Methodenartikel

Onderzoek naar de netwerkbrede mechanismen van pallidale diepe hersenstimulatie met behulp van high-density micro-elektrode arrays

215 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70507

⸱

16 juni 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Oscar Langendorff Institute of Physiology, University Medical Center Rostock, 2Institute of General Electrical Engineering, University of Rostock, 3Institute for Pharmacology, Pharmacy and Toxicology, University of Leipzig, 4Institute of Applied Microelectronics and Computer Engineering, University of Rostock

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor ex vivo high-density micro-elektrode array-opnames van acute cerebellaire hersensnedes van een dystonisch hamstermodel dat in vivo heeft ontvangen. continue pallidale diepe hersenstimulatie gedurende 11 dagen.

Samenvatting

Dystonie is een neurologische bewegingsstoornis die wordt gekenmerkt door abnormale spiercontrole die vrijwillige bewegingen en aanhoudende houdingen beïnvloedt. Hoewel dystonie geassocieerd wordt met disfunctie van basale ganglia, wijst er steeds meer bewijs op dat het cerebellum betrokken is bij de pathofysiologie ervan. Dit protocol presenteert in vivo pallidale diepe hersenstimulatie (DBS) in een dystonisch hamstermodel (DTsz hamster) gecombineerd met ex vivo high-density micro-elektrode array (HD-MEA) opnames om cerebellaire activiteit te onderzoeken. Het protocol omvat (1) DBS-chirurgie voor elektrode- en stimulatorimplantatie, (2) acute cerebellaire snee-voorbereiding, (3) hoogresolutie elektrofysiologische opnames en (4) data-analyse. Representatieve resultaten geven aan dat 11 dagen pallidale DBS de spike-activiteit herstelde naar normale niveaus in de moleculaire, Purkinje- en granulaire lagen, wat consistent is met betrokkenheid van het cerebellaire netwerk bij dystonie. Dit protocol maakt gedetailleerde analyse van cerebellaire activiteit en de modulatie daarvan door DBS mogelijk, en biedt een platform om netwerkniveau-mechanismen te onderzoeken die aan neuromodulatietherapieën ten grondslag liggen.

Inleiding

Dystonie is de derde meest voorkomende bewegingsstoornis1 en wordt gekenmerkt door duidelijke klinische tekenen en symptomen 2,3, hoewel het soms verward kan worden met andere motorische stoornissen 4,5,6. De meest opvallende klinische kenmerken zijn onwillekeurige spiercontracties, repetitieve bewegingen en abnormale en/of verdraaide houding7. Deze kenmerken kunnen gepaard gaan met symptomen zoals pijn, verminderde motorische prestaties en vermoeidheid, die kunnen verergeren tijdens periodes van stress, angst of fysieke uitputting 8,9,10,11. De pathofysiologie van dystonie is nog niet volledig begrepen12,13. Hoewel studies traditioneel gericht zijn op de basale ganglia, ondersteunt het toenemende bewijs een netwerkniveau-concept van de aandoening, waarbij meerdere hersengebieden betrokken zijn, waaronder het cerebellum 14,15,16,17. Dit protocol heeft als doel extracellulaire netwerkactiviteit te onderzoeken over verschillende lagen van de cerebellaire cortex om hun rol in de pathofysiologie van dystonie te verduidelijken en om de netwerkbrede mechanismen van diepe hersenstimulatie (DBS) te begrijpen.

Diepe hersenstimulatie (DBS) gericht op de globus pallidus internus (GPi) of de subthalamische kern (STN) wordt vaak gebruikt om bepaalde vormen van dystonie18,19 te behandelen, met name die die resistent zijn tegen medicijnen. Daarnaast is het behandelresultaat heterogeen en onvoorspelbaar, omdat patiënten met vergelijkbare klinische manifestaties verschillend kunnen reageren op dezelfde therapeutische benadering20. Een meer uitgebreid begrip van het neurale netwerk dat aan dystonie ten grondslag ligt, kan de behandelingsuitkomsten verbeteren21. Daarom zijn grootschalige en experimentele benaderingen nodig, wat alleen kan worden bereikt via preklinische studies in diermodellen. Door in vivo DBS-experimenten te combineren met ex vivo high-density micro-electrode array (HD-MEA) opnames maakt het mogelijk om de (bijna) fysiologische neuronale netwerkactiviteit met hoge resolutie te monitoren om de pathofysiologie van dystonie en de mechanismen van DBS beter te begrijpen.

De basale ganglia en het cerebellum beïnvloeden elk de motorische controle, ten minste gedeeltelijk, via hun verbindingen met de primaire motorische cortex (M1)22. Een anatomisch onderzoek met een striatale laesie en chirurgische verwijdering van het cerebellum ondersteunt dit idee23. In onze studie gebruiken we het diermodel van de dystonische dtsz hamster24,25, die cerebellaire afwijkingen vertoont die geassocieerd worden met dystonie26. Met behulp van high-density micro-elektrode arrays (HD-MEA's) onderzochten we cerebellaire corticale netwerkactiviteit bij dystonische en gezonde hamsters. Conventionele elektrofysiologische benaderingen missen echter de ruimtelijke resolutie om laagspecifieke netwerkdynamiek vast te leggen, terwijl deze methode deze beperking aanpakt. Aan de andere kant onderzochten we het effect van diepe hersenstimulatie in de globus pallidus internus op de cerebellaire corticale netwerken.

Het HD-MEA-systeem biedt het voordeel van gedetailleerde elektrofysiologische opnames parallel, waardoor analyse mogelijk is over de lagen van de cerebellaire cortex (granulaire, Purkinje- en moleculaire lagen), waarbij elke laag een essentiële rol speelt bij de verwerking van bewegingssequenties27. De korrellaag, dicht beladen met granulaire cellen, ontvangt en geeft sensorische en motorische informatie door van mosachtige vezels, waardoor de eerste signaalintegratie mogelijk is voordat verder wordt verwerkt27. De Purkinje-laag, die Purkinje-cellen bevat, zendt remmende signalen door naar de diepe cerebellaire kernen, waar de granulaire en moleculaire lagen het uitgaande signaal moduleren. De moleculaire laag, rijk aan dendrieten en interneuronen, ondersteunt complexe modulatie via synaptische interacties met Purkinje-cellen, waarbij motorische output28 wordt verfijnd. HD-MEA is, in tegenstelling tot andere opnametechnieken, niet beperkt door ruimtelijke resolutie of bemonsteringsgebied, waardoor de unieke bijdragen van elke laag kunnen worden vastgelegd in de veranderde neurale dynamiek die bij dystonie15 wordt waargenomen. Deze aanpak biedt een hogere ruimtelijke resolutie en parallelle opnamemogelijkheden vergeleken met enkel-elektrode of laag-dichtheid opnamemethoden. Er zijn HD-MEA-systemen gebaseerd op de complementaire metaal-oxide-halfgeleider (CMOS)29,30-technologie, gecombineerd met het Active Pixel Sensor (APS)-concept, die functionele beeldvorming bieden voor het visualiseren van de elektrische activiteit van grote populaties neuronen over tijd 31,32. Met deze techniek kan de dynamiek van elke laag van de cerebellaire cortex worden gemonitord en kunnen specifieke synaptische transmissieprocessen worden onderzocht door te wassen met verschillende stoffen. Deze methode is bijzonder geschikt voor studies die complexe neuronale netwerkactiviteit en laagspecifieke veranderingen in neurologische ziektemodellen onderzoeken.

Dit werk behandelt technische uitdagingen met betrekking tot het inkapselen van het stimulatiesysteem, evenals weefselvoorbereiding, gegevensverzameling en de analyse van een grote elektrofysiologische dataset. Met dit werk presenteren we een optie voor in vitro onderzoek van zeer complexe neuronale verwerking, wat in ons geval enerzijds bijdraagt aan een meer gedifferentieerd begrip van de pathofysiologische dynamiek in dystonische neuronale netwerken en anderzijds kennis biedt over het therapeutische werkingsmechanisme van DBS.

