Method Article

Het ontcijferen van het epitranscriptoom: In Silico Inzichten in het m6A-regulerend netwerk bij borstkanker

DOI:

10.3791/70545

⸱

June 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, College of Science and General Studies, Alfaisal University, 2Department of Biological and Biomedical Sciences, Aga Khan University, 3College of Medicine, Alfaisal University, 4Affiliated Hospital of Hunan University, School of Biomedical Sciences, Hunan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een benadering voor het uitvoeren van in silico genetische, moleculaire en prognostische analyses van m6A-modificatieregulatoren door mutatieprofielen, kopienummerveranderingen, genexpressie en klinische uitkomsten te integreren met behulp van publiek beschikbare datasets van de Cancer Genome Atlas (TCGA), het Genotype-Tissue Expression (GTEx) project en microarrayplatforms.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N6-methyladenosine (m6A) is de meest voorkomende interne RNA-modificatie in eukaryote transcripten en speelt een cruciale rol in RNA-metabolisme, genexpressie en cellulaire homeostase. Ontregeling van m6A-regulatoren, waaronder "schrijvers", "gummen" en "lezers", wordt steeds meer betrokken bij kankerbiologie; hun uitgebreide rol bij borstkanker moet echter nog duidelijk worden. Het primaire doel van dit artikel, waar deze methoden werkt, is om beginners in de bio-informatica een stapsgewijs kader te bieden voor het gebruik van publiek beschikbare kankerdatasets om mutatieanalyses uit te voeren, veranderingen in genexpressie te beoordelen en hun relaties met patiëntoverleving te onderzoeken. Als casestudy werden m6A-regulatoren bij borstkanker geanalyseerd met behulp van datasets van de Cancer Genome Atlas (TCGA), het Genotype-Tissue Expression (GTEx) project en microarrayplatforms. Transcriptomische profielen werden systematisch geanalyseerd om workflows aan te tonen voor het evalueren van de prognostische relevantie van m6A-regulerende componenten bij borstkanker. Met dit analytische kader werden duidelijke patronen van genetische veranderingen en differentiële expressie onder belangrijke m6A-regulatoren geïdentificeerd. Verschillende regulatoren, waaronder METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 en RBMX, waren geassocieerd met een betere overleving van patiënten, terwijl YWHAG geassocieerd was met een slechte algehele overleving. Deze studie biedt een uitgebreid overzicht van systeemgenomica van m6A-regulatorische genen bij borstkanker en demonstreert een praktische en reproduceerbare webgebaseerde bio-informatica-workflow. Deze bevindingen bevorderen het begrip van epitranscriptomische regulatie bij borstkanker en vormen een basis voor de ontwikkeling van nieuwe m6A-gebaseerde diagnostische en therapeutische strategieën.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitranscriptomische modificaties vormen een belangrijke laag van post-transcriptionele genregulatie en dragen bij aan diverse cellulaire processen en ziektetoestanden. Van de meer dan 170 tot nu toe geïdentificeerde RNA-modificaties is N6-methyladenosine (m6A) het meest voorkomend en goed gekarakteriseerd in eukaryote mRNA's1. Geïnstalleerd door "writer"-complexen waaronder METTL3/METTL14, verwijderd door "erasers" waaronder FTO en ALKBH5, en geïnterpreteerd door "reader"-eiwitten waaronder leden van de YTH- en IGF2BP-familie, orkestreert m6A RNA-splicing, stabiliteit, transport en translatie, en beïnvloedt zo belangrijke biologische processen zoals ontwikkeling, differentiatie en stressrespons 2,3.

