Methodenartikel

Herprogrammering van geïnduceerde pluripotente stamcellijnen uit bevroren Buffy Coat-monsters

DOI:

10.3791/70522

⸱

10 april 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Interdisciplinary Neuroscience, University of Georgia, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 4Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, 5Division of Pediatric Endocrinology, Emory University School of Medicine, 6Dysautonomia Center, New York University Langone Health, 7Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Emory University School of Medicine, 8Stem Cell Core, Columbia Stem Cell Initiative, Columbia University, 9Department of Cellular Biology, University of Georgia

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft stappen voor het oplossen van problemen met geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) uit de perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) van patiëntenmonsters die moeilijk te herprogrammeren waren volgens de instructies van de fabrikant. Dit protocol is specifiek voor bevroren buffy coat-monsters, maar kan ook worden toegepast op de herprogrammering van gezuiverde PBMC's.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) zijn een waardevol hulpmiddel voor ziektemodellering. Verdere stamcellen kunnen worden geherprogrammeerd uit volwassen somatische cellen, genaamd geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC). iPSC-technologie maakt het mogelijk om specifieke deelnemers en populaties te evalueren en zich te richten op gepersonaliseerde geneeskunde. Bloed wordt routinematig afgenomen en gecryoppreserve voor onderzoeksdoeleinden. Deze monsters worden verwerkt als buffy coats, een bloedmonster met witte bloedcellen en bloedplaatjes, of als perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's), die een meer gezuiverde populatie witte bloedcellen zonder eosinofielen, basofielen, bloedplaatjes of rode bloedcellen vertegenwoordigen. Beide zijn een gemakkelijk beschikbare en relatief niet-invasieve bron voor herprogrammeerbare somatische cellen. Verschillende rapporten beschrijven herprogrammering van PBMC's, terwijl slechts één dit proces beschrijft van bevroren buffycoats. Recente ervaringen toonden aan dat PBMC-herprogrammeringsprotocollen die beschikbaar zijn in de literatuur en van fabrikanten niet succesvol zijn wanneer ze worden toegepast op bevroren buffy coat-monsters, waardoor de aanpassingen en probleemoplossingsstrategieën die hier beschreven worden noodzakelijk zijn. Voor veel onderzoekers die iPSC-technologieën gebruiken, is het essentieel om grondige protocollen met een hoog succespercentage te hebben, vooral in gevallen waarin patiëntenmonsters slechts enkele cellen bevatten, in ruime tijdsintervallen worden verkregen, uit een beperkte deelnemerspool komen, of anderszins zeer waardevol zijn. Hier worden checkpoints en probleemoplossingsstrategieën geïdentificeerd om de kans te vergroten op het herprogrammeren van menselijke bevroren buffycoats of gezuiverde PBMC's. Uiteindelijk stelt dit protocol onderzoekers in staat voorspellers van herprogrammeringssucces te identificeren en alternatieve benaderingen te ontwikkelen om de kans op succesvolle iPSC-afleiding te verbeteren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De technologie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) is een gemakkelijk schaalbare en hernieuwbare bron van menselijke cellen die kan worden gedifferentieerd tot elk celtype in het lichaam, waardoor onderzoekers cel- en weefseltypen kunnen onderzoeken die moeilijk te verkrijgen of ontoegankelijk zijn bij patiënten. Verder kunnen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) direct worden afgeleid van somatische cellen van de patiënt1. Dit maakt de differentiatie mogelijk van patiëntspecifieke celtypen van interesse, een onschatbaar hulpmiddel voor ziektemodellering en geneesmiddelenontdekking. Daarom zijn rigoureuze, reproduceerbare en succesvolle methoden om somatische cellen te herprogrammeren tot iPSC's cruciaal.

Fibroblasten, urinecellen en bloedcellen 2,3, elk met hun eigen beperkingen, behoren tot de meest gebruikte somatische celbronnen voor iPSC-afleiding. Fibroblasten, historisch gezien de populairste keuze voor herprogrammeringvan 3, zijn niet erg gemakkelijk te verkrijgen en vereisen een enigszins invasieve huidbiopsie. Herprogrammeerbare cellen kunnen worden afgeleid van urinemonsters, die gemakkelijk te verkrijgen en niet-invasief zijn, maar het herprogrammeringsproces moet beginnen met verse monsters tot 48 uur na hetverzamelen van 4. Bloed biedt een uitstekende bron voor herprogrammeerbare cellen, omdat het minimaal invasief is om te verkrijgen en gemakkelijk beschikbaar is. Er zijn veel beschikbare herprogrammeringsprotocollen van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's), bloedcellen met één enkele kern waaronder lymfocyten, monocyten en natuurlijkemoordcellen. Omdat PBMC's minder dicht zijn dan andere bloedcellen, kunnen ze worden geïsoleerd/gezuiverd uit vers geïsoleerde volbloedmonsters via dichtheidsgradiëntcentrifugatie5. Alternatief scheidt volbloed zich bij centrifugatie in drie duidelijke lagen: plasma, buffy coat en rode bloedcellen6. Buffy-coats bevatten PBMC's, evenals bloedplaatjes en enkele erytrocyten. PBMC's zijn echter minder gemakkelijk verkrijgbaar in de meeste biobanken, terwijl volbloed- of buffycoats overvloedigen toegankelijk zijn. Ondanks de beschikbaarheid van buffy coats in biobanken en de aanwezigheid van herprogrammeerbare PBMC's in deze monsters, beschrijven maar weinig protocollen herprogrammering van bevroren buffy coats8, waardoor dit een onbenutte bron blijft.

Momenteel zijn er veel gepubliceerde protocollen 1,8,9 en commercieel verkrijgbare kits10 om herprogrammering te stroomlijnen; Ze onderzoeken echter niet diepgaand hoe het succes van donorcellen van patiënten die moeilijk te herprogrammeren zijn, kunnen maximaliseren. Het is algemeen aanvaard dat sommige cellen gewoon niet herprogrammeren, en wanneer dit gebeurt, proberen veel onderzoekers het met een ander donorceltype of een andere patiënt. Dit is echter mogelijk geen haalbare optie voor veel onderzoekers of patiëntenpopulaties. In tegenstelling tot eerder gepubliceerde protocollen 8,9 bevat dit protocol een gids met controlepunten en criteria, waarop het succes van herprogrammering wordt voorspeld, en volgt het een unieke aanpak door bevroren buffycoats te zuiveren met dichtheidsgradiëntcentrifugatie bij ontdooien.

