Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Single-cell RNA-sequencing van longweefsel in een ratmodel van het acute respiratoire distresssyndroom

435 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70491

⸱

7 april 2026

 ,  , 
1Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel presenteert een gestandaardiseerd protocol voor single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analyse van longweefsel in een ratmodel van het Acute Ademhalend Distress Syndroom (ARDS). Het beschrijft stappen van het opzetten van door LPS geïnduceerde modellen tot bio-informatische analyse, waarbij 21 celclusters en 6 macrofagensubpopulaties worden geïdentificeerd, en belangrijke ontstekingsroutes worden belicht die betrokken zijn bij de pathogenese van ARDS.

Samenvatting

Het Acuut Ademhalingsnoodsyndroom (ARDS) is een ernstige ontstekingsaandoening van de longen met een hoge sterfte, gekenmerkt door ontregelde immuunresponsen en alveolaire schade, maar de cellulaire heterogeniteit blijft onvolledig begrepen. Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) biedt ongekende resolutie om celtype-specifieke mechanismen te dissecten, maar de toepassing ervan in ARDS wordt belemmerd door technische variabiliteit. Hier presenteren we een gestandaardiseerd protocol voor scRNA-seq-analyse van longweefsel in een lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerd rat-ARDS-model. Deze methode omvat geoptimaliseerde weefseldissociatie, strenge kwaliteitscontrole, het verwijderen van dubbelt, batcheffectcorrectie en uitgebreide bio-informatische pijplijnen voor clustering, annotatie en differentiële expressieanalyse. Onze aanpak identificeert betrouwbaar 21 verschillende celpopulaties en onthult zes macrofaag/monocyt subpopulaties met unieke transcriptiesignaturen in ARDS. Subcluster-specifieke differentiële genexpressie- en functionele verrijkingsanalyse identificeerden verder belangrijke genen en routes die ten grondslag liggen aan de pathogenese van ARDS. Deze reproduceerbare workflow maakt diepgaande karakterisering mogelijk van cellulaire diversiteit, ontstekingsroutes en kandidaat-therapeutische doelwitten, wat een robuuste basis biedt voor mechanistische en translationele studies in ARDS.

Inleiding

Acuut Ademhalingsnoodsyndroom (ARDS) is een acute luchtwegaandoening die wordt gekenmerkt door diffuse longontsteking en niet-cardiogene longoedeem, die zich voornamelijk uiten in progressieve hypoxemie en ademhalingsfalen 1,2. De pathologische mechanismen van ARDS omvatten ontregelde ontstekingscascades, verstoring van de alveolair-capillaire barrière en abnormale activatie en interacties van meerdere immuunceltypen 3,4. Tijdens de progressie van ARDS drijven immuuncellen in longweefsel ontstekingscascades aan door afscheiding van ontstekingsmediatoren en modulatie van immuunreacties, waardoor het longendotire wordt verstoord, de activatie van de extrinsieke stollingscascade wordt geactiveerd en longschade verergert 5,6,7. Het huidige begrip van cellulaire pathologische mechanismen in ARDS blijft echter beperkt, wat de ontwikkeling van specifieke farmacologische therapieën belemmert, terwijl de huidige beheerstrategieën voornamelijk bestaan uit verschillende modaliteiten van zuurstofondersteuning en mechanische ventilatie1. Diepgaande karakterisering van cellulaire heterogeniteit en dynamische veranderingen tijdens de pathogenese van ARDS is van het grootste belang voor het identificeren van nieuwe therapeutische doelwitten en het ontwikkelen van nieuwe behandelstrategieën 8,9,10.