Veranderingen in m6A-regulerende componenten zijn gerapporteerd over een breed spectrum van maligniteiten4. Bij veel kankers veroorzaakt afwijkende m6A-activiteit kwaadaardige fenotypen; bijvoorbeeld, verhoogde expressie van METTL3 bevordert de initiatie en progressie van prostaatkanker door het moduleren van de hedgehog-route en MYC RNA-methylering 5,6. Aanvankelijk werd vastgesteld dat FTO betrokken was bij het uitoefenen van oncogene effecten bij acute myeloïde leukemie, maar het bleek tumorprogressie te stimuleren bij lever-, long- en colorectale kanker 7,8,9,10. Echter, contextafhankelijke rollen van FTO en ALKBH5 werden geïdentificeerd die de dubbele aard van m6A-gemedieerde regulatie illustreren, die zowel de oncogene als tumorsuppressieve signalering kan bevorderen 11,12,13,14. M6A-lezers, waaronder YTHDF1/2/3, heterogene nucleaire ribonucleoproteïnen (hnRNP's) en insuline-achtige groeifactor-2 mRNA-bindende eiwitten (IGF2BP1-3), zijn ook geassocieerd met carcinogenese 15,16,17.

Bij borstkanker wijst er steeds meer bewijs op dat m6A-regulatoren vaak ontregeld zijn en mogelijk geassocieerd zijn met tumorsubtypes, immuungerelateerde kenmerken en klinische uitkomsten18,19. Meerdere mechanistische studies positioneren METTL3 als een vaak geupreguleerde pro-oncogene factor bij borstkanker. METTL3-gemedieerde m6A-installatie kan de translatie van transcripten stabiliseren of versterken die proliferatie, epitheliaal-mesenchymale overgang (EMT), metastase en chemoresistentiebevorderen. Er is ook aangetoond dat METTL3 de progressie van borstkanker bevordert door te richten op Bcl-221. ALKBH5 is betrokken bij de regulering van kankerstam-programma's via NANOG en andere stam-gerelateerde moleculen, maar de invloed ervan kan variëren per tumorcontext22.

Nu de lijst van m6A-regulatoren de afgelopen jaren blijft groeien, is een update nodig over hoe de nieuw geïdentificeerde regulatoren mogelijk ontregeld zijn bij borstkanker. Tabel 1 geeft een lijst van m6A-regelaars die schrijvers, lezers en gummen van m6A-modificatie bevatten. Daarnaast zijn nieuwe m6A-regulatoren, waaronder LRPPRC en YWHAG, geïdentificeerd met implicaties voor kankerprogressie 23,24,25. Daarom is een uitgebreide genetische en moleculaire karakterisering van alle bekende m6A-regulatoren uitgevoerd bij borstkanker met behulp van instrumenten die door onderzoekers met beperkte bio-informatische achtergrond kunnen worden gebruikt.

Het doel van dit artikel over Methodes is om een stapsgewijs, platformgebaseerd bio-informaticaprotocol te presenteren voor het analyseren van m6A-regulatoren bij borstkanker met behulp van publiek beschikbare bronnen voor kankergenomica. Met behulp van datasets van The Cancer Genome Atlas (TCGA) (www.cancer.gov/tcga), het Genotype Tissue Expression (GTEx) project26 en webgebaseerde analyseplatforms zoals cBioPortal en UCSC Xena, demonstreert dit protocol reproduceerbare workflows voor het beoordelen van mutatieprofielen, genexpressieveranderingen en de associatie met patiëntoverleving. Deze gevisualiseerde en toegankelijke aanpak is bedoeld om de adoptie van epitranscriptomische data-analyse door onderzoekers die nieuw zijn in kankerbio-informatica te vergemakkelijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: De lijst van genen die coderen voor m6A-methylatieregulatoren, gecategoriseerd als schrijvers, lezers en gummen, wordt gepresenteerd in Tabel 1. Alle genoemde genen werden opgenomen in de daaropvolgende analyses van mutaties, expressiepatronen en algehele overleving. Alle software en hulpmiddelen die in deze studie worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaallijst.