Protocol

Gebruik dystonische dtsz-hamsters en bestrijd Syrische gouden hamsters voor experimenten26. In totaal werden vier experimentele groepen onderzocht in de huidige studie: (1) niet-dystonische controlehamsters (wild type, WT), (2) inheemse onbehandelde dtsz-hamsters , (3) dtsz-Sham (ondergingen implantatie, maar zonder actieve stimulatie), en (4) dtsz-DBS (met continue DBS in vivo gedurende 11 dagen vóór de slice-voorbereiding). Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de EU-richtlijn 2010/63/EU en de federale wetten ter bescherming van dieren, onder licentie 7221.3-1-029/20.

1. Dieren

  1. Houd de dieren onder de standaardomstandigheden van GV Solas33 in een 14 uur licht/10 uur donkercyclus, en met vrije toegang tot water en voedsel (standaard dieethamster, Altromin).
  2. Screen de DTsz-mutante hamsters op dystonische symptomen met behulp van de triple stimulation technique26, op de leeftijd van 20 ± 1 en 27 ± 4 dagen
    OPMERKING: Deze gestandaardiseerde milde stressprocedure bestaat uit het verwijderen van de hamster uit zijn thuiskooi en het overplaatsen naar een nieuwe lege kooi, gevolgd door intraperitoneale of subcutane injectie van zoutoplossing, en kortdurende slaaptekort. Deze reeks milde angstprikkelende prikkels induceert betrouwbaar dystonische aanvallen met reproduceerbare latentie en wordt daarom gebruikt voor fenotypische screening voordat ze worden opgenomen in experimentele groepen. Niet-dystonische controlehamsters ondergaan dezelfde procedure om vergelijkbare experimentele omstandigheden tussen groepen te waarborgen.
  3. Voor analgesie behandel je de dieren van de dtsz-Sham en dtsz-DBS groepen met 100 mg·kg-1 perorale (p.o.) metamizol. Implanteer beide groepen volgens de hieronder beschreven chirurgische procedure.

2. Inkapseling van het STELLA-stimulatiesysteem

  1. De STELLA-stimulatiesystemen zijn ingekapseld met een biocompatibele aanpak om de apparaten te beschermen tegen vloeistofpenetratie tijdens chronische implantatie. De elektronica is ondergebracht in een op maat gemaakte 3D-geprinte PETG-capsule.
    1. Sluit tussen het deksel en de capsule met siliconen.
    2. Sluit daarnaast de behuizing af met siliconen bij de kabeluitgang.
    3. Als er na het drogen kieren kieren in het siliconen zichtbaar zijn, herhaal dan stap 1 en 2.
    4. Na volledige stolling van het siliconen bereid je de epoxyhars voor op een mengverhouding van 100:35 (gewicht).
    5. Verwijder luchtbellen uit de hars onder vacuüm (Vevor RS-1.5).
    6. Breng vóór de assemblage van de mal een dunne laag vaseline aan op het aansluitende oppervlak van de op maat gemaakte siliconenmal om de afdichting te verbeteren en het ontvormen na het uitharden van epoxy te vergemakkelijken. Plaats de stimulatorcapsule in de siliconenmal en vul de mal langzaam met epoxyhars totdat de verbindingen tussen de stimulator en kabel volledig bedekt zijn. Vermijd luchtbellen tijdens het vullen.
    7. Zodra de hars is uitgehard, haal je de capsule uit de mal en maak je het epoxy-oppervlak glad met een fijne vijl of polijstgereedschap om scherpe randen te verwijderen.
    8. Breng een laatste dunne siliconencoating aan over de uitgeharde epoxycapsule door de capsule onder te dompelen in vloeibare siliconen. Gebruik een plastic pipet om extra siliconen rond de kabel bij het aansluitingsgebied aan te brengen. Overtollige siliconenophoping moet met een stok worden verwijderd voordat je uithardt om de laagdikte te voorkomen.
    9. Voer ten slotte een post-encapsulatie-functionele test uit om de juiste stimulatie-output vóór implantatie of experimenteel gebruik te verifiëren. Plaats het STELLA-stimulatiesysteem in Ringer's oplossing en activeer de magnetische BIST-functie. Bevestig het juiste LED-knipperpatroon (2 × 2), wat de juiste stimulatie-uitgang aangeeft en het ontbreken van kortsluitingen, open circuits of lage batterijtoestand34.

3. Chirurgische procedure voor het implanteren van een stimulatiesysteem

  1. Bereid chirurgische instrumenten voor (Figuur 1) en het STELLA (software-defined implantable modular platform) stimulatiesysteem34.
    1. Steriliseer de metalen instrumenten uit Figuur 1 ongeveer 5 minuten bij 200 °C, bijvoorbeeld met de FST Sterilisator 250. Let op dat de instrumenten heet zijn bij het verwijderen ervan.
    2. Desinfecteer het STELLA-stimulatiesysteem met de twee DBS-elektroden met 70% ethanol. Plaats het gedroogde stimulatiesysteem in een Falcon (50 mL conisch buisje) gevuld met Ringer's oplossing gedurende de nacht.
  2. Bereid het dier voor (op de leeftijd van 25–32 dagen)
    1. Plaats de anesthesiekamer (zelfgemaakt) in de hamsterkooi. De hamster loopt vrijwillig na korte tijd in de buis (Figuur 2A).
    2. Wanneer de hamster in de buis zit, sluit je de buis aan het uiteinde en verbind je de buis 1-2 minuten met de vluchtige isoflurane-uitgang (inductie van anesthesie met 4% isoflurane) (Figuur 2B).
    3. Haal het dier voorzichtig uit de cilinder. Plaats het dier op de temperatuurgecontroleerde
      oppervlak (ongeveer 38 °C) en voorzien van een ademhalingsmasker (GM-4; onderhoud van anesthesie met 3% isofluran; test de diepte van de anesthesie met de interdigitale reflex).
    4. Scheer het chirurgische gebied op het hoofd met een geschikte haarknipper (Figuur 2C). Maak het gebied schoon met een natte swab en injecteer 500 μL 0,25% bupivacaïne subcutaan (s.c.) in de hoofdhuid voor extra lokale verdoving van het periost. Wacht minstens 5 minuten voordat je de hoofdhuid opent.
    5. Breng het dier voorzichtig over in het stereotaxische frame en bevestig het met de oorbalken zodat bregma en lambda op dezelfde hoogte zijn (verlaag isofluraan tot 1,5–2,5% om de anesthesie te behouden).
    6. Bescherm de ogen met een traanvervanger (TVM Ocry-Gel).

