Isolatie en karakterisering van kleine extracellulaire blaasjes uit infrapatellaire vetpads van artrosepatiënten

Summary

SAMENVATTING Dit protocol biedt een gestandaardiseerde workflow voor het isoleren en karakteriseren van kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) uit infrapatellaire vetkussenweefsels van patiënten met artrose.

Abstract

Extracellulaire blaasjes (EV's), met name kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) die worden gedefinieerd als blaasjes kleiner dan 200 nm, dienen als essentiële mediatoren van intercellulaire communicatie en worden door bijna alle celtypen vrijgegeven in diverse biologische vloeistoffen. Het infrapatellaire vetpad (IPFP) is nauw verbonden met de ontwikkeling en progressie van knieartrose (OA). Gestandaardiseerde methoden om sEV's direct van IPFP-explants te isoleren blijven echter beperkt. We presenteren een reproduceerbaar protocol voor de isolatie en karakterisering van sEV's afkomstig van IPFP-weefsels verkregen van OA-patiënten. Het geconditioneerde medium dat uit IPFP-weefselculturen wordt verzameld, wordt sequentieel van cellen en afval verwijderd door centrifugatie met lage snelheid, gevolgd door ultracentrifugatie om blaasjes binnen het sEV-groottebereik te verrijken. De resulterende vesikels worden gekarakteriseerd op basis van minimale informatie voor studies van extracellulaire vesikels (MISEV2023) aanbevelingen met behulp van een set representatieve eiwitmarkers over verschillende functionele categorieën: CD63 als membraan-geassocieerd tetraspanine, ALIX en TSG101 als cytosolische eiwitten betrokken bij biogenese, gemedieerd door de Endosomal Sorting Complex Required for Transport (ESCRT)-machine, en Calnexin als een endoplasmatisch reticulum-resident eiwit om het potentieel te monitoren niet-vesiculaire besmetting. Deze workflow levert goed gedefinieerde sEV-preparaten op die geschikt zijn voor latere toepassingen zoals functionele assays of proteomische profilering in artroseonderzoek.

Introduction

Kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) zijn een heterogeen subtype van extracellulaire vesikels die, volgens de operationele classificatie voorgesteld door de International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) in de minimale informatie voor studies van extracellulaire vesikels (MISEV2023) richtlijnen, worden gedefinieerd als vesikels die doorgaans kleiner zijn dan 200 nm in diameter¹. sEV's worden door vrijwel alle celtypen vrijgegeven in biologische vloeistoffen en hebben steeds meer aandacht getrokken vanwege hun essentiële rol als mediatoren van intercellulaire communicatie in zowel fysiologische als pathologische contexten ^2,3.

Het membraan van sEV's is verrijkt met meerdere functionele eiwitten. Onder hen zijn tetraspanines zoals CD63 geassocieerd met de organisatie van het blaasmembraan en fusie⁴. Bovendien zijn cytosolische eiwitten die geassocieerd zijn met het endosomale sorteercomplex dat nodig is voor transport (ESCRT), zoals ALIX en TSG101, integraal voor de biogenese en secretie van sEV. Daardoor dienen ze als betrouwbare markers om de endosomale oorsprong van de geïsoleerde blaasjes ^5,6 te bevestigen.

Het infrapatellaire vetpad (IPFP) is erkend als een actief gewrichtsgeassocieerd weefsel dat nauw verbonden is met het initiëren en de progressie van artrose (OA)^7,8. Onder inflammatoire en degeneratieve aandoeningen wordt aangenomen dat sEV's afkomstig van IPFP ontstekingsmediatoren en pathogene signalen dragen, en zo bijdragen aan synoviale ontsteking en kraakbeendegradatie⁹. Het karakteriseren van sEV's die door IPFP-weefsels van OA-patiënten worden vrijgegeven, kan daarom cruciale inzichten bieden in ziektegerelateerde intercellulaire communicatienetwerken.

Gezien de toenemende interesse in sEV's als moleculaire mediatoren en potentiële therapeutische middelen is het opzetten van een hoogrendement, hoogzuivere en reproduceerbare isolatiebenadering essentieel. Hoewel differentiële ultracentrifugatie een van de meest gebruikte^{zuiveringsstrategieën} blijft, zijn protocollen geoptimaliseerd voor celkweeksupernatanten of biofluiden mogelijk niet direct toepasbaar op vaste vetweefsels zoals het IPFP. Het hoge lipidengehalte, de dichte extracellulaire matrix en de variabele enzymatische verteringscondities kunnen het herstel en de zuiverheid van blaasjes beïnvloeden.