1. Identificatie van genetische veranderingen in m6A-regulatoren

  1. Toegang tot het cBioPortal voor kankergenomica. Ga naar de cBioportal-website (www.cbioportal.org)27,28. Selecteer vanaf de homepage het tabblad "Query" om een nieuwe analyse te starten.
  2. Selecteer de juiste kankerstudie en cohort.
  3. In de zoekbalk "Select Studies for Visualization and Analysis" typ je "Breast Invasive Carcinoma" en selecteer je "Breast Invasive Carcinoma (TCGA, Pan-Cancer Atlas)".
  4. Selecteer onderaan "Query by Gene".
    CRUCIAAL: Zorg ervoor dat de geselecteerde cohort (996 monsters) zowel mutatie- als copy-number alteration (CNA)-gegevens bevat.
  5. Definieer de genetische vraag. In de "Enter Gens" voer je de HUGO-gensymbolen in voor de volledige lijst van m6A-regulatoren die worden onderzocht.
    OPMERKING: Genen kunnen worden ingevoerd als een lijst gescheiden door spaties (spaties gescheiden). Onder "Selecteer genomische profielen" wordt gecontroleerd op de volgende twee datatypen: mutaties en kopienummerveranderingen.
  6. Kies onder "Selecteer patiënt/casusset" de standaard steekproefset die overeenkomt met de cohort met alle profielcasussen.
  7. Klik op de blauwe knop "Query indienen".
  8. Haal de gegevens over genetische veranderingen op en interpreteer ze. Bij het indienen wordt het resultaat geladen op het tabblad "samenvatting". De centrale "OncoPrint"-visualisatie geeft een direct overzicht van genetische veranderingen in alle geraadpleegde genen in de cohort, die gedownload kunnen worden.
  9. Naast de OncoPrint vindt u de grafiek "Cancer Type Summary". Dit geeft een kwantitatieve uitsplitsing van veranderingen tussen de subtypen van borstkanker.
  10. Voer een pankankeranalyse uit. Ga terug naar de cBioPortal-homepage en selecteer "TCGA PanCancer Atlas Studies" onder het tabblad "Query".
  11. In het geninvoervak voer je dezelfde lijst van m6A-regulatorgenen in.
  12. Klik op "Query indienen" en ga op de resultatenpagina naar het tabblad "Cancer Types Summary". Dit geeft een pankanker-perspectief.

2. Vergelijkende transcriptomische analyse van m6A-regulatoren met behulp van UCSC Xena.

  1. Toegang tot het UCSC Xena Platform. Ga naar de UCSC Xena-website (https://xena.ucsc.edu)29.
  2. Klik vanaf de homepage op de knop "Launch Xena" om de hoofdanalysebrowser te openen.
  3. Klik in de Xena-browser op "DATA SETS".
  4. Selecteer onder de datasets "TCGA TARGET GTEx". Dit bevat uniform verwerkte RNA-Seq-gegevens uit de normale weefsels van de TCGA- en GTEx-projecten.
  5. Klik op de volgende pagina op "VISUALISEER".
  6. Definieer de fenotype (steekproefgroep) variabele. Selecteer in de "Selecteer uw eerste variabele" "Hoofdcategorie" in het fenotypische datatype.
  7. Klik op "TO SECOND VARIABLE". Vervolgens vinkt u in het genomische datatype "Genexpressie" aan in de dataset. Voeg de genenlijst toe in het vakje "Gen of Positie toevoegen". Klik op "Klaar".
  8. Visualiseer expressiepatronen met een heatmap.
  9. Om de borstmonsters (TCGA+GTEx) te scheiden van de TCGA TARGET GTEx, typ je "Borst" en gebruik je de filteroptie om monsters te bewaren.
  10. De heatmap is nu zichtbaar en kan als PDF worden gedownload.
  11. Genereer vergelijkende boxplots voor individuele genen. Om expressieverschillen voor een specifiek gen te kwantificeren en te visualiseren, gebruik je de "View as chart". Met deze optie kunnen gegevens worden bekeken als een boxplot, een dotplot en een vioolplot, waarbij de expressieverdeling tussen de twee steekproefgroepen wordt vergeleken.
  12. Gebruik de optie "Download als PDF" om de grafieken te downloaden.
  13. Statistische significantie (p-waarde) kan worden verkregen door op "STATISTICS" te klikken.