4. Implanteer het STELLA-stimulatiesysteem

  1. Maak een 2 cm lange incisie op de hoofdhuid. Een retractor (Figuur 1, Nr. 14 en Figuur 2D) trekt de huid weg. Bereid de schedel voor door het periost lokaal met het lemmet te verwijderen door te krabben. Stop mogelijk bloeden met wattenstaafjes.
  2. Breng 3% H2O2 aan met een wattentip applicator om het ruwe te maken.
  3. Neem het stimulatiesysteem van Ringer's oplossing en bescherm de DBS-elektroden met parafilm.
  4. Steek een bot schaar door de huidincisie die net op het hoofd is gemaakt en vorm een 5 cm lange huidzak subcutaan richting de nek en flank.
  5. Plaats de stimulator, die uit de Falcon is gehaald en doordrenkt is met dermale desinfectie.
  6. Breng ongeveer 500 μL antibioticum (10 mg·g-1 fusidinezuur) aan op het huidzakje met een watten tip-applicator.
  7. Boor twee gaten van 7 mm (met FST#19007-07) in de schedel voor DBS-elektroden bij AP: −0,6 mm en ML: ± 2,2 mm volgens de bregma.
  8. Boor nog twee gaten (9 mm; FST#19007-09) lateraal op elk elektrodegat. Schroef vier schroeven (DIN 84 A2 M1x2) in de voorbereide gaten (Figuur 2D).
  9. Implanteer twee DBS-elektroden (SNEX-100) met DV: 6,0 mm volgens de bregma. Let op: de elektrodehouder van jouw specifieke stereotactische frame bepaalt aan welke kant de elektrode als eerste wordt geïmplanteerd (de afstand tussen de elektroden is 4,4 mm).
  10. Bevestig de elektrode met UV-lichtuithardende binding (Heliobond) aan de twee schroeven. Wanneer beide elektroden worden geïmplanteerd, wordt er een laatste laag met UV-licht-uithardende binding tussen hen aangebracht. Ten slotte worden de elektroden gecementeerd met Compoglass Flow (Figuur 2E).
  11. Activeer de stimulator van de DBS-groep magnetisch na minstens drie dagen herstel voor 11 dagen onafgebroken DBS. In deze studie gebruikten we stimulatieparameters die vergelijkbaar zijn met die in klinieken (130 Hz, 50 μA en 60 μs).
  12. Controleer het lichtpatroon van de stimulator door dagelijks met een magneet over de flank van de hamster te vegen (Figuur 2F).

5. Bereiding van acute cerebellaire sneden

  1. Bereid 1 L kunstmatig hersenvocht (ACSF) en 0,5 L sucrose voor elk dier voor (zie Tabel 1 en Tabel 2 voor details).
  2. Gebruik sucroseoplossing bij ongeveer 4 °C tijdens het extractie en snijden van de hersenen, met continue carbogenatie. Bereid daarnaast ijskoude slushy-sucrose voor om de temperatuur van het weefsel tijdens snelle dissectie te behouden.
  3. Bereid de werkplek voor met dissectiegereedschappen, sucroseoplossing, petrischaaltjes en vibratoomopstelling (zie Figuur 3A).
  4. Het offer van dieren moet binnen ongeveer 15 minuten na het beëindigen van de DBS plaatsvinden, en de cerebellaire extractie moet direct daarna beginnen. Onthoofd het dier in diepe anesthesie die is geïnduceerd met vluchtige isofluran. Plaats het hoofd in een hogere Petrischaal gevuld met ijskoude slushy sucrose.
  5. Dissecteer de hersenen door mediale sneden door het wervelkanaal te vermijden om het cerebellaire weefsel te beschermen tegen schade.
  6. Breng de hersenen over in een nieuwe petrischaal gevuld met ijskoude slush sucrose, met een filterpapier onderaan om te voorkomen dat het cerebellum wegschuift tijdens het doorsnijden.
  7. Verwijder eerst het cerebellum door een coronale zaagte door de pons met een mesje (Figuur 3B). Verwijder vervolgens de cerebellaire hemisferen via parasagittale sneden met een mes (Figuur 3C).
  8. Bereid de vibratoomplaat voor met een druppel secondelijm. Verwijder voorzichtig het cerebellaire vermis uit de petrischaal. Dep het schaaf van de parasagittale sectie op een filterpapier om te drogen voordat je deze kant lijmt (Figuur 3D).
  9. Plaats de vibratoomplaat in de tray en vul die met genoeg sucrose (half slushy, half oplossing) om de vermis volledig onder te dompelen. Vergeet niet te tanken met carbogen (CB).
  10. Parasagittale cerebellaire sneden met een dikte van 200 μm worden gesneden met een constante snelheid van 0,08 mm·s-1 (Figuur 3E). Bewaar de plakjes in ACSF in een beker die constant met CB wordt vergasd op kamertemperatuur (Figuur 3F).
  11. Laat de plakjes ongeveer 40 minuten herstellen in koolzuurhoudende ACSF bij kamertemperatuur voordat ze worden overgebracht naar de HD-MEA, die dient als herwarmings- en stabilisatieperiode vóór opname. Houd tijdens deze periode de ACSF op kamertemperatuur.

6. Voorbereiding van de CorePlateTM Single-Well van het BioCAM DupleX MEA-systeem voor opname

  1. Zet het BioCAM DupleX-opnamesysteem met de Brainwave 5-software (BW5) minstens 30 minuten voordat je met de experimenten begint.
  2. Voordat je het weefselsnee op de CorePlateTM Single-Well plaatst voor opname, beoordeel je het achtergrondruisniveau door de single-well in de opnameopstelling te plaatsen. Het optimale ruisniveau voor hoogwaardige opname moet 9-20 μV zijn.
  3. Maak de verguldde pads schoon met 100% ethanol (Figuur 4A-1), de elektrodearray met 70% ethanol en een zachte borstel (Figuur 4A-2). Spoel tenslotte de elektrodearray af met MilliQ-water.
  4. Verbind de HD-MEA/CorePlateTM Single-Well met het opnamesysteem (Figuur 4D-1).
  5. Pipetteer ongeveer 2 mL ACSF in de put. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen op de elektroden of de grond zitten (Figuur 4D-2).
  6. Start live opname en neem minstens 30 seconden op met BW5.

7. Analyseer piek-tot-piek amplitude

  1. Om de ruisinterface te analyseren, open je het opgenomen *.bxr-bestand, dat 30 seconden intrinsieke ruisopname bevat (gegenereerd door de resistieve componenten van de elektroden en versterkercircuits).
  2. Selecteer "Activiteitenkaart" en kies onder "Metriek" voor Piek-tot-Piek Amplitude. De schaal is ingesteld op 500 μV, waardoor de signaalvariabiliteit over de elektrodearray kan worden weergegeven (Figuur 5A).
  3. In het venster "Activiteitskaart" plaatst u de muiswijzer boven de opgenomen elektrode om de amplitudewaarde van "Well Wide Mean" weer te geven.
  4. Je kunt ook de gemiddelde amplitudewaarde bepalen door een Excel-bestand (*.xlsx) aan te maken onder "Graph Export." Open dan dat Excel-bestand en bereken de gemiddelde amplitudewaarde [=Gemiddelde(Getal1; Nummer 2;...)].

8. Analyseer de baselineruis (signaalstandaarddeviatie)

  1. Analyseer de basislijnruis door op "Playback" te klikken om het *.brw-bestand te genereren. Selecteer vervolgens "Activiteitenkaart" en onder "Metriek" selecteer je "Standaardafwijking". De schaal wordt automatisch ingesteld op 30 μV, waardoor de signaalvariabiliteit over de elektrodearray zichtbaar kan worden (Figuur 5B).
  2. In het venster "Activity Map" zweeft u met de muiswijzer over de opgenomen elektrode om de standaardafwijking "Well Wide Mean" weer te geven.
  3. Je kunt ook de gemiddelde standaarddeviatie bepalen met "Chart Export" en het *.xlsx Excel-bestand aanmaken. Open vervolgens het Excel-bestand en bereken de gemiddelde standaarddeviatie [=Gemiddelde(Nummer1; Nummer 2;...)].