Weefselexplantkweek biedt een fysiologisch relevante benadering die de natuurlijke cellulaire architectuur en cel-cel interacties behoudt, terwijl overmatige enzymatische verstoring wordt geminimaliseerd, waardoor de verzameling van sEV's die onder bijna-inheemse omstandigheden vrijkomen mogelijk wordt. Echter, een gestandaardiseerde workflow die specifiek is afgestemd op het isoleren van sEV's van IPFP-explantculturen ontbreekt momenteel echter.

Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol voor het isoleren en karakteriseren van kleine extracellulaire blaasjes uit infrapatellaire vetpad-explantatieculturen van artrosepatiënten met behulp van differentiële ultracentrifugatie, waarmee een reproduceerbaar methodologisch kader wordt geboden voor downstream functionele en translationele studies.

Protocol

Het gebruik van IPFP-weefsels van artrosepatiënten in deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Eerste Ziekenhuis van de Hebei Medische Universiteit (goedkeuringsnummer [2024] 018). De monsterafname werd uitgevoerd binnen de goedgekeurde periode en schriftelijke geïnformeerde toestemming werd van alle deelnemers verkregen voorafgaand aan de weefselverwerving.

1. Bereiding van medium en oplossingen

1. Bereid 500 mL exosoom-uitgeputte complete DMEM/F12-medium voor door 445 mL basaal DMEM/F12-medium, 50 mL exosoomvrij foetaal rundserum (10%) en 5 mL penicilline/streptomycine/amfotericine B (respectievelijk 100 U/mL, 100 μg/mL en 0,25 μg/mL) te mengen. Filtersteriliseer via een 0,22 μm filter.
2. Bereid een western blot running buffer voor door 950 mL gedestilleerd water (dH₂O) te mengen met 50 mL 20x running buffer (Tris/MOPS/SDS).
3. Bereid de western blot transfer buffer voor door 800 mL dH_2Ote mengen met 100 mL 10x transfer buffer en 100 mL absolute ethanol.
   OPMERKING: Deze rapid transfer buffer is specifiek geoptimaliseerd voor hoogstroom natte transfer (400 mA) bij kamertemperatuur. Vanwege de lage warmteproductie is een ijsbad niet nodig voor overdrachtsduur van minder dan 45 minuten, wat is aangetoond dat het een hoge overdrachtsefficiëntie voor eiwitten binnen het bereik van 10–250 kDa behoudt.
   WAARSCHUWING: Absolute ethanol is brandbaar. Behandel in een goed geventileerde ruimte en vermijd warmtebronnen.
4. Bereid de was-buffer voor door 50 mL van 20 x TBS (200 mM Tris en 3 M NaCl bij pH 7,5–7,6) en 2 mL Tween-20 met 950 mL dH₂O te mengen.
5. Bereid een chemiluminescente werkoplossing voor door gelijke hoeveelheden luminol/versterkeroplossing en peroxidebuffer te mengen (ongeveer 0,1 mL werkoplossing is per vierkante centimeter membraan nodig).
   VOORZICHTIG: Chemiluminescente substraten kunnen irriterend zijn. Draag handschoenen en oogbescherming. Verwijder chemisch afval volgens lokale institutionele regelgeving.

2. Bereiding van IPFP-weefsel en verzameling van geconditioneerd medium

1. Was vers verkregen IPFP-weefsel (ca. 10 g) drie keer met 50 ml voorgekoeld PBS per wasbeurt door voorzichtige handmatige beweging in de centrifugebuis om het resterende bloed grondig te verwijderen.
2. Snijd het IPFP-weefsel in stukjes van ongeveer 2 mm x 2 mm met een steriele schaar of een scalpel.
3. Breng IPFP-weefselstukken over in T175-kolven. Voeg 50 mL exosoom-uitgeputte DMEM/F12 complete medium toe. Incubeer bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 48 uur met zachte roering.
4. Verzamel het DMEM/F12 complete medium (d.w.z. geconditioneerd medium) in 50 mL buizen op ijs. Filter door een 70 μm zeef om weefselresten te verwijderen.

3. Isolatie van sEV's met behulp van differentiële ultracentrifugatie

OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit bij 4 °C of op ijs.

