RF-niveau bij 55%. Gegevens werden verkregen over een m/z-bereik van 100–1500 in full-scan MS-modus met een resolutie van 120.000, terwijl MS/MS-fragmentatie werd uitgevoerd in data-afhankelijke acquisitiemodus (dd-MS2, TopN=5) bij 60.000 resolutie met behulp van hogere-energetische collisionele dissociatie.
Dierproeven
Tweeënzeventig mannelijke Sprague-Dawley-ratten (6 weken oud, aanvankelijk lichaamsgewicht 180–200 g; RRID: IMSR_JAX:000664) werden ondergebracht onder SPF-omstandigheden (24 ± 1 °C, 12 uur licht/donker cyclus) met vrije toegang tot voedsel en water. Na een week acclimatisatie werden ze willekeurig verdeeld in zes groepen (n=12/groep) op basis van lichaamsgewicht: (1) blanco controle (normale zoutoplossing), (2) constipatiemodelgroep (10 mg/kg loperamide hydrochloride), (3) lage (SDPF-L)-, (4) medium(SDPF-M)- en (5) hoge (SDPF-H)-dosering SDPF-groepen (respectievelijk 6, 9 en 12 g/kg), en (6) positieve controle (2 mg/kg mosapride citraat). SDPF werd vers bereid als suspensie in gedestilleerd water bij concentraties van 3, 4,5 en 6 g/mL en toegediend met orale gavage bij een vast volume van 2 mL/kg, wat overeenkomt met doses van respectievelijk 6, 9 en 12 g/kg. Loperamidehydrochloride werd vers bereid als suspensie in gedestilleerd water met een concentratie van 5 mg/mL en toegediend via orale gavage met een vast volume van 2 mL/kg (gelijk aan 10 mg/kg). Na een week acclimatisatie werd constipatie opgewekt in groepen (2) – (6) door orale gavage van loperamide hydrochloride eenmaal daags gedurende een week. De blanke controlegroep ontving een gelijkwaardig volume normale zoutoplossing. Vervolgens kregen ratten in groepen (3)–(5) de volgende week SDPF-behandeling via orale gavage eenmaal daags, de positieve controlegroep (6) kreeg daarnaast gelijktijdig mosapridecitraat (2 mg/kg), terwijl ratten in groepen (2) – (6) loperamidehydrochloride (10 mg/kg) eenmaal dagelijks bleven ontvangen om het constipatiemodel te behouden. De blanke controlegroep bleef normale zoutoplossing ontvangen. Aan het einde van de behandelingsperiode werden alle ratten 's nachts vastend met gratis toegang tot water. Dieren werden vervolgens verdoofd met een intraperitoneale injectie van natriumpentobarbital (40 mg/kg lichaamsgewicht). Na diepe anesthesie, bevestigd door het ontbreken van pedaalreflexen, werden ratten geëuthanaseerd door een cervicale ontwrichting. Direct daarna werden rectale weefsels snel geoogst. Voor histologische en immunohistochemische analyses werden weefselsegmenten vastgezet in 4% paraformaldehyde. Voor eiwitexpressie-analyse werden weefselmonsters ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 °C tot verder gebruik.
Eerste zwarte kruk
De tijd tot uitscheiding van de eerste zwarte ontlasting werd geregistreerd voor drie ratten per groep. Voorafgaand aan het experiment werden alle ratten 12 uur vastend met vrije toegang tot water. Elk dier kreeg vervolgens een intragastrische toediening van een voorbereide inktsuspensie (5% actieve kool en 5% Arabisch gom) met een dosis van 10 mL/kg lichaamsgewicht, waarbij het exacte toedieningstijdstip werd geregistreerd. Na de gavage werden de ratten individueel in aparte kooien gehuisvest met ad libitum toegang tot voedsel en water. Het verschijnen van de eerste zwarte ontlasting van elke rat werd zorgvuldig geobserveerd en geregistreerd om de darmtransittijd te berekenen.