9. Voor het evalueren van de signaalkwaliteit:

  1. Bereken de signaal-ruisverhouding (SNR)
    figure-protocol-1
    SNR ≥ 5: Goede kwaliteit
    SNR tussen 2 en 5: Matige kwaliteit
    SNR < 2: Slechte kwaliteit

10. Slice-positionering in CorePlate single-well voor data-acquisitie

  1. Met behulp van een Pasteur-pipet, plaats je de snee bij de elektrodearray zodat het interessegebied wordt bedekt door opname-elektroden (Figuur 4 B-1). Verwijder de oplossing uit de put (Figuur 4 B-2). Maak een foto met een rechtopstaande microscoop.
  2. Bevestig het weefsel met het slice-anker (Figuur 4C).
  3. Voeg met een 3 mL Pasteur-pipet één druppel ACSF toe aan de plak.
  4. Verwijder de vloeistof met een Pasteur-pipet met een kleiner volume. Verwijder de resterende vloeistof met een stuk gedraaid papier (herhaal dit 7-10 keer) (Figuur 4C-2).
  5. Voor perfusie tijdens opnames gebruik je ACSF bij kamertemperatuur en stel je de snelheid in op 2 mL·min-1. De instroompositie bevindt zich boven de weefselschijf en de uitstroom bevindt zich bij de wand van de put (Figuur 4D).
  6. Een extra aarding van de in- en uitstroom wordt aanbevolen om perfusie-geïnduceerde ruis te minimaliseren, wat kan worden bereikt door ze via een draad aan te sluiten op het opnamesysteem (Figuur 4D-1).
  7. Om verstoringen te verminderen, zet je de microscoop en het licht in de kamer uit.

11. Opnames van netwerkactiviteiten met de CorePlateTM Single-Well

  1. Stel de opnameparameters in op een samplefrequentie van 20.000 Hz met een high-pass filter op 100 Hz.
    1. Ga in de BrainWave 5-software naar Bestand en open een nieuwe opnamesessie.
    2. Klik op "Bron".
    3. Open: chip pilot, en selecteer de volgende aanpassingen:
      Spontane neurale activiteit wordt geregistreerd met een bemonsteringsfrequentie: 20.000 Hz/elektrode.
      Hardware high-pass filter cutoff: 100 Hz.
      Lichtcompensatieratio: kort (directe lichtstimulatie).
  2. Om het kalibratiekanaal van de chip en het type ruwe spoor te selecteren.
    1. Open: Stuursignaal, en selecteren: Bij interne chipkalibratie, selecteer outputkanaal: 1.1.
    2. Klik op "+" en "Charting".
    3. Open: Grafiek opstellen.
    4. Selecteer raw traces: raw en spikes.

12. Voeg het microscoopbeeld in en lijn het uit op de activiteitskaart

  1. Klik op "+".
  2. "Overlays and Annotations" om het microscoopbeeld in de activiteitskaart op BW5 te plaatsen:
  3. Ga naar putlagen:
    1. Selecteer beheer-lagen en het cerebellaire beeld.
    2. Selecteer afbeeldingslaag uitlijnen: klik op start.
    3. Klik op de vier hoeken van de afbeelding volgens de numerieke reeks en pas toe.

13. Opstelling van datacompressie vóór opname

  1. Om de gegevens te comprimeren, ga je naar de eerste pagina van RECORDER:
    1. Cockpitmodus: geavanceerd
    2. Sla raw comprimed op: wavelet-compressie + gebeurtenissen: pieken.
    3. Speel 10 minuten af voordat je de opname begint.
  2. Maak de vergulde pads schoon met 100% ethanol nadat je de opnames hebt afgerond. Vul vervolgens de put met zuiver water en borstel het 30 seconden lang.
  3. Vul vervolgens de put met 70% ethanol en borstel voorzichtig de elektrodearray ongeveer 30 seconden lang. Vul tenslotte de put met puur water en borstel het voorzichtig 30 seconden (herhaal deze stap 2 of 3 keer).
  4. Houd de CorePlateTM Single-Well droog in de juiste container.

14. Offline analyse van geregistreerde gegevens

  1. Open het gewenste bestand met de BW5.
  2. Verdeel de cerebellaire cortex in drie groepen door elektroden te selecteren op basis van anatomische laagtoewijzing (moleculaire laag, Purkinje-cellaag, granule cellaag).
    OPMERKING: Het aantal elektroden binnen de interessegebieden (ROI's) per laag hing af van de spontane activiteit die in elke laag werd gedetecteerd en varieerde daardoor per opname. Typisch werden 25-250 elektroden per ROI geanalyseerd van één enkele snee. Elektroden die zich bevinden in gebieden die twee anatomische lagen beslaan, werden uitgesloten om ambiguïteit in de laagtoewijzing te voorkomen. Voor verdere evaluatie werden alleen elektroden die duidelijk aan één specifieke cerebellaire laag konden worden toegeschreven, toegevoegd.
    1. Selectie en groepering: Ga naar eenheidsgroepen.
    2. Klik bij 'Beheer eenheidsgroepen' op "+" om één groep te vormen en deze te benoemen.
    3. Om meer elektroden in de groep op te nemen, selecteer je de elektroden en klik je op "geselecteerde eenheden toevoegen of verwijderen".
  3. Analyseer ruwe sporen met behulp van de spike-detectiemethode, bekend als precieze timing spike detectie (PTSS). Het richt zich op het detecteren van relatieve maxima en minima met piek-tot-piek amplitudes die een vooraf bepaalde drempel overschrijden, zodat nauwkeurige en nauwkeurige piekidentificatie wordt gegarandeerd.
    1. Gegevensverwerking: Ga naar Spike-detectie en zet de modus op geavanceerd.
    2. Gebruik data van: Raw.
    3. Algoritme: PTSD (Nauwkeurige timing spike detectie).
    4. Standaarddeviatiefactor: 8,0.
    5. Pieklevensduur: 2,0 ms.
    6. Refractaire periode: 1,0 ms.
    7. Piektoewijzing: negatieve piek.
    8. Pre-piekgolf duur: 1,0 ms.
    9. Duur van de golf na piek: 1,5 ms.
  4. Ga naar Spike sortering en zet de modus op gevorderd. Pas de volgende parameter aan:
    1. Pre-piekgolf genomen duur: 0,5 ms.
    2. Post-piekgolf genomen duur: 1,0 ms.
    3. Feature-extractie-algoritme: Legendre-momenten.
    4. Aantal functies: 3.
    5. Clustering-algoritme: K-Means & Silhouette.
    6. Minimum aantal pieken per cluster: 20.
    7. Maximaal aantal clusters: 3.
    8. Omlijningsdrempel: 2.
  5. Gegevens exporteren naar Excel.
    1. Klik op "Charting".
    2. Ga naar Chart Export.
    3. Selecteer de spreadsheet en exporteer.

Resultaten

Pallidale DBS verhoogde het aantal pieken tot normale niveaus in corticale lagen tussen groepen.

We analyseerden het totale aantal pieken in drie lagen van de cerebellaire cortex—moleculaire laag (ML), Purkinje-cellaag (PL) en granulaire cellaag (GL) — verspreid over vier experimentele groepen: wildtype (WT, N = 8), dtsz (N = 8), dtsz-Sham (N = 7) en dtsz-DBS (N = 7), waarbij analyses werden uitgevoerd op plakjes verkregen van deze dieren.

Terwijl dystonisch weefsel (dtsz) significant minder pieken veroorzaakte, verhoogde pallidale DBS het aantal pieken tot niveaus vergelijkbaar met dat van gezonde controles (Tabel 3). De Kruskal-Wallis H-test bevestigde dit verder en toonde een statistisch significante toename van het aantal pieken in de ML voor de dtsz DBS-groep vergeleken met zowel de dtsz- als dtsz-Sham-groepen (χ2(3) = 20,728, p = 0,001; Figuur 6A). De dtsz-DBS-groep liet ook een vergelijkbare toename in pieken in PL zien (χ2(3) = 16,855, p = 0,001; Figuur 6B) en GL (χ2(3) = 13,164, p. = 0,004; Figuur 6C), waarbij waarden vergelijkbaar zijn met die van de WT-groep (Tabel 3).