1. Initiële centrifugatie met lage snelheid om weefselresten te verwijderen
   1. Centrifugeer het geconditioneerde medium op 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verzamel voorzichtig het supernatant en doe het over in nieuwe 50 mL centrifugebuizen.
   2. Centrifugeer het supernatant op 3.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verzamel het supernatant en doe het in nieuwe buizen, zodat het pelletje niet wordt verstoord.
2. Tussentijdse centrifugatie en filtratie.
   1. Centrifugeer het supernatant op 10.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
   2. Verzamel het supernatant en filter het door een 0,22 μm vacuümfilter om grotere blaasjes en verontreinigingen te verwijderen.
3. Eerste ultracentrifugatie: sEV-pelleting.
   1. Breng het gefilterde supernatant over in 40 mL polycarbonaat centrifugebuizen.
   2. Ultracentrifugeer de monsters op 110.000 x g gedurende 70 minuten bij 4 °C met een rotor met een vaste hoek (k-factor = 70). Verwijder het supernatant voorzichtig met een pipet.
   3. Suss de pellet opnieuw in 10 mL voorgekoelde, steriele PBS. Filter de opnieuw suspendeerde oplossing door een 0,22 μm spuitfilter om het verwijderen van resterende aggregaten te waarborgen.
4. Tweede ultracentrifugatie: sEV-zuivering
   1. Ultracentrifugeer de ophanging opnieuw op 110.000 x g gedurende 70 minuten bij 4 °C met behulp van de rotor met vaste hoek (k-factor = 70).
   2. Gooi het supernatant voorzichtig weg en laat de sEV-pellet onderin de buis liggen. Suss de laatste sEV-pellet opnieuw in 200 μL steriele PBS.
   3. Verdeel de sEV-ophanging in 20 μL aliquots om schade door herhaalde vries-ontdooicycli te voorkomen. Bewaar de aliquots bij -80 °C voor langdurig gebruik.

4. Karakterisering van sEV's door western blot-analyse

1. Maak de sEV-eiwitmonsters klaar.
   1. Meng de sEV-pellet (uit stap 3.5.2) met 80–120 μL RIPA-lysebuffer, aangevuld met proteaseremmers.
      OPMERKING: Streef naar een verhouding van ongeveer 1 μL RIPA-buffer per 0,5–1,0 μg geschat eiwit. Een uiteindelijke eiwitconcentratie van minstens 1,0 μg/μL wordt aanbevolen om efficiënte elektroforetische scheiding en hoogwaardige signaaldetectie tijdens western blot-analyse te waarborgen.
      VOORZICHTIG: RIPA-buffer bevat detergenten en irriterende stoffen. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen.
   2. Vortex het mengsel kort en incubeer de monsters op ijs gedurende 15–30 minuten met zacht wiegen.
      OPMERKING: Grondige menging in deze fase is cruciaal voor volledige membraanverstoring en optimale eiwitafgifte. Onvoldoende vortexing kan resulteren in onvolledige lysis en inconsistente eiwitconcentraties tussen replicaten.
   3. Centrifugeer het lysaat op 12.000–14.000 x g gedurende 10–15 minuten. Verzamel voorzichtig het supernatant.
   4. Bepaal de totale eiwitconcentratie van het sEV-lysaat met behulp van een hooggevoelig bicinchonininezuur (BCA) eiwittestassay.
      OPMERKING: Een hooggevoelige BCA-assay wordt aanbevolen boven de standaard BCA-assay voor extracellulaire blaasjesmonsters vanwege het lagere detectiebereik (0,5–20 μg/mL), wat een nauwkeurige kwantificering mogelijk maakt van de typisch lage eiwitconcentraties verkregen uit gezuiverde sEV-preparaten. Voer de assay uit volgens het kitprotocol.
2. Western Blot analyse.
   1. Meng de eiwitmonsters met een 5 x SDS-PAGE sample loading buffer.
      OPMERKING: Voor CD63-detectie bereid je monsters voor met een niet-reducerende 5x laadbuffer (zonder β-mercaptoethanol) en incubeer je bij 70 °C gedurende 10 minuten. Deze omstandigheden behouden conformationele epitopen en voorkomen door hitte veroorzaakte aggregatie van dit tetraspanine-eiwit. Voor andere markers, waaronder ALIX (ALG-2-interactief eiwit X), TSG101 (tumorgevoeligheidsgen 101) en Calnexin, bereid monsters voor met een reducerende 5x laadbuffer die 10% β-mercaptoethanol bevat en verhit 5 minuten bij 95 °C om volledige eiwitdenaturatie te garanderen.
   2. Laad de voorbereide monsters (meestal 20–40 μg totaal eiwit) in een prefab gradiëntgel (4%–12%).
   3. Laad de molecuulmassa-marker van het eiwit in de toegewezen put volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
   4. Draai de gel in een lopende buffer op een constante spanning van 100 V.
   5. Ga 1–1,5 uur door, of totdat de laadkleurstof de bodem van de gel bereikt.
      OPMERKING: De looptijd kan verschillen afhankelijk van het elektroforesesysteem en het percentage gel.
   6. Transfereer de eiwitten van de gel naar PVDF-membranen met een nat transfersysteem bij 400 mA gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: De overdrachtsduur kan variëren afhankelijk van het merk van de gebruikte transferbuffer.
   7. Blokkeer de membranen in een eiwitvrije blokkeringsbuffer, bereid in tris-gebufferde zoutoplossing met 0,2% Tween-20 (TBS-T) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met zachte schudding. De blokkerende buffer wordt geformuleerd zonder serumeiwitten, biotine of gefosforyleerde eiwitten om niet-specifieke binding en achtergrondinterferentie te minimaliseren.
   8. Incubeer het membraan met specifieke primaire antilichamen verdund in een serumvrije antilichaamverdunningsbuffer met eiwitgebaseerde stabilisatoren en antilichaambehoudende additieven bij 4 °C 's nachts (12–16 uur) met zachte roering.
   9. Was de membranen in een wasfilter (TBST bevat 0,2% Tween-20) onder zachte roering op een shaker.
   10. Incubeer de membranen met de juiste secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met zachte roering.
   11. Was de membranen opnieuw in een wasbuffer onder zachte roering op een shaker.
   12. Visualiseer de eiwitbanden met behulp van chemiluminescente substraat.
       VOORZICHTIG: Chemiluminescente substraten kunnen de huid en ogen irriteren. Draag geschikte handschoenen en veiligheidsbrillen. Voer het substraat af volgens de institutionele richtlijnen voor gevaarlijk afval.