De opkomst van single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) technologie heeft revolutionaire doorbraken gebracht in RNA-sequencingonderzoek, waardoor we cellulaire heterogeniteit en functionele dynamiek in ziektepathogenese kunnen analyseren11,12. In vergelijking met traditionele bulk RNA-sequencing kan scRNA-seq-technologie zeldzame maar cruciale celsubpopulaties identificeren, dynamische processen van cel-toestandsovergangen onthullen en complexe intercellulaire interactienetwerken ontdekken, informatie die vaak wordt gemaskeerd in analyses op populatieniveau 13,14,15. Recente scRNA-seq-studies in ARDS hebben aanzienlijke vooruitgang geboekt, waaronder de identificatie van specifieke monocytgenexpressiesignaturen, de ontdekking van abnormale macrofagenpolarisatiepatronen en het ophelderen van profibrotische intercellulaire communicatienetwerken 16,17,18,19 . Deze bevindingen verdiepen niet alleen ons begrip van de pathofysiologische mechanismen van ARDS, maar bieden ook nieuwe inzichten in de ontwikkeling van biomarkers, ziektestratificatie en precisietherapie20,21.

Het huidige onderzoek van ARDS scRNA-seq kent echter uitdagingen, waaronder onvoldoende methodologische standaardisatie, aanzienlijke verschillen in monsterverwerkingsprotocollen en inconsistente dataanalysepijplijnen, die de reproduceerbaarheid van onderzoeksresultaten en hun klinische translationele toepassingen beperken22,23. Dit protocol pakt de technische uitdagingen aan die gepaard gaan met scRNA-seq-analyse van ARDS-longweefsel door procedures voor weefselverwerking, kwaliteitscontrole en data-analyse te optimaliseren, waarmee een basis wordt gelegd voor mechanistische studies en therapeutische ontwikkeling. De gestandaardiseerde benadering zorgt voor reproduceerbaarheid tussen verschillende laboratoria en faciliteert vergelijkende studies in ARDS-onderzoek naar cellulaire heterogeniteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Twaalf specifieke pathogeenvrije (SPF) mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten, 6–7 weken oud en met een gewicht van 220 g ± 10 g, werden gekocht van Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Dierlicentienummer: SCXK (Jing) 2025-0008). De ratten werden gehuisvest in het Laboratoriumdierencentrum van het Dongzhimen Ziekenhuis, Beijing Universiteit voor Chinese Geneeskunde, in overeenstemming met de nationale norm "Laboratoriumdieren - Vereisten voor Milieu en Huisvesting" (GB 14925-2010, uitgegeven door het Nationaal Laboratorium Dierenstandaardisatie Technisch Comité van China). De experimentele procedures werden goedgekeurd door de Commissie voor Dierenwelzijn en Ethiek van het Dongzhimen Ziekenhuis, Beijing Universiteit voor Chinese Geneeskunde (Goedkeuringsnummer: 24-54). De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Modeloprichting en monsterverzameling

OPMERKING: Voorafgaand aan het experiment onderneem alle ratten een acclimatisatieperiode van 1 week om stressgerelateerde effecten te minimaliseren.

  1. Los Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) op in 0,9% zoutoplossing om een 0,4 mg/mL LPS-oplossing te verkrijgen.
  2. Verdeel willekeurig 12 mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten met SPF in twee groepen: een controlegroep (n = 6) en een ARDS-modelgroep (n = 6).
  3. Geef 0,9% zoutoplossing via injectie intratracheaal in een dosis van 0,5 mL/100g lichaamsgewicht aan de controlegroep.
  4. Geef de 0,4 mg/mL LPS-oplossing via injectie intratracheaal op hetzelfde volume (0,5 mL/100g) aan de ARDS-modelgroep, en na 16 uur doof je de ratten met isoflurane (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
  5. Verzamel bloed via de abdominale aorta en centrifugeer vervolgens (4 °C, 1000 × g, 30 min) om serum te verkrijgen.
  6. Open de thoracale holte en haal longweefsel eruit.
  7. Voer bronchoalveolaire spoeling uit via de bronchiale stomp met een spuit om bronchoalveolaire spoelvloeistof (BALF) te verkrijgen.
  8. Haal de rechterlongkwab en spoel deze af met PBS voor een volgend pathologisch onderzoek.
  9. Oogst de linker longkwab en spoel deze af met PBS voor volgende single-celsequencing en moleculaire biologische experimenten 26,27.

