Methodenartikel

Verklaring van de materiële basis van de Yiqi Qingjie-formule tegen IgA-nefropathie met behulp van UHPLC-Q-Orbitrap HRMS geïntegreerd met netwerkfarmacologie

328 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70541

⸱

19 mei 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences., 2Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences., 3Department of New Drug Research and Development, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences.

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft het gebruik van ultra-high-performance vloeistofchromatografie in combinatie met hybride quadrupool-Orbitrap hoge-resolutie massaspectrometrie (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS), gecombineerd met netwerkfarmacologie en moleculaire koppeling, om de materiële basis van de Yiqi Qingjie-formule (YQQJ) voor de behandeling van IgA-nefropathie (IgAN) te voorspellen en te valideren.

Samenvatting

Deze studie maakt gebruik van UHPLC-Q-Orbitrap HRMS om de water-extracteerbare en bloedopgenomen bestanddelen van YQQJ te karakteriseren. Netwerkfarmacologie en moleculaire koppeling worden verder toegepast om de materiële basis ten grondslag van de therapeutische effecten van YQQJ tegen IgAN te voorspellen en te verifiëren. De waterige extract- en serummonsters van YQQJ werden geanalyseerd met behulp van UHPLC-Q-Orbitrap HRMS om de chemische bestanddelen te karakteriseren en door bloed opgenomen verbindingen te identificeren. Verbindingidentificatie werd uitgevoerd op basis van referentiedatabases, gepubliceerde literatuur en een uitgebreide evaluatie van retentietijd, precursorionmassa-nauwkeurigheid, MS/MS-fragmentatiepatronen en isotopische distributie. Potentiële doelwitten van de prototype bloedgeabsorbeerde verbindingen werden voorspeld met behulp van doelvoorspellingsdatabases, terwijl IgAN-gerelateerde doelen werden verzameld van geïntegreerde bio-informaticaplatforms. Kerndoelen werden gescreend met behulp van PPI-netwerkanalyse. Er werd een "compound–target–pathway–disease"-netwerk opgebouwd om belangrijke bestanddelen te identificeren, en moleculaire koppeling werd uitgevoerd om de interacties tussen kernverbindingen en doelwitten te evalueren. In totaal werden 185 verbindingen geïdentificeerd in het waterextract van YQQJ. Hiervan kwamen 28 verbindingen in hun prototypevorm in de bloedbaan terecht. PPI identificeerde 42 kerndoelen die geassocieerd zijn met de therapeutische effecten van YQQJ in IgAN. KEGG- en GO-verrijkingsanalyses toonden betrokkenheid bij celproliferatie, ontsteking en apoptose, en verrijking in verschillende belangrijke routes zoals PI3K-Akt, MAPK en JAK-STAT. Moleculaire koppelingsanalyse voorspelde gunstige bindingsinteracties tussen zes kritieke doelwitten (CASP3, IGF1R, JUN, STAT3, PRKCB en PIK3CA) en drie belangrijke door bloed opgenomen verbindingen—deacetylasperulosidezuur, geniposidinezuur en dioscine—met consequent lage bindingsenergieën, wat wijst op mogelijke interacties. Deze geïntegreerde analyse toont aan dat YQQJ therapeutische effecten uitoefent tegen IgAN via meerdere componenten en meerdere doelwitten. Deacetylasperulosidezuur, Geniposidinezuur en Dioscine worden voorgesteld als belangrijke actieve bestanddelen die bijdragen aan deze effecten.

Inleiding

IgA-nefropathie (IgAN) is een van de meest voorkomende primaire glomerulonefritis wereldwijd. De klinische manifestaties zijn zeer heterogeen, meestal gepresenteerd als microscopische of grove hematurie, vaak gepaard met wisselende graden van proteïnurie, hypertensie en nierschade. Eerdere studies suggereerden dat tot 40% van de patiënten binnen 20 jaar na diagnose nierfalen bereikte1; recenter bewijs wijst echter op een aanzienlijk slechtere prognose, waarbij de meeste patiënten binnen 10–15 jaar nierfalen ontwikkelden en slechts een klein deel een levenslange nierfunctie behield zonder progressie 2,3,4. Hoewel gerichte therapieën recent klinische vooruitgang hebben geboekt in het beheer van IgAN, blijven hun hoge kosten en relatief trage inzet van werkzaamheid grote uitdagingen, en de klinische baten-risicobalans blijft onderwerp van discussie 5,6.

Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) vertoont bijzondere voordelen bij de behandeling van complexe ziekten. Het wordt gekenmerkt door stabiele therapeutische effectiviteit, relatief lage incidentie van bijwerkingen en multi-target synergistische effecten7. In tegenstelling tot farmacologische middelen met één doelwit bevatten TCM-formules doorgaans meerdere bioactieve componenten die gelijktijdig diverse biologische routes kunnen moduleren. Deze multicomponent- en multi-target werkwijze biedt een potentieel therapeutisch voordeel bij de behandeling van complexe ziekten zoals IgAN8. In de TCM-theorie heeft IgAN geen specifieke ziektenaam, maar wordt het doorgaans geclassificeerd onder "hematurie," "oedeem", "rugpijn", "nierwind" en "tuberkuloseziekte." De meeste geleerden beschouwen de kernpathogenese ervan als long-milt Qi-tekort, wat leidt tot verlies van controle over defensieve Qi en op zijn beurt tot de invasie van wind, vocht, hitte en toxines, wat uiteindelijk de nieren beschadigt. Hoewel de nier het primaire orgaan is, kunnen ook het hart, de lever, milt en longenworden aangetast. Op basis van deze kennis hebben talrijke onderzoeken zich gericht op het identificeren van kruidengeneesmiddelen en -formules met Qi-tonificerende, extern consolidatie, warmte-clearing, detoxifying en vochtverlichtende eigenschappen voor de klinische behandeling van IgAN10,11.

Yiqi Qingjie-formule (YQQJ) is een effectief empirisch recept dat wordt gebruikt op de afdeling Nefrologie van ons ziekenhuis voor de behandeling van IgAN. De formule bestaat uit zeven kruiden, waaronder Astragalus membranaceus (Huangqi), Lonicera japonica Thunb. (Jinyinhua), Rheum palmatum L. (Dahuang), Hedyotis diffusa Willd. (Baihuasheshecao), Dioscorea nipponica makino (Chuanshanlong), Spatholobus suberectus Dunn (Jixueteng) en Plantago asiatica L. (Cheqiancao). YQQJ vervult therapeutische functies door Qi te versterken, de buitenkant te consolideren, warmte te verwijderen, te ontgiften, de bloedcirculatie te activeren en diuresete bevorderen. Klinische studies hebben aangetoond dat YQQJ eiwiturie en hematurie bij patiënten met IgAN significant vermindert, de nierfunctie verbetert en de slijmvliesontstekingsgerelateerde symptomen verlicht, terwijl het een gunstig veiligheidsprofiel vertoont12,13.

Hoewel deze formule een gunstige klinische effectiviteit heeft getoond, blijft de farmacologisch actieve materiaalbasis moeilijk te verduidelijken omdat TCM-formules talrijke chemische bestanddelen bevatten. Chemische profilering die uitsluitend op chromatografische of massaspectrometrische analyse gebaseerd is, kan de algehele chemische samenstelling van een formule aan het licht brengen; het kan echter niet bepalen welke verbindingen in de systemische circulatie worden opgenomen en direct bijdragen aan therapeutische effecten14. Daarnaast zijn conventionele netwerkfarmacologiestudies grotendeels gebaseerd op databasegebaseerde voorspellingen en screenen ze doorgaans kandidaatverbindingen met parameters zoals orale biobeschikbaarheid en geneesmiddelgelijkheid. Deze benadering kan verbindingen over het hoofd zien die daadwerkelijk farmacologische activiteit in vivo uitoefenen.

