Een gestandaardiseerd protocol voor het evalueren van cadmiumtoxiciteit in menselijke colorectale organoïden via een op luciferase gebaseerde levensvatbaarheidstest

Samenvatting

Het protocol heeft als doel menselijke colorectale organoïden vast te stellen en een luciferase-gebaseerde ATP-bioluminescentietest te evalueren voor het detecteren van door cadmium veroorzaakte toxiciteit. Het beoordeelt de haalbaarheid en gevoeligheid van de assay door dosis- en tijdsafhankelijke veranderingen in de levensvatbaarheid van organoïden te kwantificeren.

Samenvatting

Cadmium (Cd) wordt geclassificeerd als een groep 1 kankerverwekkend stof en vormt een ernstig wereldwijd milieuprobleem. Deze studie had als doel een menselijk colorectaal organoïdemodel op te stellen en de haalbaarheid en gevoeligheid te evalueren van een luciferase-gebaseerde ATP-bioluminescentietest voor het detecteren van toxische reacties van colorectale organoïden (CO's) op CD-blootstelling. Stamcellen werden geïsoleerd uit menselijk colorectaal weefsel en gekweekt in een driedimensionale basale membraanmatrix om CO's te genereren. Organoïden werden behandeld met een gegradueerde reeks CD-concentraties voor verschillende blootstellingsduur. Een luminescente levensvatbaarheidsreagens werd toegevoegd in een gelijke volumeverhouding, voorzichtig gemengd door te wiegen op kamertemperatuur om lysis en reagenspenetratie te bevorderen, en vervolgens geïncubeerd om de bioluminescente reactie te laten doorgaan. Luminescentie werd geregistreerd in luminescentiemodus op een multimode microplaatlezer. Dose-responscurve fitting werd gebruikt om de half-maximale remmende concentratie te berekenen en om veranderingen in levensvatbaarheid of relatieve levensvatbaarheid te evalueren. Primaire stamcellen werden met succes geïsoleerd uit menselijk colorectaal weefsel en gebruikt om CO's te genereren. CD-blootstelling veroorzaakte dosisafhankelijke en tijdsafhankelijke afnames in de metabole activiteit van organoïden; dosis-responsanalyse leverde overlevingscurves en IC50-waarden op voor de organoïden. Deze studie biedt methodologische richtlijnen en praktische inzichten voor het gebruik van menselijke CO's in milieutoxicologische studies rond zware metalen.

Inleiding

Cd is een van nature voorkomend zwaar metaal dat wordt geclassificeerd als een Groep 1 kankerverwekkend stof en is een wereldwijd milieuconcern^geworden. Menselijke blootstelling aan Cd vindt voornamelijk plaats via inademing en voedingsinname. Hoewel chronische blootstelling aan lage doses geassocieerd wordt met een reeks nadelige gezondheidsuitkomsten, blijft het aanzienlijk verminderen van het gebruik en de uitstoot in de omgeving een uitdaging ^2,3. Traditionele tweedimensionale culturen groeien op vlakke substraten en missen weefselarchitectuur, celpolariteit en de tumormicro-omgeving. Daardoor beschikken ze over een beperkt vermogen om in vivo heterogeniteit en authentieke toxicologische reacties op cadmiumblootstelling te recapituleren⁴. Dergelijke systemen kunnen cel-cel interacties, matrixafhankelijke groei of de biologische processen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van geneesmiddelresistentie^{niet adequaat modelleren}. Driedimensionale organoïde systemen afkomstig van patiëntweefsels bieden een fysiologisch relevanter platform in vergelijking met conventionele tweedimensionale cellijnen⁶. Organoïden behouden de genomische kenmerken, histologische organisatie en functionele toestanden van het primaire weefsel. Dit maakt nauwkeurigere modellering mogelijk van tumorgroei, evolutie en gevoeligheid voor cadmiumtoxiciteit, wat duidelijke voordelen biedt voor ziektemodellering en toxicologisch onderzoek⁷. CO's beschikken over een complexe driedimensionale architectuur, cellulaire heterogeniteit en intrinsieke capaciteiten voor zelfvernieuwing en zelforganisatie ^8,9. Transplantatie van CO's in ontvangende muizen kan de zelfvernieuwing van intestinale stamcellen bevorderen en het immuunmicro-milieu van de gastheer moduleren, wat beschermende effecten oplevert⁴. In 2009 toonden Sato et al. voor het eerst aan dat een enkele Lgr5⁺ volwassen darmstamcel spontaan kan organiseren en differentiëren om crypt–villus-structuren te vormen die alle intestinale cellijnen^omvatten.