2. Histopathologische beoordeling van longweefsel

  1. Dompel het geoogste rechterlongweefsel van ratten onder in 4% paraformaldehyde voor fixatie gedurende 12 uur.
  2. Na fixatie droog je het weefsel door een gegradueerde reeks ethanol (70%, 80%, 90%, 95%, 100% en 100%), waarbij je 2 uur per concentratie toelaat.
  3. Behandel het uitgedroogde weefsel met xyleen totdat het transparant wordt.
  4. Infiltreer het transparante weefsel met gesmolten paraffine in een oven van 60 °C gedurende 2 uur.
  5. Plaats het geïnfiltreerde weefselblok in een inbeddingsmal, giet verse paraffine erin en laat het afkoelen en stolen tot een paraffineblok.
  6. Snijd het paraffineblok in plakjes van 4 μm dik met een microtoom, laat de secties drijven in een waterbad van 45 °C om ze te verspreiden, en neem ze vervolgens op met poly-L-lysine gecoate glaasjes.
  7. Bak de glaasjes in een oven van 60 °C om een stevige hechting van de secties aan de glaasjes te garanderen.
  8. Deparaffiniseer de secties door onderdompeling in xyleen en rehydrateer ze via een dalende ethanolgradiënt (100%, 95%, 90%, 80% en 70%).
  9. Spoel de secties af met PBS, voer hematoxyline- en eosinekleuring (HE) uit en monteer de coverslips met neutrale hars.
  10. Beoordeel het longletsel op gescande secties van hele dia's met behulp van een gestandaardiseerd scoresysteem gebaseerd op neutrofileninfiltratie, interstitiele ontsteking, oedeem en verstopping.
    OPMERKING: Elke parameter werd gescoord van 0 tot 4 op basis van de mate van pathologische betrokkenheid: 0 (geen); 1 (≤25%); 2 (26-50%); 3 (51-75%); 4 (>75%)28,29.

3. Enzym-gekoppelde immunosorbent-assay

OPMERKING: Monsters kunnen op -80 °C worden gehouden als analyse niet direct na de verworving kan worden uitgevoerd.

  1. Los de standaarden op en laat ze 15 minuten op kamertemperatuur staan, waarna je seriële verdunning uitvoert volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Bereid de biotinyleerde antilichaam-werkoplossing, enzymconjugaat-werkoplossing en wasbuffer voor zoals voorgeschreven in de handleiding.
  3. Voeg 100 μL van elk monster of 100 μL seriëel verdunde standaarden toe aan de met antilichamen gecoate putten en incubeer bij 37 °C gedurende 90 minuten.
  4. Was de plaat 4 keer met een plaatwasser, voeg 100 μL biotinyleerde antistofwerkoplossing toe en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten.
  5. Was de plaat 4 keer, voeg 100 μL enzymgeconjugeerde werkoplossing toe en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten.
  6. Voeg per put 100 μL substraatoplossing toe en incubeer beschermd tegen licht bij 37 °C gedurende 10 minuten.
  7. Voeg 100 μL stopoplossing per put toe, meng voorzichtig en meet de optische dichtheid (OD) bij 450 nm met een microplaatlezer.
  8. Genereer een standaardcurve door de OD-waarden uit te zetten tegen standaardconcentraties met de ontworpen software.
  9. Bepaal de monsterconcentraties op basis van de gemeten OD-waarden en de standaardcurve.

4. Voorbereiding van single-cell suspensies voor sequencing

OPMERKING: Nadat longweefsel is verkregen, moet het op ijs worden gelegd en snel worden verwerkt om de levensvatbaarheid van de cel te behouden.