Om deze beperkingen aan te pakken, hanteren recente studies steeds vaker integratieve analytische strategieën die ultra-high-performance vloeistofchromatografie combineren met hybride quadrupool-Orbitrap hoogresolutie massaspectrometrie (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS), serumfarmacochemie en systeemfarmacologie in TCM-onderzoek16,17. Serumfarmacochemie identificeert verbindingen die na toediening in de systemische circulatie terechtkomen, waardoor farmacokinetisch relevant bewijs wordt geleverd voor het screenen van potentiële bioactieve bestanddelen18. Ondertussen maakt UHPLC-Q-Orbitrap HRMS zeer nauwkeurige detectie en structurele karakterisering van chemische bestanddelen binnen complexe kruidenmatrices19 mogelijk.

In vergelijking met benaderingen die uitsluitend vertrouwen op chemische profilering of theoretische doelvoorspelling, biedt de integratieve workflow die in deze studie wordt toegepast—bestaande uit UHPLC-Q-Orbitrap HRMS-gebaseerde componentidentificatie, serumfarmacochemiescreening, netwerkfarmacologische analyse en moleculaire dockingvalidatie—verschillende methodologische voordelen. UHPLC-Q-Orbitrap HRMS maakt een uitgebreide en nauwkeurige identificatie van complexe chemische bestanddelen mogelijk. Serumfarmacochemie beperkt kandidaatverbindingen tot die welke daadwerkelijk in de systemische circulatie worden opgenomen, waardoor de biologische plausibiliteit van latere netwerkanalyses wordt verbeterd. Netwerkfarmacologieanalyse gebaseerd op experimenteel bevestigde geabsorbeerde verbindingen maakt systeemniveau verkenning van multi-doelmechanismen mogelijk en weerspiegelt beter de holistische farmacologische kenmerken van TCM-formules. Moleculaire koppeling biedt verder voorlopige computationele validatie van voorspelde interacties tussen verbinding en doelwit en ondersteunt rationele prioritering van kandidaatmoleculen voor latere experimentele verificatie. Gezamenlijk biedt deze integratieve workflow een betrouwbare, efficiënte en fysiologisch relevante strategie om de materiële basis en mechanismen van complexe kruidenformules zoals YQQJ te verduidelijken.

Deze workflow is bijzonder geschikt voor het onderzoeken van de farmacologisch actieve materiaalbasis en mechanismen van complexe kruidenformules, wanneer in vivo absorptiegegevens kunnen worden verkregen uit dier- of menselijke farmacokinetische studies. Het is vooral toepasbaar op formules met een vastgestelde klinische werkzaamheid maar onduidelijke actieve bestanddelen. Toch moeten verschillende beperkingen worden erkend. Ten eerste hangt de nauwkeurigheid van doelvoorspelling af van de kwaliteit en volledigheid van publieke databases. Ten tweede richt de workflow zich op prototypeverbindingen die in de circulatie worden gedetecteerd en houdt geen rekening met bioactieve metabolieten die in vivo worden geproduceerd. Ten derde vereisen voorspellingen die zijn afgeleid van netwerkfarmacologieanalyses verdere experimentele validatie. Ondanks deze beperkingen biedt de workflow een efficiënte en betrouwbare benadering voor hypothesevorming en doelprioritering in mechanistische studies van TCM-formules.

Daarom gebruikt deze studie UHPLC-Q-Orbitrap HRMS om systematisch zowel de waterige extractcomponenten als de circulerende verbindingen van YQQJ te karakteriseren, waardoor een relatief uitgebreide database van potentiële actieve bestanddelen wordt opgezet. Op basis van deze dataset voorspelt netwerkfarmacologie-analyse, gecombineerd met moleculaire dockingvalidatie, de potentiële farmacologisch actieve componenten van YQQJ voor de behandeling van IgAN en biedt het een basis voor latere mechanistische onderzoeken.

Protocol

Alle experimentele procedures met dieren voldeden aan de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren, uitgegeven door het China Animal Welfare Committee. Alle procedures in deze studie zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Animal Experimental Center van het Guang'anmen Ziekenhuis.

1. Dieren en medicijntoediening

  1. Gebruik twaalf mannelijke Sprague–Dawley (SD) ratten van 6 weken oud die 200–230 g wegen.
  2. Onderneem alle dieren in het Experimenteel Dierencentrum.
    OPMERKING: Houd de huistemperatuur op 20–26 °C en de relatieve luchtvochtigheid op 40–70%. Gebruik een 12 uur/12 uur licht/donker cyclus om natuurlijke circadiane ritmes te simuleren.
  3. Acclimatismeer dieren gedurende 7 dagen onder standaardomstandigheden met vrije toegang tot voedsel en water vóór het experiment. Verdeel de ratten willekeurig in twee groepen (n = 6 per groep): een controlegroep en een met medicijnen behandelde groep.
  4. Zie de equivalente dosis die door lichaamsoppervlak tussen mensen en dieren wordt omgezet20. Geef YQQJ geconcentreerd extract via orale gavage van 24,68 mL/(kg·dag) aan de met medicijnen behandelde groep. Geef gelijktijdig een gelijke hoeveelheid gedestilleerd water aan de controlegroep om een synchroon behandeling te garanderen.
  5. Ga 1 dag door met toedienen. Verdeel de totale dagelijkse dosis in drie gelijke toedieningen (bijvoorbeeld om 08:00, 13:00 en 18:00) om een volledige dosis binnen 1 dag te garanderen.
    OPMERKING: Dieren 12 uur vasthouden voor de laatste herbei, met gratis toegang tot water.
  6. Neem bloedmonsters 2 uur en 8 uur na de laatste toediening. Verdoof de ratten door intraperitoneale injectie van 1% natriumpentobarbital (50 mg/kg). Verzamel bloed uit de abdominale aorta.
  7. Laat de bloedmonsters 1 uur rechtop op kamertemperatuur staan, en centrifugeer dan 5 minuten op 450 × g bij 4 °C. Controleer of het supernatant (serum) vrij is en vrij van hemolyse. Breng het supernatant serum over en bewaar het bij –80 °C voor verdere analyse.

2. Voorbereiding van oplossingen

  1. Voorbereiding van testoplossingen
    1. Verzamel alle ruwe kruiden van YQQJ volgens de formule. Voeg 4 volumes gezuiverd water toe aan de decoctionpot en laat het 20 minuten weken.
      OPMERKING: Gezuiverd water werd aan de kruiden toegevoegd in een verhouding van 4:1 (v/z).
    2. Breng het mengsel aan de kook en ga daarna 30 minuten verder met het aftrekken op laag vuur. Filter door gaas en verzamel het filtrat. Herhaal het afgieten van de residuen met 4 volumes water nog eens 30 minuten en filter opnieuw.
    3. Combineer de twee filtraten. Concentreer de gemengde oplossing met een roterende verdamper die is ingesteld op een waterbadtemperatuur van 60 °C tot een concentratie van 3 g/mL (w/v, gelijk aan ruwe medicinale stoffen) is bereikt.
    4. Controleer of het geconcentreerde extract een donkere, stroperige vloeistof is zonder zichtbare neerslag. Bewaar op 4 °C voor later gebruik.
  2. Voorbereiding van referentieoplossingen
    1. Weeg de volgende referentieverbindingen nauwkeurig: deacetylasperulosidezuur, Geniposidinezuur, Loganinezuur, Morroniside, Chlorogenzuur, Sweroside, Plantagoguanidinzuur, Rhein-8-O-β-D-glucopyranoside, Genistine, Apigenin-7-glucoside, Diosmetine-7-O-β-D-glucopyranoside, Calycosine, Protodioscine, Genisteïne, Diosmetine, Pseudoprotodioscine, Formononetine, 3-Hydroxy-9,10-dimethoxyptercarpan, Aloeemodine, Rhein, Dioscine.
    2. Los elke verbinding op in methanol, laat het mengsel 1 minuut vortexen, en sonicaer dan 10 minuten op kamertemperatuur om volledige oplossing te garanderen.
    3. Verdun elke oplossing met methanol om een uiteindelijke concentratie van 10 μg/mL per standaard te bereiken.