Het proces begint met het afnemen van bloed van geselecteerde personen en het isoleren van PBMC's of buffy coats. Voor nieuwe experimenten zal dit waarschijnlijk het werven van nieuwe donoren omvatten die vers bloed zullen laten prikken onder IRB-goedkeuring en met een correct toestemmingsformulier. De volgende stap is somatische celexpansie, waarbij bevroren bloedcellen worden ontdooid en gekweekt onder omstandigheden die de proliferatie van hematopoëtische stamcellen en erytroide voorlopers bevorderen, de bloedcellen die de beste kandidaten zijn voor herprogrammering11. Na 10–14 dagen zouden de cellen klaar moeten zijn voor herprogrammering, zoals blijkt uit een aparte morfologie die niet in eerdere protocollen is besproken, en worden ze vervolgens getransduceerd door inoculatie met een Sendai-virus dat de Yamanaka-factoren Oct4, Sox2, c-Myc en Klf41 draagt. Na transductie beginnen cellen de Yamanaka-transcriptiefactoren tot expressie te brengen en keren terug naar een pluripotente toestand, opnieuw aangeduid door een duidelijke morfologische verandering en proliferatie naar stamcelkolonies. Opkomende kolonies worden vervolgens individueel geplukt, uitgezet en gecryopserveerd. Na tien passages valideert karakterisering door bevestiging van de expressie van stammarkeringen en differentiatiepotentiaal in de drie kiemlagen een succesvol geherprogrammeerde iPSC-lijn.

Dit protocol werkt het beste voor cryopgereserveerde buffy coats, die < maand zijn opgeslagen, of voor cryopgeconserveerde PBMC's die tot 2 jaar zijn opgeslagen met minstens 1 miljoen levensvatbare cellen bij ontdooien. De beschreven controlepunten kunnen echter helpen bij het herprogrammeren van problemen met een kwalitatieve bloedmonster. Daarnaast kunnen details over het aanpassen van geherprogrammeerde iPSC's aan feedervrije omstandigheden toepasbaar zijn op elke iPSC-herprogrammeringsworkflow, ongeacht het starttype somatische cel.

Dit protocol, opgesteld door hands-on troubleshooting, beschrijft het herprogrammeren van iPSC's uit bevroren buffy coats en identificeert morfologische indicatoren van het succes van herprogrammering, waarmee het een werkbare gids biedt voor het herprogrammeren van moeilijke monsters. Uiteindelijk leidt het implementeren van deze strategieën tot tijd, geld, reagentia en monsters.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van de Universiteit van Georgia. Alle menselijke proefpersonen werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Verklaring van Helsinki van de Wereldmedische Associatie. Op basis van eigen rapport leden de vrijwilligers niet aan de volgende ziekten: taaislijmziekte, chronische obstructieve longziekte, tuberculose, astma, diabetes of acute luchtweginfecties. Vrijwilligers van 18 tot 50 jaar en van beide geslachten werden gerekruteerd. Zwangere vrouwen werden uitgesloten van het onderzoek.

1. Buffy coat of PBMC-extractie en cryopreservatie

Beslissingscriteria: Als de monsters lang bewaard zullen blijven, is het het beste om optie 2 te kiezen. Als de reagentia voor PBMC-zuivering niet beschikbaar zijn, of als monsters voor korte tijd worden opgeslagen, is optie 1 geschikt.

  1. Optie 1: Buffy Coat Extractie
    1. Voer een flebotomie uit (venenpunctie om bloed te nemen) volgens WHO best practices12 en neem 7–10 ml volbloed in bloedbuisjes met antistollingsmiddelen. Houd monsters op ijs.
    2. Breng 7–10 mL volbloed over naar een 15 mL conische buis. Draai het bloed rond met een zwaaiende bak centrifuge op 200 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C zonder remmen. Dit zou 3 lagen moeten vormen met geel plasma erbovenop, de witte buffy coatlaag in het midden en de rode erytrocyten onderaan.
    3. Verzamel het plasma met een steriele serologische pipet zonder de buffy coat-laag te verstoren. Gooi het plasma weg. Breng de witte buffy coat laag over in een verse 15 mL conische buis (ongeveer 1–2 mL).
      VOORZICHTIG: Gooi het plasma weg in de juiste biohazardous waste-bak.
      OPMERKING: Enige plasma-contaminatie van de buffy coat is prima omdat het helpt bij het herstel na het ontdooien.
    4. Voeg DMSO toe aan de buffy-coat zodat de uiteindelijke samenstelling 10% DMSO v/v is en vries direct in cryovial (1 mL/flesje) bij -80 °C. De dag erna verplaats je de flesjes naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
      OPMERKING: Als voorbeeld, voor 2 ml Buffy Coat, voeg je 200 μl DMSO toe, meng goed, en verwijder je het dan in 2 flesjes. Dit resulteert meestal in 1–3 bevroren buisjes per monster.
  2. Optie 2: PBMC-zuivering
    1. Voer een flebotomie uit (venenpunctie om bloed te nemen) volgens de WHO best practices12 en neem 7–10 ml volbloed in bloedafzuigbuisjes met antistollingsmiddelen om. Houd monsters op ijs.
    2. Voeg 4 mL dichtheidsgradiëntoplossing 1 toe aan een verse 15 mL conische buis. Laag voorzichtig 4 ml bloed bovenop de dichtheidsgradiëntoplossing 1.
    3. Centrifuge met een zwaaiende emmer centrifuge op 400 x g bij RT gedurende 30 minuten, waarbij de remmen worden uitgeschakeld. Dit resulteert in plasma in de bovenste laag, PBMC's in de middelste laag, en de rest van het bloed zal zich in de onderste laag bevinden.
    4. Verzamel de PBMC-fractie in een verse 15 mL conische buis en was deze vervolgens 2–3 keer met 1x PBS door te centrifugeren in een zwaaiende emmercentrifuge op 350 x g bij RT gedurende 5 minuten met de rem aan. Gooi het supernatant weg. Om cryopreservatie over te slaan en direct te beginnen met herprogrammeren, ga je door naar stap 2.3.4.
      VOORZICHTIG: Gooi het supernatant weg in de juiste biogevaarlijke afvalcontainer.
    5. Suspendeer de pellet opnieuw in cryopreservatiemedium (90% serum en 10% DMSO) en vries in cryoviaal (1 mL/buisje) bij -80 °C onmiddellijk. De dag erna verplaats je de flesjes naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
      OPMERKING: PBMC-isolerende bloedverzamelbuizen kunnen worden gebruikt in plaats van dichtheidsgradiëntcentrifugatie voor PBMC-zuivering uit vers bloed. Het is ook mogelijk om te cryopconserveren met commercieel verkrijgbare alternatieve vriesmediums. De typische opbrengst is 1–4 bevroren flesjes per monster.