  1. Was het longweefsel drie keer met PBS voorgekoeld tot 4 °C.
  2. Voeg 2 ml voorgekoeld PBS toe en maal deze verder in kleinere fragmenten met een steriele schaar tot ongeveer 0,5 mm3 inch groot.
  3. Gebruik een Pasteur-pipet om het gehakte weefsel samen met PBS over te brengen in een 15 mL centrifugebuis.
  4. Voeg nog eens 1 ml PBS toe, voorgekoeld tot 4 °C, aan de kweekschaal, spoel en suspendeer de resterende weefselfragmenten opnieuw, en breng de suspensie over in dezelfde buis.
  5. Stel het volume bij op 6,5 mL met PBS voorgekoeld tot 4 °C, verteert weefselfragmenten in enzymoplossing met Collagenase I (100 U/mL) en Dispase II (1 U/mL), en incubeer met zacht schudden op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  6. Wanneer de weefselfragmenten doorschijnend worden en er geen duidelijke vaste stukken meer overblijven, filter je het verteerde weefsel door 70 μm en 40 μm celfilters, centrifugeer je (4° C, 500 × g, 5 min) en gooi je het supernatant weg.
  7. Onmiddellijk opnieuw opsussen in 3 ml rode bloedcel (RBC) lysebuffer, meng voorzichtig door te pipetteren en glyceer op ijs gedurende 10 minuten.
  8. Wanneer de supernatant bleekgeel of bijna kleurloos lijkt, voeg dan 7 mL PBS toe om de reactie te beëindigen, centrifugeer (4 °C, 500 × g, 5 min) en gooi het supernatant weg.
  9. Voeg 3 mL PBS toe om de cellen opnieuw te laten suspenseren en bepaal de celconcentratie en levensvatbaarheid met trypanblauwe kleuring.
    OPMERKING: Als de levensvatbaarheid van cellen onder de 70% ligt, voer dan een procedure uit voor het verwijderen van dode cellen.
  10. Was de cellen twee keer met een wasbuffer die 0,04% rundereserumalbumine (BSA) bevat, bereid in DPBS.
  11. Susselt de cellen opnieuw voor tellen en pas de concentratie aan op 1.000 cellen/μL voor latere belasting en detectie.

5. Kwaliteitscontrole voor single-cell sequencinggegevens

OPMERKING: Enkelcel-RNA-bibliotheken zijn bereid uit celsuspensies met behulp van een druppel-gebaseerde methode van het bouwen van enkelcelbibliotheken. Bibliotheken werden gesequenced op een high-throughput platform met behulp van DNA-nanoball-gebaseerde sequencingchemie. Ongeveer 21.000 cellen per bibliotheek werden geladen, met als doel een celherstelpercentage van ~60%. Sequencing genereerde in totaal 5,0 × 108 lezingen per bibliotheek, met een gemiddelde diepte van 30.000-40.000 lezingen per cel. Ruwe sequencinggegevens werden verwerkt met behulp van de bijbehorende single-cell RNA-analysepijplijn om de genexpressiematrix voor elk monster te produceren.

  1. Bouw de Oligo-bibliotheek op met PCR en barcodelabeling, waarbij een concentratie >10 ng/μL en een piekgrootte van 180 bp ±10 bp wordt gegarandeerd.
  2. Bouw de cDNA-bibliotheek op door fragmentatie, eindreparatie, adapterligatie en PCR, waarbij concentratie >10 ng/μL en een piekgrootte van 350–550 bp wordt gegarandeerd.
  3. Genereer een Seurat-object voor elk monster uit de genexpressiematrix met behulp van de Read10X-functie in het Seurat-pakket (v4.3.0) in R-software (v4.2.0).
  4. Verwijder cellen van lage kwaliteit door die met mitochondriale genproportie >10% of hemoglobinegenproportie >5% eruit te filteren.
  5. Normaliseer de data met de "LogNormalize"-methode met een schaalfactor van 10.000.
  6. Identificeer zeer variabele kenmerken met behulp van de "VST"-methode en behoud de top 2.000 genen voor downstream analyse.
  7. Voer celcyclusscores uit met behulp van Seurats ingebouwde celcyclusmarkergenen en regresseer de celcycluseffecten (G2M. Score en S.Score) tijdens data-schaal.
  8. Detecteer en verwijder potentiële doublets met DoubletFinder (v2.0.3) met pN = 0,25, pK = 0,09 en een verwachte doubletrate van 0,06, en sluit deze uit van verdere verwerking.
  9. Correctie van batcheffecten over samples met het Harmony-pakket (v0.1.1) met theta = 2 en max.iter.harmony = 20.
  10. Voeg informatiekolommen toe voor individuele voorbeeldnamen en groeperingsdetails van de ARDS-modelgroep en controlegroep aan de metadata in het Seurat-object.