Fecale waterinhoud
Na succesvolle modelopbouw en aan het einde van de behandeling werden verse ontlastingsmonsters die binnen 2 uur werden uitgescheiden van elke groep ratten (n = 6) verzameld en in voorgewogen droge EP-buizen geplaatst. Het natte gewicht van de ontlasting werd onmiddellijk geregistreerd. Vervolgens werden de monsters overgebracht naar een droogoven en 36 uur gedehydrateerd bij 60 °C. Na de initiële droogperiode werden de monsters gewogen en teruggebracht in de oven, waarbij gewichtsmetingen elke 2 uur werden herhaald totdat een constant gewicht was bereikt (wat volledige uitdroging aanduidt). Het percentage fecale waterinhoud werd vervolgens berekend met de volgende formule:
Fecale waterinhoud (%) = [(Nat gewicht - Droog gewicht) / Nat gewicht] × 100%
Intestinale voortstuwingssnelheid
Na een nuchtere periode van 12 uur (met vrije toegang tot water) kregen ratten van elke groep (n = 6) een intragastrische dosis (10 mL/kg) inktsuspensie toegediend die 5% actieve kool en 5% gom arabicum bevatte. Vijfentwintig minuten later werden de dieren verdoofd via intraperitoneale injectie van 5% chloralhydraat. De buikstreek werd gedesinfecteerd door 75% ethanol af te vegen voordat weefsel werd verzameld, waarna de ledematen op een dissectiebord werden vastgezet. De buikholte werd voorzichtig blootgelegd met een chirurgische schaar en het darmkanaal van de pylorus tot de ileocecale overgang werd verwijderd. De geïsoleerde darm werd rechtgetrokken op steriel filterpapier en er werden twee metingen vastgelegd: (1) de totale lengte van de dunne darm, en (2) de afstand die de inktvoorkant aflegde. De darmvoortstuwingsverhouding werd vervolgens berekend met de volgende formule:
Intestinale voortstuwingssnelheid (%) = (Inktmigratieafstand / Totale darmlengte) × 100%
HE-vlekken
Voor de controle-, model-, SDPF-M- en Mos-groepen (n = 3 per groep) werden rectale monsters verzameld en verwerkt voor hematoxyline- en eosinekleuring. De monsters werden vastgesteld in 4% paraformaldehyde, gedehydrateerd in gegradueerd ethanol en ingebed in paraffineblokken. Dunne secties, met een dikte van 4–5 μm, werden voorbereid en bevestigd op glasglaasjes voordat ze conventioneel hematoxylin- en eosinekleuring ondergingen. De procedure begon met deparaffinisatie met xyleen, gevolgd door rehydratatie via een reeks dalende ethanolconcentraties. De kernen werden gekleurd door secties 5–8 minuten aan hematoxyline bloot te stellen. Na differentiatie in 1% zuuralcohol en blauwing in 0,2% ammoniakwater, werden het cytoplasma en de extracellulaire matrix 1–2 minuten tegengekleurd met eosine. Ten slotte werden de gekleurde delen gedehydrateerd, verwijderd en gemonteerd met dekfolies voor microscopische observatie. Deze benadering maakte een gedetailleerde beoordeling mogelijk van de darmmucosale morfologie, inclusief de structuur van villi en crypts, de toestand van epitheelcellen en de aanwezigheid van inflammatoire infiltraten in de lamina propria.
KEGG-route- en GO-verrijkingsanalyse
Met gebruik van het eerder vastgestelde chemische profiel van SDPF werden silico-voorspellingen van eiwitdoelen voor elk bestanddeel uitgevoerd met behulp van het SwissTargetPrediction-platform. Veronderstelde doelen die relevant zijn voor constipatie werden gefilterd en onderworpen aan functionele annotatie met behulp van de DAVID 6.8-database, met een significantiegrens van P < 0,05. De resulterende genset werd vervolgens onderworpen aan GO-classificatie om de rol ervan in biologische processen, moleculaire functies en cellulaire componenten te verduidelijken. Om hun betrokkenheid bij ziektepathogenese verder te verduidelijken, werden deze doelwitten vervolgens gekoppeld aan KEGG-routes, waarbij verschillende signaalcascades werden onthuld die aanzienlijk verrijkt waren en mogelijk betrokken waren bij het ontstaan en ontwikkelen van constipatie.