5. Karakterisering van sEV's door Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)

1. Zet de nanodeeltjesvolgingsanalyzer en de spuitpompmodule aan volgens de instructies van de fabrikant, en laat het systeem minstens 30 minuten voor de meting in evenwicht komen.
2. Ontdooi de EV-monsters voorzichtig op ijs en verdun ze in steriele, deeltjesvrije fosfaatgebakken zoutoplossing (PBS) om een optimale deeltjesconcentratie binnen het aanbevolen meetbereik te bereiken (ongeveer 1 x 10⁸ tot 1 x 10^{9 deeltjes} per ml).
3. Laad 1 mL van het verdunde monster in een steriele spuit en injecteer het monster langzaam in de meetkamer, zodat er geen luchtbellen worden ingebracht.
4. Stel het cameraniveau en de focus aan om individuele deeltjes met Browniaanse beweging duidelijk te visualiseren.
5. Neem drie video's van 60 seconden per monster op onder constante stromingsomstandigheden met behulp van de spuitpomp om een consistente deeltjesverdeling te garanderen.
6. Analyseer de opgenomen video's met NTA-software met een detectiedrempel ingesteld op 12, de blurgrootte op Auto en de maximale sprongafstand op Auto.
7. Genereer profielen voor de verdeling van de deeltjesgrootte en concentratie met behulp van de geautomatiseerde analysefunctie van de software.
8. Exporteer de ruwe gegevens, de grafieken van de deeltjesgrootte en concentratiemetingen voor verdere statistische analyse.
9. Maak de meetkamer grondig schoon met steriel deeltjesvrij water, gevolgd door 70% ethanol, en spoel opnieuw door met steriel deeltjesvrij water om kruisbesmetting tussen monsters te voorkomen.

6. Karakterisering van sEV's door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)

1. Gebruik koolstofgecoate koperen roosters van 200 mesh. Voer gloeiontlading uit op de roosters gedurende 30 seconden met een gloeiontlaadsysteem, indien beschikbaar.
2. Breng 10 μL van de sEV-suspension (opnieuw opgehangen in steriel, gefilterd PBS) aan op het rooster en incubeer 2–5 minuten bij kamertemperatuur.
3. Verwijder overtollige vloeistof door voorzichtig de rand van het rooster met filterpapier aan te raken.
4. Was het rooster door het met monster belaste oppervlak achtereenvolgens op drie afzonderlijke druppels ultrazuiver water te plaatsen.
5. Breng 10 μL 2% fosfhotungstische zuuroplossing (pH 7,0) aan op het rooster en incubeer 1–2 minuten bij kamertemperatuur.
   VOORZICHTIG: Fosfhotungstinezuur is een corrosief zuur reagens dat irritatie kan veroorzaken aan de huid, ogen en luchtwegen. Behandel het volgens de veiligheidsrichtlijnen van de instelling terwijl je passende persoonlijke beschermingsmiddelen draagt, waaronder handschoenen en oogbescherming. Verwijder vlekkend afval en besmette materialen volgens goedgekeurde procedures voor gevaarlijk chemisch afval.
6. Verwijder overtollige beits met filterpapier en laat het rooster minstens 10 minuten aan de lucht drogen op kamertemperatuur.
7. Onderzoek de roosters met een transmissie-elektronenmicroscoop die werkt op een versnellingsspanning van 80 kV.
8. Maak representatieve beelden met geschikte vergroting om de morfologie van de blaasje te beoordelen.