6. Dimensionaliteitsreductie, clustering en celtype-annotatie

  1. Voer principal component analysis (PCA) uit op zeer variabele genen met behulp van de RunPCA-functie in Seurat.
  2. Bepaal het optimale aantal hoofdcomponenten via ElbowPlot-visualisatie.
  3. Identificeer grote celclusters door het Leiden-algoritme toe te passen via Seurats FindClusters-functie en FindNeighbors-functie met een resolutie van 0,1.
  4. Voer een omlaag van de dimensie-dimensionaliteit van UMAP uit met behulp van de geselecteerde hoofdcomponenten.
  5. Annoteer celtypen door markergenen te identificeren met de FindAllMarkers-functie.
  6. Visualiseer markergenexpressie over celtypen met behulp van de DotPlot-functie.
  7. Voeg een nieuwe informatiekolom met celannotatieresultaten toe aan de metadata en visualiseer celtype-annotatie met Umap.
  8. Bereken het aandeel van elke experimentele groep binnen elk geïdentificeerd celtype met behulp van dplyr-functies om cellen te tellen en percentages te berekenen.
  9. Genereer gestapelde balkplots met ggplot2 om groepssamenstelling per celtype te illustreren, inclusief percentagelabels en statistische vergelijkingen tussen groepen.

7. Subpopulatieanalyse

  1. Extraheer de doelcelsubpopulatie met behulp van de subsetfunctie en maak een overeenkomstig Seurat-object voor analyse op downstream subpopulatieniveau.
  2. Normaliseer en schaal de subpopulatiegegevens opnieuw op terwijl je mitochondriale genen, hemoglobinegenen, UMI-tellingen en celcyclusscores terughaalt.
  3. Voer secundaire PCA-analyse uit en pas Harmony batchcorrectie specifiek toe op de subpopulatie.
  4. Voer herclustering uit met behulp van FindNeighbors- en FindClusters-functies om verschillende subtypes binnen doelcelsubpopulaties te identificeren.
  5. Genereer nieuwe UMAP-embeddings en visualiseer subpopulatieclusters met celtype-annotaties volgens dezelfde benadering als eerder beschreven.

8. Analyse van differentiële genexpressie

  1. Identificeer differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) tussen de ARDS-modelgroep en controlegroep voor elk subcluster met behulp van de MAST-statistische methode.
  2. Integreer latente variabele regressie om te controleren op sequencing diepte-effecten tijdens differentiële expressietesten.
  3. Filter DEG's op basis van vooraf gedefinieerde log fold change thresholds en aangepaste p-waarden met behulp van de FindMarkers-functie.
  4. Genereer vulkaangrafieken met de ggplotfunctie voor elk subcluster om differentiële genexpressiepatronen met significantielabeling te visualiseren.
  5. Exporteer DEG-resultaten en maak uitgebreide samenvattende tabellen om functionele verrijking en andere downstream-analyses te vergemakkelijken.