3. Monstervoorbereiding

  1. Bereiding van YQQJ-extractmonsters
    1. Pipette 100 μL van het YQQJ-waterextract in een 1,5 mL centrifugebuis. Voeg 300 μL methanol toe en vortex gedurende 1 minuut. Centrifugeer op 1800 × g, 4 °C gedurende 10 minuten. Zorg ervoor dat het resulterende supernatant helder is en vrij van zwevende deeltjes.
    2. Neem 100 μL van het supernatant en meng met 100 μL ultrazuiver water om een verdunning van 1:1 te bereiken. Vortex voorzichtig en overbrengen naar een autosampler-buis voor analyse.
  2. Bereiding van serummonsters met geneesmiddelen
    1. Pipetteer 100 μL serum in een 1,5 mL centrifugebuis. Voeg 300 μL methanol toe en laat het vortex 10 minuten draaien om eiwitprecipitatie te garanderen. Centrifugeer op 1800 × g., 4 °C gedurende 10 minuten.
    2. Verzamel 270 μL van het supernatant en breng over in een schone buis. Verdamp het supernatant tot droogte met een vacuüm centrifugale concentrator ingesteld op 120 × g., 37 °C gedurende 4 uur totdat er een zichtbaar vast residu ontstaat.
    3. Reconstrueren van het residu met 90 μL waterige oplossing van 50% methanol. Vortex 1 minuut om het residu volledig op te lossen, dan opnieuw centrifugeren op 1800 × g., 4 °C 10 minuten.
    4. Verzamel 80 μL van het uiteindelijke heldere supernatant en breng het over in een autosampler-flesje voor analyse.

4. Analytische voorwaarden

  1. Chromatografische omstandigheden
    1. Voer chromatografische scheiding uit met een UHPLC-systeem uitgerust met een chromatografische kolom.
    2. Gebruik een binaire mobiele fase (Fase A: water met 0,1% mierenzuur; Fase B: acetonitril). Pas een gradiënt-elusieprogramma toe zoals weergegeven in Tabel 1, bij een debiet van 0,3 mL/min. Stel de kolomtemperatuur in op 40 °C en het injectievolume op 6,0 μL.
      OPMERKING: De kolomspecificaties zijn 2,1 mm × 100 mm, deeltjesafmeting van 1,8 μm.
  2. MS-voorwaarden
    1. Analyseer monsters met een quadrupool-orbitrap massaspectrometer uitgerust met een verwarmde elektrospray-ionisatie (HESI) sprayprobe.
    2. Stel parameters als volgt in: Ionisatiespanning: 3,7 kV (positieve modus) / 3,5 kV (negatieve modus); Capillaire temperatuur: 320 °C; gasdruk in de mantel: 30 psi; Hulpgasdruk: 10 psi; desolvatietemperatuur: 300 °C; mantelgas en het hulpgas: stikstof; botsingsgas: stikstof, 1,5 mTorr.
    3. Verzamel gegevens in Full scan/dd-MS2 modus. Stel volledige scanparameters als volgt in: resolutie 70000, auto gain control target 1×106, maximale isolatietijd 50 ms, en m/z scanbereik 100 – 1500.
    4. Verzamel de dd-MS2 data met parameters resolutie 17500, auto gain control target 1×105, maximale isolatietijd 50 ms, selecteer ≤de meest intense ouderionen voor fragmentatie in combinatie met een dynamisch uitsluitingsmechanisme, isolatievenster van m/z 2, botsingsenergie 10 V, 30 V, 60 V en intensiteitsdrempel 1×105.

5. Verwerking van MS-gegevens

  1. Verwerk de verkregen MS-gegevens met behulp van gespecialiseerde dataverwerkingssoftware. Ga naar de module Gegevens importeren en upload de ruwe databestanden.
  2. Voer de Peak Picking-module uit en voer piekdeconvolutie uit om adductionen te groeperen en samengestelde kenmerken te genereren.
  3. Zoek in referentiedatabases, doelvoorspellingsdatabases en relevante gepubliceerde literatuur naar kandidaatidentificatie.
  4. Identificeer verbindingen met behulp van twee complementaire identificatiestrategieën op basis van hoogresolutie MS-gegevens.
    1. Identificatie gebaseerd op referentiestandaardmatching. Bevestig verbindingen door te vergelijken met authentieke referentienormen. Accepteer identificaties alleen wanneer aan alle volgende criteria is voldaan:
      1. Massanauwkeurigheid: De massafout van zowel precursorionen als fragmentionen moet binnen ±5 ppm liggen.
      2. Spectrale gelijkenis: De cosinusgelijkenisscore tussen het experimentele MS/MS-spectrum en het MS/MS-spectrum van de referentiestandaard moet ≥ 0,85 zijn.
      3. Isotopische verdeling: De isotopische patroonmatchingscore moet ≥ 90% zijn.
      4. Chromatografisch gedrag: De retentietijdafwijking tussen de gedetecteerde verbinding en de referentiestandaard moet < 0,2 minuten bedragen.
        OPMERKING: Verbindingen die aan al bovenstaande criteria voldoen, worden aangeduid als MSI Niveau 1, wat bevestigde structurele identificatie aanduidt.
    2. Identificatie gebaseerd op hoogresolutie MS-gegevens en in silico spectrale voorspelling. Voor verbindingen zonder beschikbare referentiestandaarden voer je veronderstelde identificatie uit op basis van nauwkeurige massametingen en computationele spectrale voorspellingen. Accepteer annotaties alleen wanneer aan de volgende criteria is voldaan:
      1. Massanauwkeurigheid: De massafout van precursorionen moet binnen ±5 ppm liggen, en de massafout van fragmentionen moet binnen ±10 ppm liggen.
      2. Spectrale gelijkenis: Vergelijk het experimentele MS/MS-spectrum met het theoretische MS/MS-spectrum dat wordt gegenereerd uit de samengestelde SMILES-structuur met behulp van het Progenesis QI-algoritme. Accepteer matches met een cosinusgelijkheidsscore ≥ 0,60.
      3. Isotopische verdeling: De isotopische patroonmatchingscore moet ≥ 90% zijn.
      4. Voorspelling van chromatografisch gedrag: De afwijking tussen de experimentele retentietijd en de door machine learning voorspelde retentietijd moet < 1,0 minuten zijn.
        OPMERKING: Het voorspellingsmodel voor retentietijd is getraind met experimentele chromatografische gegevens van meer dan 2000 referentieverbindingen die onder dezelfde chromatografische omstandigheden zijn geanalyseerd. Verbindingen die aan deze criteria voldoen, worden geannoteerd als MSI Niveau 2, wat verondersteld geïdentificeerde verbindingen met hoge structurele zekerheid vertegenwoordigt.