figure-results-1
Figuur 1. Overzicht van chirurgische instrumenten. De afbeelding toont een gerangschikte tray met een set chirurgische en microchirurgische instrumenten die expliciet zijn ontworpen voor procedures waarbij diepe elektroden en stimulatoren worden geïmplanteerd. De instrumenten zijn in volgorde van gebruik georganiseerd, wat de procedurele efficiëntie verhoogt. Ze worden op een tissue geplaatst om de netheid te behouden en een gemakkelijke toegankelijkheid tijdens de procedure te garanderen. Deze regeling richt zich op precisie, steriliteit en gereedheid voor complexe chirurgische workflows. (1) Schaar bot of stomp, (2) hechtingsschaar, (3) Schaar scherp/scherp, (4) Naaldhouder, (5) hechtingspincet, (6) Splinterpincett/gebogen, (7) Tang gekarteld, (8) Standaard korte tang, (9) Standaard pincet, lang, (10) Microspatel, (11) Hergebruikte elektrode, (12) Schroeven, (13) Booraccessoires, (14) Trekpunt/klem, (15)) Glasblok wordt gevuld met 0,9% NaCl en xylocaïne. Voor meer informatie, bekijk de materiaallijst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Experimentele opstelling voor het verdoofen en positioneren van het dier in het stereotaxische apparaat voor implantatie van DBS-elektroden en de stimulator. (A) Het dier wordt voorzichtig in een speciaal gemaakte inductiekamer geplaatst om de narcose te starten. (B) De inductiekamer is verbonden met een ademhalingsmasker om de juiste toediening van anesthesie te waarborgen (inductie met isoflurane op 4%) terwijl de veiligheid tijdens het hanteren wordt gewaarborgd. (C) Na verdoving wordt het dier overgebracht naar een verwarmingsplaat met een aangesloten ademhalingsmasker (onderhoud met isofluaan op 3%) om onderkoeling te voorkomen en continue verdoving tijdens het scheren te waarborgen. (D) Het dier wordt zorgvuldig in het stereotaxische frame geplaatst. Er wordt een longitudinale incisie gemaakt en klemmen worden gebruikt om de huid terug te trekken. Vier stippen geven de plaatsing van de schroef aan. Schroeven worden in de gemarkeerde gebieden geplaatst, en twee extra stippen worden gemarkeerd voor het plaatsen van elektroden. (E) De elektrode wordt in de GPi geplaatst en met lijm vastgezet voordat de stereotaxische houder wordt verwijderd. Voor een betere fixatie wordt cement rond de elektroden aangebracht. Onderbroken longitudinale hechtingen worden gebruikt om de operatieplaats te sluiten, en (F) de stimulator wordt geplaatst in het subcutane flankgebied van het dier. Het dier blijft na de operatie leven, en de pijl geeft de locatie van de stimulator aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Illustratie van hersendoorsnijden en snijden. (A) chirurgische instrumenten voor de dissectieprocedure. (1*) Zelfgemaakte Agar Petrischaal, (2*) Agar Petri schaal, (3*) Klem die de carbogen tube bevestigt, (4*) Papierfilter, (5*) Mes, (6*) secondelijm, (7*) Vibratoom plaat/houder, (8*) Gebogen pincet, (9*) Schaar, scherp/stomp. (B) Voorbereiding van hersenmonsters: na dissectie wordt de hersenen gesneden en geven de stippellijnen de oriëntatie van de doorsnede van het coronale vlak aan. (C) Parasagittale sectie: de hersenen worden langs het gespecificeerde parasagittale vlak gesneden. (D) Weefselfixatie: Het resulterende hersenweefsel wordt met lijm aan een plaat/houder bevestigd om het nauwkeurig te kunnen verdelen. (E) Vibratoomsectie: De plaat met het aanhechtende weefsel wordt overgebracht naar een vibratoom, waar ultradunne plakjes worden verkregen (200 μm). (F) Laatste sneden: Precieze parasagittale cerebellaire sneden worden geproduceerd, klaar voor elektrofysiologische opname35. Voor meer informatie, bekijk de materiaallijst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4. Illustratie van de stappen om een goede celactiviteit te krijgen. (A) Reiniging: Deze stap houdt in dat de HD-MEA wordt voorbereid door het oppervlak schoon te maken om te garanderen dat geen vuil de bevestiging (contactpad, A-1) of het opnameproces (vlak gebied, A-2) verstoort. (B) Sneepositie: De weefselsnee wordt zorgvuldig op de HD-MEA (B-1) geplaatst, zodat de juiste uitlijning wordt gegarandeerd voor effectief elektrodecontact (B-2). Een dunne punt van de pipet (pijl) wordt gebruikt om de resterende ACSF te verwijderen, zodat het anker kan worden ingebracht. (C) Bevestiging van de slice: de slice wordt stevig op de HD-MEA geplaatst met behulp van het anker. In deze stap is het cruciaal om een druppel ACSF toe te brengen en vervolgens voorzichtig het overtollige vocht te verwijderen met een pipet (C-1; pijl) en een gedraaid stuk precisiedoekpapier (C-2). Dit zorgt ervoor dat de slice stabiel blijft en goed verbonden is met de elektroden voor nauwkeurige opname. (D) Perfusie: Ten slotte wordt een perfusiesysteem aangesloten en gestart om de levensvatbaarheid van het weefselschijfje tijdens het experiment te behouden, waarbij de instroom bovenop de schijf moet plaatsvinden en de uitstroom dicht bij de wand (D-2). Het is ook essentieel om alle belletjes uit de grond te verwijderen om ruis tijdens de opname te minimaliseren (aangegeven door de pijl). Extra aarding is aangesloten op zowel de instroom- als de uitlaatbuis (D-1). De rode schaalbalken zijn 1,5 mm lang. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5. Metrics voor amplitude en standaarddeviatie in HD-MEA-opnames met behulp van Brain Wave 5-software (BW5) om de signaalkwaliteit te evalueren. (A) Peak-to-Peak Amplitude-metriek geselecteerd om intrinsieke elektrode-amplitudewaarden te extraheren (schaal: 500 μV). (B) Standaarddeviatiemetriek gekozen om baseline-ruis over elektroden te kwantificeren (schaal: 30 μV). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Effecten van pallidale DBS op spike-activiteit over cerebellaire corticale lagen: (A) moleculaire laag (ML), (B) Purkinje-cellaag (PL) en (C) granulaire laag (GL). De Box-Whisker-grafieken tonen het gemiddelde en mediaan respectievelijk met een kruis- en horizontale lijn, samen met het 25e en 75e percentiel. De respectievelijke groepen zijn wild type (WT, n = 22 slices), dtsz zonder chirurgie (n = 20 slices), dtsz DBS inactief (Sham, n = 20 slices), en dtsz-DBS actief (n = 20 slices). De statistische significantie werd bepaald met behulp van de Kruskal-Wallis-test, gevolgd door Dunns paargewijze vergelijkingen (*p .< 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

NaamMolecuulgewicht [g/mol]Eindconcentratie [mol/ l]
NaCl58.440.124
KCl74.550.003
Glucose180.160.01
CaCl2 (watervrij)110.980.0025
NaHCO384,0070.026
NaH2PO4119.980.00125
pH7,35 tot 7,40 (verstelbaar met HCl)
Osmolaliteit [mosmol/ kg]290 tot 300

Tabel 1: Kunstmatige cerebrospinale vloeistofoplossing (ACSF): Samenstelling en uiteindelijke molaire concentraties van componenten die worden gebruikt om ACSF voor cerebellaire snee-experimenten te bereiden. de pH werd aangepast naar 7,35–7,40 met HCl, en de osmolaliteit bleef tussen 290–300 mOsm·kg-1.

NaamMolecuulgewicht [g/mol]Eindconcentratie [mol/L]
Saccharose342.300.075
KCl74.550.0025
NaCl58.440.087
CaCl2 (watervrij)110.980.0005
MgCl295.210.007
Glucose180.160.01
NaHCO384.010.025
NaH2PO4119.980.00125
pH7,35 tot 7,40 (verstelbaar met HCl)
Osmolaliteit [mosmol/ kg]320 tot 330

Tabel 2: Sucroseoplossing. Samenstelling en uiteindelijke molaire concentraties van de sucroseoplossing die wordt gebruikt tijdens de voorbereiding van een cerebellaire schijf. de pH werd aangepast naar 7,35–7,40, en de osmolaliteit bleef gehandhaafd tussen 320–330 mOsm·kg-1.

