Methodenartikel

Isolatie en therapeutische toepassing van extracellulaire blaasjes afkomstig van zelfgeassembleerde mesenchymale stamcelaggregaten

DOI:

10.3791/70534

⸱

24 april 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of Stomatology, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 4The second Department of Surgery, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 5Military Medical Innovation Center, The Fourth Military Medical University, 6School of Basic Medicine, Shaanxi University of Chinese Medicine, 7Department of Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of The Fourth Military Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de efficiënte isolatie van grote extracellulaire blaasjes (LEV's) uit zelfgeassembleerde stamcelaggregaten en hun therapeutische toepassing voor mandibulaire botregeneratie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn essentiële mediatoren van intercellulaire communicatie en veelbelovende celvrije middelen voor regeneratieve geneeskunde. Onder EV-subpopulaties zijn grote extracellulaire blaasjes (LEV's) bijzonder geschikt voor weefselherstel vanwege hun verrijkte pro-regeneratieve lading. Gestandaardiseerde en reproduceerbare methoden om functionele tandheelkundige stamcel-afgeleide LEV's te genereren voor downstream karakterisering en therapeutische evaluatie blijven echter beperkt. Met gebruik van het uitzonderlijke osteogene potentieel van stamcellen uit de apicale papilla (SCAP's) ontwikkelden we een 3D-kweekmodel onder omstandigheden met lage adhesie om zelfgeassembleerde SCAP-aggregaten te induceren. Dit model bootst fysiologische mesenchymale condensatie na, wat de interacties tussen cel en cel aanzienlijk versterkt en de LEV-secretie verhoogt. Belangrijke kweekparameters en verwerkingsnotities worden verstrekt om de consistentie van de aggregate te verbeteren en de LEV-output te maximaliseren, terwijl de levensvatbaarheid van de cel behouden blijft. Hier presenteren we een gestandaardiseerd protocol voor de efficiënte productie van functionele SCAP-afgeleide LEV's, met 3D-aggregategeneratie, isolatie via differentiële centrifugatie, nanoparticle tracking analysis (NTA)-gebaseerde deeltjesgrootteverdeling en concentratieanalyse, en therapeutische toediening met een thermisch gekruiste hydrogel voor het herstel van mandibulaire botdefecten. Deze aanpak stroomlijnt de productie van LEV voor downstream mechanistische studies en preklinische evaluatie bij craniofaciale regeneratie. Deze geoptimaliseerde workflow zorgt voor reproduceerbare voorbereiding van bioactieve LEV's met consistente opbrengsten en verrijkte pro-osteogene lading, wat fundamenteel onderzoek faciliteert en de klinische translatie van EV-gemedieerde craniofaciale reconstructie versnelt. In representatieve toepassingen bieden hydrogel-belaste LEV's een gelokaliseerd depot op defectlocaties en vergemakkelijken ze gemakkelijke hantering tijdens implantatie. Gezamenlijk biedt deze methode een schaalbaar platform om SCAP-afgeleide LEV's op te bereiden en benadrukt het belangrijke overwegingen voor gestandaardiseerde rapportage en translationele studieontwerp. Deze aanpak ondersteunt bredere adoptie in craniofaciale EV-laboratoria.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn membraangebonden nanodeeltjes die door cellen worden vrijgegeven en intercellulaire communicatie bemiddelen via de overdracht van bioactieve ladingen zoals eiwitten, miRNA's en lipiden 1,2,3. Onder EV-subpopulaties zijn grote extracellulaire vesikels (LEV's) kenmerkend voor hun directe vrijgave uit het celmembraan en de inherente verrijking van pro-regeneratieve moleculen, waardoor ze goed geschikt zijn voor weefselherstel en regeneratie(4,5). In de regeneratieve geneeskunde worden EV's afkomstig van mesenchymale stamcellen (MSC's) steeds vaker erkend als een levensvatbaar celvrij alternatief voor heelceltherapie 6,7,8. Ze herhalen de paracriene regeneratieve effecten van ouderlijke MSC's, terwijl beperkingen van directe celtransplantatie, zoals lage engraftmentefficiëntie, immunogeniciteit en batchvariabiliteit 7,8,9,10, worden vermeden. Onder MSC-bronnen vertonen stamcellen van de apicale papilla (SCAP's) een superieur osteogene en odontogene differentiatiepotentiaal 11,12,13, waardoor SCAP-afgeleide EV's bijzonder aantrekkelijk zijn voor herstel van orofaciaal bot en tandweefsel 8.