9. Verrijkingsanalyse

  1. Koppel gensymbolen aan ENTREZ-ID's met behulp van de organisatie. Rn.eg.db annotatiedatabase voor compatibiliteit van pathwayanalyse.
  2. Combineer DEG's van alle subclusters en filter significante genen op basis van log fold change thresholds en aangepaste p-waarden (Wilcoxon rank-sum test, logfc.threshold = 0,25, p_val < 0,05).
  3. Voer genontologie (GO) verrijkingsanalyse uit met behulp van de verrijking van GO-functie met categorieën Biologisch Proces, Moleculaire Functie, Cellulaire Componentontologie en de Benjamini-Hochberg-correctiemethode.
  4. Voer de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) routeverrijkingsanalyse uit met behulp van de verrijkende KEGG-functie met de rat-organismendatabase en pas statistische significantiedrempels toe.
  5. Genereer dotplots voor GO- en KEGG-verrijkingsresultaten met behulp van de dotplotfunctie, waarbij de top 15 significant verrijkte termen met genverhoudingen en aangepaste p-waarden worden weergegeven.
  6. Exporteer verrijkingsresultaten als CSV-bestanden en sla visualisatiegrafieken op voor een uitgebreide interpretatie van padanalyses.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

HE-kleuring van rattenlongweefsel toonde duidelijke alveolaire structuren met minimale ontsteking in controlegroepen, terwijl de ARDS-modelgroep vervormde alveolaire holtes, verdikte wanden en significante ontstekingscelinfiltratie vertoonde, zoals blijkt uit corresponderende longletselscores (Figuur 1A–E). Verhoogde niveaus van IL-6, TNF-α en IL-1β in BALF en serum bevestigden succesvolle modellering en een systemische ontstekingsrespons (<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde benadering voor single-cell RNA-sequencinganalyse van longweefsel in een rattenmodel van acuut respiratoire distress syndroom (ARDS). Deze resultaten tonen de succesvolle vestiging van het door LPS geïnduceerde ARDS-model aan, bevestigd door histopathologisch onderzoek, verhoogde longletselscores en verhoogde niveaus van inflammatoire cytokines in BALF en serum. Single-cel transcriptomische analyse toonde 21 verschillende celpopulaties aan, met a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de steun van het Horizontal Project van het Dongzhimen Ziekenhuis, Beijing University of Chinese Medicine (HX-DZM-202114) erkennen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.4% Trypan blue oplossingGibco, USA15250061
4% paraformaldehydeServicebio, ChinaG1101
Bovine serum albumine (BSA)Sangon Biotech, ChinaA600332-0005
Collagenase IYEASEN, China40507ES60
CurveExpertHyams Developmentv1.4
Dispase IIYEASEN, China40104ES60
Escherichia coli lipopolysacharide (LPS) Sigma, USAL6511
hematoxyline en eosine (HE) kleuringSolarbio, ChinaG1120
Hoge-doorvoer gensequentieapparaat MGI Tech Co., LtdMGISEQ-2000RS
Fosfatase remmerBeyotime Biotechnology, ChinaP1081
Fosfaat buffer oplossingSolarbio, ChinaP1020
PMSFSolarbio, ChinaR0010
R software Lucent Technologies, USAv4.2.0
rat IL-1β ELISA kit4abio, ChinaCRE0006
rat IL-6 ELISA kit4abio, ChinaCRE0005
rat TNF-α ELISA kit4abio, ChinaCRE0003
Rode bloedcel (RBC) lyse bufferSolarbio, ChinaR1010
Rode bloedcel lyse bufferTiangen Biotech, ChinaRT122-1
RNase-vrij waterAmbion, USAAM9937
TE buffer, pH 8.0Ambion, USAAM9858
Tris-Glycine Transfer BufferServicebio, ChinaG2017