2. Bereid monsters voor op somatische celexpansie

  1. Mediavoorbereiding
    1. Bereid Expansion Media (EM)9 voor door 45 mL EM-basis te aliciteren. Voeg 127,8 μL L-ascorbinezuur toe (50 μg/mL uit 100 mM voorraad) en 450 μL penicilline-streptomycine (100x voorraad).
    2. Bereid EM + cytokinesvoor 13 tot 4 ml EM, voeg 2 μL stamcelfactor (SCF) toe (50 ng/mL van 100 μg/ml voorraad), 2 μL interleukine-3 (IL-3) (10 ng/mL van 20 μg/mL voorraad), 16 μL erytropoëtine (EPO) (2 U/mL van 500 U/mL voorraad), 4 μL insuline-achtige groeifactor 1 (IGF1) (40 ng/mL van 40 μg/ml voorraad), en 4 μL dexamethason (1 μM uit 1 mM voorraad). Gebruik EM + cytokines op dezelfde dag dat het wordt bereid.
      OPMERKING: Alternatieve commerciële expansiemediumsystemen kunnen worden gebruikt.
  2. Optie 1: PBMC Zuivering van Bevroren Buffy Coat
    Beslissingscriteria: als optie 1 in stap 1 is gekozen (bijv. buffy coat extractie), kies dan optie 1 in stap 2 (bijv. PBMC-zuivering uit frozen buffy coat).
    1. Haal dichtheidsgradiëntoplossing 2 op en laat het tot kamertemperatuur komen. Meng grondig door de fles om te draaien. Aseptisch overbrengen van 3 mL dichtheidsgradiëntoplossing 2 naar een 15 mL conische buis.
    2. Bereid een andere 15 mL conische buis voor met 12 mL Dulbecco's fosfaatbufferzoutoplossing (DPBS).
    3. Haal het flesje met bevroren buffy coat uit de vloeibare stikstof. Laat het ijs staan tot het kan ontdooien. Ontdooi het monster voorzichtig door het te draaien in een bad van 37 °C. Verwijder wanneer er nog maar een klein ijskristal over is.
    4. Voorzichtig (druppelgewijs) overbreng je de inhoud van het flesje naar de kegelvormige buis met DPBS. Spoel het flesje af met 1 ml DPBS en voeg het toe aan de conische buis met de teruggehaalde cellen.
    5. Centrifuge met een zwenkbare emmer centrifuge op 200 x g bij RT gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig supernatant en resuspendeer celpellet in 4 mL DPBS met 1% foetaal rundereserum (FBS).
    6. Laag het buffy coat-mengsel voorzichtig bovenop de dichtheidsgradiëntoplossing, waarbij je voorzichtig bent om niet te mengen. Centrifugeer in een zwaaiende emmer centrifugeer op 800 x g gedurende 20 minuten bij RT met de rem eruit.
    7. Verwijder en verwijder met een pipet de bovenste plasmalaag zonder de plasma:gradiëntinterface te verstoren. Verwijder met een pipet de PBMC-laag aan de interface (Figuur 1A) en breng deze over naar een schone 15 mL buis.
      VOORZICHTIG: Gooi de andere lagen weg in de juiste biogevaarlijke afvalbak.
    8. Was de PBMC's met 3 mL EM door te centrifugeren op 200 x g gedurende 10 minuten bij RT. Verwijder voorzichtig het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in 2 mL EM + cytokines. Plaat in 1 put van een 12-put plaat.
    9. Plaats de plaat in de broedmachine op 37 °C, 5%CO2 en 20%O2.
  3. Optie 2: Ontdooien van bevroren PBMC's
    Beslissingscriteria: als optie 2 in stap 1 is gekozen (d.w.z. PBMC-zuivering), of als er zorg is dat bevroren buffycoats een lage levensvatbaarheid zullen hebben (dus langer dan 1 maand in opslag) (Figuur 1B), kies dan optie 2 in stap 2 (d.w.z. het ontdooien van bevroren PBMC's).
    1. Bereid een 15 mL conische buis met 12 mL DPBS voor.
    2. Haal het flesje met bevroren PBMC's uit vloeibare stikstof. Laat het ijs staan tot het klaar is om te ontdooien. Ontdooi het monster voorzichtig door het te draaien in een waterbad van 37 °C. Verwijder wanneer er nog maar een klein kristal over is.
    3. Breng voorzichtig (druppelwijs) de inhoud van het flesje over in de kegelvormige buis. Zorg ervoor dat je alle cellen uit het flesje haalt door het buisje te spoelen met 1 ml DPBS.
    4. Centrifugeer in een schanderende emmer centrifugeer op 200 x g bij RT gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw (Figuur 1C) in 2 mL EM, neem vervolgens 10 μL om de trypanblauwe uitsluitingstest uit te voeren op cellenlevensvatbaarheid om celaantal14 te verkrijgen.
      VOORZICHTIG: Gooi het supernatant weg in de juiste biogevaarlijke afvalcontainer.
    5. Plaat 1,0 x 106–2,0 x 106 cellen /mL in 2 mL EM + cytokines in één put van een 12-put plaat. Plaats de plaat in de broedmachine op 37 °C, 5%CO2 en 20%O2.