Opmerkelijk is dat de biogenese en functionaliteit van EV's diepgaand worden beïnvloed door de cellulaire micro-omgeving14,15. Conventionele tweedimensionale (2D) monolaagculturen wijken aanzienlijk af van de native tissue context16,17, wat vaak EV's oplevert met een verminderde regeneratieve capaciteit18. Daarentegen repliceren driedimensionale (3D) zelfgeassembleerde MSC-aggregaten belangrijke aspecten van fysiologische mesenchymale condensatie, een ontwikkelingsfase die wordt gekenmerkt door hoge celdichtheid, intensief cel-cel contact en verrijkte extracellulaire matrix (ECM), die structurele ondersteuning biedt en biochemische en mechanische signalen levert die celadhesie, migratie en lotsbeslissingen reguleren 19,20,21. Deze biomimetische 3D-microomgeving verbetert niet alleen intercellulaire communicatie en paracriene signalering22,23, maar bevordert ook de afscheiding van EV's met een hogere opbrengst en verbeterde bioactieve ladingprofielen 24,25,26. Het gebruik van 3D-zelfgeassembleerde MSC-aggregaten blijkt dus een veelbelovende strategie te zijn om functioneel krachtige EV's te verkrijgen voor regeneratieve toepassingen18.

Ondanks de duidelijke voordelen van op aggregate gebaseerde EV's, blijven gestandaardiseerde protocollen voor hun isolatie en karakterisering van 3D-systemen onderontwikkeld. Huidige EV-isolatiemethodologieën, zoals differentiële centrifugatie, zijn goed gevestigd en bieden een schaalbaar kader voor EV-productie27. Evenzo zijn methoden gerapporteerd om MSC-aggregaten te genereren, vaak gebaseerd op vitamine C-geïnduceerde cellulaire curling en aggregatie uit 2D-gekweekte cellen28. De ECM-architectuur binnen deze door vitamine C geïnduceerde aggregaten kan echter nog steeds verschillen van de ruimtelijk georganiseerde, condensatie-achtige microomgeving van inheemse mesenchymale weefsels. Daarentegen faciliteert steigervrije zelfassemblage onder omstandigheden met lage adhesie de vorming van compacte, bolvormige aggregaten die de belangrijkste kenmerken van mesenchymale condensatiebenaderen 19,29. Momenteel ontbreekt een systematische en reproduceerbare workflow voor het isoleren en toepassen van EV's uit zulke laag-adhesie-geïnduceerde 3D SCAP-aggregaten. Vanuit praktisch oogpunt valt de LEV-productie uit conventionele 2D SCAP-culturen doorgaans in het ~10 tot11 deeltjes/mL bereik volgens nanoparticle tracking analysis (NTA), en 3D-aggregatie met lage adhesie zal naar verwachting de LEV-output meerdere keren verhogen terwijl reproduceerbaarheid behouden blijft voor downstream toepassingen. Om deze kloof te dichten, beschrijven we hierin een uitgebreid protocol dat gebruikmaakt van de inherente osteogene/odontogene functionaliteit van SCAP's en de MSC-microomgeving optimaliseert via 3D-aggregatie met lage adhesie. Dit protocol maakt de betrouwbare productie van hoogwaardige LEV's mogelijk en biedt een gestandaardiseerd hulpmiddel om celvrije regeneratieve therapieën in de craniofaciale geneeskunde te bevorderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Commissie voor Dierenverzorging en Gebruik van de Vierde Militaire Medische Universiteit en werden uitgevoerd in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen. Het verzamelen en gebruiken van menselijke monsters werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Vierde Militaire Medische Universiteit (goedkeuring nr. IRB-REV-2022187). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle donoren voorafgaand aan de monsterafname; Voor donateurs die minderjarig waren of anderszins geen toestemming konden geven, werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen van hun wettelijke voogden. Alle reagentia waren sterielgefilterd en celkweekprocedures werden uitgevoerd in een bioveiligheidskast om de steriliteit te behouden (zie Materiaaltabel). Behandel alle materialen van menselijke basis (tanden, weefsels, primaire cellen, geconditioneerde media en EV-preparaten) als potentieel besmettelijk. Voer alle procedures uit waarbij menselijke monsters betrokken zijn in een gecertificeerde bioveiligheidskast met passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder een labjas, handschoenen en oogbescherming. Voor bioveiligheid en afvalverwerking volgt u de institutionele BSL-2 richtlijnen: Behandel alle door mensen afgeleide materialen en besmette wegwerpmaterialen als BSL-2 biohazard afval; Decontaminateer oppervlakken/apparatuur met een door de instelling goedgekeurd desinfectiemiddel na gebruik. Verzamel vloeibaar biohazard afval in gelabelde containers en deactiveer het met goedgekeurde methoden voordat het wordt afgevoerd. Gooi scherpe stukken onmiddellijk weg in goedgekeurde containers (geen herkap). Behandel dierlijk weefsel/karkassen en anesthesie/chemische residuen als gereguleerd biohazard/chemisch afval en voer deze af via institutionele diensten volgens de toepasselijke regelgeving.