Het darmepitheel vormt de eerste verdedigingslinie tegen CD-toxiciteit na inname. In feite is de orale biobeschikbaarheid van Cd doorgaans onder de 5%. Cd-geïnduceerde darmtoxiciteit wordt gekenmerkt door de verstoring van intercellulaire verbindingen, verhoogde paracellulaire permeabiliteit en de inductie van ontstekingsreacties. Bovendien verstoort Cd de darm-immuunfunctie en verandert het de samenstelling en homeostase van de darmmicrobiota^. Afhankelijk van de blootstellingsdosis en duur kan Cd een celcyclusdisregulatie veroorzaken, wat in sommige contexten oncogene fenotypes bevordert en in andere apoptose induceert. Cd kan indirect de productie van ROS (reactieve zuurstofsoorten) stimuleren, wat oxidatieve stress en een disbalans van redox veroorzaakt. De functie van receptoren, kinasen, fosfatasen, proteasen, adhesiemoleculen en transcriptiefactoren kan worden gemoduleerd via redoxsignaal. Cd verstoort ook signaalcascades, waardoor de activatiestatus van ERK1/2, JNK (c-Jun N-terminale kinase) en p38 MAPK (p38 mitogeengeactiveerde protenekinase) over meerdere celtypen^verandert. Door ERK1/2 binnen de MAPK-cascade te activeren, kan Cd celproliferatie en overleving bevorderen, geprogrammeerde celdood onderdrukken en bijdragen aan abnormale hyperproliferatie¹³. Cd kan direct of indirect de expressie en activiteit van belangrijke effectoreiwitten reguleren. Zo downreguleert het de tumorsuppressor p53 en upreguleert het anti-apoptotische eiwitten zoals Bcl-2 en Bcl-xL, waardoor uiteindelijk apoptose en celcyclushomeostase¹⁴ worden verstoord.

In CO-modellen die worden gebruikt om de cytotoxische effecten van CD te evalueren, wordt ATP-inhoudmeting veel gebruikt om de levensvatbaarheid van organoïden te beoordelen. ATP, het centrale molecuul van het energiemetabolisme, weerspiegelt direct de algehele metabole toestand en levensvatbaarheid van organoïden. Bij blootstelling aan cadmium bij COs induceert Cd voornamelijk mitochondriale disfunctie, verergert het oxidatieve stress en verstoort het de homeostase van organoïde energie. Deze gebeurtenissen verzwakken gezamenlijk de ATP-productie en verminderen uiteindelijk de levensvatbaarheid van organoïden. Daarom dienen veranderingen in ATP-niveaus als een robuuste functionele meting van door cadmium geïnduceerde cytotoxiciteit. Conventionele cytotoxiciteitsassays omvatten colorimetrische MTT/CCK-8 assays, Live/Dead-kleuring en flowcytometrie-gebaseerde analyses. In vergelijking met deze methoden bieden ATP-gebaseerde assays duidelijke voordelen in driedimensionale organoïde systemen. Door de structurele complexiteit en uitgesproken ruimtelijke heterogeniteit van organoïden worden traditionele kleurings- en beeldvormingsmethoden vaak beperkt door onvoldoende weefselpenetratie en verminderde kwantitatieve nauwkeurigheid. ATP-assays daarentegen vertrouwen op een luciferase-gemedieerde bioluminescente reactie, waardoor directe kwantificatie mogelijk is zonder de organoïdestructuur te verstoren. ATP-meting vertoont een hoge gevoeligheid en een breed dynamisch bereik. Dit maakt het mogelijk om continue biologische reacties te detecteren, variërend van vroege metabole onderdrukking tot organoïde dood, wat nauwkeurige dosis-responsanalyses over verschillende cadmiumconcentraties mogelijk maakt. ATP-niveaus weerspiegelen volledig de algemene functionele status van organoïden en presteren beter dan benaderingen die afhankelijk zijn van morfologische beoordeling of enkele moleculaire markers. Daarom is deze assay bijzonder geschikt voor high-throughput toxiciteitsscreening, met verbeterde stabiliteit en reproduceerbaarheid.

Het kernprincipe achter het gebruik van ATP-bioluminescentie om de gevoeligheid van CO's voor CD-blootstelling te evalueren, is dat vuurvlieg-luciferase de oxidatie van D-luciferine katalyseert in aanwezigheid van ATP, Mg²⁺ en O₂ om oxyluciferine te produceren en fotonen uit te zenden. De intensiteit van het uitgezonden licht is evenredig met het meetbare ATP-gehalte in het monster binnen een gedefinieerd lineair bereik. Daarom dient luminescentie als een indirecte kwantitatieve surrogaat voor cellulaire metabole activiteit of levensvatbaarheid. Organoïden zijn ingebed in een extracellulaire matrix en bezitten een meerlaagse driedimensionale structuur. Om dit te accommoderen, beschikken ATP-assayreagentia over geoptimaliseerde samenstellingen en procedures voor lysisbuffers. Deze optimalisaties verbeteren de verstoring van interne organoïde cellen, bevorderen de afgifte van ATP en stabiliseren het bioluminescente signaal¹⁵. Belangrijk is dat ATP-bioluminescentie metabole activiteit rapporteert in plaats van een exact aantal cellen. Mitochondriale remmers kunnen bijvoorbeeld de cellulaire ATP-niveaus over korte intervallen aanzienlijk verlagen, zelfs terwijl cellen levensvatbaar blijven. Omgekeerd kunnen sommige vroege vormen van celdood relatief hoge ATP-niveaus tijdelijk behouden.