6. Netwerkfarmacologie

  1. Identificatie van door bloed opgenomen componenten en IgAN-gerelateerde doelen
    1. Importeer de geïdentificeerde prototype bloedgeabsorbeerde bestanddelen van YQQJ in de doelvoorspellingsdatabases. Selecteer "Homo sapiens" als doelsoort en bepaal de potentiële doelwitten. Noteer deze als de doelgroep van bloedopgenomen verbindingen in YQQJ.
    2. Gebruik het trefwoord "IgA Nephropathy" om IgAN-gerelateerde ziektedoelen op te halen van de geïntegreerde bio-informaticaplatforms. Consolidatie van resultaten uit meerdere bronnen om bias te minimaliseren.
      OPMERKING: Gebruik een eiwitdatabase om alle opgehaalde doelen om te zetten naar het gensymboolformaat voor consistentie.
  2. Constructie van een eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerk en identificatie van kerndoelwitten
    1. Meng de doelgroep van door YQQJ geabsorbeerde verbindingen met de IgAN-ziektedoelset en extraheren van hun snedepunt.
    2. Upload de kruisende doelen naar het PPI-platform21. Configureer de instellingen: stel het organisme in als Homo sapiens, de betrouwbaarheidsscore als 0,90, en gooi alle losgekoppelde knooppunten weg.
    3. Importeer de PPI-gegevens in de visualisatiesoftware22. Start de topologische analyse-plugin. Bereken graadcentraliteit (DC)23, tussenheidscentraliteit (BC)24 en nabijheidscentraliteit (CC)25.
    4. Screenen op de kerntherapeutische doelen van YQQJ tegen IgAN door knopen te filteren met topologische parameterwaarden (DC, BC en CC) die de mediaan overschrijden.
  3. Constructie en analyse van het geïntegreerde netwerk "YQQJ–bloedgeabsorbeerde componenten–doelen–pathways–disease"
    1. Bereid het node-attribuutbestand voor: Maak een spreadsheet met twee kolommen. Label de eerste kolom Knoopnaam en het tweede knooppunttype. Ken aan elke knoop een van de vijf categorieën toe (Formule, Bloedopgenomen Component, Intersectiedoel, Route of Ziekte).
    2. Bereid het netwerkinteractiebestand (edge) voor: Maak een spreadsheet aan waarin de verbindingen tussen knooppunten worden gedefinieerd (bijv. Bloedgeabsorbeerde component naar intersectiedoel). Zorg ervoor dat alle knooppuntnamen overeenkomen met die in het knooppuntattributenbestand om kaartfouten te voorkomen.
    3. Importeren en bouwen van het netwerk: Start de netwerkvisualisatiesoftware. Navigeer naar Bestand > Importeren > Netwerk om het randbestand te laden. Map in het previewvenster de kolommen als Bronknoop en Doelknoop en klik OK om de initiële grafiek te genereren.
    4. Kaart nodeattributen en stel visuele stijlen in: Importeer het node-attribuutbestand via Bestand > Importeren > Table. Open het Stijl-paneel en wijs de knooptypekolom aan specifieke visuele eigenschappen, waaronder knoopvorm, vulkleur en grootte.
    5. Voer topologische analyses uit: Ga naar Tools > Analyze Network om topologische berekeningen uit te voeren. Filter en identificeer kernactieve verbindingen en belangrijke therapeutische doelen op basis van graadwaarden.
      OPMERKING: Gebruik dezelfde topologische parameters als beschreven in stap 6.2 om consistentie in de identificatie van kernknooppunten te waarborgen.
    6. Exporteer de netwerkafbeelding: Maak de netwerkindeling definitief. Navigeer naar Bestand > Exporteer > Netwerk naar Afbeelding om de geoptimaliseerde visualisatie op te slaan.
  4. GO-verrijking en KEGG-routeanalyses
    1. Dien de genenlijst in: Open het webgebaseerde functionele annotatieplatform. Navigeer naar het gedeelte Stap 1: Dien Genenlijst in en upload de eerder gefilterde kerndoelgenlijst26.
    2. Selecteer soort: Selecteer in de dropdownmenu's voor Stap 2: Invoer als Soort en Stap 3: Analyse als Soort H. sapiens. (mens) om te zorgen dat de analyse binnen de juiste biologische context wordt uitgevoerd.
    3. Configureer aangepaste analyse: Selecteer de Aangepaste Analyse-modus . In de categorie Verrijking kunt u de volgende databases raadplegen: Gene Ontology (GO) Molecular Function (MF), GO Biological Process (BP), GO Cellular Component (CC) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG Pathway).
    4. Stel significantiedrempels in: Stel de P-waarde grens in op < 0,01, de minimale verrijking op ≥ 1,5 en de minimale overlap op ≥ 3. Houd alle andere parameters op hun standaardinstellingen.
    5. Voer de analyse uit: Klik op de knop Verrijkingsanalyse om de taak in te dienen en wacht tot de berekening is voltooid.
    6. Resultaten ophalen en exporteren: Toegang tot de pagina met het gegenereerde analyserapport. Klik op de downloadknop om de gedetailleerde verrijkingsgegevens te exporteren in een spreadsheet, samen met de bijbehorende staafdiagrammen en heatmaps.

7. Moleculaire koppelverificatie

  1. Download de hoogresolutie (< 2,50 Å) 3D-eiwitstructuren van de kerndoelen en 2D-chemische structuren van de kernbestanddelen die door bloed opgenomen bestanddelen worden opgenomen uit de structurele biologiedatabases27.
  2. Start de moleculaire dockingsoftware en importeer de gedownloade structuren.
  3. Voer de volgende preprocessing-stappen sequentieel uit: Navigeer naar Bewerken > Verwijder Water om watermoleculen te elimineren; selecteer Bewerken > Verwijder heteroatomen om niet-standaard residuen weg te gooien.
  4. Ga naar Bewerken > waterstof > Voeg > alleen polair toe om polaire waterstofatomen toe te voegen. Sla de verwerkte structuren op in PDBQT-formaat via File > Save > Write PDBQT.
  5. Definieer de dockinglocatie met behulp van de Grid > Grid Box-tool . De afmetingen van de rasterdoos werden adaptief aangepast (20–100 Å) om volledige dekking van de voorspelde bindingsgebieden te garanderen.
  6. Initialiseer de dockingparameters: Selecteer de receptor via Docking > Macromolecule > Stel Rigid Filename in en open de ligand via Docking > Ligand > Open. De koppelparameters werden als volgt ingesteld: uitputtingsgraad = 32, energiebereik = 3 kcal/mol, en tot 10 bindingsmodi werden behouden. Voor eiwitten met co-gekristalliseerde liganden was de docking grid box gecentreerd op het ligandcentroide met een extensie van 8,0 Å, terwijl voor eiwitten zonder co-gekristalliseerde liganden bindingspockets werden voorspeld met DoGSiteScorer met ongeveer 90% dekking.
  7. Kies het Lamarckian Genetic Algorithm (LGA) als zoekstrategie. Voer de simulatie uit via Docking > Start AutoDock.
  8. Evalueer de bindingsaffiniteit op basis van de berekende bindingsenergie (dockingscore)28.
    OPMERKING: Een lagere bindingsenergie duidt op sterkere voorspelde bioactiviteit en een hogere structurele stabiliteit van het eiwit-ligandencomplex. Een drempel van ≤ -5,0 kcal/mol wordt doorgaans gebruikt om gunstige bindingsstabiliteit te bepalen.

Resultaten

Analyse van bestanddelen in het YQQJ-waterige extract
De componentanalyse van het YQQJ-waterige extract werd uitgevoerd onder de voorwaarden die in PROTOCOL 4 zijn vastgesteld. UHPLC-Q-Orbitrap HRMS werd gebruikt in zowel positieve als negatieve ion full-scan modi om het waterige extract van YQQJ te profileren, en het verkregen Base Peak Ion chromatogram (BPI) is weergegeven in Figuur 1. Op basis hiervan maakte een zelfopgestelde chemische bestanddelendatabase gecombineerd met MS/MS-spectrale karakterisering het mogelijk om succesvol 185 verbindingen uit het waterige extract te identificeren, met gedetailleerde informatie samengevat in Aanvullende Tabel 1. Representatieve MS/MS spectrale matching en fragmentatiepatronen die worden gebruikt voor verbindingidentificatie zijn geïllustreerd in aanvullende figuur 1. Statistische analyse van verbindingcategorieën toonde aan dat flavonoïden en terpenoïden de overheersende bestanddelen waren in YQQJ, goed voor 94 verbindingen, het meest voorkomende aandeel.