Referenties

  1. Meyer, N. J., Gattinoni, L., Calfee, C. S. Acute respiratory distress syndrome. Lancet. 398 (10300), 622-637 (2021).
  2. Gragossian, A., Siuba, M. T. Acute respiratory distress syndrome. Emerg Med Clin North Am. 40 (3), 459-472 (2022).
  3. Bos, L. D. J., Ware, L. B. Acute respiratory distress syndrome: causes, pathophysiology, and phenotypes. Lancet. 400 (10358), 1145-1156 (2022).
  4. Huang, Q., Le, Y., Li, S., Bian, Y. Signaling pathways and potential therapeutic targets in acute respiratory distress syndrome (ARDS). Respir Res. 25 (1), 30(2024).
  5. Cutolo, M., Campitiello, R., Gotelli, E., Soldano, S. The role of M1/M2 macrophage polarization in rheumatoid arthritis synovitis. Front Immunol. 13, 867260(2022).
  6. Scozzi, D., Liao, F., Krupnick, A. S., Kreisel, D., Gelman, A. E. The role of neutrophil extracellular traps in acute lung injury. Front Immunol. 13, 953195(2022).
  7. Zheng, J., Li, Y., Kong, X., Guo, J. Exploring immune-related pathogenesis in lung injury: providing new insights into ALI/ARDS. Biomed Pharmacother. 175, 116773(2024).
  8. Qiao, Q., Liu, X., Yang, T., Cui, K., Kong, L., Yang, C., Zhang, Z. Nanomedicine for acute respiratory distress syndrome: The latest application, targeting strategy, and rational design. Acta Pharm Sin B. 11 (10), 3060-3091 (2021).
  9. Bonaventura, A., et al. Endothelial dysfunction and immunothrombosis as key pathogenic mechanisms in COVID-19. Nat Rev Immunol. 21 (5), 319-329 (2021).
  10. Yıldırım, F., Karaman, İ, Kaya, A. Current situation in ARDS in the light of recent studies: classification, epidemiology and pharmacotherapeutics. Tuberk Toraks. 69 (4), 535-546 (2021).
  11. Huminiecki, Ł Bulk and single-cell RNA sequencing elucidate the etiology of severe COVID-19. Int J Mol Sci. 25 (6), 3280(2024).
  12. Riemondy, K. A., et al. Single cell RNA sequencing identifies TGF-β as a key regenerative cue following LPS-induced lung injury. JCI Insight. 5 (8), e123637(2019).
  13. Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: a brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
  14. Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. Int J Oral Sci. 13 (1), 36(2021).
  15. Cheng, C., Chen, W., Jin, H., Chen, X. A review of single-cell RNA-seq annotation, integration, and cell-cell communication. Cells. 12 (15), 1970(2023).
  16. Zhang, F., Wei, K., Slowikowski, K. Defining inflammatory cell states in rheumatoid arthritis joint synovial tissues by integrating single-cell transcriptomics and mass cytometry. Nat Immunol. 20 (7), 928-942 (2019).
  17. Mulder, K., Patel, A. A., Kong, W. T. Cross-tissue single-cell landscape of human monocytes and macrophages in health and disease. Immunity. 54 (8), 1883-1900.e5 (2021).
  18. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), eaau0964(2019).
  19. Kang, Z. Y., et al. Heterogeneity of immune cells and their communications unveiled by transcriptome profiling in acute inflammatory lung injury. Front Immunol. 15, 1382449(2024).
  20. Wang, H. P., et al. Single-cell transcriptome analysis of the mouse lungs during the injury and recovery periods after lipopolysaccharide administration. Inflamm Res. 73 (12), 2087-2107 (2024).
  21. Yao, C., et al. Cell-type-specific immune dysregulation in severely ill COVID-19 patients. Cell Rep. 34 (1), 108590(2021).
  22. Cheng, C., Chen, W., Jin, H., Chen, X. A review of single-cell RNA-seq annotation, integration, and cell-cell communication. Cells. 12 (15), 1970(2023).
  23. Su, M., et al. Data analysis guidelines for single-cell RNA-seq in biomedical studies and clinical applications. Mil Med Res. 9 (1), 68(2022).
  24. Yang, Q., et al. The interaction of macrophages and CD8 T cells in bronchoalveolar lavage fluid is associated with latent tuberculosis infection. Emerg Microbes Infect. 12 (2), 2239940(2023).