3. Somatische celexpansie (1 dag na ontdooien)

  1. Verwijder voorzichtig 1 ml verbruikte media uit elke put. Verbruikte media kan worden verzameld in een andere put of centrifugebuis en gecontroleerd om te verzekeren dat er geen cellen verloren zijn gegaan.
  2. Vervang het gebruikte medium door 1 ml verse EM + cytokines.
  3. Herhaal stappen 3.1 en 3.2 en maak om de dag foto's van PBMC's totdat er een significante verandering in morfologie wordt waargenomen, met heldere en ronde cellen van grote en kleine grootte (Figuur 2A, respectievelijk oranje en blauwe pijl), die de erythroblasten zijn, het celtype dat opnieuw geprogrammeerd moet worden. Dit duurt ongeveer 10–14 dagen.
    OPMERKING: Cellen die deze morfologieën niet vertonen, meestal zonder de grotere ronde cellen (Figuur 2B), zullen waarschijnlijk niet succesvol herprogrammeren en kunnen dood zijn (Figuur 2C).

4. Transductie (10–14 dagen na ontdooien)

  1. Bereid Sendai-virus voor
    1. Met behulp van de lot-specifieke titerwaarde bereken je het volume van elk virus dat nodig is voor transductie van 2,0 × 105cellen met behulp van KOS: c-Myc: Klf4 met een multipatiënt van infectie (MOI) van 5:5:3, zoals aanbevolen door de fabrikant. De vergelijking voor deze berekening is te vinden in de productdocumenten die door de fabrikant zijn verstrekt.
    2. Haal virussen uit de vriezer en bewaar ze op ijs tot het tijd is om te ontdooien. Ontdooi de virussen één voor één voorzichtig door ze te laten draaien in een waterbad van 37 °C.
    3. Bereid aliquots voor waarin alle drie de virussen worden gemengd op het juiste volume voor transductie van 2,0 × 105 cellen bij MOI's van 5:5:3. Bevries aliquots op -80 °C tot ze klaar zijn voor gebruik.
      VOORZICHTIG: Zorg ervoor dat je alle afvalstoffen die in contact is gekomen met het Sendai-virus grondig bleekt.
      OPMERKING: De instructies van de fabrikant bevelen een daadwerkelijke telling van cellen aan met MOI-berekening om het volume toegevoegde virus te bepalen, maar de benadering van 2,0 × 105 is succesvol gebleken voor de doeleinden van dit protocol. Aliquoteren kan kosteneffectiever zijn en vermindert het aantal vries-/ontdooicycli voor virussen.
  2. Dag van Transductie (d0)
    1. Als de PBMC's de dag ervoor niet zijn gevoed, verwijder dan 1 ml verbruikte media en vervang door 1 ml verse EM + cytokines. Ontdooi het virus aliquot op het ijs, voeg het dan direct toe aan de put, laat de media ronddraaien.
    2. Wikkel de plaat in parafilm en centrifugeer de plaat in een zwaaiende helm centrifuge op 350 x g bij RT gedurende 90 minuten. Plaats de plaat 's nachts in de broedmachine op 37 °C, 5%CO2 en 20%zuurstof .
      VOORZICHTIG: Zorg ervoor dat je alle afvalstoffen die in contact is gekomen met het Sendai-virus grondig bleekt.
  3. 1 Dag na transductie (d1)
    1. Verzamel de cellen in een 15 mL conische buis. Spoel goed af met 2 mL EM en controleer onder de microscoop of alle cellen zijn verzameld. Centrifuge-cellen op 300 x g bij RT gedurende 10 minuten.
    2. Verwijder voorzichtig het supernatant en breng het opnieuw in 2 mL EM+ cytokines. Plaats het in een verse put van een plaat met 12 putten en zet de plaat terug in de broedmachine bij 37 °C, 5%CO2 en 20%O2.
      VOORZICHTIG: Zorg ervoor dat u alle afvalstoffen die in contact is gekomen met het Sendai-virus grondig bleekt.

5. Overgeplaatste cellen opnieuw op voedercellen plaatsen

  1. Bereid voedercel voor
    1. Voeg aan 43,5 mL Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium (DMEM) 5 mL FBS toe (eindconcentratie 10%), 0,5 mL minimale essentiële medium niet-essentiële aminozuuroplossing (MEM-NEAA) (uit 100x voorraad), 50 μL 2-mercaptoethanol (55 μM uit 55 mM voorraad) en 0,5 mL antibioticum-antimycoticum (uit 100x voorraad).
    2. Bereid gelatine-gecoate 6-put platen voor door 600 μL gelatine (0,1% van 2% voorraad) toe te voegen aan 12 mL DPBS en 2 mL per put te verdelen. Broed 20 minuten op kamertemperatuur.
    3. Haal het bevroren flesje met bestraalde embryonale fibroblasten van de muis (MEF's) en ontdooi voorzichtig door te draaien in een waterbad van 37 °C.
    4. Voeg druppelgewijs toe aan een 15 mL conische buis met 10 mL DPBS en spoel het flesje met nog eens 1 mL DPBS. Centrifugeer op 200 x g bij RT gedurende 5 minuten.
    5. Verwijder voorzichtig het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in 1 mL fibroblastmedium. Verwijder 10 μL om de trypanblauwe uitsluitingstest uit te voeren op cellevensvatbaarheid om het celaantal14 te verkrijgen.
    6. Verwijder de gelatineoplossing uit de 6-wellplaten en plaatbestraalde MEF's bij 2,5 × 104 cellen/cm². Incubeer in de broedmachine bij 37 °C, 5%CO2 en 20%O2 gedurende 6–48 uur.
      OPMERKING: Feedercelplaten moeten worden voorbereid voordat de getransduceerde cellen opnieuw worden verplat. De beste resultaten zijn te zien wanneer bestraalde MEF's ongeveer 2 dagen worden geïncubeerd voordat ze opnieuw worden geplateerd, maar incubatie van minstens 6 uur kan voldoende zijn.
  2. Herplatgetransduceerde cellen
    1. Bereid iPSC-media 90 mL DMEM/F12 voor met 10 mL FBS (10% eindconcentratie), 1 mL MEM-NEAA (uit 100x voorraad), 1 mL L-glutamine (2 mM uit 200 mM voorraad), 1 mL penicilline-streptomycine (uit 100x voorraad), 100 μL 2-mercaptoethanol (55 μM uit 55 mM voorraad), en 100 μL fibroblast growth factor 2 (FGF2) (10 ng/mL uit 10 μg/mL voorraad). Voeg bij elke voeding L-ascorbinezuur (50 μg/mL) vers toe.
    2. Op dag 3 na transductie verzamel je alle media en cellen uit de getransduceerde put in een 15 mL conische buis. Spoel goed af met minstens 1 extra ml EM en centrifugeer in een zwaaiende emmer centrifuge op 300 x g bij RT gedurende 10 minuten.
    3. Suspendeer de pellet opnieuw in 6 mL iPSC-media. Aspireer het medium uit 3 putten van de plaat met bestraalde MEF's.
    4. Plaattransduceerde cellen naar deze 3 putten van bestraalde MEF (2 ml/put). Incubeer in de broedmachine bij 37 °C, 5%CO2 en 20%O2.