Bloedopgenomen componenten van YQQJ
Om de directe bioactieve stoffen in vivo te verduidelijken, werden serummonsters die na toediening van YQQJ zijn verzameld geanalyseerd. Het BPI-chromatogram van het blanco serum (Figuur 2) werd opgenomen ter vergelijking om geneesmiddelafgeleide verbindingen te onderscheiden van endogene serumcomponenten. Op basis van de BPI van het medicatiehoudende serum (Figuur 3) werden in totaal 28 prototypecomponenten geïdentificeerd die in de bloedbaan zijn opgenomen, voornamelijk flavonoïden, terpenoïden en steroïden. Geëxtraheerde ionenchromatogrammen (EIC's) van representatieve verbindingen over het YQQJ-extract, blank serum en geneesmiddelhoudend serum bevestigden verder de aanwezigheid van geneesmiddelafgeleide componenten in de circulatie (Aanvullende Figuur 2). Hiervan zijn 10 verbindingen afkomstig van Spatholobus suberectus Dunn, 7 van Dioscorea nipponica Makino, 7 van Astragalus membranaceus, 6 van Hedyotis diffusa Willd., 6 van Lonicera japonica Thunb., 4 van Plantago asiatica L. en 4 van Rheum palmatum.L., zoals samengevat in Aanvullende Tabel 1.

Doelvoorspelling van door bloed opgenomen componenten van YQQJ gerelateerd aan IgAN
In totaal werden 28 geïdentificeerde prototypebestanddelen die in de bloedbaan terechtkwamen, ingevoerd in doelvoorspellingsdatabases, wat 459 potentiële doelwitten opleverde. Ondertussen werden 2779 IgAN-gerelateerde doelen opgehaald van geïntegreerde bio-informaticaplatforms. Snedeanalyse identificeerde 247 overlappende doelen tussen YQQJ en IgAN (Figuur 4).

Constructie en analyse van het PPI-netwerk
De 247 kruisende doelen werden geüpload naar het PPI-platform, en de visualisatiesoftware werd gebruikt om kerndoelen te screenen op basis van drie topologische parameters: DC, BC en CC. In totaal werden uiteindelijk 42 doelen geïdentificeerd als kernknooppunten. De workflow die wordt gebruikt voor het screenen van deze kerndoelen wordt samengevat in Aanvullende Figuur 3. In het PPI-netwerk varieerden de knooppuntgrootte en -kleur met parameterwaarden (Figuur 5), waaronder TP53, SRC, AKT1, ESR1 en STAT3 tot de top vijf kerndoelen behoorden.

"Formule–bloedopgenomen componenten–kerndoelen–routen–ziekte" netwerk van YQQJ
Om systematisch de multicomponent- en multi-doelmechanismen van YQQJ tegen IgAN te onthullen, werd een "Formula–Blood-Absorbed Components–Core Targets–Pathways–Disease" interactienetwerk opgebouwd met behulp van visualisatiesoftware. Het netwerk bestond uit 96 knooppunten en 459 randen, waarbij elke zijde een relatie of interactie tussen twee knooppunten vertegenwoordigde (Figuur 6).

GO- en KEGG-verrijkingsanalyses
GO-verrijkingsanalyse van de 42 kerndoelen toonde 1162 BP-termen, 52 CC-termen en 92 MF-termen aan. Figuur 7 toont de top 10 meest significant verrijkte GO-termen in BP-, CC- en MF-categorieën. KEGG-verrijkingsanalyse identificeerde verder 182 routes die met deze kerndoelen geassocieerd zijn. Figuur 8 toont de top 20 significant verrijkte routes die nauw verwant zijn aan de pathogenese van IgAN. In deze grafieken geven diepere rode kleuren een sterkere statistische significantie aan, terwijl grotere bubbelgroottes of langere balklengtes een groter aantal verrijkte doelen binnen elk pad aangeven.

Moleculaire koppelingsevaluatie
In deze studie, gebaseerd op de eerdere analyse van belangrijke doelen en gerelateerde routes van YQQJ bij de behandeling van IgAN 29,30,31,32, werden zes kerndoelen, waaronder CASP3 (PDB ID: 6X8I), IGF1R (PDB ID: 1JQH), JUN (PDB ID: 8RPP), STAT3 (PDB ID: 6NJS), PRKCB (PDB ID: 8SE3) EN PIK3CA (PDB ID: 5FI4), geselecteerd als receptoreiwitten voor moleculaire koppeling. Overeenkomstig met de kernpathogenese van IgAN in TCM, gedefinieerd als "pathogene wind, vochtige hitte en toxines die de nier binnendringen", werden representatieve actieve componenten met warmte-opruimende, vochtverwijderende en ontgiftende eigenschappen geselecteerd als liganden, namelijk deacetylasperulosidische zuur en geniposidinezuur van Hedyotis diffusa Willd., en Dioscine van Dioscorea nipponica. Makino. De dockingresultaten zijn weergegeven in Figuur 9. Van alle ligand-receptorcombinaties vertoonde Dioscin duidelijk lagere bindingsenergieën bij alle geselecteerde doelwitten, wat wijst op een hogere voorspelde bindingsaffiniteit. Afgezien van de interacties tussen JUN en deacetylasperulosidzuur/geniposidinezuur, vertoonden de andere koppelparen ook gunstige bindingsactiviteiten. Vertegenwoordigende 3D-dockingconformaties zijn te zien in Figuur 10.