Groepen:WTDTSZ dtsz-Shamdtsz-DBS
n22202020
Variantiecoëfficiënt
ML0.530.550.60.35
PL0.570.570.520.46
GL0.480.660.610.51
Aantal spikes
ML287240±32605163434±19998234209±31284345915±27113
PL413223±50171194277±24786304568±35692412707±42509
GL390817±40139211274±31193325533±44318373208±42220

Tabel 3: Samenvatting van spike-metrieken over cerebellaire lagen en experimentele groepen. WT – wildtype, niet-dystonische controlehamsters; DTSZ - inheemse DTZ hamsters; dtsz-DBS - dtsz hamsters continu gestimuleerd gedurende 11 dagen; dtsz-Sham - dtsz hamsters die de operatie ondergaan, echter zonder actieve DBS; ML – moleculaire laag; PL – Purkinje-cellaag; GL. – korrelige cellaag.

Discussie

We beschreven een methodologische benadering om de mechanismen van diepe hersenstimulatie (DBS) in het pathofysiologische dystonische neuronale netwerk in de dtsz-hamster te onderzoeken. Kritieke stappen zijn onder meer nauwkeurige elektrodeimplantatie, snelle voorbereiding van cerebellaire snede en stabiele HD-MEA-opnamecondities om betrouwbare gegevensverzameling te garanderen. We demonstreren de operatieprocedure, de bereiding van cerebellaire sneden, opname- en analysetechnieken om de ex vivo cerebellaire activiteit en de modulatie daarvan door DBS te onderzoeken. De elektrofysiologische metingen met HD-MEA leverden realtime opnames van spontane activiteit van het cerebellaire lichaam met een hoge temporele en ruimtelijke resolutievan 36, wat wij noodzakelijk achten voor het onderzoeken van de mechanismen van pallidale diepe hersenstimulatie bij de behandeling van dystonie.

Dystonie staat momenteel bekend als een netwerkstoornis die wordt gekenmerkt door abnormale motorische output die ontstaat door disfunctionele interacties tussen basale ganglia, cerebellaire en corticale circuits37,38. Cerebellaire afwijkingen zijn aangetoond een significante rol te spelen bij dystonie, zoals ondersteund door zowel klinische als experimentele studies 15,22,39. Bovendien toont een anatomisch onderzoek waarbij retrograde rabiësvirus (RV) in de cerebellaire cortex van Cebusapen werd geïnjecteerd dat de subthalamische kern van de basale ganglia een aanzienlijke projectie heeft naar de cerebellaire cortex40. Deze bevindingen onderstrepen het belang van het verkennen van cerebellaire circuits naast de basale ganglianetwerken bij het bestuderen van de therapeutische mechanismen van DBS 40,41,42. Deze methode is bijzonder geschikt voor studies naar neuronale interacties en neuromodulatie-effecten bij bewegingsstoornissen.

Wat betreft de netwerkbrede mechanismen van pallidale DBS hebben studies aangetoond dat DBS van het interne segment van de globus pallidus (GPi) wijdverspreide veranderingen in hersenactiviteit veroorzaakt, niet alleen binnen de basale ganglia maar ook over onderling verbonden gebieden zoals het cortico-striatale netwerk43, de thalamus44 en het cerebellum15. Deze observaties ondersteunen de hypothese dat pallidale DBS de activiteit in het basale ganglia-cerebellaire netwerk kan moduleren, wat bijdraagt aan de therapeutische effectiviteit bij dystonie. Dit toont de noodzaak aan van preklinische studies om DBS-mechanismen te onderzoeken en het voordeel van HD-MEA-opnames voor het vastleggen van netwerkbrede elektrofysiologische veranderingen. Bovendien ondersteunt de studie van Kotyra et al. (2025) de aanwezigheid van langdurige neuroplastische remodellering geïnduceerd door langdurig GPi-DBS binnen het dystonisch motorisch netwerk45. In vivo bevindingen toonden aan dat pallidale stimulatie geleidelijk de ernst van dystonie bij dtsz-hamsters verminderde en dat het gunstige effect aanhield na het stoppen van stimulatie, wat suggereert dat door DBS veroorzaakte effecten niet beperkt zijn tot alleen acute stimulatie45. Daarnaast toonden recente elektrofysiologische studies netwerkbrede modulatie van synaptische plasticiteit en piekpatronen na langdurig DBS aan, waaronder verhoogde cerebellaire activiteit15, verbeterde exciterende input naar motorische thalamische neuronen en meer geclusterde exciterende input naar corticale M146.

Representatieve resultaten wijzen op een netwerkbreed effect van diepe hersenstimulatie (DBS), zoals blijkt uit de normalisatie van spike-activiteit in de moleculaire, Purkinje-cel- en granulaire cellagen van de cerebellaire cortex bij dystonische hamsters (Figuur 6). De verhoogde piekactiviteit waargenomen in de dtsz DBS-groep bereikte niveaus vergelijkbaar met de wildtypecontroles. Deze normalisatie van spike-activiteit ondersteunt het therapeutische potentieel van DBS voor de behandeling van dystonie. Opmerkelijk is dat de dt sz-Sham-groep intermediaire piekwaarden vertoonde vergeleken met de WT-groep over alle cerebellaire lagen, wat suggereert dat alleen de implantatie van elektroden invloed kan hebben op de activiteit van het cerebellaire netwerk. Deze interpretatie is consistent met het klinisch beschreven microlaesie-effect bij dystonie, waarbij de implantatie van de elektrode zelf de symptomen tijdelijk kan verbeteren vóór het begin van de stimulatie47. Hoewel de dtsz-hamster belangrijke kenmerken van paroxysmale gegeneraliseerde dystonie reproduceert, weerspiegelt het niet volledig de klinische heterogeniteit die wordt waargenomen bij menselijke dystonie-syndromen. Daarom moet voorzichtigheid worden betracht bij het vertalen van deze bevindingen naar menselijke dystonie.

Dit werk behandelt technische uitdagingen met betrekking tot stimulator-inkapsling, DBS-chirurgie, snijvoorbereiding en grootschalige elektrofysiologische data-analyse. De combinatie van CMOS-gebaseerde HD-MEA-technologie biedt een robuust platform voor in vitro onderzoek van zeer complexe neuronale interacties48. Onze resultaten dragen bij aan een genuanceerder begrip van de pathofysiologische dynamiek achter dystonie en bieden waardevolle inzichten in de netwerkniveaumechanismen van DBS-therapie. Het faciliteren van een gedetailleerde functionele analyse van specifieke hersengebieden en hun interacties draagt bij aan een meer gedifferentieerd begrip van de pathofysiologische dynamiek in dystonische neuronale netwerken, en biedt daarentegen inzicht in het therapeutische werkingsmechanisme van DBS.

In deze studie leidden technische problemen tot meer achtergrondruis en verstoorden stabiele signaalacquisitie tijdens HD-MEA-opnames. Veelvoorkomende stappen voor probleemoplossing zijn het aanpakken van ruisbronnen, het zorgen voor een juiste aarding en het behouden van een stabiel contact tussen weefsel en elektrode. Bij hoge ruisniveaus of onstabiele metingen moeten eerst aarding, kabelverbindingen en nabijgelegen elektrische apparaten worden gecontroleerd. Luchtbellen op de elektrodearray kunnen ook het contact tussen weefsel en elektrode en de stabiliteit van de opname belemmeren en moeten zorgvuldig worden verwijderd (Figuur 4). Bovendien moet stabiele datatransmissie van de versterker naar de computer via een hoogwaardige USB-C-naar-USB-C-kabel worden gegarandeerd. Elektroden met aanhoudende ruis moeten worden uitgesloten van verdere analyse. Hoewel het opnemen van extracellulaire signalen met HD-MEA een hoge ruimtelijke resolutie van de netwerkactiviteit mogelijk maakt en, samen met het gesuperponeerde microscopische beeld, toewijzing aan de afzonderlijke lagen van de cerebellaire cortex, kan niet worden uitgesloten dat de gedetecteerde extracellulaire activiteit is gegenereerd door het kruisen van axonen uit een andere laag dan de toegewezen. Bovendien werden statistische analyses op snijniveau uitgevoerd, aangezien elke snee een onafhankelijke elektrofysiologische registratie vormde onder gestandaardiseerde experimentele omstandigheden, hoewel sommige sneden afkomstig waren van hetzelfde dier.