6. Onderhoud tot kolonie-ontstaan

  1. Voeg op dag 4, 5 en 6 na transductie elke dag 1 mL verse iPSC-media toe aan elke put. Dit beperkt onnodige verstoring van de vers geherprogrammeerde cellen terwijl ze zich op de voeders vestigen, terwijl het hen ook verse voedingsstoffen voorziet.
  2. Op dag 7 na transductie verwijder je alle oude media en vervang je door 2 ml verse iPSC-media per put. Blijf om de dag met iPSC-media eten totdat kolonies beginnen te ontstaan.
  3. Bereid hES-media voor 78 mL DMEM/F12 met 20 mL FBS-vrije aanvulling (20%), 1 mL MEM-NEAA (100x), 1 mL L-glutamine (2 mM uit 200 mM voorraad), 1 mL penicilline-streptomycine (100x), 100 μL 2-mercaptoethanol (55 μM uit 55 mM voorraad) en 100 μL FGF2 (10 ng/mL uit 10 μg/ml voorraad). Voeg bij elke voeding L-ascorbinezuur (50 μg/mL) vers toe.
  4. Zodra kleine kolonies zijn ontstaan, blijf je de getransduceerde cellen onderhouden door om de dag te voeden met hES-media (Figuur 3A).
    OPMERKING: Kolonies beginnen al 7 dagen na transductie te verschijnen. Als er drie weken na transductie geen kolonies zijn ontstaan, is het onwaarschijnlijk dat er ooit kolonies zullen ontstaan.

7. Kies kolonies zodra ze groter zijn geworden (Figuur 3B)

OPMERKING: Soms ondergaan getransduceerde cellen een morfologische verandering die niet resulteert in een stamcelachtige kolonie (Figuur 3C). Dit wordt niet beschouwd als een kolonie die tot een succesvolle iPSC-lijn kan leiden.

OPMERKING: Vanaf het opkomen van de kolonie moeten iPSC-lijnen worden aangepast aan de voorkeursomstandigheden voor hPSC-kweek in het laboratorium. Dit protocol zal aantonen hoe iPSC-lijnen zijn aangepast aan feedervrije omstandigheden, gekweekt op met vitronectine (VTN) gecoate platen, gevoed met chemisch gedefinieerde en commercieel beschikbare hPSC-media. Als kolonies zich niet goed aanpassen aan de nieuwe omstandigheden, hebben ze mogelijk een zachtere overgang nodig, zoals het ophalen van voedercellen met hES-media.

  1. Bereid platen met VTN voor door VTN te ontdooien en grondig te mengen. Voor een 24-well plaat bereid je 12 mL DPBS met 120 μL VTN (5 μg/mL uit 500 μg/mL voorraad) en verdeel je 0,5 mL VTN oplossing/put. Broed 1 uur op kamertemperatuur.
  2. Bereid hPSC medium voor door 1 fles hPSC supplement 's nachts te ontdooien op 4°C. Na ontdooiing voeg je 10 mL hPSC-supplement toe aan één fles van 500 ml hPSC basaal medium.
  3. Bereid de platen voor op plukt door VTN-oplossing uit putten van de 24-put plaat te verwijderen en 0,5 mL hPSC-medium met 0,5 μL Y-27632 (10 μM uit 10 mM voorraad) aan elke put toe te voegen.
  4. Breng de nieuwe plaat, de 6-put met de getransduceerde cellen/kolonies, steriele spuitnaalden en een p200-pipet en tips naar een dissectiemicroscoop onder steriele omstandigheden.
  5. Plaats de plaat met de getransduceerde cellen en uitgekomen kolonies op de dissectiemicroscoop en gebruik de microscoop om één kolonie te lokaliseren om te kiezen. Til het deksel van de plaat op om de put bloot te leggen.
  6. Open de spuit aseptisch en maak de naald bloot. Geleid door de microscoop gebruik je de naaldpunt om de kolonie los te maken van eventuele omliggende voedercellen door met de naald de omtrek van de kolonie te volgen.
  7. Gebruik de naaldtip om de kolonie in een paar even grote stukken te snijden. Als de stukjes van de kolonie nog niet van de plaat zijn losgekomen, gebruik dan de zijkant van de naald om ze van de plaat te scheppen of te schrapen zodat ze blijven drijven.
    VOORZICHTIG: Gooi de naald weg in de juiste scherpe verpakking.
  8. Gebruik met de p200 de microscoop om de gekozen kolonie te verplaatsen. Aspireer de drijvende kolonie met de pipet en breng de voorbereide 24-put plaat over. Probeer de hele kolonie in de put te krijgen zonder andere kolonies of voedercellen te krijgen.
  9. Plaats de plaat in de broedmachine op 37 °C, 5%CO2 en 20%O2.
  10. Voed de geplukte kolonies elke dag met 1 ml hPSC-medium totdat ze samenvloeien.
    OPMERKING: Kolonies hebben het potentieel om genetisch van elkaar te verschillen. Elke put van de 24-put plaat mag slechts één gekozen kolonie bevatten. Elke gekozen kolonie krijgt een eigen identificatie en wordt vanaf nu behandeld als een andere cellijn dan andere gekozen kolonies. Voor een rigoureuze herprogrammeringsronde kies je minstens 24 kolonies en breid je er minstens 3 uit en karakteriseer je.