Ondanks het aantonen van superieure fysiologische relevantie bij cadmium (Cd) toxiciteitsbeoordelingen, vertonen colorectale organoïde modellen verschillende praktische beperkingen. In vergelijking met traditionele tweedimensionale (2D) cellijnen is de teelt van organoïden tijdrovender en kostenintensiver. Bovendien introduceert hun afhankelijkheid van dierlijke matrices batch-tot-batch variabiliteit, wat hun nut beperkt bij grootschalige, hoogdoorlopende toxiciteitsscreening. Hoewel deze modellen zeer geschikt zijn voor het evalueren van de directe toxicologische effecten van zware metalen op het darmepitheel, kunnen ze nog niet volledig in vivo modellen vervangen voor het beoordelen van systemische toxiciteit of complexe toxicokinetische processen.

In deze studie werd menselijk colorectaal weefsel gebruikt als bronmateriaal om colorectale stamcellen te isoleren en COs in vitro vast te stellen. Organoïden werden blootgesteld aan Cd bij verschillende concentraties en voor verschillende blootstellingsduur. De luminescentie werd vervolgens gemeten met de multimode microplaatlezer in luminescentiedetectiemodus. Cellevensvatbaarheid of IC50-waarden werden berekend en gevisualiseerd met operationele software voor een specifieke microplaatlezer.

Protocol

Het experiment werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Suzhou Beroepsinstituut voor Gezondheid (Goedkeuringsnr. SWYXLL202516) en werd uitgevoerd volgens medische ethische normen. Alle deelnemers in dit onderzoek gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming.

1. Isolatie van menselijk colorectaal weefsel en vestiging van CO's

1. Transport en behoud van weefselmonsters
   1. Voor het experiment ontdooi je de basale membraanmatrix langzaam bij 4 °C en breng je het benodigde kweekmedium in evenwicht tot kamertemperatuur.
   2. Plaats onmiddellijk menselijk colorectaal weefsel dat uit klinische procedures is verkregen in voorgekoelde weefselconserveringsoplossing (2–8 °C).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het weefsel tijdens het transport volledig onder water blijft. Breng de monsters over naar het laboratorium.
2. Plaats het weefsel onder een bioveiligheidskast in een kweekschaal van 6 cm voor beoordeling. Verwijder voorzichtig zichtbaar vetweefsel en spierlagen met een scalpel en pincet, terwijl de epitheelcomponenten behouden blijven.
3. Breng het weefsel over in een schaal van 6 cm met 3 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 300 μL antibiotica. Snijd het weefsel in fragmenten van 2 mm × 5 mm.
4. Breng de weefselfragmenten over in een centrifugebuis van 50 mL.
5. Voeg 10 mL voorgekoeld PBS en 200 μL 0,5 M EDTA (eindconcentratie ~10 mM) toe aan de buis.
6. Plaats de tube op een shaker op kamertemperatuur en roer hem voorzichtig op 0,072 g gedurende 15 minuten.
7. Gebruik een pincet om het weefsel in de kweekschaal te plaatsen en onder een microscoop te bekijken. Ga door naar de volgende stap zodra de cryptestructuren zichtbaar worden of beginnen los te komen.
   OPMERKING: Wanneer cryptstructuren zichtbaar worden onder microscopische observatie na EDTA-behandeling, heeft de vertering over het algemeen een voldoende niveau bereikt voor crypte-isolatie en beginnen crypten los te komen van losgemaakte epitheelweefselfragmenten. Intacte crypten behouden doorgaans een goed gedefinieerde klier- of buismorfologie met een waarneembaar centraal lumen, terwijl overmatige vertering grote aantallen gedissocieerde enkele cellen en necrotisch puin produceert.
8. Beëindig de vertering zodra talrijke intacte cryptes zichtbaar zijn en weefselfragmenten los en doorschijnend lijken, waardoor zacht pipetteren crypten gemakkelijk kunnen vrijlaten.
   OPMERKING: Langdurige EDTA-incubatie verstoort de integriteit van de crypte, verhoogt de ophoping van cellulair puin en vermindert de levensvatbaarheid van intestinale stamcellen, waardoor de daaropvolgende efficiëntie van organoïde vorming afneemt.
9. Voeg 15 ml antibiotica-supplementeerde PBS toe om de spijsvertering van EDTA te stoppen. Meng voorzichtig.
10. Centrifugeer het monster op 300 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
11. Verwijder het supernatant.
12. Voeg 1 ml volledig celmedium toe en breng de suspensie over in een 1,5 mL microcentrifugebuis.
13. Centrifugeer de suspensie op 300 × g gedurende 3 minuten en gooi het supernatant weg.
14. Voeg 500 μL van de basalmembraanmatrix toe aan een 1,5 mL microcentrifugebuis en meng goed.
15. Minimaliseer blootstelling aan kamertemperatuur tijdens het mengen en houd de membraanmatrix van de kelder op ijs om voortijdige stolling te voorkomen.
16. Voeg 25 μL van het mengsel druppelwijs toe aan elke put van de 24-put plaat om een druppel te vormen.
17. Keer de 24-well-plaat om en incubeer deze bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 20 minuten.
18. Voeg 600 μL CO-kweekmedium toe aan elke put.
19. Verkrijg colorectale organoïde kweekmedium en dissociatiereagentia uit commerciële bronnen en gebruik deze strikt volgens de instructies van de fabrikant.
20. Om het volledige celkweekmedium te bereiden, vul 500 mL DMEM basaal medium aan met 50 mL fotaal rundserum (FBS) en 5 mL penicilline-streptomycine. Meng de oplossing grondig door een zachte inversie.

2. Gevoeligheidstest van CO's die aan Cd zijn blootgesteld

1. Plating en cultiveren van CO's in 96-wellplaten
   1. Verwijder het kweekmedium uit elke put en voeg 500 μL organoïde dissociatieoplossing toe. Pipetteer voorzichtig op en neer om de basale membraanmatrix te verspreiden.
   2. Plaats de behandelde plaat in een incubator van 37 °C, 5% CO₂ voor de vertering, met een initiële verteringstijd van 10 minuten.
   3. Verzamel de verteringsoplossing uit elke put van de 24-put plaat in een 15 mL centrifugebuis en voeg 10 mL compleet celkweekmedium toe.
   4. Centrifugeer op 300 × g gedurende 3 minuten om het organoïde te verzamelen en het supernatant weg te gooien.
   5. Voeg 1 ml compleet celkweekmedium toe, meng grondig door pipetten, en breng de suspensie over in een 1,5 mL microcentrifugebuis.
   6. Centrifugeer op 300 × g gedurende 3 minuten, en gooi daarna het supernatant weg.
   7. Voeg 100 μL van de basale membraanmatrix toe en meng grondig door te pipetten.
   8. Dissocieer de organoïden en schat het aantal afzonderlijke cellen onder een microscoop voordat je ongeveer 3.000–5.000 individuele cellen per put plant.
   9. Houd een relatief consistente zaaidichtheid in alle experimentele groepen om reproduceerbare organoïdegroei en experimentele uitkomsten te waarborgen.
   10. Pas het zaaibereik aan op basis van microscopische evaluatie na organoïde dissociatie en op eerder gerapporteerde aandoeningen die vaak worden gebruikt in organoïde kweekstudies.
   11. Voeg 6 μL van het mengsel toe aan het midden van elke put van een 96-put plaat. Gebruik in totaal 30 putten, met drie technische replica's.
   12. Draai de plaat om en breng hem uit bij 37 °C in een 5% CO₂-broedmachine gedurende 15 minuten.
   13. Voeg 100 μL organoïde kweekmedium toe aan elke put van de 96-putplaat.
   14. Start de cadmiumbehandeling precies 7 dagen na het zaaien.
       OPMERKING: Deze kweekperiode van 7 dagen stelt individuele cellen in staat zich volledig te ontwikkelen tot structureel intacte CO's.
2. CD-concentratieverdunning
   1. Los 3,67 mg cadmiumchloridepoeder op in 2 mL steriel ultrazuiver water om een 10 mM voorraadoplossing te bereiden met een eindvolume van 2 mL.
   2. Steriliseer de 2 mL van 10 mM cadmiumoplossing door deze door een 0,22 μm filter te laten gaan.
   3. Aliquot de gesteriliseerde cadmiumoplossing in 1,5 mL centrifugebuizen en bewaar deze bij 4 °C, beschermd tegen licht.
   4. Draag gedurende het hele experiment geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder een labjas, beschermende handschoenen en veiligheidsbril.
   5. Voer alle gerelateerde handelingen uit in een chemische dampkap om blootstellingsrisico's te minimaliseren.
   6. Classificeer en beheer al het afval dat CD bevat, inclusief met cadmium aangevuld kweekmedium, pipetpunten, centrifugebuizen en kweekschotels, als gevaarlijk chemisch afval.
   7. Gooi deze materialen weg in aangewezen containers voor het verzamelen van zware metalen vloeistof of vast afval.
   8. Voer al het afval strikt af volgens de institutionele richtlijnen en lokale milieuvoorschriften.
   9. Behandel CD-afval nooit als algemeen laboratoriumafval of giet het in de gootsteen.
   10. Label het deksel van een 24-wells plaat als 4, 3, 2, 1 en 0.
       OPMERKING: Behandel de organoïden met Cd bij eindconcentraties van 40 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM en 0 μM. De verdunning van de cadmiumvoorraadoplossing werd berekend met behulp van de standaardformule:
               C₁ V₁ = C₂ V₂
3. Om 4 mL van de werkconcentratie van 20 μM te bereiden, voeg 8 μL van de 10 mM voorraadoplossing toe aan 3992 μL volledig kweekmedium. Meng de oplossing grondig om een gelijkmatige verdeling te garanderen.
   1. Voeg 1,4 mL kweekmedium toe aan de goed gelabelde 4 en voeg 700 μL kweekmedium toe aan elk van de overgebleven putten.
   2. Verwijder 5,6 μL kweekmedium uit de goed gelabelde 4 en voeg 5,6 μL cadmiumoplossing toe. Meng grondig.
   3. Breng 700 μL van de oplossing over van de put met het label '4' naar de put met het label '3' en meng grondig.
   4. Herhaal het overdrachts- en mengproces van elke put naar de volgende lager genummerde put (van '3' naar '2', '2' naar '1', en '1' tot '0'), en meng grondig bij elke stap.
      OPMERKING: Voer geen bewerking uit in de put die 0 is gelabeld.
   5. Verwijder de 96-well-plaat uit de broedmachine en gooi het bestaande kweekmedium weg.
   6. Label het deksel van de 96-wellplaat van links naar rechts als 40 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM en 0 μM.
   7. Voeg 100 μL cadmiumhoudend kweekmedium toe aan elk overeenkomstig gelabeld put.
   8. Plaats het bord in de broedmachine.

3. Toevoeging van het Luminescente Levensvatbaarheidsreagens

1. Verwijder het luminescente levensvatbaarheidsreagens uit de −20 °C vriezer en laat het ontdooien bij kamertemperatuur. Voeg het luminescente levensvatbaarheidsreagens toe in een volumeverhouding van 1:1.
2. Voeg 2,5 mL luminescente levensvatbaarheidsreagens toe aan een wegwerpreservoir.
3. Voeg 2,5 ml colorectal organoïde kweekmedium toe en meng grondig door te pipetten.
4. Gebruik een afvalaspiratiesysteem om het organoïde kweekmedium uit elke put van de 96-put plaat te verwijderen. Vermijd het aspireren van de basale membraanmatrix uit de putten.
5. Breng 200 μL van de oplossing uit het wegwerpreagensreservoir over in elke put van de 96-put plaat met CO's, en meng grondig door krachtig pipetteren. Vermijd het introduceren van luchtbellen tijdens het pipetten.
6. Broeuw het bord 25 minuten op kamertemperatuur. Incubeer op kamertemperatuur, beschermd tegen licht.

4. Meting van luminescente levensvatbaarheidsreagens

1. Open de operationele software voor de specifieke microplaatlezer (Aanvullende Figuur 1A).
2. Klik op Nu lezen (aanvullende figuur 1B).
3. Klik op Nieuw (Aanvullende Figuur 1B).
4. Klik op Lees (aanvullende figuur 1C).
5. Selecteer luminescentie (Aanvullende Figuur 1D).
6. Selecteer luminescentievezel (Aanvullende Figuur 1D).
7. Klik op OK (Aanvullende Figuur 1D).
8. Selecteer Volledige plaat (Aanvullende Figuur 1E).
9. Klik op 'Alles verwijderen' (aanvullende figuur 1F).
10. Selecteer de overeenkomstige posities op de doelplaat 96-put, voor in totaal 15 putten (Aanvullende Figuur 1G).
11. Klik op OK (Aanvullende Figuur 1G).
12. Plaats de 96-put plaat in het instrument (Aanvullende figuur 1H).
13. Selecteer gebruik deksel (Aanvullende Figuur 1I).
14. Klik op OK om de meting te starten (Aanvullende Figuur 1I).
15. Na voltooiing van de meting klik je op Exporteren om de gegevens naar Excel te exporteren (Aanvullende Figuur 1J).

5. Gegevensverwerking en analyse

1. Open software voor statistische data-analyse die niet-lineaire regressie kan uitvoeren. (Aanvullende figuur 2A).
2. Selecteer een XY-datatabel (Aanvullende Figuur 2A).
3. Stel X in op getallen (aanvullende figuur 2A).
4. Stel Y in om replicatieve waarden in naast elkaar te voeren en voer 3 replicaties in (Aanvullende Figuur 2A).
5. Hier komt de data in (Aanvullende Figuur 2B).
6. Klik op analyses (Aanvullende Figuur 2C).
7. Klik op XY-analyses (Aanvullende Figuur 2D).
8. Klik op Niet-lineaire regressie (curve fit) (Aanvullende Figuur 2D).
9. Klik OK. (Aanvullende Figuur 2D).
10. Selecteer dosis-respons – Remming (Aanvullende Figuur 2E).
11. Selecteer log(inhibitor) versus genormaliseerde respons – Variabele helling (Aanvullende Figuur 2E).
12. Klik op OK om de analyse uit te voeren (Aanvullende Figuur 2E).
13. Klik op Bestand (Aanvullende Figuur 2F).
14. Klik op Exporteren (Aanvullende Figuur 2F).
15. Klik op OK (Aanvullende Figuur 2G).

Resultaten

Oprichting van menselijke CO's
We hebben met succes colorectale cryptstructuren geïsoleerd uit weefselmonsters, en de typische cryptmorfologie werd duidelijk waargenomen onder zowel lage als hoge vergroting microscopie. Tijdens de in-vitrokweek breidden de geïsoleerde crypten zich geleidelijk uit en vertoonden een geordend proces van morfologische rijping (Figuur 1A,B). Op dag 3 en 6 van de kweek waren structureel intacte colorectale organoïden gevormd, die overwegend bolvormige of vroege knopachtige structuren vertoonden (Figuur 1C,D).

Gevoeligheid van CO's voor CD-blootstelling
COs werden in 96-wellplaten gezaaid en nog eens 5 dagen gekweekt, gevolgd door behandeling met cadmium bij concentraties van 0, 5, 10, 20 en 40 μM. Na 72 uur blootstelling werd een ATP-gebaseerde luminescentietest uitgevoerd om relatieve luminescentie-eenheden (RLU) te meten, en werden de gegevens geanalyseerd en gevisualiseerd. De resultaten toonden een significante dosisafhankelijke afname van de levensvatbaarheid van organoïden aan bij toenemende cadmiumconcentraties (Figuur 2A). COs die werden blootgesteld aan 10 μM, 20 μM en 40 μM cadmium vertoonden duidelijk verlaagde RLU-waarden (Figuur 2B). We observeerden geen significante toxiciteit in colorectale organoïden blootgesteld aan 5 μM Cd. In overeenstemming met de levensvatbaarheidsgegevens toonde morfologische analyse uitgesproken structurele veranderingen aan in cadmiumbehandelde colorectale organoïden, waaronder verminderde organoïdegrootte, ernstige verstoring van de epitheelarchitectuur en progressieve structurele fragmentatie (Figuur 2C). Deze bevindingen geven aan dat colorectale organoïden zeer gevoelig zijn voor door cadmium veroorzaakte cytotoxiciteit.

Figuur 1: Isolatie van menselijke colorectale crypte en vestiging van colorectale organoïde culturen. (A) Representatief beeld van geïsoleerde menselijke colorectale crypten. (10×). (B) Hoge vergroting van een enkele crypte (20×). (C) Representatief beeld van CO's na 3 dagen in kweek (4×). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Cd-geïnduceerde cytotoxische en morfologische veranderingen bij COs. (A) Relatieve dosis-responscurve van CO's die worden blootgesteld aan variërende concentraties Cd. De x-as geeft de Cd-concentraties weer en de y-as geeft de levensvatbaarheid van de organoïden aan. (B) Relatieve RLU-waarden van CO's na behandeling met variërende concentraties Cd. De X-as geeft de Cd-concentraties weer en de Y-as geeft de relatieve RLU-waarden aan. Eenrichtings-ANOVA *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. (C) Representatieve brightfieldbeelden van onbehandelde (0 μM) en Cd-behandelde CO's op 5 μM, 10 μM, 20μM, 40μM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 1: Een gedetailleerde workflow van 16 stappen voor RLU-detectie waarbij gebruik wordt gemaakt van de operationele software voor een specifieke microplaatlezer. (A) Software-icoon. (B) Software-opstartinterface. (C) Instellingenmenu. (D) Assay-selectie-interface. (E) Configuratiemenu voor plaatindeling. (F) Standaard plaatindeling. (G) Putposities configureren volgens de indeling van de experimentele plaat. (H) De microplaat wordt geladen. (I) Het instrument start RLU-meting. (J) Data-export. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: Volgende data-export, gegevensverwerking en statistische analyse worden uitgevoerd in software voor statistische data-analyse. (A) Startscherm. (B) Gegevensinvoertabel. (C) Analysedialoog. (D) Menu met analyseparameters. (E) Configuratiemenu voor niet-lineaire regressie. (F) Bestandsoptiesmenu. (G) Gegevensexportdialoog. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Deze studie stelt een gestandaardiseerd protocol vast voor cadmiumblootstelling en ATP-levensvatbaarheidsassays met behulp van CO's om de impact van cadmium op de levensvatbaarheid van organoïden te evalueren. Dit protocol optimaliseert specifiek de organoïde-dissociatie en 96-well-platingstappen om de experimentele reproduceerbaarheid en de stabiliteit van latere ATP-assay-uitlezingen te verbeteren. Hoewel het huidige experimentele protocol zich primair richt op het opzetten van een 3D-colorectal kanker-organoïdemodel voor de beoordeling van CD-toxiciteit, heeft uitgebreid onderzoek aangetoond dat traditionele 2D-celculturen en 3D-organoïdemodellen significant verschillen in geneesmiddelresponsen, cel-celinteracties, weefselarchitectuur en toxicologische profielen. In vergelijking met 2D-monolagen recapituleren organoïden nauwkeuriger de ruimtelijke architectuur, cellulaire heterogeniteit en in vivo-achtige micro-omgeving van tumoren, wat een superieure fysiologische relevantie biedt. Door het ontbreken van complexe interacties tussen cellen en cellen en extracellulaire matrix (ECM), kan de respons van 2D-culturen op blootstelling aan zware metalen er niet in slagen echte in vivo toxicologische processen nauwkeurig vast te leggen¹⁶. Omgekeerd simuleert het CO-model dat in deze studie is vastgesteld effectief de driedimensionale groeidynamiek van tumorweefsels, wat een fysiologisch zeer relevant platform biedt voor het evalueren van door CD veroorzaakte toxiciteit.

Tijdens het passeren van organoïden werd de dissociatietijd strikt gehandhaafd op ongeveer 10 minuten. Deze optimalisatie voorkomt onvolledige dissociatie, wat leidt tot te grote celaggregaten, terwijl overdissociatie wordt vermeden, wat resulteert in een buitensporig aantal afzonderlijke cellen. Door de mate van dissociatie nauwkeurig te beheersen, bereikten we relatief uniforme organoïdestructuren, wat de consistentie van latere farmacologische behandelingen en ATP-levensvatbaarheidstests verbeterde.

We gebruikten een high-throughput 96-put kweeksysteem en standaardiseerden het basale membraanmatrix platingvolume tot 6 μL per put. Deze standaardisatie minimaliseert variabiliteit tussen putten door consistente organoïdedichtheid en groeikenmerken over alle putten te waarborgen, wat uiteindelijk de experimentele reproduceerbaarheid en gegevensvergelijkbaarheid verbetert. Door ATP-luminescentietests te koppelen aan dosis-responscurveanalyses met behulp van statistische data-analysesoftware, bereikten we een robuuste kwantitatieve beoordeling van veranderingen in de levensvatbaarheid van organoïden na CD-blootstelling. Gezamenlijk stelt deze studie een zeer reproduceerbaar experimenteel protocol vast voor de toepassing van organoïdemodellen in milieutoxicologie en blootstelling aan zware metalen.

Tijdens de COs-cultuur is grondig mengen van de cryptpellet met de basalmembraanmatrix een cruciale stap om een goede COS-vorming en stabiele groei te waarborgen. Het aandeel van de basalmmembraanmatrix moet boven de 70% blijven (het volume van de basalmmembraanmatrix > 70%). De aanbevolen volumes van de basementmembraanmatrix zijn 6 μL per put voor 96-wellplaten, 20 μL per put voor 48-well platen, en 25 μL per put voor 24-well platen. Na matrixpolymerisatie worden de volgende volumes aan de putten toegevoegd: 100 μL per put voor 96-put platen, 300 μL per put voor 48-well platen, en 500 μL per put voor 24-well platen. Er moet voorzichtig worden geacht om directe pipettie van het medium op de koepels van de basale membraanmatrix te vermijden, omdat dit de driedimensionale architectuur kan verstoren. Om fenotypische en genetische stabiliteit te behouden, beperkte deze studie het gebruik van colorectale organoïden tot maximaal 4 passages.

Wanneer crypts of CO's een diameter van ongeveer 600 μm bereiken of verdonkering en groeistop vertonen, moet passaging snel worden uitgevoerd om latere gevoeligheidsanalyses mogelijk te maken. Tijdens enzymatische dissociatie van CO's moet de vertering onder een microscoop worden gemonitord. Als COs niet voldoende gedissocieerd zijn in kleine celclusters of enkele cellen, kan de verteringstijd geleidelijk worden verlengd op basis van de grootte van de organoïde en dissociatiestatus. Langdurige vertering in één stap moet worden vermeden om het risico op oververtering en verlies van cellenlevensvatbaarheid te minimaliseren.

Bereken de relatieve levensvatbaarheid van elke put met behulp van de volgende vergelijking en gebruik het gemiddelde percentage van replicatieve putten als responswaarde voor elke concentratie

 

De ATP-bioluminescentietest is gebaseerd op vuurvlieg-luciferase-gekatalyseerde oxidatie van D-luciferine, wat resulteert in fotonenemissie. Vanwege de hoge gevoeligheid, compatibiliteit met plaatgebaseerde hoge-doorvoerformaten en de beschikbaarheid van gestandaardiseerde commerciële kits, is deze methode veelvuldig toegepast voor voorlopige toxiciteitsscreening in organoïde modellen¹⁷.

Verschillende verstorende factoren moeten worden meegewogen. Bepaalde chemicaliën kunnen de luciferase-enzymatische reactie direct remmen door chemische interferentie of enzymatische onderdrukking, wat leidt tot signaalonderdrukking. Achtergrondluminescentie van de driedimensionale extracellulaire matrix, heterogeniteit in organoïde grootte en dichtheid, en onvolledige lysis kunnen aanzienlijke variabiliteit tussen de put en tussen de batches introduceren. ATP-gebaseerde luminescentie alleen kan celsterftemodaliteiten niet nauwkeurig onderscheiden of onderliggende toxicologische mechanismen verduidelijken¹⁸.

Om de methodologische betrouwbaarheid te verbeteren, worden systematische kwaliteitscontrolemaatregelen aanbevolen. gebruik van door de fabrikant aanbevolen of eerder gevalideerde lysisbuffers, en verlengde lysistijd, mechanische dissociatie of vries-ontdooicycli wanneer nodig om de cellyse-efficiëntie binnen de matrix te verbeteren. Ten tweede voer ATP spike-in herstelexperimenten uit tijdens assay-optimalisatie om potentiële directe inhibitie van de luminescente reactie door de testverbindingen of de lysisomgeving te evalueren. Ten derde, bevestig het lineaire detectiebereik met behulp van een ATP-standaardcurve en controleer strikt de timing tussen toevoeging van reagentia, incubatie en plaatafmeting om technische variabiliteit te minimaliseren. Tot slot moet blanke, voertuig- en negatieve controles in elke assay worden opgenomen en voldoende technische replica's worden opgenomen om randeffecten en batchgerelateerde variatie te beoordelen en te corrigeren. Onlangs zijn er verschillende organoïde-geoptimaliseerde levensvatbaarheidsassays ontwikkeld met verbeterde lysischemie en verbeterde signaalstabiliteit, en deze formuleringen hebben over het algemeen superieure prestaties getoond in driedimensionale toxiciteitsassays¹⁹. Samenvattend gebruikte deze studie menselijke CO's als een in vitro model van milieutoxicologie van zware metalen en stelde een hoogdoorvoerbare, gevoelige ATP-bioluminescentie-gebaseerde assay op om de gevoeligheid van organoïden voor CD-blootstelling te evalueren. Dit werk biedt een praktische experimentele referentie en methodologische richtlijnen voor toxiciteitsbeoordeling in organoïde-gebaseerde onderzoekssystemen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
100 μm cell strainer	BIOLOGIX	15-1100
15 mL centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011150
1mL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808633
200 μL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808214
24-well plates	Corning Incorporated	3524
50 mL centrifuge tubes	CLUXCELL	321050
96-well plates	Corning Incorporated	220400
BioTek Cytation 5	BioTek Co., LTD	16280004	De operationele software voor specifieke microplaatlezer.
Cadmium chloride,10g	Sigma	202908-10G
Cell Counting-Lite 3D Luminescent Cell Viability Assay	Vazyme	DD1102-01/02/03	Luminescente levensvatbaarheidsreagens in een volumeverhouding van 1:1.
Human Colonic organoid Kit Plus(Expansion)	Mogenel Biotechnology	MA-0817HOO1HLP
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	thermo fisher	6125552
Forceps	Beyotime	FS019
Ice box	Beyotime	FBX078
Low-temperature high-speed centrifuge	Anhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTD	KDC-40
Matrigel	Mogenel Biotechnology	82755	De basement membrane matrix
Organoid Dissociation Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L01L	Organoid Dissociation Solution
Penicillin-Streptomycin	Beyotime	C0222
Phosphate-buffered saline (1XPBS)	Fdbio Science Biotech Co.,Ltd	FD7032
Pipettes	RUINING	Pipet-Lite XLS
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		De operationele software voor specifieke microplaatlezer.
Scissors	Beyotime	FS001
Tissue Digestion Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L06L/MB-0818L06S