  25. Zheng, L., et al. Single-cell transcriptome sequencing reveals the immune microenvironment in bronchoalveolar lavage fluid of checkpoint inhibitor-related pneumonitis. Cancer Immunol Immunother. 74 (4), 128-145 (2025).
  26. Shi, X. Y. Single-cell transcriptomic analysis of radiation-induced lung injury in rat. Biomol Biomed. 24 (5), 1331-1349 (2024).
  27. Huang, H., et al. Single-cell RNA sequencing uncovered the involvement of an endothelial subset in neutrophil recruitment in chemically induced rat pulmonary inflammation. Int J Med Sci. 19 (4), 669-680 (2022).
  28. Kosaka, J., et al. Effects of biliverdin administration on acute lung injury induced by hemorrhagic shock and resuscitation in rats. PLoS One. 8 (5), e63606(2013).
  29. Hassan, N. H., El-Wafaey, D. I. Histopathological scoring system role in evaluation of electronic cigarette's impact on respiratory pathway in albino rat: Biochemical, histo-morphometric and ultrastructural study. Tissue Cell. 79, 101945(2022).
  30. Wang, P., et al. Single-cell suspension preparation from Nile Tilapia intestine for single-cell sequencing. J Vis Exp. (192), e64321(2023).
  31. Wang, F., et al. Integrating bulk and single-cell sequencing reveals the phenotype-associated cell subpopulations in sepsis-induced acute lung injury. Front Immunol. 13, 981784(2022).
  32. Zi, S. F., et al. Endothelial cell-derived extracellular vesicles promote aberrant neutrophil trafficking and subsequent remote lung injury. Adv Sci Weinh. 11 (38), e2400647(2024).
  33. Zi, S. F., Wu, X. J., Tang, Y., Liang, Y. P. Endothelial cell-derived extracellular vesicles promote aberrant neutrophil trafficking and subsequent remote lung injury. Adv Sci Weinh. 11 (38), e2400647(2024).
  34. Hurskainen, M., et al. Single cell transcriptomic analysis of murine lung development on hyperoxia-induced damage. Nat Commun. 12 (1), 1565(2021).
  35. Zhou, X., Zhang, C., Yang, S. Macrophage-derived MMP12 promotes fibrosis through sustained damage to endothelial cells. J Hazard Mater. 461, 132733(2024).
  36. Zhao, C. Q., et al. Heterogeneity of T cells and macrophages in chlorine-induced acute lung injury in mice using single-cell RNA sequencing. Inhal Toxicol. 34 (13-14), 399-411 (2022).
  37. Liu, D., Zhang, Y., Bai, B., Xiong, X. Integration of single-cell RNA sequencing and network pharmacology to elucidate the effect of Yantiao Formula on alleviating ALI by regulating the polarization of alveolar macrophages. J Ethnopharmacol. 343, 119436(2025).
  38. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of Cibotium barometz in treating osteoarthritis. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 1826299(2022).
  39. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong Recipe in the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022, 7858925(2022).
  40. Dun, Y., et al. PTTG1 promotes CD34+CD45+ cells to repair the pulmonary vascular barrier via activating the VEGF-bFGF/PI3K/AKT/eNOS signaling pathway in rats with phosgene-induced acute lung injury. Biomed Pharmacother. 162, 114654(2023).
  41. Liu, Z., Wei, J., Sun, H., Xu, L. Plumbagin ameliorates LPS-induced acute lung injury by regulating PI3K/AKT/mTOR and Keap1-Nrf2/HO-1 signalling pathways. J Cell Mol Med. 28 (13), e18386(2024).
  42. Guo, Y., Zhang, H., Lv, Z., Du, Y. Up-regulated CD38 by daphnetin alleviates lipopolysaccharide-induced lung injury via inhibiting MAPK/NF-κB/NLRP3 pathway. Cell Commun Signal. 21 (1), 66(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Rat ARDS modelweefseldissociatiekwaliteitscontrolecorrectie voor batch effectencelclusteringdifferenti le genexpressieinflammatoire routes
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.