8. Uitbreiden

  1. hPSC-onderhoud
    1. De geplukte kolonies zijn klaar om te splitsen wanneer ze groot en rond zijn met gloeiende randen (Figuur 4A). Kolonies breken in meerdere stukken wanneer ze worden geplukt. Als er meerdere kolonies in één put zijn, splits ze dan voordat ze groot genoeg zijn geworden om contact te maken en te beginnen te onderscheiden.
    2. Bereid een VTN-gecoate 6-put plaat voor: Voor een 6-put plaat bereid 12 mL DPBS met 120 μL VTN (5 μg/mL uit 500 μg/mL materiaal) en verdeel 1 mL VTN oplossing/put. Incubeer op kamertemperatuur gedurende 1 uur. VTN-oplossing kan worden vervangen door DPBS en een maand worden bewaard bij 37 °C, 5%CO2 . In de putten waarin wordt opgesplitst, aspireer je DPBS en vervang je het door 1 mL hPSC medium.
    3. Aspireer het medium uit de put om te splitsen, spoel dan één keer af met 1 mL DPBS. Aspirateer de DPBS en voeg 500 μL 0,5 mM EDTA dissociatiebuffer toe (bereid in 500 mL DPBS met 0,9 g NaCl en filter gesteriliseerd)15. Broeden op 37 °C, 5%CO2 gedurende 2 minuten, totdat de kolonies beginnen los te worden en cellen binnen elke kolonie zich beginnen te verzamelen en van elkaar los te maken.
    4. Verwijder de plaat uit de broedmachine, aspireer de EDTA-dissociatiebuffer. Met een p1000-pipet verzamelt u de cellen met 1 mL hPSC-medium door voorzichtig op en neer te pipetteren totdat de kolonies volledig losgekoppeld en licht zijn opgebroken. Breng de 1 mL medium en cellen over in de nieuwe 6-put met 1 mL vers hPSC-medium. Deze eerste splitsing wordt uitgevoerd in een splitsingsverhouding van 1:1, waarbij alle cellen van de originele plaat worden overgenomen naar de nieuwe plaat.
    5. Plaats de cellen in de broedmachine op 37 °C, 5%CO2 en 20%O2. Geef dagelijks iPSC's totdat de put samenvloeit en klaar is om te splitsen.
      OPMERKING: Slechte stamcelmorfologie (Figuur 4B) kan worden verzacht door het splitsingsprotocol aan te passen, zoals eerder splitsen, een kortere EDTA-incubatietijd of het aanpassen van de splitsingsverhouding.
    6. Zet uit tot een schaal van 10 cm.
      1. Zodra cellen samenkomen in elke put van de 6-put platen, bedek je een schotel van 10 cm met VTN (7 mL DPBS met 70 μL VTN (5 μg/mL van 500 μg/mL voorraad), geïncubeerd voor 1 uur bij RT).
      2. Herhaal het splitsingsprotocol, ditmaal uitbreiden van de 6-put naar de 10 cm weefselkweekschaal (splitsingsverhouding 1:1). Gebruik 7–10 mL hPSC medium per schotel van 10 cm.
      3. Zodra de cellen in de 10 cm hoge schaal samenvloeien, herhaal je dit splitsingsproces (passaging). Noteer bij elke passage het nummer. De splitsingsverhouding hangt af van de celmorfologie en -dichtheid. Een typische verhouding is 1:10, waarbij een tiende van de cellen van de oorspronkelijke plaat wordt overgedragen naar de nieuwe plaat.
  2. Freezebacks en voorraadbereidingen
    1. Na ongeveer 3 passages breid je uit tot vier 10 cm tissuekweekschalen voor vroege passages. Zodra cellen in de 10 cm schalen samenvloeien, zijn ze klaar om ingevroren te worden.
    2. Maak cryovials klaar en zet ze in de vriezer om af te koelen. Zorg ervoor dat het etiket de cellijn, kloon, doorgangsnummer en datum van bevriezing bevat.
    3. Bereid vriesmedium voor: 90% hPSC medium en 10% DMSO, je hebt 1 ml per flesje nodig (3 bevroren flesjes per schaal van 10 cm).
    4. Voer het splitsingsprotocol uit zoals normaal, met 4 mL 0,5 mM EDTA dissociatiebuffer per schotel van 10 cm.
    5. Na de EDTA-incubatie aspireer je EDTA. Voeg voorzichtig 10 mL hPSC medium toe aan het gerecht.
    6. Was de cellen voorzichtig van de schaal door het medium te pipetten. De cellen komen gemakkelijk van de bodem van de schaal en mengen zich in het medium. Pipette slechts 2–5 keer om kolonies voorzichtig te breken maar dissociatie in enkele cellen te voorkomen.
    7. Centrifugeer 5 minuten op 200 x g bij RT. Aspireer supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in een vriesmedium.
    8. Isoleer en vries onmiddellijk in bij -80 °C. Breng de bevroren flesjes over in de vloeibare stikstoftank voor langdurige opslag.
    9. Bevries meer voorraden op dezelfde manier zodra de karakterisering is afgerond.