1. Isolatie en cultuur van menselijke SCAP's

OPMERKING: P/S is een bioactief antibioticummengsel en kan huid- en oogirritatie of allergische reacties veroorzaken. Handvat in een BSL-2 bioveiligheidskast bij het openen; Draag handschoenen en oogbescherming; vermijd de productie van aerosolen; en afval afvoeren in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor chemisch afval. Collagenase type I (oplossing) is een bioactief enzym en kan huid- en oogirritatie of allergische reacties veroorzaken. Handvat in een BSL-2 bioveiligheidskast; Draag handschoenen en oogbescherming; vermijd spatten en het ontstaan van aerosolen tijdens pipetten; en decontaminateer lekkages snel volgens institutionele procedures. Bescherm collagenase type I tegen licht tijdens opslag en gebruik (zie de Materiaaltabel).

  1. Verzamel derde kiezen met onrijpe apices van gezonde donoren (16–21 jaar) en spoel grondig af met fosfaatgevulde zoutoplossing (PBS) met 1% penicilline/streptomycine (P/S) (zie Materiaaltabel).
  2. Snijd het apikale papillaweefsel van de worteltop met steriele oogpincetten en schaar, en snijd het vervolgens in kleine fragmenten (<1 mm3).
  3. Breng alle weefselfragmenten over in een centrifugebuis van 15 mL. Verteer de fragmenten met 2 mg/mL collagenase type I bij 37 °C gedurende 1 uur, met zacht schudden elke 15 minuten.
  4. Stop de vertering door een gelijk volume van volledig α-minimum essentieel medium (α-MEM) toe te voegen (zie Tabel van Materiaal).
    OPMERKING: De verteringstijd van collagenase type I is niet vast en hangt af van de verteringsstatus van het weefsel. Houd de spijsvertering nauwlettend in de gaten wanneer weefsels half-geërodeerd raken door middel toe te voegen. Oververtering kan de levensvatbaarheid van cellen aantasten.
  5. Centrifugeer de celsuspensie op 100 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, verwijder het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in 2 mL volledige α-MEM.
  6. Zaad de verteerde weefselsuspensie uit in een 10 cm petrischaal en voeg 8 ml complete α-MEM toe aan een eindvolume van 10 ml per schaal.
  7. Kweek SCAP's bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂.
    OPMERKING: Monitor de kweken continu, cellen migreren meestal uit weefselfragmenten en hechten zich binnen 3–7 dagen radiaal aan de schaal. Als de levensvatbaarheid van het weefsel slecht is of er binnen 5 dagen geen celmigratie wordt waargenomen, schakel dan over op volledige α-MEM aangevuld met 20% serum.
  8. Voor celdoorgang werden cellen gewassen met 5 mL PBS om restmateriaal te verwijderen zodra ze 80–90% samenvloeiing bereikten. Vervolgens werden ze geïncubeerd met 2 mL van 0,25% trypsins-1 mM EDTA bij 37 °C gedurende 2 minuten (zie Materiaaltabel).
    OPMERKING: Trypsine–EDTA is een irriterend middel en kan huid/ogen beschadigen. Behandel met handschoenen en oogbescherming, voorkom spetters en aerosolvorming, en spoel direct met voldoende water als er contact is. Verwijder vloeibaar afval met trypsine volgens de richtlijnen van de instelling.
  9. Wanneer cellen onder een microscoop afgerond raken met verstoorde intercellulaire verbindingen, haal je de cellen voorzichtig los van de schaal zonder overmatige structurele schade. Neutraliseer trypsine door 4 mL volledige α-MEM toe te voegen.
  10. Verzamel de cellen door zacht, herhaald pipetteren in een verse 15 mL centrifugebuis. Na centrifugatie bij 100 × g gedurende 5 minuten, gooi je het supernatant weg en suspendeer je de celpellet opnieuw in volledige α-MEM. Zaai de resuspendeerde cellen in verse kweekschalen of putten. Vervang het medium elke twee dagen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat SCAP's die voor aggregate culture worden gebruikt binnen passage 5 vallen. Stamheid en aggregatiecapaciteit nemen af bij een toename van doorgangen30,31, wat de aggregatie-efficiëntie en functionele prestaties kan verminderen.

2. Zelfassemblage van SCAP-aggregaten

  1. Oogst 3–5 SCAP's door trypsinisatie, centrifugeer op 100 × g gedurende 5 minuten, en suspenseer opnieuw in α-MEM aangevuld met 10% EV-uitgeputte fotale fovine serum (FBS) en 1% P/S (zie Materiaaltabel).
    OPMERKING: Bereid EV-uitgeputte FBS voor door FBS te centrifugeren bij 150.000 × g bij 4 °C 's nachts om EV's en andere onzuiverhedente verwijderen.
  2. Tel cellen met een hemocytometer en zaad 1 × 10 à5 cellen per put in ultra-lage hechting 24-wellplaten. Stel het medium volume in op 500 μL per put om een ophangingstoestand te behouden.
  3. Incubeer de platen bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 72 uur en vervang het kweekmedium elke 48 uur.
  4. Monitor de vorming van aggregaten dagelijks onder een omgekeerde optische microscoop. Verzamel EV's wanneer aggregaten een diameter van 200–400 μm bereiken en een compacte, gladde structuur vertonen.
    OPMERKING: Definieer één productiebatch als LEV's geïsoleerd uit het gepoolde geconditioneerde medium, verzameld uit SCAP-aggregaten die op dezelfde dag uit dezelfde celpassage zijn gezaaid en onder identieke kweekomstandigheden binnen één verzamelperiode (72 uur) zijn gehouden. Verwerk elke batch onafhankelijk door middel van centrifugatie. Vervang het kweekmedium na 48 uur na het zaaien en vul het aan met dezelfde hoeveelheid verse medium. Voor LEV-productie verzamel je geconditioneerd medium na 48 uur en opnieuw na 72 uur na het zaaien, en voeg het geoogste medium (0–48 uur en 48–72 uur fracties) samen als één batch. Houd het geconcentreerde medium op 4 °C en verwerk het voor LEV-isolatie.

3. Isolatie en karakterisering van EV's uit SCAP-aggregaten

  1. Differentiële centrifugatie voor isolatie van grote LEV's
    1. Verzamel het kweekmedium met SCAP-aggregaten in 15 mL centrifugebuizen.
    2. Centrifugeer op 800 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C om intacte aggregaten en grootcelresten te verwijderen.
    3. Breng het supernatant over in nieuwe 15 mL buizen en centrifugeer op 2.500 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C om resterende bloedplaatjes en kleine celfragmenten te elimineren.
    4. Breng het supernatant voorzichtig over in steriele 1,5 mL conische buizen en centrifugeer op 16.800 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C naar pellet-LEV's.
      OPMERKING: Gebruik 1,5 mL conische buizen om het rendement van de LEV's te verbeteren.
    5. Gooi het supernatant weg, suspendeer de pellet opnieuw in 1 mL steriele PBS, en centrifugeer opnieuw op 16.800 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C met een vaste hoek rotor (compatibel met een standaard benchtop-centrifuge) om de LEV's te pelleten.
    6. Stel de vertraging/rem in op een "langzame" of "laag" stand (meestal remniveau 1 of 2) om te voorkomen dat de LEV-pellet opnieuw ophangt tijdens de laatste vertragingsfase.
    7. Gooi het supernatant weg en suspendeer de laatste LEV-pellet opnieuw in 50 μL steriele PBS. Gebruik de suspensie onmiddellijk (binnen 24 uur) of bewaar het bij 4 °C. Vermijd invriezen om verlies van bioactiviteit te minimaliseren.
      OPMERKING: Bereid ongeveer 80 putten met aggregaten voor om voldoende LEV's te verkrijgen voor typische downstream-experimenten. LEV-monsters worden aanbevolen voor directe karakterisering of therapeutische toepassing, in plaats van langdurige opslag. Als langer opslag nodig is, aliquot dan de LEV-suspensie (bijvoorbeeld 5–10 μL per buis) om herhaalde temperatuurschommelingen en vries-dooicycli te voorkomen. Vries aliquots op droogijs en bewaar bij −80 °C voor kortdurende langdurige opslag (bijvoorbeeld tot 1–3 maanden). Ontdooi één keer op het ijs en gebruik het direct. Let op dat bevriezen de bioactiviteit kan verminderen en het deeltjesherstel en de grootteverdeling van deeltjes kan veranderen; voer daarom waar mogelijk functionele studies uit met vers voorbereide LEV's. Voor kwaliteitscontrole na opslag meet u de deeltjesconcentratie en grootteverdeling opnieuw met behulp van NTA, en gaat u alleen door als de waarden binnen het vooraf gedefinieerde acceptatiebereik blijven. Daarnaast wordt in dit protocol NTA-deeltjesconcentratie gebruikt als primaire kwantificatiemethode om het verlies van blaasjes die geassocieerd zijn met eiwitgebaseerde assays zoals BCA te voorkomen, waardoor de opbrengst voor latere toepassingen wordt gemaximaliseerd.
  2. NTA voor deeltjesgrootte en concentratie
    OPMERKING: NTA wordt uitgevoerd met een commercieel verkrijgbare nanodeeltjesvolganalyzer (zie Materiaaltabel) om de grootteverdeling en deeltjesconcentratie te evalueren.
    1. Verdun 1 μL van de LEVs-suspensie (uit sectie 3.1, stap 6) in 1.499 μL steriele PBS in een steriele 1,5 mL conische buis en meng grondig.
    2. Start de compatibele software en vul de monstercel met 10 mL ultrazuiver water. Bevestig dat het aantal achtergronddeeltjes < 10 per frame is om te zorgen dat het systeem schoon is (zie Materiaaltabel).
    3. Kalibreer het instrument met een voorbereide standaardoplossing. Stel de softwareparameters in op: Gevoeligheid 70, Sluiter 70, Minimum Gebied 5 en Minimale Helderheid 20. Voer "AutoAlignment" uit om te zorgen dat de laser scherp is. Pas de standaardverdunning aan totdat het deeltjesaantal dat in de software wordt weergegeven 50–400 is (bij voorkeur ~200) en start dan het kalibratieprogramma.
      OPMERKING: Bereid de standaardoplossing voor door 1 μL kalibratiekralen te reconstitueren in 1 mL gedestilleerd water om een primaire oplossing te maken. Verdun 100 μL van de primaire oplossing in 25 mL gedestilleerd water (1:250.000 verdunning) en bewaar tot 1 week bij 4 °C.
    4. Spoel de monstercel af met 5 ml gedestilleerd water voordat je het analyseert.
    5. Spoel het kanaal door met 1 mL gedestilleerd water en bevestig dat het deeltjesaantal op de detectie-interface <10 is.
    6. Injecteer 1 mL van het verdunde LEV-monster met een constante snelheid van 0,5 mL/s met een steriele 1 mL spuit.
      VOORZICHTIG: Bedien de spuit handmatig om een constante injectiesnelheid te behouden.
    7. Voer deeltjesanalyse uit en genereer rapporten. Maak in de software een nieuwe meting aan en selecteer de Grootte/Concentratiemodus. Stel de opname in op 3 opnames, 60 s per opname, bij 25 °C met dezelfde detectieparameters als in Stap 3 (Gevoeligheid 70, Sluiter 70, Minimum Gebied 5, Minimale Helderheid 20).
    8. Start de acquisitie en controleer dat het deeltjesaantal op het scherm binnen 50–400 deeltjes per frame blijft (bij voorkeur ~200); als het buiten dit bereik valt, stop dan en pas de verdunning van het monster aan, en herhaal dan Stap 6. Na de verwerving wordt de analyse uitgevoerd om de gemiddelde grootte, modiegrootte, D10/D50/D90 en de deeltjesconcentratie (deeltjes/mL) te verkrijgen. Exporteer vervolgens de resultaten en grootteverdelingsplots als .csv en .pdf (of equivalente rapportformaten) en sla het meetbestand op voor administratie.

4. Therapeutische toepassing van LEV's bij mandibulaire botregeneratie

  1. Bereiding van LEV-belaste hydrogel
    1. Bereid Pluronic F-127 stock voor (20% met /v). Voeg Pluronic F-127 poeder toe aan steriele PBS tot een uiteindelijke concentratie van 20% (w/v) en roer bij 4 °C tot het volledig opgelost en homogeen is (zie Materiaaltabel). Houd de oplossing tijdens de voorbereiding op 4 °C om voortijdige gelatie te voorkomen.
      OPMERKING: 20% (w/v) Pluronisch F-127 is vloeibaar bij 4 °C en ondergaat thermogelatie bij ~20–25 °C (afhankelijk van buis/kamer); het wordt een stabiele gel bij 37 °C.
    2. Laad LEV's onder koude omstandigheden. Voorkoel tubes, pipettips en hydrogel tot 4 °C. Meng 50 μg LEV's (gelijk aan LEV's van twee 24-put platen aggregaten) met 1 mL 20% Pluronic F 127 door zacht pipetteren en korte lage snelheid vortexing om een gelijkmatige verdeling te garanderen. Houd het mengsel op ijs of op 4 °C tot de innesteling.
    3. Richtlijnen voor het hanteren/gebruiken (voor reproduceerbaarheid). Voer laad- en spuit-/tipladen snel uit op ijs. Als het mengsel boven ~20–25 °C opwarmt, neemt de viscositeit toe en kan de gelatie beginnen; in dat geval keer terug naar 4 °C totdat het materiaal weer volledig vloeibaar is voordat het wordt gebruikt. Na plaatsing in het defect laat je gelatie in situ plaatsvinden bij lichaamstemperatuur (37 °C).
  2. Vaststelling van het model van muisachtige mandibulaire botdefecten
    1. Verdoof 8 weken oude C57Bl/6 muizen (mannetjes of vrouwtjes) via intraperitoneale injectie van pentobarbital natrium (50 mg/kg) (zie Materiaaltabel).
      VOORZICHTIG: Pentobarbitalnatrium is een krachtig kalmeringsmiddel/verdovingsmiddel en is giftig voor mensen als het per ongeluk wordt geïnjecteerd, ingenomen of ingeademd. Bereid deze voor en dien toe met veilige methoden voor scherpe middelen (naalden niet opnieuw afkapen; direct weggooien in een scherpe verpakking), draag handschoenen en oogbescherming, vermijd huidcontact en bewaar/registreer het gebruik volgens institutioneel gecontroleerde medicijnbeleid. Controleer de juiste verdoving bij de muizen door te controleren op een afwezige hoornvliesreflex en geen onttrekking van ledematen bij het knellen van de voetpad. Breng een beschermende oogzalf aan om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
    2. Schaf de vacht over het linker onderkaakgebied en desinfecteer afwisselend met 10% povidonjodium en 75% ethanol.
      VOORZICHTIG: 75% ethanol is zeer brandbaar; Gebruik het weg van ontstekingsbronnen en zorg voor goede ventilatie. Povidonjodium kan huid- en oogirritatie of allergische reacties veroorzaken; Draag handschoenen, vermijd contact met ogen of slijmvlies, en ruim morsen snel op.
    3. Maak een lengtesnede van 1 cm langs de onderkaakrand en snijd zachte weefsels bot open om de onderkauwhoek bloot te leggen.
    4. Creëer een cirkelvormig botdefect (2 mm in diameter) met een tandboor met continue zoutwaterspoeling om thermische schade te voorkomen (zie Materiaaltabel).
      VOORZICHTIG: Monitor het intraoperatieve bloeden nauwlettend, beheer bloedingen met kleine wattenbolletjes om een vrij chirurgisch veld te behouden en verminder het infectierisico. Vermijd contact met omliggende zachte weefsels met de boor om verstrikking te voorkomen.
  3. Implantatie van LEV-belaste hydrogel
    1. Laad het LEV-hydrogelmengsel in een steriele spuit en injecteer deze in het botdefect, zodat volledige vulling wordt gegarandeerd.
      OPMERKING: Geef ~10 μg LEV's per muis. Twee platen met 24 putplaten SCAP-aggregaten zijn nodig om voldoende LEV's te leveren voor een experiment met n = 5 muizen.
    2. Voor de controlegroep injecteer je een gelijk volume Pluronic F-127 hydrogel zonder LEV's.
    3. Hecht de incisie met 4-0 opneembare hechtingen en dien subcutane analgesie toe (Carprofen, 5 mg/kg) om postoperatieve pijn te verlichten (zie Materiaaltabel).
      VOORZICHTIG: Carprofen is een farmacologisch actief NSAID en kan schadelijk zijn als het per ongeluk wordt geïnjecteerd of als het huid/ogen raakt. Draag handschoenen, voorkom scherpe verwondingen, gooi naalden/spuiten weg in een container voor scherpe stoffen en verwijder ongebruikte medicijnen en besmette materialen volgens de procedures voor institutioneel farmaceutisch afval.
    4. Leg muizen op een opwarmdeken tot ze herstellen van de narcose, en verplaatsen ze dan naar individuele kooien met vrije toegang tot voedsel en water.
      OPMERKING: Laat muizen niet onbeheerd achter totdat ze voldoende bewustzijn hebben teruggekregen om sternale ligligging te behouden. Breng muizen pas na volledig herstel terug naar groepshuisvesting.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens de experimentele workflow werden belangrijke stappen, waaronder SCAP-isolatie, aggregatevorming, LEV-extractie en therapeutische implantatie, succesvol uitgevoerd (Figuur 1). Klinisch geïmpakteerde derde kiezen van donoren vertoonden onvolwassen apices met intact apicaal papillaweefsel rond de open wortelkanaalopeningen, wat de geschikte bron van SCAP bevestigt (Figuur 2A). Bij kweek in vitro migreerden spoelvor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De groeiende interesse in celvrije regeneratieve therapieën heeft mesenchymale stamcel-afgeleide LEV's gepositioneerd als veelbelovende alternatieven voor volledige celtransplantatie, vanwege hun vermogen om bioactieve moleculen af te leveren zonder de risico's die gepaard gaan met celgebaseerde benaderingen. De klinische vertaling van LEV-gebaseerde therapieën wordt echter belemmerd door het gebrek aan fysiologisch relevante kweeksystemen die de functionaliteit van LEVs volledig kunnen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs geven geen belangenconflicten aan.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Key Research and Development Program of China (2021YFA1100600), de National Natural Science Foundation of China (82471011, 82401201), het Project van het State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration (2024MS04), de China Postdoctoral Science Foundation (BX20230485) en het Partner Laboratory Cooperation and Exchange Program Project van de Vierde Militaire Medische Universiteit (2024HB014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL Syringe with NeedleBD300841Verdoving
10 cm CelcultuurschaalCorning353003Celcultuur
15 mL Polystyreen CentrifugeerbuisCorning352095Celcultuur
75% Ethanol DesinfectiemiddelHai Shi Hai NuoHS-750Operatie
Absorbeerbare Naald 4-0Jinhuan MedicalR413Operatie
Centrifuge voor op tafelWIGGENSCE187EV isolatie
CO2 Incubator, 150 L, Universele TypeThermoFisher51032874Celcultuur
Collagenase Type IThermoFisher17100017Celcultuur
WattenschijfjesDeroyal30-033Operatie
Gebogen Operatie schaarJZ Surgical InstrumentJ21040Operatie
Dentale Mobiele Turbine UnitKaVoS609COperatie
Elektronische WeegschaalZhi KeZK-DSTCelcultuur
EppendorfbuisjeEppendorf3810XEV isolatie
Pincet, fijnJZ Surgical InstrumentJD1020Operatie
HaarverwijderingscrèmeVeet1.00097E+11Operatie
Sneldraaiende kogelfreesDentsply SironaE0123Operatie
Sneldraaiende handpieceKaVoKV-1-008-1644Operatie
Omgekeerd MicroscoopMshotMF53-NCelcultuur
MEM α (Minimum Essentieel Medium α)ThermoFisher12561056Celcultuur
Nanoparticle Tracking Video Microscoop PMX-120Particle MetrixZetaView PMX120Nanoparticle tracking analyse
Penicilline-Streptomycine (P/S)ThermoFisher15140122Celcultuur
Pentobarbital natriumSigma-Aldrich57-33-0Verdoving
Fosfaat-Gebufferde Saline (PBS)ThermoFisher10010023Celcultuur
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443EV implantatie
Povidon-Jodium OplossingBaxterPROSL500Operatie
Specialty Foetale Bovine Serum (FBS)ThermoFisher12664025Celcultuur
Steriele Gaze BlokWinning10-000-681Operatie
Tabeltop Hoge Snelheid Micro CentrifugeHitachiCT15EEV isolatie
Trefine BoorBiomet Microfixation01-9182Operatie
Trypsine-EDTAThermoFisher25200072Celcultuur
Ultra-Laag Hechting 24-Well PlateCorning3473Celcultuur
Vortex Mixer GenieScientific IndustriesSI0425EV implantatie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qiu, G., et al. Functional proteins of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Stem Cell Res. Ther. 10, 359-372 (2019).
  2. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Res. Ther. 9, 50-63 (2019).
  3. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 19, 213-228 (2018).
  4. Rai, A., et al. Proteomic dissection of large extracellular vesicle surfaceome unravels interactive surface platform. J. Extracell. Vesicles. 10, 1-20 (2021).
  5. Ye, T., et al. Large extracellular vesicles secreted by human iPSC-derived MSCs ameliorate tendinopathy via regulating macrophage heterogeneity. Bioact. Mater. 21, 194-208 (2023).
  6. Liang, Z., Luo, Y., Lv, Y. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles mediate BMP2 gene delivery and enhance bone regeneration. J Mater Chem B. 8, 6378-6389 (2020).
  7. Olaechea, A., et al. Preclinical Evidence for the use of oral mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in bone regenerative therapy: a systematic review. Stem Cells Transl Med. 12, 791-800 (2023).
  8. Zhang, T., et al. Extracellular vesicles derived from human dental mesenchymal stem cells stimulated with low-intensity pulsed ultrasound alleviate inflammation-induced bone loss in a mouse model of periodontitis. Genes Dis. 10, 161-1625 (2023).
  9. Cai, X. Y., et al. Inflammation-triggered Gli1(+) stem cells engage with extracellular vesicles to prime aberrant neutrophils to exacerbate periodontal immunopathology. Cell Mol Immunol. 22, 371-389 (2025).
  10. Wang, Y., et al. Reciprocal regulation of mesenchymal stem cells and immune responses. Cell Stem Cell. 29, 1515-1530 (2025).
  11. Chalisserry, E. P., Nam, S. Y., Park, S. H., Anil, S. Therapeutic potential of dental stem cells. J Tissue Eng. 29, 1-17 (2017).
  12. Yang, H., et al. Secreted frizzled-related protein 2 promotes the osteo/odontogenic differentiation and paracrine potentials of stem cells from apical papilla under inflammation and hypoxia conditions. Cell Prolif. 53, 1-11 (2020).
  13. Huang, M., Dissanayaka, W. L., Yiu, C. K. Exploring the potential of stem cells from the apical papilla (SCAPs) in regenerative medicine: advantages, applications, challenges, and opportunities. Stem Cell Res Ther. 16, 1-20 (2025).
  14. Jaukovic, A., et al. Specificity of 3D MSC Spheroids Microenvironment: Impact on MSC Behavior and Properties. Stem Cell Rev Rep. 16, 853-875 (2020).
  15. Wang, X., et al. Hypoxia promotes EV secretion by impairing lysosomal homeostasis in HNSCC through negative regulation of ATP6V1A by HIF-1 alpha. J Extracell Vesicles. 12, 1-20 (2023).
  16. Yuste, I., et al. Mimicking bone microenvironment: 2D and 3D in vitro models of human osteoblasts. Pharmacol Res. 169, 1-57 (2021).
  17. Fontana, F., et al. In Vitro 3D cultures to model the tumor microenvironment. Cancers (Basel). 13, 1-16 (2021).
  18. Cook, K., Li, H. Advancing extracellular vesicle production: improving physiological relevance and yield with 3D cell culture. Nanoscale. 17, 15110-15131 (2025).
  19. Sui, B. D., et al. Mesenchymal condensation in tooth development and regeneration: a focus on translational aspects of organogenesis. Physiol Rev. 103, 1899-1964 (2023).
  20. Kobayashi, T., Kronenberg, H. M. Overview of skeletal development. Methods Mol Biol. 2230, 3-16 (2021).
  21. Naba, A. Mechanisms of assembly and remodelling of the extracellular matrix. Nat Rev Mol Cell Biol. 25, 865-885 (2024).
  22. Guo, H., et al. Odontogenesis-related developmental microenvironment facilitates deciduous dental pulp stem cell aggregates to revitalize an avulsed tooth. Biomaterials. 279, 1-16 (2021).
  23. Zhang, J., et al. Functional tissue-engineered microtissue formed by self-aggregation of cells for peripheral nerve regeneration. Stem Cell Res Ther. 13, 1-20 (2022).
  24. Yu, W., et al. Higher yield and enhanced therapeutic effects of exosomes derived from MSCs in hydrogel-assisted 3D culture system for bone regeneration. Biomater Adv. 133, 1-17 (2022).
  25. Kim, M., et al. Three-dimensional spheroid culture increases exosome secretion from mesenchymal stem cells. Tissue Eng Regen Med. 15, 427-436 (2018).
  26. Millan, C., et al. Extracellular vesicles from 3d engineered microtissues harbor disease-related cargo absent in EVs from 2D cultures. Adv Healthc Mater. 11, 1-17 (2022).
  27. Petit, I., Levy, A., Aberdam, D. Purification of extracellular microvesicles secreted by dermal fibroblasts. Methods Mol Biol. 2154, 63-72 (2020).
  28. Li, S., et al. Construction, characterization, and regenerative application of self-assembled human mesenchymal stem cell aggregates. J Vis Exp. (15), e64697(2023).
  29. Sui, B. D., et al. Reconstruction of regenerative stem cell niche by cell aggregate engineering. Methods Mol Biol. 2002, 87-99 (2019).
  30. Mobasseri, R., et al. Peptide-modified nanofibrous scaffold promotes human mesenchymal stem cell proliferation and long-term passaging. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 84, 80-91 (2018).
  31. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10, 637-644 (2011).
  32. Cao, Y., et al. Isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues. J Vis Exp. 20, e63990(2022).
  33. Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell Tissue Res. 347, 701-711 (2012).
  34. Li, Y., et al. Lysosome-Featured Cell Aggregate-Released Extracellular Vesicles Regulate Iron Homeostasis and Alleviate Post-Irradiation Endothelial Ferroptosis for Mandibular Regeneration. Adv Sci (Weinh). 12, 1-22 (2025).
  35. Longjohn, M. N., Christian, S. L. Characterizing Extracellular Vesicles Using Nanoparticle-Tracking Analysis. Methods Mol Biol. 2508, 353373(2022).
  36. Cantore, S., et al. Characterization of human apical papilla-derived stem cells. J Biol Regul Homeost Agents. 31, 901-910 (2017).
  37. Wang, Z., et al. Fibroblast growth factor 2 promotes osteo/odontogenic differentiation in stem cells from the apical papilla by inhibiting PI3K/AKT pathway. Sci Rep. 14, 19-35 (2024).
  38. Li, J., et al. TGF-beta2 and TGF-beta1 differentially regulate the odontogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Arch Oral Biol. 135, 1-15 (2022).
  39. Zhang, W., et al. Foxc2 and BMP2 Induce Osteogenic/Odontogenic Differentiation and Mineralization of Human Stem Cells from Apical Papilla. Stem Cells Int. 18, 23-36 (2018).
  40. Man, K., et al. An ECM-mimetic hydrogel to promote the therapeutic efficacy of osteoblast-derived extracellular vesicles for bone regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 10, 82-99 (2022).
  41. Ming, L., et al. Small extracellular vesicles laden oxygen-releasing thermosensitive hydrogel for enhanced antibacterial therapy against anaerobe-induced periodontitis alveolar bone defect. ACS Biomater Sci Eng. 10, 932-945 (2024).
  42. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Purification of mitochondria by sucrose step density gradient centrifugation. Cold Spring Harb Protoc. 14, 8-28 (2014).
  43. Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 2016, 299-310 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mesenchymal Stem CellsLarge Extracellular VesiclesSCAP Derived LEVs3D Cell CultureDifferential CentrifugationNanoparticle Tracking AnalysisHydrogel DeliveryCraniofacial Regeneration

Gerelateerde artikelen