figure-results-1
Figuur 1: Base Peak Ion chromatogrammen van YQQJ waterig extract. (A) Positieve ionenmodus BPI-chromatogram. (B) Negatieve ionenmodus BPI-chromatogram. De chromatogrammen tonen het algemene chemische profiel van het YQQJ-waterextract onder de gevestigde UHPLC-Q-Orbitrap HRMS-omstandigheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Base Peak Ion chromatogrammen van blank serum. (A) Positieve ionenmodus BPI-chromatogram. (B) Negatieve ionenmodus BPI-chromatogram. De chromatogrammen vertegenwoordigen het endogene serumachtergrondprofiel dat als controle wordt gebruikt voor vergelijking met medicijnhoudend serum om geneesmiddelafgeleide componenten te onderscheiden van endogene bestanddelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Base Peak Ion chromatogrammen van serum dat YQQJ bevat. (A) Positieve ionenmodus BPI-chromatogram. (B) Negatieve ionenmodus BPI-chromatogram. De chromatogrammen geven het profiel weer van door bloed opgenomen componenten die in het serum zijn aangetroffen na toediening van YQQJ. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Venn-diagram van overlappende doelen tussen YQQJ en IgAN. Het diagram toont het aantal voorspelde YQQJ-doelen, IgAN-gerelateerde doelen en hun kruispunten, waarbij de gedeelde doelen worden benadrukt die mogelijk betrokken zijn bij therapeutische effecten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerk van kerndoelwitten. Knooppunten vertegenwoordigen eiwitdoelen, en randen vertegenwoordigen interacties tussen doelen. Knooppuntgrootte en kleurintensiteit komen overeen met graadwaarden, waarbij grotere en donkerdere knooppunten een hogere connectiviteit binnen het netwerk aangeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Geïntegreerd netwerk van YQQJ-componenten, doelen, routes en ziekte. Het netwerk illustreert relaties tussen de formule, bloedopgenomen componenten, kerndoelen, routes en IgAN. Driehoek staat voor ziekte; cirkel stelt paden voor; De V-vormige knoop vertegenwoordigt de YQQJ-formule; diamant staat voor kruiden; hexagon vertegenwoordigt componenten; Octagon vertegenwoordigt prototype door bloed opgenomen componenten; De rechthoek stelt doelen voor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: GO-verrijkingsanalyse van kerndoelen. De bargrafiek toont de top 10 verrijkte genontologietermen in BP-, CC- en MF-categorieën. De x-as geeft GO-termen weer en de y-as toont −log10 (p-waarde), wat de betekenis van verrijking aangeeft. Afkortingen: BP = Biologisch proces; CC = cellulaire component; MF = Moleculaire functie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: KEGG-routeverrijkingsanalyse van kerndoelen. De bubbelgrafiek toont de top 20 verrijkte KEGG-paden. Stipgrootte geeft het aantal verrijkte genen aan, en de kleurgradiënt geeft −log10 (p-waarde) aan, waarbij roodere kleuren een hogere statistische significantie aangeven. De x-as toont de genverhouding, en de y-as geeft routetermen weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9: Moleculaire koppelingsenergie-warmtekaart. De heatmap toont bindingsenergieën (kcal/mol) tussen kerndoelen en belangrijke door bloed opgenomen verbindingen. Lagere bindingsenergiewaarden duiden op een sterkere voorspelde bindingsaffiniteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-10
Figuur 10: Representatieve moleculaire koppelingsconformaties. (A) Bindende conformatie van deacetylasperulosidezuur met CASP3. (B) Bindende conformatie van Dioscin met STAT3. (C) Bindingsconformatie van Geniposidinezuur met PIK3CA. De beelden tonen de voorspelde ligand-eiwitinteracties en bindingsoriëntaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 1: Structurele identificatie van representatieve verbindingen door hoogresolutie MS/MS. (A) Kop-tot-staart spectrale vergelijking van deacetylasperulosidzuur tussen het experimentele spectrum (boven, rood) en referentiedatabasespectrum (onder, blauw). (B) Hoogresolutie MS/MS fragmentatiespectrum van deacetylasperulosidzuur. (C) Head-to-tail spectrale vergelijking van Geniposidinezuur met de referentiedatabase. (D) Experimenteel MS/MS-fragmentatiespectrum van Geniposidinezuur. (E) Spectrale vergelijking van Dioscin met de referentiedatabase. (F) Hoogresolutie MS/MS fragmentatiespectrum van Dioscine. Deze panelen illustreren de spectrale matching die wordt gebruikt voor de identificatie van verbindingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: Geëxtraheerde ionchromatogrammen (EICs) van representatieve verbindingen over monsters heen. (A) EIC van deacetylasperulosidezuur. (B) EIC van Geniposidinezuur. (C) Hoofdinspecteur van Dioscin. Voor elk paneel vertegenwoordigt de bovenste spoor het YQQJ waterige extract (ZY), het middelste spoor het blanco controleserum (KBX), en het onderste spoor serummonsters met bloedgeabsorbeerde componenten na toediening van YQQJ (GYX). De vergelijking benadrukt de aanwezigheid van door medicijnen afgeleide verbindingen in serum. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 3: Werkwijze voor het screenen van kerndoelen. Het stroomdiagram illustreert het stapsgewijze proces van doelidentificatie, inclusief samengestelde doelwitvoorspelling, IgAN-gerelateerde doelverzameling, intersectieanalyse, PPI-netwerkconstructie en screening van kerndoelen op basis van topologische parameters. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Tijd (min)Mobiele fase
A (v%)B (v%)
0982
1.0982
14.07030
25.00100
28.00100
28.1982
30.0982

Tabel 1: UHPLC-gradiënt-elusieprogramma. De tabel toont de mobiele fasesamenstelling en gradiëntcondities die worden gebruikt voor chromatografische scheiding, inclusief tijdspunten en de bijbehorende verhoudingen van waterige (Fase A) en organische (Fase B) oplosmiddelen.

Aanvullende tabel 1: Geïdentificeerde chemische bestanddelen van YQQJ waterige extract. De tabel geeft een overzicht van verbindingen die zijn geïdentificeerd door UHPLC-Q-Orbitrap HRMS, inclusief prototype bloedgeabsorbeerde componenten (A1–A28), samen met hun classificatie en kruidenherkomst. Afkortingen: BHSSC = Hedyotis diffusa Willd.; CSL = Dioscorea nipponica Makino; DH = Rheum palmatum L.; JXT = Spatholobus suberectus Dunn; HQ = Astragalus membranaceus.; CQC = Plantago asiatica L.; JYH = Lonicera japonica. Thunb. Samengestelde klassen zijn onder andere A = Alkaloïden; Ald = Aldehyden; F = flavonoïden; N = Nucleosiden; O = Overigen; OA = Organische zuren; P = fenolen; PA = fenolzuur; Phe = fenylpropanoïden; Q = Quinonen; S = Sacchariden; Ste = Steroïden; T = Terpenoïden; Tan = tannines. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

In de huidige studie werd een geïntegreerde strategie gebruikt die "UHPLC-Q-Orbitrap HRMS-identificatie – serumfarmacochemie-analyse – netwerkfarmacologievoorspelling – moleculaire dockingvalidatie" inzet om systematisch de potentiële materiële basis en mechanismen van YQQJ in de behandeling van IgAN te verduidelijken. In tegenstelling tot eerder onderzoek dat voornamelijk vertrouwde op MS om chemische bestanddelen van kruidenformules te analyseren en vervolgens mechanismen voorspelde met alleen netwerkfarmacologie16, volgt serumfarmacochemie een workflow van "complexe kruidenbestanddelen – bloedopgenomen componenten – directe in vivo werkzame stoffen – farmacodynamisch materiaalbasis". Door de componenten te identificeren die na toediening in systemische circulatie terechtkomen, wordt deze aanpak algemeen beschouwd als een effectieve strategie om de farmacodynamische materiaalbasis van TCM-formules te identificeren.

In deze studie identificeerde UHPLC-Q-Orbitrap HRMS-analyse aanvankelijk 185 bestanddelen in YQQJ, waarvan 28 werden bevestigd als prototype door bloed opgenomen verbindingen, wat een betrouwbare chemische basis vormde voor latere mechanistische studies. De nauwkeurigheid van deze identificatie hing af van de uitgebreide matching van retentietijd, exacte massa en MS/MS-fragmentatie-informatie14. Op basis van de serumfarmacochemiestrategie werden deze prototype bloedgeabsorbeerde verbindingen gebruikt als uitgangspunt voor netwerkopbouw, wat de relevantie tussen kruidencomponenten en de daadwerkelijke in vivo werkzaamheidvergrootte. Door het integreren van verbinding–ziekte kruisende doelen met PPI-gebaseerde screening van kernknopen, gevolgd door GO- en KEGG-verrijkingsanalyses, werden15 belangrijke signaalroutes geassocieerd met IgAN geïdentificeerd. Moleculaire koppelingsresultaten suggereerden dat de belangrijkste door bloed opgenomen componenten afkomstig zijn van Hedyotis diffusa Willd. en Dioscorea nipponica Makino.kan interageren met kerndoelen op basis van voorspelde bindingsaffiniteiten in plaats van experimenteel bevestigde functionele activiteit. Deze bevindingen ondersteunen de hypothese dat deacetylasperulosidezuur, geniposidinezuur en Dioscin mogelijk de belangrijkste farmacodynamische bestanddelen van YQQJ zijn, in afwachting van verdere experimentele validatie.

Vanuit technisch oogpunt was voorbehandeling van een steekproef cruciaal. Door de complexiteit van het serum en de aanwezigheid van endogene eiwitten (bijv. hormonen en enzymen) is interferentie met de detectie van door bloed opgenomen componenten onvermijdelijk. In deze studie werd methanolprecipitatie toegepast om analyten te verrijken en achtergrondinterferentie te verminderen, waardoor zowel gevoeligheid als nauwkeurigheid van MS-analyse34 werden gegarandeerd. Wat betreft tijdspunten voor bloedafname kunnen verschillende bestanddelen in kruidenformules verschillende opname- en in vivo-transformatiepatronen vertonen, wat hun detecteerbaarheid in serum kan beïnvloeden. Daarom werden op basis van voorlopige onderzoeken serummonsters 2 uur en 8 uur na de laatste toediening genomen om de dekking van circulerende bestanddelen te maximaliseren.