9. Karakterisering van iPSC's:

  1. Expressie van stammarkeringen. Na het uitbreiden van minstens 10 passages, wanneer kolonies in een 24-put klaar zijn om gesplitst te worden, fixeer dan met 4% paraformaldehyde en kleur je met immunohistochemie voor stammarker NANOG. Het zal minstens 10 passages nodig zijn voordat kolonies Sendai-virus (SeV) negatief zijn, wat kan worden bevestigd door immunofluorescentie (Figuur 4C).
  2. Test pluripotentievermogen: Drie kiemlaagdifferentiaties. iPSC-pluripotentie wordt bevestigd door succesvolle differentiatie in elk van de drie kiemlagen. Elke differentiatie begint bij een confluent schotel van 10 cm met een goede hPSC-morfologie (Figuur 4A).
    1. Ectoderm16
      1. De dag voordat de differentiatie begint (dag 1): Zaad-iPSC's op matrix-gecoate 24-wellplaten met een dichtheid van 2,6 × 105 cellen/cm² in hPSC-medium met Y-27632 (10 μM eindconcentratie) en XAV-939 (2 μM eindconcentratie).
      2. Dag 0–dag 1: Voeden met 1 mL/putdifferentiatiebasis met LDN (100 nM eindconcentratie), SB (10 μM eindconcentratie) en XAV (2 μM eindconcentratie).
      3. Dag 2–dag 7: Voeden met 1 mL/put differentiatiebasis met LDN (100 nM eindconcentratie) en SB (10 μM eindconcentratie). Vanaf d3 voed je om de dag.
      4. Dag 8: fixeren met 4% paraformaldehyde en kleuren door immunohistochemie voor ectodermmarker PAX617 en verlies bevestigen van pluripotentiemarker NANOG (Figuur 4D).
    2. Mesoderm18:
      1. De dag voordat de differentiatie begint (dag -1): Zaad iPSC's op matrixgecoate 24-wellplaten met een dichtheid van 2,5 × 105 cellen/cm2 in hPSC-medium met Y-27632 (10 μM eindconcentratie).
      2. Dag 0: Voeden met DMEM/F12 met L-ascorbinezuur (64 μg/mL eindconcentratie), natriumseleniet (13,6 ng/mL eindconcentratie), holotransferrine (10 μg/mL eindconcentratie), chemisch gedefinieerd lipidenconcentraat (100x) en CHIR (5 μM eindconcentratie).
      3. Dag 1: Voeden met DMEM/F12 met L-ascorbinezuur (64 μg/mL eindconcentratie), natriumseleniet (13,6 ng/mL eindconcentratie), holotransferrine (10 μg/mL eindconcentratie), chemisch gedefinieerd lipidenconcentraat (100x) en heparine (0,6 U/mL eindconcentratie).
      4. Dag 2: Fixeer met 4% paraformaldehyde en kleuring door immunohistochemie voor BRACHYURY-T19 en bevestig verlies van pluripotentiemarker NANOG (Figuur 4E).
    3. Endoderm20
      1. De dag voordat de differentiatie begint (dag -1): Zaad iPSC's op matrix-gecoate 24-wellplaten met een dichtheid van 1,0 × 105 cellen/cm2 in hPSC-medium met Y-27632 (10 μM eindconcentratie).
      2. Dag 0–dag 4: Op d0, spoel met DPBS en voed met RPMI met L-glutamine substitutie (100x), FBS (0,5% eindconcentratie) en Activin A (100 ng/mL eindconcentratie). Vanaf d0, voed dagelijks met hetzelfde medium.
      3. Dag 5: Fixeren met 4% paraformaldehyde en kleuren via immunohistochemie voor endodermmarker SOX1721 en verlies van pluripotentiemarker NANOG bevestigen (Figuur 4F).
        OPMERKING: Differentiaties werden gedaan volgens eerder gepubliceerde protocollen. Uit onze ervaring kunnen matrixcoatings uitwisselbaar zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het succes van dit protocol kan in verschillende stadia worden gevolgd. Tabel 1 geeft een samenvatting van de voorbeelden waarop dit protocol is uitgevoerd. Startmonsters, die ofwel cryopgereserveerde buffy coats zijn die een week zijn opgeslagen, of cryopgereserveerde PBMC's, die bij ontdooiing een goede monsterkwaliteit hebben en het kenmerkende morfologische uiterlijk na celexpansie succesvol 6 van de 7 keer herprogrammeren (Tabel 1, categorie 1). Twe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iPSC-technologie heeft enorm veel potentieel in het biomedische veld met betrekking tot de ontdekking van ziektemechanismen, gepersonaliseerde geneeskunde en "klinische proeven in een gerecht"22,23. Efficiënte en aanpasbare protocollen voor iPSC-herprogrammering uit bloedmonsters zijn essentieel om het grote potentieel van iPSC-technologie te benutten, omdat ze gemakkelijk te verzamelen zijn en vaak gemakkelijk beschikbaar in bio...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder commerciële of financiële relaties die als een potentieel belangenconflict kunnen worden opgevat.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke proefpersonen werden gerekruteerd en kregen geïnformeerde toestemming voor bloeddonatie volgens het IRB-protocol UGA# 2012-10769-06, NYU# s21-01701, Emory# 2024P008659 en Emory# 000002114. Het onderzoek dat in deze publicatie werd gerapporteerd, werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences van het National Institute of Health onder toekenning nummer 5T32GM142623 aan J. Art, R01MH115174 aan V. Michopoulos en R01NS114567 aan N. Zeltner. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 cm standard tissue culture dishesFalcon353003
12 well platesFalcon353043
15 mL conical tubesFisher7200886
24 well platesCorning7200740
4% paraformaldehyde solutionThermo ScientificJ19943-K2
6 well platesFisher ScientificFB012927
accuSpin1RFisher Scientific75003449
Activin ABio-techne338-AC
AF488-donkey α goatinvitrogenA11055
AF555-donkey α rbtinvitrogenA31572
AF647-donkey α minvitrogenA31571
AF647-donkey α rbtinvitrogenA31573
Antibiotic-Antimycotic (100X)Fisher15 240 096 
Basix Polystyrene Serological PipetsFisher14955233
14955234
14955235
14955236
BD Tuberculin SyringesFisher14-826-87
BD Vacutaine Glass Mononuclear Cell Preparation (CPT) TubesFisher Scientific02-685-125PBMC isolatiebloedopvangbuisjes
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Hemogard ClosureFisher Scientific02-657-32bloedopvangbuisjes met anticoagulanscoating
B-MercaptoethanolFisher21 985 023 
Bovine GelatinSigmaG1393
Brachyury-T antibody polyclonal goat IgGR&DAF2085
CellDrop BFDenovixCellDrop BF
Centrifuge 5702EppendorfEP022628102-1EA
chemically defined lipid concentrateFisherNC9022744
Chir 99021 R&D4423
CO2 incubatorSanyoMCO-20AIC
Cryopreservation Storage SystemCustom Biogenic SystemsV-1500AB
CryoStor CS10Stem Cell Technologies100-1061alternatief vriesmedium
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming KitFisherA16517
DexamethasoneSigmaD2915
DMEMFisher11965118
DMEM/F12Fisher11330057
DMSOFisherBP231-1
DPBS 1X W/O CA MG FisherMT21031CM
EDTAFisherAM9262
Erythropoeitin (EPO)Bio-Techne287-TC-500
Essential 6 Medium (E6)FisherA1516401differentiatiebasis 
Essential 8 medium (E8)FisherA1517001hPSC basismedium
EVOS FL microscopeThermoAMF4300
Fetal Bovine SerumVWR45000-734
FGF basic (FGF2)Bio-techne233-FB/CF 
GeltrexFisherA1413202Matrix coating
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Fisher11140050
GlutamaxFisher35050061L-glutaminesubstituut 
HeparinStem Cell Technologies7980
Histopaque 1077Sigma10771dichtheidsgradientoplossing 1 
HolotransferrinSigmaT0665
Human Stem Cell Factor (SCF)Peprotech300-07-100UG
Insulin like Growth Factor 1 (IGF1)Peprotech100-11-100UG
Interleukin-3 (IL-3)Peprotech200-03-2UG
Isotemp 210 water bathFisher Scientific210
Knockout-Serum-Replacement (KSR)Fisher10828028FBS-vrij supplement 
L-Ascorbic AcidSigmaA4544-100G
LDN193189Stemgent04-0074
L-GlutamineFisher25030081
LymphoprepStem Cell Technologies7801Dichtheidsgradientoplossing 2
MatrigelCorningCB-40234Matrix coating
Mouse Embryonic FibroblastsFisherA34964 
Nanog polyclonal goat IgGR&DAF1997-SP
Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic TubesFisher Scientific12-565-163N
Penicillin/StreptomycinFisher15140122
Purified anti-Pax-6 Antibody rabbit polyclonal IgGBiolegend901301
QBSF-60 Serum Free MediumQuality Biological160-204-101EM-basis
Recovery Cell Culture Freezing MediumThermo Fisher Scientific12648010alternatief vriesmedium
rhVitronectin (VTN)FisherA31804
RPMI 1640 MediumFisher11875093
SB431542R&D1614
Sendai virus HN Monoclonal Antibody Mouse IgG2aInvitrogen14649482
Sodium SeleniteSigmaS5261
Sox17 Antibody polyclonal goat IgG