Tijdens DBS kunnen verdere problemen optreden door het loslaten van de elektrode of een technisch defect in de stimulator. Om deze problemen te minimaliseren, zorg je voor een juiste elektrodefixatie en handhaaf je steriele omgangsomstandigheden gedurende de procedure. Dit gebeurde in 5% van alle onderzoeken in de huidige studie. Om het loskomen van de elektrode te minimaliseren, moet het schedeloppervlak worden gedroogd voordat de elektrode wordt vastgezet met lijm of tandcement om de hechting te verbeteren en slip te voorkomen. Om steriliteit te waarborgen en mechanische besmetting te voorkomen, mogen de stimulator, elektrodetip en monofilamentdraad alleen met een tang of hemostasetang worden behandeld. Daarnaast moeten handschoenen worden gedesinfecteerd met ethanol en gedroogd worden voordat het dier wordt aangeraakt om het infectierisico te minimaliseren. Snelle voorbereiding van cerebellaire hersensneden is essentieel voor hoogwaardige elektrofysiologische opnames. Dit betekende echter dat de positie van de geïmplanteerde DBS-elektroden niet achteraf kon worden geverifieerd. In een andere studie die het effect van verschillende stimulatieparameters op de ernst van dystonie in de dtsz-hamster onderzocht, werden dezelfde stimulatie-elektroden en chirurgische technieken gebruikt. Hier konden we in 94% van de37 proeven de juiste positie van de elektrode bevestigen.

Samenvattend biedt dit protocol een krachtig platform voor het bestuderen van de elektrofysiologische mechanismen van DBS en levert het waardevolle inzichten in het werkingsmechanisme ervan. De dtsz-hamster maakt op unieke wijze preklinische studies mogelijk naar de effecten van de pallidale DBS op het dystonisch fenotype, samen met ex vivo hoogresolutieregistratie van neuronale netwerkactiviteit. Onze resultaten ondersteunen het concept van cerebellaire betrokkenheid bij dystonie en benadrukken het belang van netwerkanalyse bij het begrijpen en optimaliseren van neuromodulatietherapieën.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie wordt ondersteund door de Duitse Onderzoeksstichting (DFG) binnen het Collaborative Research Center (SFB 1270/1,2 ELAINE 299150580).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3% H2O2Caelo15301730
50 ml conische buisGreiner Bio-OneFalcon-type conische buis
Agar Petri-schaalHandmade 
Anesthesie-eenheidBioMedical InstrumentsUniventor 1200
BioCam DupleX3BrainBioCAM DupleXCMOS-HD-MEA platform
Mes (5*)Apollo Herkenrath09-025-056
Brainwave Software 53BrainVersie 5CMOS-HD-MEA platform
AdemmaskerNarishigeGM-4
Bulk Fill Flowable: Compula RefillDentsply Sirona267-0195Voor cement
Capsule dispenserpistool Dentsply Sirona296-0003Voor cement
CarbogenAir LiquideAir Liqiuide (House system)
Cavity Block GlassAIMAIM40 mm x 40 mm
Klem (3*)DIEFFENBACH12-1003-04roestvrij staal 4cm
ComputerDellPrecission 3431
CorePlateTM 1W 38/603BrainAccura HD-MEACMOS-HD-MEA chip
Boorbooraccessoire (13)FST19007-07Tip: 7mm
Boorbooraccessoire (13)FST19007-09Tip: 9mm
Eco doekjes - doekjesdispenserDr Schumacher00-915SE001 (1x1) 
Eco doekjes - doekjesrollenDr Schumacher00-915SE001 (6x1)
ELASTOSILWackerRT 601 A/B
ElektrodeMicroprobesSNEX-100
EthanolCarl Roth GmbH + Co. KGArt-Nr. T913.3
Graverd (10)HLW Dental-Instruments GermanyS-10.28-6
Pincet (5)FST18025-10Roestvrij staal 10cm
Pincet (6)AesculapBD311R9cm
Pincet (7)FST91100-12Roestvrij staal 12cm
Pincet (8)FST11231-20Roestvrij staal 11cm
Pincet (8*) Karl Hammacher9.160 160Wironit 10,5cm
Pincet (9)FST11200-33Dumoxel 13,5cm
Pincet (9)FST11200-33Dumoxel 13,5cm
Verwarmde operatietafel+geïntegreerde gasafvoerBioMedical InstrumentsBioMedical Instruments
heliobondIvoclar Vivadent42040
IJsmachineScotsmanAF 80 AS / WS
In- en uitstroomnaaldenBD Microlance 1,25 x70mm
Isathal 10mg/gDechraZul.-Nr. 400216.00.00Fucidin
IsofluraanSedana medicalN001254
Mili-Q waterfilterElgaPURELAB flex 3
Naaldhaak (4)FST12501-13Wolfraamcarbide 13cm
OcteniseptSchülke & MayrAntiseptische oplossing 
Papierfilter (4*)Carl Roth GmbH + Co. KGAP75.1
ParafilmSigma AldrichHS234526C
Platinum anker3Brain3Brain
Retractortip (14)FST18200-102.5mm
Gebruikte elektrode (11)MicroprobesSNEX-100Voor coördinaten
RingerB. Braun3570030
Schaar (1)FST14078-10Roestvrij staal 10cm
Schaar (2)AesculapBC144R
Schaar (3)FST14058-09Roestvrij staal 9cm
Schaar (9*)FST91401-12Roestvrij staal 12cm
Schroef (12)Online-Schrauben.deDIN 84 A2 M 1x2
ShaverExactaGT415
STELLA (op software gebaseerd implanteerbaar modulair platform) stimulatiesysteemniet-commercieel; ontwikkeling van de Universiteit van Rostockopen source (https://github.com/SFB-ELAINE/STELLA)batterijgestuurde DBS-stimulator
Sterilisator 250FST18000-45
Stereotaxisch apparaatNarishigeModel SR-AR
SuperlijmUHU64212
Tranencrème (Panthenol neuscrème)Jenapharm5541249
Vibratome LaicaVT12005
Xylocain Gel 2%Aspen Pharma1138060
WeegbootCarl Roth GmbH + Co. KGHYT9.1
WeegschaalVoltcraftTS-5000/1
Verbindingen gebruikt voor het bereiden van oplossingen
Calciumchloride (CaCl2)Sigma-Aldrich10043-52-4
D-Glucose(C6H12O6)Sigma-Aldrich50-99-7
Magnesiumchloride (MgCl2)Sigma-Aldrich7786-30-3
Kaliumchloride(KCl)Sigma-Aldrich7447-40-7
Natriumbicarbonaat (NaHCO3)Sigma-Aldrich144-55-8