Results

Succesvolle isolatie van kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) uit menselijke infrapatellaire vetkussenweefsels (IPFP) werd bevestigd door multimodale karakterisering.

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) toonde aan dat de geïsoleerde blaasjes de karakteristieke kopvormige morfologie vertoonden met duidelijk gedefinieerde lipide-dubbellaagmembranen, in overeenstemming met de structurele kenmerken van sEV's (Figuur 1)

Discussion

Dit protocol biedt een reproduceerbare en praktische workflow voor het isoleren van kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) uit menselijke infrapatellaire vetkussenweefsels (IPFP) met behulp van explantatiecultuur gevolgd door differentiële ultracentrifugatie. De geïsoleerde blaasjes werden gevalideerd met complementaire karakteriseringsmethoden, waaronder transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), nanodeeltjesvolganalyse (NTA) en Western blot-detectie van gevestigde EV-markers

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 mL PET Centrifuge Tubes	himac (Eppendorf Himac Technologies)	5720411148	Polyethyleen tereftalaat, 26 x 90 mm
70 µm Cell Strainer	Beijing Lanjieke Technology	560049	Voor verwijdering van weefseldebris
Anti Alix antibody	Shanghai Abways Biotechnology	CY7215	sEV positieve marker
Anti Calnexin antibody	Shanghai Abways Biotechnology	CY5839	Negatieve marker (ER-besmetting)
Anti CD63 antibody	Affinity Biosciences	DF2305	Tetraspanin-marker
Anti TSG101 antibody	Shanghai Abways Biotechnology	CY5985	sEV positieve marker
BCA Protein Assay Kit	Shanghai YaMei Biotechnology	ZJ102	Voor eiwitkwantificering
Cell culture flask (T175)	NEST Biotechnology	560229	Voor IPFP explantaatkweek
Centrifuge tube (50 mL)	BIOFIL	560041	Voor initiële lage snelheid stappen
Exosome-depleted Fetal Bovine Serum	Cyagen Biosciences	FBSNE-01061	Voor weefselkweek
HRP Goat anti-Rabbit IgG	Shanghai Abways Biotechnology	AB0101	Secundaire antilichaam voor WB
Instant Protein Loading Buffer (Denaturing, Reducing, 5×)	Shanghai YaMei Biotechnology	LT101	Voor eiwitdenaturatie
Micro BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23235	Voor eiwitkwantificering
Millex-GP Filter Unit (0.22 µm)	Beijing Lanjieke Technology	560360	Steriele, voor vesikelfiltratie
Nanoparticle Tracking Analyzer	Malvern Panalytical	NanoSight NS300	Voor grootte- en concentratieanalyse
Omni-Flash Ice-Free Rapid Transfer Buffer	Shanghai YaMei Biotechnology	PS201S	Voor Western blot eiwitoverdracht
Phosphotungstic acid (2%)	Sigma-Aldrich	P4006	Voor TEM-negatieve kleuring
Protein Loading Buffer (Denaturing, Non-Reducing, 5×)	Shanghai YaMei Biotechnology	LT103	Voor eiwitdenaturatie
Protein-Free Rapid Blocking Buffer (5×)	Shanghai YaMei Biotechnology	PS108	Voor het blokkeren van membranen
RIPA lysis buffer	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	R0010	Voor sEV-eiwitextractie
TBS(20×)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	T1080	Voor het bereiden van wasbuffer
Transmission Electron Microscope	Hitachi	HT7800	Voor morfologische karakterisering
Tris/MOPS/SDS Electrophoresis Buffer	Shanghai YaMei Biotechnology	PS120	Voor eiwitscheiding
Tween-20	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	T8220	Voor het bereiden van wasbuffer
Ultracentrifuge	himac (Eppendorf Himac Technologies)	CP100NX	Hoogsnelheid isolatiesysteem
Ultra-sensitive chemiluminescent detection kit	Shanghai YaMei Biotechnology	SQ201	Voor eiwitbandvisualisatie
Universal Antibody Dilution Buffer	Shanghai YaMei Biotechnology	PS119L	Voor primaire/secundaire antilichamen