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Ray, A., et al. An overview on promising somatic cell sources utilized for the efficient generation of induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev Rep. 17 (6), 1954-1974 (2021).
  3. Raab, S., Klingenstein, M., Liebau, S., Linta, L. A comparative view on human somatic cell sources for ipsc generation. Stem Cells Int. 2014, 768391(2014).
  4. Sauer, V., et al. Human urinary epithelial cells as a source of engraftable hepatocyte-like cells using stem cell technology. Cell Transplant. 25 (12), 2221-2243 (2016).
  5. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , 161-167 (2015).
  6. Quirynen, M., Siawasch, S. aM., Yu, J., Miron, R. J. Essential principles for blood centrifugation. Periodontol 2000. 97 (1), 43-51 (2025).
  7. Perry, J. N., Jasim, A., Hojat, A., Yong, W. H. Procurement, storage, and use of blood in biobanks. Methods Mol Biol. 1897, 89-97 (2019).
  8. Meraviglia, V., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from frozen buffy coats using non-integrating episomal plasmids. J Vis Exp. (100), e52885(2015).
  9. Yang, W., et al. iPSC reprogramming from human peripheral blood using Sendai Virus mediated gene transfer. , Stembook. Cambridge (MA). (2008).
  10. Cerneckis, J., Cai, H., Shi, Y. Induced pluripotent stem cells (ipscs): Molecular mechanisms of induction and applications. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 112(2024).
  11. Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
  12. guidelines on drawing blood: best practices in phlebotomy. , World Health Organization. Geneva. (2010).
  13. Robb, L. Cytokine receptors and hematopoietic differentiation. Oncogene. 26 (47), 6715-6723 (2007).
  14. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3 B 1-A3 B 3 (2015).
  15. Chen, G. Splitting hESC/hiPSC lines with EDTA in feeder free conditions. , Stembook. Cambridge (MA). (2008).
  16. Zeltner, N., Lafaille, F. G., Fattahi, F., Studer, L. Feeder-free derivation of neural crest progenitor cells from human pluripotent stem cells. J Vis Exp. (87), e51609(2014).
  17. Zhang, X., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7 (1), 90-100 (2010).
  18. Lin, Y., Zou, J. Differentiation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in fully chemically defined conditions. STAR Protoc. 1 (1), (2020).
  19. Technau, U. Brachyury, the blastopore and the evolution of the mesoderm. Bioessays. 23 (9), 788-794 (2001).
  20. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a psc-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  21. Kanai-Azuma, M., et al. Depletion of definitive gut endoderm in sox17-null mutant mice. Development. 129 (10), 2367-2379 (2002).
  22. Kirkeby, A., Main, H., Carpenter, M. Pluripotent stem-cell-derived therapies in clinical trial: A 2025 update. Cell Stem Cell. 32 (1), 10-37 (2025).
  23. Verma, I., Seshagiri, P. B. Current applications of human pluripotent stem cells in neuroscience research and cell transplantation therapy for neurological disorders. Stem Cell Rev Rep. 21 (4), 964-987 (2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ge nduceerde pluripotente stamcellenherprogrammering van de buffycoatPBMC herprogrammeringstamcelmorfologieSendai virus transductiestamcelmarker NANOGerythroblastdifferentiatieimmunofluorescentiekleuringisolatie via dichtheidsgradi nthumane pluripotente stamcellen

Gerelateerde artikelen