Referenties

  1. Beylergil, S. B., et al. Tremor in cervical dystonia. Dystonia. , (2024).
  2. Stephen, C. D., et al. Dystonias: Clinical recognition and the role of additional diagnostic testing. Semin Neurol. , (2023).
  3. Fung, V. S. C., Jinnah, H. A., Bhatia, K., Vidailhet, M. Assessment of the patient with isolated or combined dystonia: An update on dystonia syndromes. Mov Disord. , (2013).
  4. Klepitskaya, O., Neuwelt, A. J., Nguyen, T., Leehey, M. Primary dystonia misinterpreted as Parkinson disease. Neurol Clin Pract. , (2013).
  5. Drivenes, B., et al. A child with myoclonus-dystonia (DYT11) misdiagnosed as atypical opsoclonus myoclonus syndrome. Eur J Paediatr Neurol. , (2015).
  6. Valeriani, D., Simonyan, K. A. Microstructural neural network biomarker for dystonia diagnosis identified by a DystoniaNet deep learning platform. Proc Natl Acad Sci U S A, , (2020).
  7. Albanese, A., et al. Definition and classification of dystonia. Mov Disord. , (2025).
  8. Balint, B., et al. Dystonia. Nat Rev Dis Primers. , (2018).
  9. Bohne, P., et al. Cerebellar α1D-adrenergic receptors mediate stress-induced dystonia in totteringtg/tg mice. Cell Mol Life Sci. , (2025).
  10. Gwinn-Hardy, K. A., et al. Effect of hormone variations and other factors on symptom severity in women with dystonia. Mayo Clin Proc, , (2000).
  11. Kim, J. E., et al. Cerebellar 5HT-2A receptor mediates stress-induced onset of dystonia. Sci Adv. , (2021).
  12. Vitek, J. L. Pathophysiology of dystonia: A neuronal model. Mov Disord. , (2002).
  13. Rissardo, J. P., et al. Neurobiology of dystonia: Review of genetics, animal models, and neuroimaging. Brain Sci. , (2025).
  14. Bologna, M., Berardelli, A. The cerebellum and dystonia. Handb Clin Neurol. , (2018).
  15. Kragelund, F. S., et al. Network-wide effects of pallidal deep brain stimulation normalised abnormal cerebellar cortical activity in the dystonic animal model. Neurobiol Dis. , (2025).
  16. Löscher, W., Hörstermann, D. Abnormalities in amino acid neurotransmitters in discrete brain regions of genetically dystonic hamsters. J Neurochem. , (1992).
  17. Lüttig, A., et al. Short-term stimulations of the entopeduncular nucleus induce cerebellar changes of c-Fos expression in an animal model of paroxysmal dystonia. Brain Res. , (2024).
  18. Yousef, O., et al. Subthalamic nucleus versus globus pallidus internus deep brain stimulation in the treatment of dystonia: A systematic review and meta-analysis of safety and efficacy. J Clin Neurosci. , (2025).
  19. Lin, S., et al. Globus pallidus internus versus subthalamic nucleus deep brain stimulation for isolated dystonia: A 3-year follow-up. Eur J Neurol. , (2023).
  20. Liker, M. A., et al. Stereotactic awake basal ganglia electrophysiological recording and stimulation (SABERS): A novel staged procedure for personalized targeting of deep brain stimulation in pediatric movement and neuropsychiatric disorders. J Child Neurol. , (2024).
  21. Hock, A. N., et al. A randomised double-blind controlled study of deep brain stimulation for dystonia in STN or GPi: A long-term follow-up after up to 15 years. Parkinsonism Relat Disord. , (2022).
  22. Shakkottai, V. G., et al. Current opinions and areas of consensus on the role of the cerebellum in dystonia. Cerebellum. , (2017).
  23. Neychev, V. K., et al. The basal ganglia and cerebellum interact in the expression of dystonic movement. Brain. , (2008).
  24. Fredow, G., Löscher, W. Effects of pharmacological manipulation of GABAergic neurotransmission in a new mutant hamster model of paroxysmal dystonia. Eur J Pharmacol. , (1991).
  25. Löscher, W., et al. The sz mutant hamster: A genetic model of epilepsy or of paroxysmal dystonia? Mov Disord. , (1989).
  26. Richter, A., Löscher, W. Pathophysiology of idiopathic dystonia: Findings from genetic animal models. Prog Neurobiol. , (1998).
  27. Hull, C., Regehr, W. G. The cerebellar cortex. Annu Rev Neurosci. , (2022).
  28. van der Heijden, M. E., Sillitoe, R. V. Interactions between Purkinje cells and granule cells coordinate the development of functional cerebellar circuits. Neuroscience. , (2021).
  29. Emery, B. A., et al. High-resolution CMOS-based biosensor for assessing hippocampal circuit dynamics in experience-dependent plasticity. Biosens Bioelectron. , (2023).
  30. Viswam, V., et al. Impedance spectroscopy and electrophysiological imaging of cells with a high-density CMOS microelectrode array system. IEEE Trans Biomed Circuits Syst. , (2018).
  31. Imfeld, K., et al. Large-scale, high-resolution data acquisition system for extracellular recording of electrophysiological activity. IEEE Trans Biomed Eng. , (2008).
  32. Berdondini, L., et al. Extracellular recordings from locally dense microelectrode arrays coupled to dissociated cortical cultures. J Neurosci Methods. , (2009).
  33. Busch, M., et al. Species-appropriate housing of laboratory rats. , GV-SOLAS Committee for Laboratory Animal Husbandry. (2019).
  34. Plocksties, F., et al. The software defined implantable modular platform (STELLA) for preclinical deep brain stimulation research in rodents. J Neural Eng. , (2021).
  35. Kragelund, F. S. Illustration of brain sectioning and slicing. , BioRender. (2026).
  36. Schröter, M., et al. Advances in large-scale electrophysiology with high-density microelectrode arrays. Lab Chip. , (2025).
  37. Paap, M., et al. Deep brain stimulation by optimized stimulators in a phenotypic model of dystonia: Effects of different frequencies. Neurobiol Dis. , (2021).
  38. Takada, M., et al. Two separate neuronal populations of the rat subthalamic nucleus project to the basal ganglia and pedunculopontine tegmental region. Brain Res. , (1988).
  39. Filip, P., Lungu, O. V., Bareš, M. Dystonia and the cerebellum: A new field of interest in movement disorders? Clin Neurophysiol. , (2013).
  40. Bostan, A. C., Strick, P. L. The basal ganglia and the cerebellum: Nodes in an integrated network. Nat Rev Neurosci. , (2018).
  41. Bostan, A. C., Dum, R. P., Strick, P. L. The basal ganglia communicate with the cerebellum. Proc Natl Acad Sci U S A, , (2010).
  42. Middleton, F. A., Strick, P. L. Basal ganglia and cerebellar loops: Motor and cognitive circuits. Brain Res Rev. , (2000).
  43. Heerdegen, M., et al. Mechanisms of pallidal deep brain stimulation: Alteration of cortico-striatal synaptic communication in a dystonia animal model. Neurobiol Dis. , (2021).
  44. Pralong, E., et al. Effect of deep brain stimulation of GPI on neuronal activity of the thalamic nucleus ventralis oralis in a dystonic patient. Neurophysiol Clin. , (2003).
  45. Kotyra, M., et al. Effects of longer-term pallidal stimulation on the severity of dystonia in a phenotypic animal model. Exp Neurol. , (2026).
  46. Franz, D., et al. Network-wide modulation of synaptic plasticity and spike patterns in motor circuits after pallidal deep brain stimulation in a dystonia model. Neurobiol Dis. , (2025).
  47. Cersosimo, M. G., et al. Micro lesion effect of the globus pallidus internus and outcome with deep brain stimulation in patients with Parkinson disease and dystonia. Mov Disord. , (2009).
  48. Blotter, M. L., et al. High-quality seizure-like activity from acute brain slices using a complementary metal-oxide-semiconductor high-density microelectrode array system. J Vis Exp. (211), e67065(2024).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Dystonie modelcerebellaire activiteitelektrofysiologische registratiesbasale gangliacerebellumnetwerkDBS chirurgiePurkinjecellenneuromodulatietherapie n
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen