Methodenartikel

Evaluatie van 3D-sferoïden voor AAV-transductiestudies

96 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70517

⸱

14 augustus 2026

 , 
1Office of Gene Therapy, Office of Therapeutic Products, Center for Biologics Evaluation and Research

In dit artikel

Samenvatting

Driedimensionale sferoïde-cultuursystemen vormen een verbetering ten opzichte van conventionele 2D-modellen voor de ontwikkeling van AAV-gentherapie. Deze methodologie maakt een gevoelige detectie van AAV-transductie bij lage doses mogelijk, biedt een verbeterde fysiologische relevantie en maakt robuuste monitoring op lange termijn mogelijk. Het platform ondersteunt potentiebeoordeling, high-throughput screening en vectoroptimalisatie voor diverse cellijnen en AAV-serotypen.

Samenvatting

Adeno-geassocieerde virussen (AAV's) zijn krachtige vectoren die worden gebruikt voor genoverdracht in gentherapeutische producten. Hun ontwikkeling vereist in vitro systemen die betrouwbaar verschillen in vectorontwerp, serotypeprestaties, sterkte van regulatoire elementen en expressiekinetiek kunnen detecteren. Deze systemen moeten daarnaast toepassingen ondersteunen zoals potentiebeoordeling en vectoroptimalisatie. Hier beschrijven we een gestroomlijnd driedimensionaal sferoïdenplatform dat is geoptimaliseerd voor het evalueren van AAV-potentie, transgene expressiekinetiek en serotype-specifieke transductie-efficiëntie in diverse cellijnen. Uniforme sferoïden worden gegenereerd met behulp van ultra-low attachment platen en in stand gehouden onder omstandigheden die een stabiele architectuur en langetermijnbeeldvorming ondersteunen. Na AAV-transductie worden fluorescente of luminescente readouts in real-time gemonitord met behulp van live-cell imaging systemen. Dit maakt kwantitatieve beoordeling van het reportersignaal, doserespons, activiteit van regulatoire elementen en de aanlooptijd mogelijk via continue kinetische beeldvorming. Het platform maakt effectief onderscheid tussen potente en zwakke vectorgenoomontwerpen en tussen meerdere AAV-serotypes. Deze methode vertoont robuuste prestaties in zowel langzaam als snel delende cellijnen. Deze resultaten bevestigen de bruikbaarheid ervan als een schaalbaar en fysiologisch relevant systeem voor preklinische evaluatie en ontwikkeling van gentherapie.

Inleiding

AAV-vectoren zijn een van de geprefereerde systemen voor genoverdracht geworden voor in vivo toepassingen vanwege hun veiligheidsprofiel en het vermogen om persistente genexpressie te bereiken1. AAV-gentherapie blijkt succesvol bij de behandeling van meerdere zeldzame ziekte-indicaties, met honderden producten in de ontwikkelingspijplijn2. Bovendien omvatten opkomende toepassingen de in vivo levering van componenten voor genoomredigering zoals Cas9, wat een groot potentieel heeft om te helpen bij de behandeling van moeilijk behandelbare indicaties3. Belangrijke ontwikkelingsuitdagingen zijn onder meer de hoge productiekosten en de beperkte voorspellende capaciteit van huidige in vitro assays voor het bepalen van de productkwaliteit en klinische effectiviteit4.

De vooruitgang van AAV-therapeutica wordt fundamenteel beperkt door het gebrek aan voorspellende, gestandaardiseerde activiteitsassays die de klinische prestaties nauwkeurig kunnen voorspellen4,5. Deze assays zijn een cruciaal onderdeel van de ontwikkelingspijplijn, aangezien ze voor meerdere doeleinden worden gebruikt, waaronder het screenen van bibliotheken met engineered vectoren, het optimaliseren van capsid-modificaties voor verbeterde targeting en het evalueren van weefselspecifiek tropisme. Ze dienen daarnaast om de invloed van regulatoire sequenties op de expressie van het transgen te karakteriseren6. Naast de selectie van kandidaten ondersteunen AAV-transductieassays ook de cruciale kwaliteitscontrole bij de productie via potentie-assays die worden gebruikt voor lot-vrijgave, lot-vergelijkbaarheidsstudies en stabiliteitsbeoordelingen6,7.

De wetenschappelijke uitdaging ligt in het ontwikkelen van assays die de complexiteit van vector-gastheerinteracties vastleggen, terwijl de praktische haalbaarheid voor routinematig gebruik behouden blijft7,8. Huidige benaderingen omvatten het gebruik van geïmmortaliseerde cellijnen die het doelorgaan representeren in traditionele 2D-monolaagculturen. Deze kweekcondities missen fysiologische relevantie en vereisen hoge doses geneesmiddelen. Dit creëert een aanzienlijke kloof tussen laboratoriumvoorspellingen en klinische translatie. Nieuwe genetisch gemodificeerde cellijnen, zoals AAVR-overexpresserende of CRISPR-geactiveerde systemen, vormen belangrijke vorderingen, maar slagen er niet in de driedimensionale architectuur en interacties van de extracellulaire matrix te recapituleren die kenmerkend zijn voor natuurlijke weefsels9,10,11. Modellen van de volgende generatie die in vivo micro-omgevingen beter simuleren, zouden deze translationele kloof kunnen overbruggen12,13,14.

Onlangs hebben we een 3D-sferoïdensysteem ontwikkeld dat is geoptimaliseerd voor AAV-transductie om de transleerbaarheid van AAV-transductie-assays te verbeteren. Dit systeem verhoogt de AAV-transductie-efficiëntie aanzienlijk over meerdere cellijnen en AAV-serotypes vergeleken met de gouden standaard van 2D-assays. Naast de verbeterde gevoeligheid en het behoud van het in de assay gebruikte product, verbeteren deze modellen de 2D-monolagen door realistische cel-celinteracties te bieden die variëren afhankelijk van de cellulaire locatie binnen de sferoïden. Ze maken daarnaast een betekenisvol onderzoek mogelijk naar drugpenetratie die werkelijke organomstandigheden simuleert11,15,16. Bovendien biedt deze sferoïdenaanpak praktische voordelen ten opzichte van complexere organoïde- of co-culturesystemen, aangezien er standaard laboratoriumapparatuur wordt gebruikt en gespecialiseerde medium- of steigervereisten worden vermeden. Deze eenvoud waarborgt de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid, waardoor het systeem zeer geschikt is voor routinematige gentherapietests en workflows voor vectorontwikkeling17.

Dit 3D-sferoïdeplatform is bijzonder goed geschikt voor toepassingen waarbij een gevoelige detectie van AAV-transductie bij lage doses en een vergelijkende evaluatie van vectorgenoomontwerpen vereist zijn. Het ondersteunt daarnaast de beoordeling van serotype-afhankelijk tropisme. Het is vooral voordelig voor cellijnen met een relatief lage transductie-efficiëntie waarvoor hoge AAV-doses nodig zijn in conventionele 2D-culturen. In deze contexten zijn de verhoogde gevoeligheid en de verbeterde fysiologische relevantie van het 3D-platform essentieel. Echter kan dit systeem minder geschikt zijn voor studies waarbij immuuncomponenten, vasculaire toediening of volledige weefselcomplexiteit vereist zijn. Dit komt omdat sferoïden de in vivo omgeving niet volledig nabootsen.

Hier presenteren wij een rechtvooruit 3D-sferoïdprotocol dat is geoptimaliseerd voor AAV-transductie-assays, met twee kritische en complementaire read-outs: transductie-efficiëntie (hier gedefinieerd als het totale reportersignaal per sferoïd) en transductiekinetiek. Deze methode biedt een kosteneffectief, fysiologisch relevant en informatief platform voor de evaluatie van AAV-potentie, vectorontwerp en neutralisatie-assays.

Protocol

In deze studie werden gevestigde menselijke cellijnen (HEK293T, HeLa, Huh7, HEP3B, HEPG2 en A375) gebruikt, verkregen via commerciële of eerder gepubliceerde bronnen. Er zijn geen primaire menselijke of dierlijke monsters gebruikt, waardoor geen ethische goedkeuring vereist was.

1. Steriele experimentele opstelling en initiële voorbereiding van de zuurkast

  1. Activeer de biosafety cabinet.
  2. Schakel de Klasse II laminaire flow microbiologische veiligheidskabinet 15 min vóór aanvang in om voldoende tijd te geven voor de stabilisatie van de luchtstroom.
  3. Bespuit alle binnenoppervlakken van de zuurkast met 70% (v/v) ethanol.
  4. Maak een 5% (v/v) bleekmiddel-desinfectieoplossing in een glazen bekerglas van 500 mL voor de verwijdering van celsupernatans en cellulair debris.
  5. Reinig de apparatuur door alle micropipetten en tipdoosjes grondig te desinfecteren met 70% (v/v) ethanol.

2. Bereiding van celkweekmedia

  1. Bereid 500 mL Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) high glucose basismedium voor.
  2. Suppleer het basismedium met 10 mL hitte-inactief foetaal runderserum (FBS), 1 mL penicilline/streptomycine-oplossing (100 units/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine) en 5 mL 2 mM L-glutamine.
    OPMERKING: Gedurende alle procedures moeten aseptische technieken worden gehanteerd. Voor elk experiment is de bereiding van vers medium vereist. Raadpleeg de Tabel met materialen voor specifieke specificaties van de apparatuur.

3. Bereiding van sferoïden

  1. Bereid compleet DMEM-medium voor zoals hierboven beschreven.
  2. Warm het kweekmedium 10–15 min op in een waterbad van 37 °C.
  3. Haal de gewenste cellijnen uit de tank met vloeibare stikstof.
  4. Ontdooi cryopreserveerde HEK293T-, Huh7-, HEP3B-, HEPG2-, A375- en HeLa-cellen snel door ze in een waterbad van 37 °C te plaatsen.
  5. Haal ze onmiddellijk uit het waterbad zodra het laatste ijskristal is gesmolten.
  6. Verdun 1 mL ontdooide cellen in 9 mL compleet DMEM-medium.
    OPMERKING: Alle in dit protocol gebruikte cellijnen worden onderhouden in hetzelfde DMEM-medium en onder dezelfde kweekcondities.
  7. Centrifugeer de cellen 5 min bij 350 × g bij kamertemperatuur.
  8. Verwijder het supernatant.
  9. Resuspendeer de pellet in 5 mL compleet DMEM-medium.
  10. Zaai de cellen uit in een T75-celkweekfles.
  11. Plaats de gezaaide flessen in een celkweekincubator ingesteld op 37 °C, 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid.

4. Monitoring van celgroei

  1. Voeg elke 3 dagen 15 mL kweekmedium toe.
  2. Passageer HEK293T-, Huh7-, HEP3B-, HEPG2-, A375- en HeLa-cellen wanneer ze een confluentie van 70% bereiken; aspireer het complete DMEM-medium uit de T75-flessen. 
  3. Was de cellen door 5 mL PBS toe te voegen aan de T75-flessen die de cellen bevatten. 
  4. Aspireer de 5 mL PBS 30 s na toevoeging aan de T75-flessen. 
  5. Herhaal deze wasstap nog één keer.  
  6. Trypsiniseer de cellen met 5 mL 0,05% trypsine-EDTA gedurende 5 min. 
  7. Incubeer de flessen in een incubator van 37 °C gedurende 5 min om volledige cel loslating mogelijk te maken. 
  8. Voeg 5 mL compleet DMEM-medium toe om de trypsine te neutraliseren. 
  9. Centrifugeer de cellen bij 350 × g. gedurende 5 min om de trypsine te verwijderen. 
  10. Resuspendeer de celpellet in 5 mL DMEM. 
  11. Split de cellen in een 1:10 verdunning voor routinematige celpassaging. 
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de cellen 2 keer te passageren voordat experimenten worden uitgevoerd, zodat de cellen de log-fase kunnen bereiken en metabolisch actief worden. 
  12. Zet de incubatie onder deze gecontroleerde omstandigheden voort totdat de cellen een confluentie van 70% bereiken, en ga vervolgens over tot de volgende experimentele procedures.
    OPMERKING: Celmorfologie en groeipatronen dienen regelmatig te worden gemonitord. Zorg voor een juiste positionering van de flessen voor een optimale gasuitwisseling. Steriele omstandigheden zijn essentieel gedurende de gehele incubatieperiode.

5. Oogsten van cellen en initiële celpreparatie

  1. Verwijder het kweekmedium door het bestaande kweekmedium uit de T75-flasks te aspireren.
  2. Was HEK293T-, Huh7-, HEP3B-, A375-, HEPG2- en HeLa-cellen 3 keer met PBS om residu van het medium en debris te verwijderen.
  3. Voeg 5 mL voorverwarmde 1× trypsine-oplossing toe aan deze cellen om adherente cellen van het flaskoppervlak los te maken.
    OPMERKING: Zorg dat trypsine voorverwarmd is om een optimale enzymatische activiteit te behouden. Plaats de flasks gedurende 5 min in een incubator van 37 °C om volledige celdetachement mogelijk te maken. Controleer de trypsinisatietijd nauwgezet om overdigestie te voorkomen.
  4. Voeg 5 mL volledig kweekmedium toe om het trypsine-enzym te inactiveren.
  5. Pipetteer het mengsel meerdere keren op en neer om de oplossing te homogeniseren.
  6. Verzamel elke celsuspensie door de volledige celsuspensie over te brengen naar individueel gelabelde centrifugebuisjes.
    OPMERKING: Cellen moeten tijdens het resuspenderen voorzichtig worden behandeld om de levensvatbaarheid te behouden.
  7. Centrifugeer de cellen door ze 5 min bij kamertemperatuur te spinnen bij 350 × g. om de cellen te pelletten.
  8. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de celpellet voorzichtig in 5 mL vers kweekmedium.

6. Celttelling en levensvatbaarheidsbeoordeling met behulp van een celteller

  1. Homogeniseer de suspensie door voorzichtig op en neer te pipetteren om een uniforme celdistributie in de centrifugebuis te waarborgen.
  2. Bereid telbuisjes voor voor HEK293T-, Huh7-, HEP3B-, HEPG2-, A375- en HeLa-cellen.
  3. Maak een 1:10 verdunning van het monster in compleet DMEM-kweekmedium. Bijvoorbeeld 40 µL celsuspensie in 360 µL compleet DMEM-medium.
  4. Pipetteer het mengsel voorzichtig vier keer op en neer om een homogene verdunning te verkrijgen.
  5. Label het monster in het logboek en vermeld het gebruikte celtype, de verdunning en de monsternaam.
  6. Plaats het monster in de celteller en positioneer de buis met de verdunde celsuspensie op het toegewezen nummer.
    OPMERKING: De celteller is een automatische celteller die celmonsters opzuigt en mengt met trypaanblauw, waardoor de variabiliteit tussen verschillende operators wordt verminderd.
  7. Laat de celsuspensie 1 min bezinken voordat het monster wordt geteld.
  8. Resuspendeer de cellen gelijkmatig vóór het tellen om nauwkeurige resultaten te verkrijgen.
  9. Bereken het totale aantal cellen.
  10. Gebruik de totale concentratie levensvatbare cellen om de celuitzaai voor experimenten te bepalen.
  11. Gebruik levensvatbare cellen met > 90% levensvatbaarheid.
  12. Maak onderscheid tussen levensvatbare (ongekleurde) en niet-levensvatbare (blauw gekleurde) cellen.
    OPMERKING: Consistente telcriteria moeten voor alle monsters worden gehanteerd.

7. Uitplaatten van sferoïden en optimalisatie van de grootte

  1. Pipetteer de celsuspensie meerdere keren op en neer om de oplossing te homogeniseren.
  2. Zaai verschillende celdichtheden van HEK293T-, Huh7-, HEP3B-, HEPG2- of HeLa-cellen.
  3. Begin met het zaaien van 1 x 104 cellen in 200 µL in een ultra-low attachment (ULA) 96-wells plaat met ronde bodem.
  4. Verdun de 1 x 104 cellen / well via seriële 2-voudige verdunningen totdat de gewenste celdichtheid voor de experimenten is bereikt.
  5. Voeg 1 volume compleet medium toe aan alle rijen (1B-1H), behalve aan de bovenste rij.
  6. Voeg 2 volumes van 1 x 104 cellen /well toe in rij 1A (bovenste rij).
  7. Verdun rij 1A serieel door 1 volume van rij 1A toe te voegen aan 1B, enzovoort. Zie het voorbeeld van de experimentele indeling hieronder in Supplementary Figure 1.
    OPMERKING: Zorg voor een gelijkmatige resuspensie door voorzichtig tegen de zijkanten van de plaat te tikken.
  8. Centrifugeer de ULA-plaat bij 350 × g . gedurende 5 min om de cellen naar het midden te trekken en het cel-celcontact te bevorderen.
    OPMERKING: Indien er andere cellijnen worden gebruikt dan die hier vermeld, kan optimalisatie van de parameters nodig zijn, aangezien verschillende cellijnen variërende groeisnelheden en sferoïdevormingssnelheden vertonen.
  9. Vermijd verstoring van de platen gedurende de eerste 24–48 h om de initiële sferoïdevorming mogelijk te maken. Laat de sferoïden 3 dagen rijpen om een diameter van ~400 µm te bereiken.
  10. Controleer de uniformiteit van de sferoïdegrootte. Zorg ervoor dat de cellen uniform zijn geresuspendeerd en dat de platen niet vervormd zijn.
    Opmerking: Gebruik geen platen met sferoïden van inconsistente grootten. Zorg ervoor dat sferoïden binnen elke well een relatief uniforme diameter hebben.
  11. Monitor de morfologie van de sferoïden.
    Opmerking: Goed gevormde sferoïden zien er rond uit met scherp gedefinieerde randen.
  12. Zorg voor rijpe sferoïden die een sterke cel-celadhesie vertonen, en geen losse celaggregaten.
  13. Verhoog de zaaidichtheid of verleng de vormingstijd. Als sferoïden niet compact zijn, verhoog dan de zaaidichtheid of verleng de vormingstijd.
  14. Minimaliseer de vorming van meerdere kleine aggregaten door de zaaidichtheid te verlagen of de centrifugatiestap te verlengen.

8. Real-time monitoring van sferoïden in levende cellen

  1. Zodra de celsuspensies zijn gecentrifugeerd, wordt de plaat overgeplaatst naar een incubator van 37 °C (5% CO2, 95% luchtvochtigheid) waarin een live-cell imaging-instrument is geplaatst voor geautomatiseerde live-cell imaging.
  2. Stel de parameters voor de live-cell imaging van sferoïden in zoals nodig voor het experiment:
    OPMERKING: De volgende parameters werden gebruikt voor alle geteste cellijnen.
  3. Log in op de acquisitiesoftware.
  4. Selecteer de volgende commando's:|Schedule To Acquire | Launch Add Vessel | Scan On Schedule | Create Vessel: New.
  5. |Select Scan Type|: Spheroid. |Selecteer de kanalen van belang|: Fase + Brightfield (om de groei van de sferoïden te volgen), Groen/Rood (om de AAV-transductie te volgen, acquisitietijd respectievelijk 300 ms of 400 ms).
  6. Selecteer de gewenste vergroting: 10x.
  7. Kies het plaatmodel en de positie ervan in de lade.
  8. Selecteer de positie van de wells die gefotografeerd moeten worden en hoeveel beelden per well gewenst zijn.
  9. Voer de beschrijving van het experiment in: naam, type cellen, aantal cellen.
  10. Selecteer voor de analyse-instellingen  Defer Analysis Until Later.
  11. Klik met de rechtermuisknop op de tijdlijn en selecteer  de optie Set Selected Scan Group Interval.
  12. Stel  scans in om elke 6 h toe te voegen en  scan onbeperkt. Stel de gewenste starttijd in (ten minste 1 h na incubatie in het geautomatiseerde imaging-apparaat).
  13. Controleer dagelijks de groei van de sferoïden door in te loggen op de imaging-software.
  14. Kies de optie  View Recent Scans en dubbelklik op het gewenste experiment. |Selecteer  Brightfield in het paneel voor beeldkanalen| en gebruik vervolgens de tool  |Measure image| features om de diameter van de sferoïden te meten.
    OPMERKING: Een optimale rijpingstijd kan nodig zijn om compacte sferoïden te produceren uit de betreffende cellen.
  15. Verwijder de plaat op de dag van optimale sferoïdvorming en gebruik deze voor AAV-transductie.

9. AAV-transductie

  1. Koop of produceer AAV-serotypes3 en de transgenen van belang.
  2. Maak DMEM-medium aangevuld met 2% FBS voor AAV-transducties door 10 mL FBS toe te voegen aan 490 mL DMEM-medium.
    OPMERKING: Voor het screenen van capsiden of genomische regulatoire elementen is een GFP-transgeen zeer effectief, zoals aangetoond in de sectie met representatieve resultaten. Verdun de betreffende AAV in DMEM-medium aangevuld met 2% FBS, zonder antibiotica.
  3. Verdun in een daarvoor bestemde ronde 96-well plaat voor seriële verdunningen.
  4. Maak 1:10 verdunningen vanaf de start-MOI om AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 en AAV9 te titreren.
  5. Zie het onderstaande voorbeeld van de experimentele lay-out in Aanvullende Figuur 2. Bereken de MOI die nodig is voor AAV-transductie, zoals beschreven in de sectie Discussie.
  6. Voeg 33 µL AAV-stock toe aan 297 µL medium om in totaal 330 µL van MOI 1 × 106 te verkrijgen.
  7. Voer 10-voudige seriële verdunningen uit, beginnend met een MOI van 1 × 106, door 33 µL toe te voegen aan 297 µL DMEM-medium aangevuld met 2% FBS.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om hoge MOI's te vermijden om een verminderde cellevensvatbaarheid te voorkomen. Optimalisatie van de experimentele condities kan nodig zijn voor elk celtype en AAV-serotype, aangezien deze de optimale MOI aanzienlijk kunnen beïnvloeden. Niet alle virale genomen zijn infectieus; functionele titers kunnen afwijken van de vg/mL-waarde.

10. AAV-dosering

  1. Zuig alle media uit de reeds voorbereide spheroidplaat met een multichannelpipet.
  2. Voeg 100 µL van de gewenste MOI toe door dit volume met een multichannelpipet van de verdunningsplaat naar de behandelplaat over te brengen.
  3. Plaats de platen terug in het imaging-instrument en start de monitoring van de transductie door de groene fluorescentie-intensiteit gedurende 72 h te volgen.
  4. Voeg elke 3 dagen 100 µL compleet DMEM-medium per well toe om de voedingsstoffen aan te vullen, indien de monitoring langer dan 3 dagen duurt.

11. Live-cell imaging, monitoring van transductie en data-analyse

  1. Plaats de plaat terug in het instrument nadat de gewenste AAV en MOI aan de behandelingsgroep zijn toegevoegd.
  2. Begin met het elke 6 h vastleggen van de transductie-efficiëntie.
    OPMERKING: Het duurt gewoonlijk tussen de 3 en 5 dagen om een optimale GFP-expressie te bereiken. Dit hangt af van de gebruikte promotor en de genoomconfiguratie.
  3. Analyseer de gegevens door een analysedefinitie te maken die specifiek is voor de cellen en reportergenen van belang.
    OPMERKING: Alternatief kan de plaat in een standaard 37 °C incubator worden bewaard en de transductie-efficiëntie worden beoordeeld via qPCR, western blotting of ELISA.
  4. Definieer de analyseparameters door een brightfield-analyse uit te voeren voor de primaire detectie van sferoïden.
  5. Optimaliseer de segmentatieparameters als volgt:
    1. Analysetype: "Spheroid Brightfield."
    2. Segmentatiemethode: "Adaptive Threshold."
    3. Drempelbereik: 0.3–0.8 (initieel wordt automatische aanpassing aanbevolen)
    4. Top-hat-filter: 200–500 µm (verwijdert ongelijkmatige verlichting)
  6. Optimaliseer de brightfield-parameters als volgt:
    1. Laad representatieve beelden van verschillende tijdstippen.
    2. Test het drempelbereik (0.2–0.9) om de optimale detectie te vinden.
    3. Pas groottefilters aan op basis van het verwachte groottebereik van de sferoïden.
    4. Valideer de segmentatie door visuele inspectie van de overlay.
  7. Optimaliseer het groene kanaal voor de beoordeling van AAV-transductie als volgt:
    1. Bepaal de achtergrondniveaus van onbehandelde putjes (MOI=0).
    2. Stel de drempelwaarde in op 2–3× boven de achtergrondruis.
    3. Test met het monster dat met de hoogste MOI is behandeld.
  8. Optimaliseer de belichtingstijd om verzadiging te voorkomen terwijl het signaal behouden blijft
    OPMERKING: Rapporteer bij AAV-transducties het totale fluorescentiesignaal per sferoïde als maat voor de transductie-efficiëntie.

12. Data-analyse

  1. Selecteer de juiste parameters door de filters en maskers aan te passen, zodat de cellen op de afbeelding worden geselecteerd en niet de achtergrondruis.
  2. Selecteer een representatieve afbeelding om de software te trainen.
  3. Pas de geoptimaliseerde parameters toe op alle afbeeldingen in de studie.
  4. Extraheer de gegevens als individuele waarden of gegroepeerd en transfer deze naar een statistisch analysesysteem voor verdere datapresentatie.

13. Berekening van de aanstijd

  1. Bereken de tijd die nodig is om het eerste GFP-signaal per MOI te detecteren.
  2. Voer interpolatie uit bij het gemiddelde van de onbehandelde wells (MOI = 0) + 3 standaarddeviaties (SD).
  3. Kopieer de groene fluorescentie-intensiteit van elke sferoïde op elk tijdstip van de live-cell imaging-software naar een statistische software.
  4. Bereken het gemiddelde van de replicates.
  5. Bereken het gemiddelde en de SD van de signalen van alle wells met onbehandelde sferoïden (MOI = 0).
  6. Gebruik de asymmetrische sigmoïdale 5PL-curvefit om de onset-tijd voor elke MOI te interpoleren.
  7. Bijvoorbeeld, de volgende interpolatiewaarden werden gebruikt in Tabel 1:
    1. Voor scGFP: 254.955 (gemiddelde) + 3 × 288.055 (SD) = 1.412.120 (interpolatiesignaal)
    2. Voor ssGFP: 2.417.941 (gemiddelde) + 3 × 26.093  (SD) =  3.200.746 (interpolatiesignaal)

14. Meet de fluorescentie met een platenlezer met fluorescentiecapaciteiten.

  1. Start de software van de fluorescentieplaatlezer op de computer die is aangesloten op de plaatlezer.
  2. Ga naar Bestand > Open Protocol, kies het plaattype (bijv. 96-well, 384-well) en zorg dat de juiste well-indeling is geselecteerd. 
  3. Stel de integratietijd voor fluorescentiedetectie in; dit bepaalt hoe lang de lezer fluorescentie uit elke well verzamelt.
  4. Pas eventuele gain-  of gevoeligheidsinstellingen aan
    als de assay een hogere of lagere signaaldetectie vereist.
  5. Stel de fluorescentieparameters voor GFP als volgt in: excitatie: 485 nm en emissie: 528 nm.
  6. Klik in de software op 'Run' om de meting te starten.
  7. Meet de fluorescentie van elke well.
    OPMERKING: Na de run toont de software de ruwe fluorescentiewaarden, die kunnen worden gebruikt om grafieken te genereren door gemiddelden te berekenen en de achtergrond af te trekken.
  8. Exporteer de resultaten in het gewenste formaat voor verdere analyse of rapportage.
    OPMERKING: Als het monsterprotocol is gewijzigd, gebruik dan Bestand > Opslaan als om een unieke versie te maken, zodat het origineel behouden blijft voor toekomstig gebruik.

15. Luminescente transgene transductie

  1. Volg hetzelfde protocol voor het uitplaten en de AAV-dosering zoals hierboven beschreven.
  2. Voeg 100µL van AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 en AAV9 die een nano luciferase-transgeen dragen met verschillende MOI's variërend van 0–106 toe aan 100 µL HeLa-sferoïden die reeds zijn gegroeid in ULA-platen.
  3. Incubeer de platen in een reguliere 37 °C incubator en beoordeel de transductie-efficiëntie na 3 dagen transductie.

16. Bereid de extracellulaire luminescentieremmer en het luminescentiesubstraat voor voor detectie via een live-cell assay

  1. Haal de assayplaten op dag 3 (eindpunt) uit de incubator.
  2. Voeg de extracellulaire luminescentieremmer en het substraat direct toe aan de cellen.
    OPMERKING: Verwijdering van het medium is niet nodig.
  3. Haal de extracellulaire remmer uit de opslag bij −20 °C en laat deze ontdooien bij kamertemperatuur.
  4. Centrifugeer kort om vloeistof van de dop en de wanden van de buis te verzamelen.
  5. Bereid de gewenste hoeveelheid gereconstitueerde 15X extracellulaire luminescentieremmer door 1 volume extracellulaire remmer te mengen met 14 volumes volledig DMEM-medium.
    1. Als het experiment bijvoorbeeld 1,0 mL reagens vereist, voeg dan 67 µL remmer toe aan 933 µL DMEM. Bereid voor 1 plaat 1 mL DMEM en voeg 67 µL remmer toe.
  6. Overbreng de bereide remmer uit stap 16.5 naar een steriel reagensreservoir.
  7. Gebruik een multichannelpipet om 10 µL remmer te dispenseren in de wells die met AAV zijn getransduceerd.
  8. Haal het Live Cell Substraat uit de opslag bij −20°C en meng dit.
  9. Centrifugeer kort om vloeistof van de dop en de wanden van de buis te verzamelen.
  10. Bereid de gewenste hoeveelheid gereconstitueerd 3,6X Live Cell Reagens.
  11. Bereid 4 mL DMEM en voeg 144 µL substraat toe voor 1 plaat.
  12. Overbreng het bereide substraat uit stap 16.11 naar een steriel reagensreservoir.
  13. Gebruik een multichannelpipet om 50 µL substraat te dispenseren in dezelfde wells die met AAV zijn getransduceerd.
    OPMERKING: Het volume van de reagentia moet mogelijk worden aangepast als er meerdere assayplaten gelijktijdig worden verwerkt.
  14. Schud de plaat 5 min bij 300 rpm op kamertemperatuur.
  15. Lees de plaat uit met een in vivo imaging-systeem binnen 2 u na toevoeging van de luminescentiedetectiereagentia.
    OPMERKING: De luminescentie-intensiteit zal gedurende 2 u geleidelijk afnemen.

17. Bioluminescentie-imaging

  1. Zet het bioluminescentie-beeldvormingssysteem minstens 30 min voor de beeldvorming aan, zodat de CCD-camera kan afkoelen (−90 °C).
  2. Zorg dat de platen klaar zijn voor beeldvorming (bijv. het substraat voor levende celbeeldvorming is toegevoegd voor de bioluminescentie-uitlezing).
  3. Verwijder het platendeksel om lichtreflectie en verstrooiing te voorkomen.
  4. Maak de onderkant van de plaat schoon als er van onderaf wordt gefotografeerd.
  5. Plaats de plaat in de beeldvormingskamer op de tafel.
  6. Positioneer de plaat gecentreerd onder de camera.
  7. Stel de beeldvormingsparameters voor luminescentie in: auto-belichting of stel de belichtingstijd in (typisch 1–60 s), binning (medium aanbevolen), diafragma (f/1 voor maximale gevoeligheid).
  8. Maak een foto als anatomische referentie.
  9. Leg het luminescente beeld vast.

18. Analyse van bioluminescentie-beeldvormingsgegevens

  1. Gebruik ROI-tools om wells of gebieden van interesse te omcirkelen.
  2. Zorg voor een consistente ROI-grootte over alle monsters voor vergelijking.
  3. Meet de totale flux (fotonen/seconde) voor bioluminescentie.
  4. Meet de stralingsefficiëntie.
  5. Exporteer de gegevens naar een spreadsheet voor statistische analyse.
  6. Sla de afbeeldingsbestanden en analyseresultaten op.
  7. Exporteer afbeeldingen als TIFF of JPEG voor presentaties.

Resultaten

Hier tonen we aan dat 3D-sferoïden kunnen worden gebruikt als instrument om AAV-transductie te beoordelen, om onderscheid te maken tussen vectorgenoomontwerpen zoals zelfcomplementair (sc) en enkelstrengs (ss), en om transductiekinetiek te evalueren. Een overzicht van het proces wordt weergegeven in Figuur 1. Kort samengevat worden cellen eerst uitgebreid in 2D-culturen en gezaaid in platen met ultra-lage hechting (ULA) om compacte sferoïden te vormen (Figuur 1A). Vervolgens worden de platen gecentrifugeerd om aggregatie te bevorderen (Figuur 1B) en overgebracht naar een live-cell imaging-systeem voor real-time monitoring van de sferoïdevorming (Figuur 1C). Op dag 3 worden de sferoïden getransduceerd met AAV bij verschillende MOI's (Figuur 1D). De transductiekinetiek wordt longitudinaal gevolgd met behulp van live-cell imaging (Figuur 1E), en de eindpuntsanalyse wordt uitgevoerd met behulp van plaatgebaseerde fluorescentie- of luminescentie-metingen (Figuur 1F).

Figuur 2 toont de morfologie van sferoïden van 6 verschillende cellijnen, waarbij een variatie in dichtheid, rondheid en vorm zichtbaar is. Alle cellijnen werden gedurende enkele passages gekweekt in compleet DMEM-medium voordat ze in experimenten werden gebruikt. Zodra de cellen de logfase bereikten, werden HEP3B-, HEK293T-, A375-, HeLa-, HEPG2- en Huh7-cellen geoogst en serieel verdund in ULA-ronde bodemplaten, beginnend bij een celdichtheid van 10.000 cellen per putje, met een seriële 2-voudige verdunning (het plaatontwerp is opgenomen in Supplementary Figuur 1 en representatieve resultaten worden getoond in Supplementary Figure 2). De grootte van de sferoïden kan zo klein zijn als 50 µm, terwijl de sferoïdenstructuur en een uitstekende transductiegevoeligheid behouden blijven. Na het uitplaten van de cellen werd de ULA-ronde bodemplaat gecentrifugeerd bij 350 × g gedurende 5 min, waardoor de cellen in het centrum van het putje konden samenklonteren en tot sferoïden konden zelf-assembleren. Deze stap is bijzonder gunstig voor cellen die niet van nature aggregeren. De centrifugatietijd kan worden verlengd van 5 naar 15 min voor zeer resistente cellen, zoals lymfocyten. Goed gevormde sferoïden vertonen een rond en compact fenotype, zoals waargenomen bij HEK293T- en Huh7-cellen, terwijl slecht gevormde sferoïden los geaggregeerd zijn en geneigd zijn tot desintegratie tijdens mediumwissels.

Vervolgens wordt de plaat overgebracht naar een incubator van 37 °C die is uitgerust met een instrument voor live-cell monitoring. De platen worden dagelijks met intervallen van 6 h gemonitord om de sferoïdevorming voor elk van de hier vermelde cellijnen te beoordelen. De meeste cellijnen hebben 3 dagen nodig om zichzelf te assembleren tot een sferoïde. Zoals getoond in Figuur 2, vertoonde elke cellijn na 3 dagen zaaien kenmerkende morfologische eigenschappen en verschillende graden van compactie. Hepatische cellijnen (Huh7, HEPG2 en HEP3B) vormden compactere, dichtere sferoïden dan de andere cellijnen. HEK293T vormde een zeer ronde sferische verschijning met een duidelijke necrotische kern, terwijl A375 een onregelmatig gevormd celaggregaat vormde (voorheen beschreven als een gedeformeerde sferoïde)18,19. Er wordt aangenomen dat deze verschillen in morfologie indicatoren zijn van pathofysiologische ziektestadia, wat het nut van 3D-modellen ten opzichte van 2D-culturesystemen verder ondersteunt18,19. Het protocol voor sferoïde-assemblage is zeer reproduceerbaar over de zes geteste cellijnen en is toegepast op alle hier getoonde transducties.

Na het optimaliseren van de celconcentratie, de tijd voor sferoïdevorming en de status van groene/rode autofluorescentie (getoond in Aanvullende Figuur 3), zijn we overgegaan tot het testen van AAV-transductie in sferoïden met behulp van een live-cell imaging-systeem en een plaatlezer (een voorbeeld van de plaatindeling voor AAV-titratie is getoond in Aanvullende Figuur 4). Figuur 3 toont het geoptimaliseerde sferoïde-protocol toegepast op vier verschillende cellijnen (HEK293T, Huh7, HEP3B en HEPG2). Op dag 3 van de sferoïdevorming werden de sferoïden getransduceerd met twee AAV2-vectoren met verschillende vectorgenoomontwerpen, gelabeld met GFP, bij diverse multiplicities of infection (MOI's). Deze twee AAV-transgeenontwerpen vertegenwoordigen GFP-varianten met een hoge potentie (scGFP) en een lage potentie (ssGFP). Nadat de cellen waren getransduceerd, werden de platen in een live-cell imaging-systeem geplaatst voor real-time monitoring van de AAV-transductie. Op het tijdstip van 72 u werd de groene fluorescentie-intensiteit gedetecteerd met behulp van live-cell imaging-software. In Figuur 3, vertegenwoordigen de blauwe lijnen sc-GFP-genomen, terwijl de rode lijnen ss-GFP-genomen vertegenwoordigen. Sferoïden waren zeer gevoelig voor AAV-transductie, waarbij sterke transductie werd gedetecteerd bij zeer lage AAV-titers en over verschillende cellijnen voor scGFP. Representatieve video's van AAV-transductie in diverse cellijnen en MOI's, in real-time vastgelegd, worden getoond in Aanvullende Film 1, Aanvullende Film 2, Aanvullende Film 3, Aanvullende Film 4, Aanvullende Film 5, en Aanvullende Film 6. Aan de andere kant werd de sferoïdetransductie van ssGFP AAV op lagere niveaus waargenomen, wat de verwachte zwakkere/tragere transductie van dit type regulatoir element weerspiegelt20,21. Dit demonstreert het nut van 3D-sferoïden voor sterke en zwakke AAV-transducties, evenals voor het onderscheiden tussen sterk transducerende genen, zoals sc-GFP, en minder potente genen, zoals ss-GFP. We observeerden een 100-voudig verschil in relatieve fluorescentie tussen de sc- en ss-transgenen bij een MOI van 106 in HEK293T-cellen, en een 3-voudig verschil in cellijnen die moeilijker te transduceren zijn, zoals HEP3B.

Vervolgens hebben we de AAV-transductie van verschillende serotypes op een dosisafhankelijke manier getest in zowel HEK293T-sferoïden als Huh7-sferoïden. Zoals getoond in Figuur 4, waren 3D-sferoïden vatbaar voor AAV-scGFP-transducties van vier verschillende serotypes. Na 72 u transductie werd scGFP gemeten met een fluorescentieplaatlezer (Figuur 4A,B) en live-cell imaging software (Figuur 4C,D)). Alle 4 serotypes werden succesvol gedetecteerd met deze twee instrumenten. Het live-cell imaging systeem vertoonde een groter bereik in de signaal-ruisverhouding dan de fluorescentieplaatlezer, hoewel het genormaliseerde signaal geen significante verschillen liet zien. We stelden vast dat AAV2 de sterkste transductie-efficiëntie had in beide cellijnen, gevolgd door AAV1, terwijl AAV5 en AAV9 een significant lagere transductie vertoonden.

Vervolgens hebben we de luminescentietransductie geëvalueerd met behulp van het sferoïdenprotocol. Om dit te testen, werden HeLa-cellen gekweekt tot 3D-sferoïden volgens het hier beschreven geoptimaliseerde protocol. Op dag 3 werden HeLa-sferoïden getransduceerd met 5 verschillende AAV-serotypes die een nano-luciferase-reportergen coderen. Na 72 u AAV-transductie werden de cellen behandeld met Live Cell-substraat en 5 min bij kamertemperatuur geïncubeerd. Daarna werd de luminescentie gemeten en vastgelegd met behulp van een bioluminescentie-beeldvormingssysteem(Figuur 5A). Met dit systeem werd een efficiënte transductie waargenomen voor alle AAV-serotypes. Er was een gevoelig onderscheid merkbaar tussen de transductie-efficiëntie van de verschillende AAV-serotypes, wat aangeeft dat het protocol niet beperkt is tot fluorescentie-uitlezingen. In overeenstemming met de trends waargenomen in Figuur 5, toonde AAV-nano-luciferase-transductie in HeLa-cellen aan dat AAV2 het meest potente serotype is, zoals ook werd gezien bij de AAV-GFP-vectoren. Op dezelfde wijze werd de laagste transductie-efficiëntie waargenomen voor het AAV9-serotype, zoals aangetoond door zowel fluorescentie- als luminescentievectoren (Figuur 4 en 5). Een representatieve afbeelding van AAV-nano-luciferase-transductie is weergegeven in Figuur 5B.

Naast de transductie-intensiteit maken 3D-sferoïden-protocollen kinetische monitoring van de transductie mogelijk. Figuur 6 toont representatieve resultaten van de transductiekinetiek van AAV2-scGFP en AAV2-ssGFP in 3D HEK293T-sferoïden, getransduceerd bij verschillende MOI's (0-106) (Figuur 6A-G). We stelden vast dat AAV2-scGFP-transductie detecteerbaar is bij MOI's zo laag als 101, met een toename van het GFP-signaal die na ongeveer 34 uur detecteerbaar is in vergelijking met onbehandelde cellen, gebruikmakend van een live-cell imaging-systeem. Het AAV2-ssGFP-signaal is veel zwakker en trager dan het AAV2scGFP-signaal. Om de transductiesnelheid verder te vergelijken, hebben we de aanlooptijd berekend waarbij het GFP-signaal detecteerbaar wordt. We stelden vast dat scGFP gemiddeld 4 keer sneller is dan ssGFP bij het transduceren van cellen. Individuele aanlooptijden worden vermeld in Tabel 1Deze kinetische metingen tonen een aanvullend aspect van de transductie-efficiëntie dat nuttig is voor de optimalisatie van de assay.

Diagram van de celkweekworkflow; sferoïdevorming, transductie en analyse met behulp van IncuCyte.
Figuur 1: Overzicht van AAV-transducties met behulp van 3D-kweken. (A) Cellen worden uitgebreid in 2D-kweek en gezaaid in ultra-low attachment (ULA) platen om sferoïden te vormen. (B) Platen worden gecentrifugeerd om aggregatie te bevorderen en overgebracht naar een (C) IncuCyte S3-systeem voor real-time monitoring van de sferoïdevorming. (D) Op dag 3 worden de sferoïden getransduceerd met AAV bij verschillende MOI's. (E) De transductiekinetiek wordt longitudinaal gevolgd met behulp van live-cell imaging, en (F) endpoint-analyse kan worden uitgevoerd met behulp van platgebaseerde fluorescentie- of luminescentiemetingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

Vergelijking van celluultuursferoïden; microscopiebeeld van zes verschillende cellijnen in de experimentele opstelling.
Figuur 2: Morfologische karakterisering van sferoïden in meerdere cellijnen. Representatieve beelden van sferoïden gegenereerd uit HEP3B-, HEK293T-, A375-, HeLa-, HEPG2- en Huh7-cellen tonen variabiliteit in grootte, morfologie en compactheid, terwijl ze een hoge reproduceerbaarheid tussen replica's vertonen (schaalbalk, 50 µm). Alle cellijnen werden gezaaid met 1 x 104 cellen/well gedurende 3 dagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Genexpressieanalyse in GFP-gelabelde cellen; MOI versus fluorescentie, meerdere cellijnen, grafiek, afbeeldingen.
Figuur 3: Vergelijking van de AAV-transductie-efficiëntie tussen zelfcomplementaire (scGFP) en enkelstrengs (ssGFP) vectoren in verschillende cellijnen. 3D-sferoïden van (A>) HEK293T, (B>) Huh7, (C>) HEP3B en (D>) HEPG2 werden zelfgeassembleerd en getransduceerd met verschillende MOI's van AAV2-scGFP (blauw) en AAV2-ssGFP (rood). De totale groene fluorescentie-intensiteit werd gekwantificeerd 72 u na transductie. Representatieve afbeeldingen van sferoïden behandeld met de hoogste MOI voor elke AAV, genomen op tijdstip 72 u met behulp van een live-cell imaging-systeem. Schaalbalken representeren 200 µm. Foutbalken representeren SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Fluorescentie-intensiteitsgrafieken voor AAV-serotypen in HEK293T- en Huh7-cellen; MOI, tijdsvariabele.
Figuur 4: AAV-transductie in 3D-sferoïden maakt onderscheid tussen de activiteit van verschillende AAV-serotypen. 3D-sferoïden van (A,C) HEK293T en (B,D) Huh7 werden getransduceerd met AAV1, AAV2, AAV5 en AAV9, scGFP-transgen over een reeks MOI's. Fluorescentie-intensiteitseenheden werden gemeten na 72 h met behulp van een fluorescentie-gebaseerde platenlezer (A,B) en een live-cell imaging-systeem (C,D). Foutenbalken representeren SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Grafiek en heatmap van AAV-transductie-efficiëntie; MOI vs. totale flux; analyse van virale vectoren.
Figuur 5: AAV-transductie in 3D-sferoïden met luminescente reporters. HeLa-sferoïden werden getransduceerd met AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 en AAV9 die een nanoluciferase-reportertransgen coderen bij toenemende MOI's. Luminescentie werd gevisualiseerd en gemeten met een Endpoint-uitlezing met het luminescentie-beeldvormingssysteem 72 u na transductie. (A) Waarden voor de totale flux. (B) Representatieve End-point-uitlezing met luminescentiebeelden van sferoïdenplaten toont de signaalverdeling over MOI's en serotypes. Elke AAV-vector werd in twee horizontale replica's uitgevoerd. Foutenbalken representeren de SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Genexpressieanalyse; grafieken van MOI versus tijd; sgGFP-fluorescentie-intensiteit; experimentele resultaten.
Figuur 6: Evaluatie van de transductiekinetiek in 3D-sferoïden. HEK293T-sferoïden werden getransduceerd met AAV2-scGFP (blauw) en AAV2-ssGFP (rood) over een bereik van 7 MOI's (A–G). De totale groene intensiteit werd gemeten over een periode van 72 h, met tijdsintervallen van 6 h, met behulp van het Monitor spheroid formation/growth-systeem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

MOIscGFP (uur)ssGFP (uur)
1>72 uur>72
1034.2>72
10016.554.2
10005.623.1
100003.313
1000001.98

Tabel 1: Aanvangstijd voor GFP-detectie.

Aanvullende Figuur 1: Platindeling voor sferoïdetitratie. (A) Representatieve platindeling die het verdunningsschema toont voor HEK293T, Huh7, HEP3B en HEPG2 sferoïden, gegenereerd vanuit initiële uitzaaidichtheden variërend van 10.000 tot 78 cellen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Sferoïdvorming bij verschillende uitzaaidichtheden. Representatieve microscopiebeelden van HEK293T- en Huh7-sferoïden, gegenereerd vanuit initiële uitzaaidichtheden variërend van 10.000 tot 78 cellen op dag 3. De schaalbalk staat voor 50 µm.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Informatie over de cellijnen voor de vorming van 3D-sferoïden.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Plaatindeling voor seriële verdunningen van AAV. (A) Representatieve plaatindeling die het seriële verdunningsschema van AAV laat zien dat is gebruikt voor AAV1, AAV2, AAV5 en AAV9, beginnend bij een MOI van 106. Negatieve controle wordt getoond in rij H, wat staat voor onbehandelde sferoïden.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film 1: Real-time live-cell imaging van AAV2-scGFP-transductie in HEK293T-sferoïden bij een MOI van 106.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film 2: Real-time live-cell imaging van AAV2-scGFP-transductie in Huh7-sferoïden bij een MOI van 106.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video 3: Real-time live-cell imaging van AAV2-scGFP-transductie in HEP3B-sferoïden bij een MOI van 106.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film 4: Real-time live-cell imaging van AAV2-scGFP-transductie in HEK293T-sferoïden bij een MOI van 106, als onderdeel van een dosisonderzoek.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film 5: Real-time live-cell imaging van AAV2-scGFP-transductie in HEK293T-sferoïden bij een MOI van 104.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film 6: Real-time live-cell imaging van AAV2-scGFP-transductie in HEK293T-sferoïden bij een MOI 101.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Berekening van de MOI die nodig is voor AAV-transductie.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Wij presenteren hier een gestroomlijnd in vitro 3D-platform voor de ontwikkeling en potentietest van AAV. Dit platform maakt gebruik van verbeterde transductie, een hoge sensitiviteit en een betere translationele voorspelbaarheid door gebruik te maken van driedimensionale celkweek die nauwer aansluit bij de architectuur van menselijk weefsel. Dit systeem maakt succesvol onderscheid in transductie-efficiëntie tussen AAV-serotypes en regulatoire elementen, inclusief enkelstrengs en zelf-complementaire vectoren, in meerdere cellijnen. Wij merken op dat, in tegenstelling tot conventionele 2D-assays, waarbij transductie-efficiëntie vaak wordt gedefinieerd als het percentage transgene-positieve cellen, het 3D-sferoïdensysteem geen kwantificering met enkelcelresolutie toelaat. Daarom wordt de transductie-efficiëntie in deze studie gedefinieerd als de bulk-reportersignaalintensiteit (fluorescent of luminescent), wat de gecombineerde bijdragen weerspiegelt van het aandeel getransduceerde cellen en het niveau van transgene expressie per cel. De hoge sensitiviteit van de sferoïden vermindert de behoefte aan grote producthoeveelheden aanzienlijk, waardoor het kosteneffectief, veelzijdig en fysiologisch relevant is voor AAV-onderzoek en -ontwikkeling.

Deze benadering pakt belangrijke uitdagingen aan van traditionele 2D-celkweekassays, die afhankelijk zijn van adhesie aan kunstmatige oppervlakken en een gebrek aan cellulaire organisatie vertonen, wat mogelijk leidt tot onnauwkeurige voorspellingen van de vectorprestaties in klinische settings. Het 3D-sferoïdensysteem bootst de weefselstructuur en drugdistributiepatronen beter na, waardoor gegevens over het vectorgedrag worden verkregen die nauwer aansluiten bij werkelijke biologische omstandigheden22,23. Het protocol maakt gebruik van eenvoudige ultra-low attachment platen, waardoor het gemakkelijk reproduceerbaar is in standaard laboratoriumomgevingen.

Dit aanpasbare systeem kan worden gebruikt voor AAV-neutralisatieassays, om AAV-penetratie te bestuderen en om complexere co-culturexperimenten te ontwikkelen om de effecten van verschillende cellulaire omgevingen op AAV-transductie te onderzoeken. Daarnaast kunnen high-throughput drug- en vectorscreeningsplatforms eenvoudig worden geïntegreerd met het sferoïdenplatform, wat automatisering en kostenreductie mogelijk maakt in workflows voor vectorontdekking voor de ontwikkeling van meer gerichte producten.

Een groot praktisch voordeel van sferoïden is hun vermogen om wekenlang continu te groeien zonder dat celpassage nodig is, wat uitgebreide studies naar AAV-activiteit mogelijk maakt. Dit stabiele cultuursysteem behoudt belangrijke cel-celinteracties en matrixcomponenten, waardoor de onderbrekingen die worden veroorzaakt door de herhaalde celwinning die bij 2D-culturen vereist is, worden voorkomen24. De behouden cellulaire omgeving ondersteunt de natuurlijke eiwitorganisatie en membraanstructuren die essentieel zijn voor het evalueren van de AAV-binding en de entry in cellen25.

Hoewel 3D-sferoïden een groot potentieel vertonen voor het beoordelen van AAV-transductie, presenteren ze ook enkele translationele tekortkomingen vergeleken met in vivo modellen, primair vanwege hun vereenvoudigde structuur ten opzichte van natuurlijke weefsels. Sferoïden missen kritische fysiologische componenten, waaronder vasculatuur voor de aflevering van vectoren, immuuncellen voor het beoordelen van immunogeniciteit en weefselspecifieke barrières zoals de bloed-hersenbarrière, die de AAV-prestaties aanzienlijk kunnen beïnvloeden26. Deze beperkingen geven aan dat sferoïden, ondanks het feit dat ze een tussenliggend complexiteitsniveau bieden tussen conventionele 2D-culturen en in vivo diermodellen, onvoldoende blijven om de fysiologische micro-omgeving die nodig is voor een uitgebreide AAV-beoordeling volledig te recapituleren.

Het hier gepresenteerde spheroid-protocol beschrijft telkens één enkel celtype. Dit protocol kan worden uitgebreid om 2–3 aanvullende celtypen te bevatten die aggregeren tot een basis driedimensionale structuur. Complexere 3D-modellen, zoals organoïden of microfluidica, zijn multicellulaire systemen die de cellulaire diversiteit en organisatie van specifieke organen nabootsen, met 10 of meer verschillende celtypen die zijn gerangschikt in weefselachtige patronen. Dergelijke geavanceerde 3D-organoïden kunnen meerdere cellen bevatten27, hydrogel-ingebedde culturen, hanging drop-technieken en microfluidische platforms11,27,28. Hoewel deze methoden een complexere weefselarchitectuur bieden die ons begrip van de AAV-biologie verder zou kunnen bevorderen, vereisen ze doorgaans gespecialiseerdere reagentia, apparatuur en aanzienlijke technische expertise. Aan de andere kant zijn 3D-spheroiden gevormd in ultra-low attachment plates aanzienlijk eenvoudiger en geschikt voor veel laboratoria vanwege hun kosteneffectiviteit en reproduceerbaarheid.

Kritieke stappen voor een succesvolle uitvoering van dit protocol zijn onder meer het handhaven van een hoge celviabiliteit, aangezien beschadigde cellen de sferoïdvorming en de transductie-efficiëntie kunnen belemmeren. Het gebruik van ultra-low attachment plates en de optimalisatie van de centrifugatie zijn eveneens cruciaal voor het bereiken van een compacte sferoïde. Het optimaliseren van de MOI voor elk celtype en AAV-serotype is essentieel om zwakke signalen of verzadiging te voorkomen. De selectie van de juiste detectiemethode is ook van groot belang, met name voor kinetische analyses, waarbij compatibiliteit met systemen voor continue live-cell imaging vereist is. Diverse technische overwegingen zijn belangrijk voor een nauwkeurige interpretatie van de AAV-transductie in 3D-sferoïden.

Een zwak of afwezig transductiesignaal kan het gevolg zijn van een lage virale titer, een suboptimale MOI of een onvoldoende incubatietijd; dit kan worden opgelost door virale titers te verifiëren, de MOI te optimaliseren en de incubatietijd te verlengen (doorgaans 3–5 dagen). Zwakke fluorescentie- of luminescentiesignalen kunnen wijzen op een lage expressie van het transgen of beperkte penetratie van reagentia binnen de 3D-structuur, wat kan worden verbeterd door de belichtingsinstellingen te optimaliseren of door extra tijd toe te staan voor substraatdiffusie. Een belangrijke uitdaging bij bepaalde cellijnen, zoals HeLa-cellen, is autofluorescentie, wat kan leiden tot een hoog achtergrondsignaal en een verminderde gevoeligheid bij fluorescentie-gebaseerde assays. Om deze beperking aan te pakken, hebben we een op luminescentie gebaseerd nanoluciferase-reporter-systeem geïmplementeerd, dat een verbeterde signaal-ruisverhouding biedt en een nauwkeuriger detectie van transductie in autofluorescerende achtergronden mogelijk maakt. Daarnaast kan het achtergrondsignaal ontstaan door onjuiste drempelwaardebepaling of media-gerelateerde fluorescentie en dient dit te worden gecontroleerd met onbehandelde wells (MOI = 0) om de basiswaarden te definiëren. Tot slot kan signaalverzadiging bij hoge MOI's optreden door een overmatige virale input of detectorbeperkingen; dit kan worden beperkt door het MOI-bereik te verkleinen en de belichtingsinstellingen van de detector te optimaliseren om metingen binnen het lineaire dynamische bereik te houden.

Over het algemeen biedt deze 3D-sferoïdenmethode een gestroomlijnd, reproduceerbaar systeem voor het evalueren van AAV-transductie, potentie en kinetiek. Door de kloof tussen conventionele 2D-assays en in vivo-studies te overbruggen, maakt dit een meer geïnformeerde vectorontwikkeling mogelijk en ondersteunt het de vooruitgang van klinisch relevante gentherapiestrategieën.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te melden.

Dankbetuigingen

De auteurs danken Morten Seirup en Trish Hoang voor het verstrekken van het plasmide voor de productie van AAV nanoluciferase en de reagentia voor het levende substraat. Dit project werd ondersteund door een aanstelling bij het ORISE Research Participation Program bij het CBER, U.S. Food and Drug Administration, beheerd door het Oak Ridge Institute for Science and Education onder een interagentschapovereenkomst tussen het Amerikaanse Ministerie van Energie en de FDA.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
37°C incubatorThermoFisher Scientific#51025983Standaard kweekcondities
A375-cellenATCCCRL-1619Cellijn
AAV1-plasmideAddgene112862AAV-plasmide
AAV2-plasmideAddgene104963AAV-plasmide
AAV5-plasmideAddgene104964AAV-plasmide
AAV8-plasmideAddgene112864AAV-plasmide
AAV9-plasmideAddgene112865AAV-plasmide
BioTek GEN5 plate readerAgilent TechnologiesNAEnd-point meting voor fluorescentie of luminescentie
CentrifugeThermoFisher Scientific#TSO-MX1RBehouden van sferoïde-suspensie
Corning™ Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1X)Fisher Scientific#MT21040CMXPBS om cellen te spoelen
DMEM high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvaatThermoFisher Scientific#10569010Compleet groeimedium
Extracellulaire NanoLuc-inhibitor PromegaN235BOnderdrukt elk Nanoluc®-signaal afkomstig uit de extracellulaire omgeving  
Foetaal kalfsserum (FBS)Sigma-Aldrich#F4135-500mLLevert groeifactoren
HEK293T-cellenATCCCRL-3216Cellijn
HeLa-cellenATCCCRM-CCL-2Cellijn
HEP3B-cellenATCCHB-8064Cellijn
HEPG2-cellenATCCHB-8065Cellijn
Huh7-cellenABMT8973Cellijn
IncuCyte S3 omgekeerde microscoopSartoriusNAMonitoren van sferoïde-vorming/groei
IVIS Spectrum ImagerSpectralinvivoNAEnd-point meting voor luminescentie
Nano-Glo® Live Cell Assay PromegaN2013Luminescent substraatreagens voor detectie van levende cellen
Penicilline-streptomycine (10.000 U/mL)ThermoFisher Scientific# 15140122Voorkomen van bacteriële contaminatie
T75 weefselkweekflessen met ventilatieFisher Scientific#NC0509296 Flessen voor celkweek
Trypsine-EDTA (0,05%)ThermoFisher Scientific#25300120Enzymatische detachering van cellen
Platen met ultra-lage adhesieCorning#7007Voorkomen van celadhesie om sferoïde-vorming te bevorderen

Referenties

  1. Mendell JR, et al. Current Clinical Applications of In Vivo Gene Therapy with AAVs. Mol Ther. 2021;29(2):464-88.
  2. Byrne BJ, et al. Current clinical applications of AAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 2025;33(6):2479-516.
  3. Najera SS, et al. AAV2 delivery of the saCas9 gene results in presentation of an HLA-A*02:01-restricted T cell epitope potent to induce T cell cytotoxicity. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(3):101506.
  4. Alhakamy NA, Curiel DT, Berkland CJ. The era of gene therapy: From preclinical development to clinical application. Drug Discov Today. 2021;26(7):1602-19.
  5. Arutyunyan IV, et al. Gene Expression Profile of 3D Spheroids in Comparison with 2D Cell Cultures and Tissue Strains of Diffuse High-Grade Gliomas. Bull Exp Biol Med. 2023;175(4):576-84.
  6. Cashen P, Manser B. Quality by design (QbD) for adeno-associated virus (AAV): A framework for a QbD assessment for AAV products within the chemistry manufacturing and controls (CMC) documentation [Internet]. Port Washington (NY): Pall Corporation; 2021. Available from: https://www.pall.com/
  7. Center for Biologics Evaluation and Research. Potency Assurance for Cellular and Gene Therapy Products: Draft Guidance for Industry [Internet]. Silver Spring (MD): U.S. Food and Drug Administration; 2023. Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/potency-assurance-cellular-and-gene-therapy-products
  8. Fu Q, Polanco A, Lee YS, Yoon S. Critical challenges and advances in recombinant adeno-associated virus (rAAV) biomanufacturing. Biotechnol Bioeng. 2023;120(9):2601-21.
  9. Martinez RA, et al. A versatile cell line for establishing potency of cell type-specific AAV transgenes. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101401.
  10. Zengel J, et al. Development of cell lines with increased susceptibility to diverse adeno-associated viral vectors to enable in vitro potency assays. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101416.
  11. Marconi GD, et al. Three-Dimensional Culture System: A New Frontier in Cancer Research, Drug Discovery, and Stem Cell-Based Therapy. Biology (Basel). 2025;14(7):875.
  12. Bialkowska K, Komorowski P, Bryszewska M, Milowska K. Spheroids as a Type of Three-Dimensional Cell Cultures-Examples of Methods of Preparation and the Most Important Application. Int J Mol Sci. 2020;21(17):6225.
  13. Ducker M, Millar V, Ebner D, Szele FG. A Semi-automated and Scalable 3D Spheroid Assay to Study Neuroblast Migration. Stem Cell Reports. 2020;15(3):789-802.
  14. Hiller T, et al. Generation of a 3D Liver Model Comprising Human Extracellular Matrix in an Alginate/Gelatin-Based Bioink by Extrusion Bioprinting for Infection and Transduction Studies. Int J Mol Sci. 2018;19(10):3129.
  15. Jakeman PG, et al. Improved in vitro human tumor models for cancer gene therapy. Hum Gene Ther. 2015;26(5):249-56.
  16. Kapalczynska M, et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 2018;14(4):910-9.
  17. Gunti S, Hoke ATK, Vu KP, London NR Jr. Organoid and Spheroid Tumor Models: Techniques and Applications. Cancers (Basel). 2021;13(4):874.
  18. McRobb LS, Lee VS, Faqihi F, Stoodley MA. A Simple Model to Study Mosaic Gene Expression in 3D Endothelial Spheroids. J Cardiovasc Dev Dis. 2024;11(10):305.
  19. Ohguro H, et al. 3D Spheroid Configurations Are Possible Indicators for Evaluating the Pathophysiology of Melanoma Cell Lines. Cells. 2023;12(5):759.
  20. Casey G, et al. Self-complementarity in adeno-associated virus enhances transduction and gene expression in mouse cochlear tissues. PLoS One. 2020;15(11):e0242599.
  21. Hutt JA, et al. Scientific and Regulatory Policy Committee Points to Consider: Nonclinical Research and Development of In Vivo Gene Therapy Products, Emphasizing Adeno-Associated Virus Vectors. Toxicol Pathol. 2022;50(1):118-46.
  22. El Harane S, et al. Cancer Spheroids and Organoids as Novel Tools for Research and Therapy: State of the Art and Challenges to Guide Precision Medicine. Cells. 2023;12(7):1001.
  23. Najera SS, et al. Targeting NAD+ Metabolism Vulnerability in FH-Deficient Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Carcinoma with the Novel NAMPT Inhibitor OT-82. Mol Cancer Ther. 2025;24(2):200-13.
  24. Huang HL, et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 2010;17(1):36.
  25. Ripa I, Andreu S, Lopez-Guerrero JA, Bello-Morales R. Membrane Rafts: Portals for Viral Entry. Front Microbiol. 2021;12:631274.
  26. Habanjar O, Diab-Assaf M, Caldefie-Chezet F, Delort L. 3D Cell Culture Systems: Tumor Application, Advantages, and Disadvantages. Int J Mol Sci. 2021;22(22):12200.
  27. Kaiser VM, Gonzalez-Cordero A. Organoids - the future of pre-clinical development of AAV gene therapy for CNS disorders. Gene Ther. 2025;Mar 27. Epub ahead of print. PMID: 40148593.
  28. Ramamurthy RM, Atala A, Porada CD, Almeida-Porada G. Organoids and microphysiological systems: Promising models for accelerating AAV gene therapy studies. Front Immunol. 2022;13:1011143.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

3D sfero dengenoverdrachtsfero dplatformtransgene expressieserotypeprestatiespotentiebeoordelinglive cell imagingreportersignaalvectoroptimalisatie
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.