Verschillende procedurele stappen bleken bijzonder cruciaal voor de succesvolle implementatie van deze workflow. Nauwkeurige identificatie van verbindingen is sterk afhankelijk van de gecombineerde evaluatie van retentietijd, hoge resolutie massanauwkeurigheid en diagnostische MS/MS-fragmentionen. Daarnaast zijn geschikte tijdstippen voor serummonstering essentieel om bloedopgenomen bestanddelen op te vangen die op verschillende stadia na toediening in de circulatie kunnen verschijnen. Zorgvuldige optimalisatie van de voorbehandelings- en chromatografische scheidingsvoorwaarden is daarom noodzakelijk om betrouwbare detectie van prototypeverbindingen in complexe biologische matrices te waarborgen.

Potentiële analytische uitdagingen kunnen zich voordoen tijdens de monstervoorbereiding en MS-analyse. Zo kan onvolledige eiwitprecipitatie resulteren in matrixeffecten die de ionisatie-efficiëntie onderdrukken, terwijl overmatig achtergrondgeluid de detectiegevoeligheid kan verminderen. Deze problemen kunnen worden verminderd door oplosmiddelverhoudingen tijdens eiwitprecipitatie te optimaliseren, chromatografische scheidingscondities te verbeteren en MS-opnameparameters aan te passen. Tijdens gegevensverwerking kunnen vals-positieve samengestelde annotaties optreden wanneer uitsluitend wordt vertrouwd op databasematching; daarom wordt handmatige verificatie van MS/MS-fragmentatiepatronen en retentiegedrag aanbevolen om de betrouwbaarheid van identificatie te verbeteren.

Verschillende methodologische overwegingen werden in dit werk opgenomen. Ten eerste werden in plaats van conventionele criteria zoals orale biobeschikbaarheid en geneesmiddellijkheid toe te passen, alleen experimenteel geverifieerde door bloed opgenomen componenten gebruikt voor de doelvoorspelling. Deze benadering voorkwam het mogelijk weglaten van actieve verbindingen door vooraf ingestelde filterdrempels en elimineerde irrelevante bestanddelen die niet biobeschikbaar zijn in vivo, waardoor de fysiologische relevantie van netwerkvoorspelling16 werd versterkt. Ten tweede richtte de selectie van actieve liganden voor koppeling zich specifiek op belangrijke componenten afkomstig van kruiden met functies als "windvochtigheid verdrijven en hittetoxine opruimen" (Hedyotis diffusa Willd. en Dioscorea nipponica Makino), waarmee een mechanistische brug werd gelegd tussen het TCM-pathologische concept van "windvocht-hittetoxine die de nier binnendringt" en de moderne pathologische kenmerken van IgAN. Dit levert voorlopig bewijs ter ondersteuning van de TCM-theorie van formule-patroon correlatie. Ten derde, rekening houdend met mogelijke verschillen in datagrootte en -kwaliteit tussen databases, werden meerdere platforms geïntegreerd om de doeldekking te verbreden en de vooringenomenheid die door één enkele database35 wordt geïntroduceerd te verminderen.

In vergelijking met conventionele strategieën die netwerkfarmacologie direct toepassen op alle gedetecteerde chemische bestanddelen, legt de huidige workflow de nadruk op evidence-based prioritering van verbindingen op basis van experimenteel gedetecteerde door bloed opgenomen componenten. Dit stapsgewijze filterproces vermindert het aantal kandidaatverbindingen dat in computationele analyse komt en verbetert de interpreteerbaarheid van verbinding–doel-interactienetwerken. Bovendien richt de huidige strategie, in tegenstelling tot op metabolomics gerichte studies die voornamelijk endogene metabole verstoringen vastleggen, zich op exogene prototypeverbindingen afkomstig van kruidengeneesmiddelen, waardoor een directere toeschrijving van farmacologische activiteit aan specifieke kruidenbestanddelen mogelijk wordt.

Vanuit praktisch methodologisch perspectief biedt deze workflow verschillende voordelen voor het onderzoeken van complexe kruidenformuleringen. De integratie van HRMS met serumfarmacochemie maakt de betrouwbare identificatie van bio-beschikbare bestanddelen mogelijk, terwijl de daaropvolgende combinatie van netwerkfarmacologie en moleculaire koppeling een hiërarchisch analytisch kader opzet dat chemisch bewijs koppelt aan mechanistische voorspellingen. Daarnaast vermindert het beperken van netwerkconstructie tot experimenteel geverifieerde verbindingen de netwerkcomplexiteit en vergemakkelijkt het duidelijkere identificatie van kerninteracties tussen verbinding en doel.

Deze studie kent ook beperkingen. Ten eerste zijn netwerkfarmacologie en moleculaire koppeling voorspellende computationele benaderingen. Sterke bindingsaffiniteit vertaalt zich niet noodzakelijkerwijs in biologische regulatie in vivo, aangezien moleculaire koppeling geen rekening houdt met eiwitdynamica, cellulaire context of downstream signalering. Bovendien bevatte het huidige dockingprotocol geen her-docking validatie met co-gekristalliseerde liganden of benchmarking tegen bekende inhibitoren, wat de beoordeling van dockingnauwkeurigheid kan beperken. Toekomstige studies met RMSD-gebaseerde validatie, moleculaire dynamica-simulaties en experimentele assays zullen de betrouwbaarheid van deze voorspellingen verder versterken. Momenteel heeft onze groep mechanistische validatie afgerond waaruit blijkt dat Dioscin werkt via de JAK2/STAT3-route, wat de geloofwaardigheid van de voorspelling enigszins versterkt en gedeeltelijke experimentele ondersteuning biedt voor de belangrijkste doelwitten die in deze studie zijn geïdentificeerd, hoewel andere component–doelwitinteracties nog bevestiging36 vereisen. Ten tweede werden de invloeden van proportionele compatibiliteit en doseringsrelaties tussen kruiden niet meegenomen in de huidige analyse. Toekomstig werk kan dose-effect-gewogen netwerkmodellen introduceren om klinische voorschrijfpraktijken beter te weerspiegelen37.

Samenvattend maakt de huidige workflow—hoogresolutie MS-gebaseerde identificatie van bloedopgenomen bestanddelen, netwerkfarmacologie-gebaseerde doel- en padgerichte analyse, en moleculaire dockingvalidatie—efficiënte versmalling van de basis van het actieve materiaal en actiedoelen vanuit een complexe kruidenformule mogelijk. Dit biedt een duidelijke experimentele richting voor opvolging van biologische verificatie en versnelt mechanistische onderzoeken van TCM-formules. In de toekomst kan het integreren van ruimtelijke metabolomics, organoïde modellen en multi-omics-technologieën dynamische en driedimensionale validatie en uitbreiding van de huidige bevindingen mogelijk maken in systemen die fysiologische en pathologische omstandigheden nauwkeuriger reproduceren, waardoor robuuster bewijs wordt geleverd voor het verduidelijken van de wetenschappelijke basis van TCM-formules.

Openbaarmakingen

De auteurs geven geen belangenconflicten aan.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidienummer 81973675), het High-Level Chinese Medical Hospital Promotion Project (subsidienummer HLCMHPP2023039), en de Beijing Natural Science Foundation (subsidie nr. 7252259).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AutoDock 4.2.6The Scripts Research Institute-
Chromatografische kolomWaters Corp.ACQUITY UPLC HSS T3
Hogesnelheids gekoelde centrifugeHettich Lab TechnologyMikro 220R
Geïntegreerde bioinformaticaplatformenWeizmann Institute of Science-GeneCards database (https://www.genecards.org/)
Geïntegreerde bioinformaticaplatformenThe Johns Hopkins University School of Medicine-OMIM database (https://omim.org/).
LC-MS/4 L AcetonitrilThermo Fisher ScientificA955-4
LC-MS/4 L MethanolThermo Fisher ScientificA456-4
LC-MS/4 L WaterThermo Fisher ScientificW6-4
LC-MS/50 mL MierenzuurThermo Fisher ScientificA117-50
Massaspectrometrie dataverwerkingssoftwareWaters Corp.-Progenesis QI 3.0 software
Moleculair dockingsoftwareOlson LaboratoryAutoDock 4.2.6
PPI-platformSTRING database company-Het STRING online platform (https://string-db.org)
EiwitdatabaseEuropean Bioinformatics Institute; the Swiss Institute of Bioinformatics; Protein Information Resource-UniProt platform (https://www.uniprot.org/)
Quadruple orbitrap massaspectrometerThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZR
Referentie verbindings databasesTCM Pro 2.0, Beijing Hexin Technology Co., Ltd.-
RotorverdamperShanghai Titan Scientific Co., LtdTR-3L
Structurele biologie databases.Brookhaven National Laboratory-De RCSB PDB database (https://www.rcsb.org/)
Structurele biologie databases.National Center for Biotechnology Information-De PubChem database (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)
Doelvoorspelling databasesSIB Swiss Institute of Bioinformatics-SwissTargetPrediction database (https://www.swisstargetprediction.ch)
Doelvoorspelling databasesShanghai Institute of Materia Medica-TCMSP database (https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php)
Topologische analyse plugin--Centiscape 2.2 plugin; Network Analyzer
UHPLC systeemVanquish Flex-
Ultra-hoge prestaties vloeistof chromatograafThermo Fisher ScientificVanquish Flex UHPLC
Ultrasonische extractorKunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.KQ3200D
Vacuum Centrifugale ConcentratorNingBo Scientz Biotechnology Co., Ltd.SCIENTZ-1LS
Visualisatie software--Cytoscape 3.10.4
Webgebaseerd functioneel annotaties platform.Broad Institute-De Metascape online platform (https://metascape.org)

Referenties

  1. Pattrapornpisut, P., Avila-Casado, C., Reich, H. N. IgA nephropathy: Core curriculum 2021. Am J Kidney Dis. 78 (3), 429-441 (2021).
  2. Pitcher, D., et al. Long-term outcomes in IgA nephropathy. Clin J Am Soc Nephrol. 18 (6), 727-738 (2023).
  3. Shen, X., et al. Long-term outcomes of IgA nephropathy in China. Nephrol Dial Transplant. 40 (6), 1137-1146 (2025).
  4. Roberts, I. S. D. Pathology of IgA nephropathy: A global perspective. Nephrology (Carlton). 29 (Suppl 2), 71-74 (2024).
  5. Floege, J., Bernier-Jean, A., Barratt, J., Rovin, B. Treatment of patients with IgA nephropathy: A call for a new paradigm. Kidney Int. 107 (4), 640-651 (2025).
  6. Zhang, Y., Zhang, H. Current understanding and new insights in the treatment of IgA nephropathy. Nephrology (Carlton). 29 (Suppl 2), 75-79 (2024).
  7. Kang, S. Comparative analysis of western medicine and traditional Chinese medicine. 4th Int. Conf. Social Sciences and Humanities and Arts (SSHA 2025), 2025, , 350-355 (2025).
  8. Wang, X. H., et al. Traditional Chinese medicine in treating IgA nephropathy. J Transl Intern Med. 9 (3), 161-167 (2021).
  9. Zeng, Q., Xu, J. L., Liang, Y., Yu, R. H. Etiology and treatment progress of IgA nephropathy. Med Recapitulate. 28 (1), 163-167 (2022).
  10. Guo, T., et al. Regulation of immune dysfunction in IgA nephropathy. Chin J Basic Med Tradit Chin Med. 30 (3), 552-555 (2024).
  11. Deng, Q. H., Zou, D., Zhang, S. L., Zhou, X. Regulation of mucosal immunity in IgA nephropathy. Acta Chin Med. 40 (5), 1026-1031 (2025).
  12. Zhang, S. Q., Rao, X. R., Dai, X. W. Clinical observation of Yiqi Qingjie Fang. Guangming J Chin Med. (12), 44-45 (2006).
  13. Dong, M. Y., et al. Efficacy of Yiqi Qingjie Fang combined with immunosuppressants. Chin J Integr Tradit West Med. 39 (7), 791-797 (2019).
  14. Yu, Y., Yao, C., Guo, D. A. Chemical basis of traditional Chinese medicine. Acta Pharm Sin B. 11 (6), 1469-1492 (2021).
  15. Zhou, W. X., Cheng, X. R., Zhang, Y. X. Network pharmacology: A new concept. Chin J Pharmacol Toxicol. 26 (1), 4-9 (2012).
  16. Huang, Q., et al. Active components of Eucommia ulmoides. Chin J New Drugs Clin Rem. 40 (6), 460-469 (2021).
  17. Zhang, A. H., et al. Chinmedomics approach. Engineering. 5 (1), 60-68 (2019).
  18. Wang, X., Zhang, A., Sun, H., Yan, G. Serum pharmacochemistry of TCM. Phytother Res. 31, 7-14 (2017).
  19. Liu, R., Zhao, Z., Dai, S., Che, X., Liu, W. Bioactive compound identification. J Agric Food Chem. 67 (13), 3811-3825 (2019).
  20. Xu, S. Y., Bian, R. L., Chen, X. Pharmacological experimental methodology. Chin Pharmacol Bull. (1), 19(1992).
  21. Szklarczyk, D., et al. STRING v11 database. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D607-D613 (2019).
  22. Shannon, P., et al. Cytoscape software. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  23. Jeong, H., Mason, S. P., Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Protein network centrality. Nature. 411 (6833), 41-42 (2001).
  24. Joy, M. P., Brock, A., Ingber, D. E., Huang, S. High-betweenness proteins. J Biomed Biotechnol. (2), 96-103 (2005).
  25. Wuchty, S., Stadler, P. F. Centers of complex networks. J Theor Biol. 223 (1), 45-53 (2003).
  26. Zhou, Y., et al. Metascape resource. Nat Commun. 10 (1), 1523(2019).
  27. Burley, S. K., et al. RCSB PDB resources. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D564-D574 (2025).
  28. Laskowski, R. A., Swindells, M. B. LigPlot+. J Chem Inf Model. 51 (10), 2778-2786 (2011).
  29. Cheung, C. K., et al. Pathogenesis of IgA nephropathy. Nat Rev Nephrol. 21 (1), 9-23 (2025).
  30. Zhao, L., et al. Triptolide and IgA nephropathy. Cell Prolif. 55 (9), e13278(2022).
  31. Tao, J., et al. JAK-STAT activity in IgA nephropathy. Clin J Am Soc Nephrol. 15 (7), 973-982 (2020).
  32. Cox, S. N., et al. Wnt/β-catenin and PI3K/AKT pathways. Kidney Int. 78 (4), 396-407 (2010).
  33. Nie, X., et al. Huagan Jian analysis. Chin Tradit Herb Drugs. 53 (2), 382-394 (2022).
  34. Wu, X. W., et al. Serum pharmacochemistry methodology. Chin J Exp Tradit Med Formulae. 25 (3), 173-179 (2019).
  35. Abbasi, K., et al. Deep learning in drug target prediction. Curr Med Chem. 28 (11), 2100-2113 (2021).
  36. Zhou, L., et al. Dioscorea nipponica mechanisms. J Ethnopharmacol. 353 (Pt A), 120272(2025).
  37. Zhang, K. Y., et al. Dose–effect network pharmacology. Chin J Hosp Pharm. 43 (7), 738-747 (2023).

Herprints en machtigingen

Tags

Moleculaire DockingBloedgeabsorbeerde ComponentenComponentidentificatieProte ne interactienetwerkKEGG padTraditionele Chinese Geneeskunde
Verklaring van de materiële basis van de Yiqi Qingjie-formule tegen IgA-nefropathie met behulp van UHPLC-Q-Orbitrap HRMS geïntegreerd met netwerkfarmacologie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.