Constructie van het "Component-Target-Pathway" netwerk
Een "Component-Target-Pathway" netwerk werd samengesteld in Cytoscape (versie 3.6.1) door systematisch de chemische bestanddelen van SDPF, hun bijbehorende therapeutische doelen voor constipatie en de relevante verrijkte routes te integreren. Binnen dit grafische model werden verschillende knoopgeometrieën gebruikt om de drie datatypen weer te geven: cirkels voor verbindingen, driehoeken voor doelen en rechthoeken voor paden. De sterkte van de verbindingen tussen deze knooppunten werd gekwantificeerd door edge weighting, wat een holistisch beeld bood van de ingewikkelde, meerlaagse farmacologische interacties.
Moleculaire koppeling
Voor de moleculaire dockinganalyse werden vier bioactieve verbindingen—namelijk Cyclocurcumine, Albiflorine, Chlorogenezuur en Quercetine—geselecteerd als ligandenmoleculen, waarvan de structuren werden gedownload uit de PubChem-database met behulp van de bijbehorende CAS-registernummers. Om de eiwitreceptoren voor te bereiden, werd de kennisbank van UniProt geraadpleegd om de doeleiwitten PI3K en AKT te bevestigen, en hun driedimensionale structuren werden vervolgens opgehaald uit de RCSB Protein Data Bank. Deze eiwit- en verbindingsstructuren werden vervolgens verwerkt in Discovery Studio 2019, waar waterstofatomen werden toegevoegd, ladingen werden toegewezen en atoomtypen werden gedefinieerd; Daarnaast werden potentiële bindingspockets op de receptoren geïdentificeerd. De voorbereide liganden en receptoren werden vervolgens opgeslagen in PDBQT-formaat voor koppelingssimulaties. De koppelingsprocedure werd uitgevoerd met de volgende configuratie: een poseclusterstraal van 0,5, generatie van 10 willekeurige ligandconformaties en 10 verfijningsoriëntaties. Na voltooiing van de koppelingsruns werden kandidaatcomplexen geëvalueerd en gerangschikt op basis van hun voorspelde bindingsvrije energieën. De meest energetisch gunstige bindingshoudingen werden uiteindelijk geselecteerd en gevisualiseerd met behulp van PyMOL om belangrijke intermoleculaire interacties te illustreren.
Immunohistochemie
Paraffine-ingebedde rectale monsters, gesneden tot een dikte van 4 μm en verkregen uit de Control, Model- en SDPF-M-behandelingscohorten, werden eerst vrijgemaakt van paraffine en geleidelijk gehydrateerd. Antigenische sites werden blootgelegd door de glaasglaasjes te verhitten in een citraatbuffer aangepast naar pH 6,0. Om endogene peroxidasen te blusten, werden de weefsels behandeld met een 3% waterstofperoxide-oplossing, gevolgd door incubatie met normaal geitenserum om de binding van niet-specifieke antistoffen te verminderen. De secties werden vervolgens 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met primaire antilichamen gericht op gefosforyleerde PI3K en AKT; parallelle secties die met PBS werden geïncubeerd, dienden als negatieve controle. Na grondig wassen werden mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen aangebracht en werd immunokleuring ontwikkeld met behulp van een DAB-chromogeen onder microscopische observatie om de reactietijd te reguleren. Ten slotte werden de weefsels licht tegengekleurd met hematoxyline, gedehydrateerd door gegradueerde alcoholen, schoongemaakt en gemonteerd. De expressieniveaus van p-PI3K en p-AKT werden kwalitatief beoordeeld door twee onafhankelijke onderzoekers die blind waren voor de experimentele groepen, en representatieve beelden werden geselecteerd om verschillen tussen de groepen te illustreren.
Westelijke verplettering
Rectale weefselmonsters van ratten werden twee keer afgespoeld met gekoeld fosfaatgebufferd zoutoplossing voordat ze 10 minuten op ijs werden gehomogeniseerd in een geschikt volume RIPA-lysebuffer. Na homogenisatie werd het mengsel gecentrifugeerd op 15.000 × g, en het supernatant werd behouden voor analyse. De eiwitkwantificatie werd uitgevoerd met behulp van de bicinchoninezuurmethode. Vervolgens werden de monsters gecombineerd met een SDS-laadbuffer en gedenatureerd via incubatie bij 95 °C gedurende 5 minuten. Equivalente eiwithoeveelheden werden vervolgens opgelost via SDS-polyacrylamide gelelektroforese en elektrotransfereerd op polyvinylidendifluoridemembranen met een poriegrootte van 0,45 μm. Na overdracht werden de membranen aan de lucht laten drogen voordat ze werden geblokkeerd met 5% magere droge melk in TBST gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Na deze stap werden de membranen gespoeld met TBST en vervolgens 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met primaire antilichamen gericht op AQP3 (RRID: AB_2837708) en AQP8 (RRID: AB_605941). De volgende dag, na extra wasbeurten met TBST, werden de membranen 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met het juiste mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichaam. Immunoreactieve banden werden uiteindelijk gedetecteerd en vastgelegd met een beeldvormingssysteem.
Immunofluorescentie
De immunofluorescentiekleuringsprocedure werd uitgevoerd op rectale weefselsecties van Control-, Model- en SDPF-M-behandelde ratten als volgt: na cryosectie werden weefsels vastgezet in 4% paraformaldehyde, permeabilisiseerd met 0,1% Triton X-100, en geblokkeerd met een geschikte blokkerende buffer om niet-specifieke binding te voorkomen. De secties werden vervolgens 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met een mengsel van primaire antilichamen tegen AQP3 en AQP8, waarna de ongebonden antilichamen werden weggespoeld en de weefsels 1 uur bij kamertemperatuur in het donker werden geïncubeerd met een mengsel van secundaire antilichamen—specifiek geitenanti-konijn IgG geconjugeerd aan Alexa Fluor 594 (rood) om AQP3 te labelen en geitenanti-muis IgG geconjugeerd met Alexa Fluor 488 (groen) om AQP8 te labelen. Na secundaire antilichaamincubatie en daaropvolgende wasbeurten werden celkernen tegengekleurd met DAPI, en werden de glaasglaasjes bedekt met een waterig montagemedium voorafgaand aan visualisatie en beeldverwerving met een fluorescentie- of confocale microscoop.
16S rRNA-sequencing van fecale microbiota
Voor elke experimentele groep (n = 8) werd bacterieel genomisch DNA geïsoleerd uit rattenuitwerpselmateriaal met behulp van een commerciële Soil DNA Extraction Kit, waarbij alle procedures strikt het protocol van de leverancier volgden. PCR-amplificatie gericht op de V3–V4 hypervariabele regio's van het 16S rRNA-gen werd uitgevoerd op een thermische cycler met behulp van het primerpaar 338F/806R. Amplicon-sequencing werd uitgevoerd op het Illumina MiSeq-platform volgens de richtlijnen van de fabrikant, waardoor voldoende sequencingdiepte werd gegenereerd om verzadiging van de verdunningscurve te bereiken en een betrouwbare microbiële diversiteitsanalyse te garanderen. Na voltooiing van sequencing werden de ruwe reads kwaliteitsgefilterd, met adapters verwijderd en samengevoegd met Trimmomatic en FLASH. Hoogwaardige sequenties werden vervolgens geclusterd in operationele taxonomische eenheden (OTU's) met een 97% gelijkenisdrempel met behulp van UPARSE, en potentiële chimere sequenties werden geïdentificeerd en verwijderd met behulp van UCHIME. Taxonomische toewijzing van representatieve sequenties werd uitgevoerd met behulp van de RDP-classifier tegen de SILVA-referentiedatabase, met een betrouwbaarheidsdrempel van 70%. Om alfa-diversiteit binnen microbiële gemeenschappen te evalueren, zijn de Chao1-rijkdomsschatter en de Shannon-diversiteitsindex berekend met behulp van het Mothur-softwarepakket (v.1.30.2). Voor bètadiversiteitsanalyse werd hoofdcoördinatenanalyse uitgevoerd om samenstellingsverschillen tussen groepen te visualiseren. Er werd een Venn-diagram geconstrueerd om de verdeling van unieke en gedeelde OTU's over verschillende experimentele omstandigheden te illustreren. De identificatie van verschillend overvloedige taxa tussen cohorten werd uitgevoerd met behulp van lineaire discriminantanalyse van effectgrootte. Ten slotte werd predictief profileren van microbiële gemeenschapsfuncties uitgevoerd met behulp van PICRUSt2, dat functioneel potentieel afleidde uit KEGG-ortologie-annotaties.
Statistieken
Alle statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS 23.0 en GraphPad Prism 8.0. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). De normaliteit van de gegevensverdeling werd beoordeeld met behulp van de Shapiro–Wilk-test. Voor vergelijkingen tussen twee groepen werd de onafhankelijke steekproeven Student t-test gebruikt voor normaal verdeelde data, en de Mann–Whitney U-test voor niet-normaal verdeelde data. Voor vergelijkingen met drie of meer groepen werd eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) gevolgd door Tukey's post-hoc test gebruikt voor normaal verdeelde data, terwijl de Kruskal–Wallis-test gevolgd door Dunns post-hoc test werd gebruikt voor niet-normaal verdeelde data. Voor microbioomanalyses werden differentieel overvloedige taxa geïdentificeerd met behulp van lineaire discriminant analysis effectgrootte (LEfSe) met de standaarddrempel (LDA-score > 2,0), en meervoudige testcorrectie werd toegepast met de Benjamini–Hochberg false discovery rate (FDR) methode. Microbiome-statistische analyses werden uitgevoerd met Mothur (v.1.30.2), LEfSe (online tool, Huttenhower lab) en PICRUSt2 (v.2.5.0). Een p-waarde van minder dan 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
SDPF-extractie en lyofilie
SDPF is een multi-kruidenformulering bestaande uit vijf medicinale planten: Radix Paeoniae Alba (Baishao), Curcuma longa (Jianghuang), Rhizoma cibotii (Tanggouji), Siegesbeckia orientalis L. (Xixiancao) en Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian) (Figuur 1A). Het mengsel werd geëxtraheerd met gezuiverd water en gelyofilieerd tot poeder voor verdere analyse (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Chronische constipatie is een multifactoriële aandoening die complexe interacties omvat tussen darmmicrobiotadysbiose, verminderde neuromusculaire functie en veranderde darmafscheiding. Deze manifestaties duren langer dan zes maanden en verminderen aanzienlijk de kwaliteitvan leven van patiënten. Constipatie kan worden ingedeeld in verschillende subtypen, waaronder slow-transit, normal-transit, defecatiestoornis en gemengde types20. Hoewel ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.
Financiering: Dit onderzoek werd ondersteund door het Shenzhen Science and Technology Program (subsidienummer JCYJ20220531092203007).
We zijn Dr. Liqun Qu van de Shandong University of Traditional Chinese Medicine zeer dankbaar voor het bieden van technische begeleiding bij het vaststellen van het ratconstipatiemodel.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Automated grinder | High-throughput tissue homogenizer for sample grinding | JXFSTPRP-48 | |
| LC-MS systeem | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive HF LC-MS systeem | Ultra-hoogwaardig vloeistofchromatografie–massaspectrometrie systeem |
| Massaspectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive HF | High-resolutie Orbitrap massaspectrometer |
| C18 kolom | Agilent Technologies | Zorbax Eclipse Plus C18 (2,1 × 100 mm, 1,8 μm) | Omgekeerde fase kolom voor verbindingsscheiding |
| Beeldscansysteem | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | Gel en blot beeldvormingssysteem |
| Thermocycler | Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific) | GeneAmp PCR System 9700 | PCR versterkingsinstrument |
| Soil DNA Extractie Kit | Omega Bio-Tek | D5625 | Kit voor microbiële DNA extractie uit fecale/bodemmonsters |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.