3. Beoordeling van de prognostische betekenis van m6A-regulatoren met behulp van de Kaplan-Meier-plotter.

  1. Toegang tot de Kaplan-Meier Plotter-tool. Ga naar de Kaplan-Meier Plotter website (https://kmplot.com/analysis)30.
  2. Selecteer vanaf de homepage het tabblad "borstkanker" om een analyse te starten die specifiek is voor borstkankerdatasets.
  3. Configureer de genquery voor één enkel gen.
  4. Zoek in de primaire invoersectie het vakje "Gen-symbool".
  5. Hier komt het officiële symbool van het m6A-regulatorgen dat geanalyseerd moet worden (bijv. METTL3).
    KRITIEK: Direct onder het geninvoervakje, zoek en activeer het selectievakje voor "Only JetSet best probe set". Dit zorgt ervoor dat de meest betrouwbare en specifieke microarray-probe automatisch wordt geselecteerd voor uw gen, waardoor de datakwaliteit en reproduceerbaarheid worden geoptimaliseerd.
  6. Definieer de parameters van de overlevingsanalyse. Selecteer in de sectie "Survival" "Overall survival (OS)" als het primaire eindpunt voor deze analyse. De tool zal automatisch gegevens gebruiken van 1880 borstkankerpatiënten wanneer deze instelling wordt geselecteerd.
  7. Zorg ervoor dat de optie "Patiënten splitsen op" op "mediaan" staat. Dit zal patiënten in twee gelijke groepen indelen; hoge en lage expressie, gebaseerd op de mediane expressiewaarde van het geraadpleegde gen over alle monsters.
  8. "Follow-up threshold" kan worden gebruikt om de follow-up periode te selecteren. Voor deze studie werd 180 maanden geselecteerd.
  9. Genereer en interpreteer het Kaplan-Meier-plot.
  10. Klik op de knop "Kaplan-Meier Plot tekenen".
  11. Er wordt een nieuw venster geladen dat de overlevingscurve toont.
  12. Interpreteer de belangrijkste plotelementen; De X-as geeft tijd in maanden aan, de Y-as toont de kans op totale overleving, de twee gekleurde lijnen stellen de overlevingscurves voor de patiëntengroepen met hoge expressie (rood) en lage expressie (zwart). De log-rang P-waarde wordt weergegeven, wat de statistische significantie van het verschil tussen de twee overlevingscurves aangeeft.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mutatielandschap van m6a-methylatieregulatoren bij borstkanker

In een eerdere studie over de genomische analyse van TCGA-datasets werden recidiverende mutaties in verschillende genen die coderen voor DNA-methylering gerapporteerd31. In de huidige studie werd cBioPortal gebruikt om de dataset "Breast Invasive Carcinoma (TCGA, PanCancer Atlas)" te analyseren om mutatieprofielen van genen te onderzoeken die coderen voor de schrijvers, lezers en gums van m6A RNA-methylering. Deze analyse toonde diverse genetische veranderingen aan bij borstkankerpatiënten, waarbij de frequentie van veranderingen aanzienlijk varieerde tussen genen – van 0,4% bij CNBP en RBM15B tot 12% bij VIRMA (Figuur 1A). Genamplificatie was de meest voorkomende verandering, terwijl aanvullende gebeurtenissen diepe deleties, basissubstituties en meerdere gelijktijdige alteraties omvatten. Opmerkelijk is dat veranderingen in genen die m6A-gerelateerde functies reguleren werden vastgesteld bij 476 patiënten (48% van de cohort) (Figuur 1B), wat het belang van m6A-modificatiedynamiek bij borstkanker onderstreept. Hoewel de frequentie van verschillende alteratietypen varieerde, werden dergelijke mutaties waargenomen bij alle moleculaire subtypes van borstkanker (Figuur 1C). Voor validatie werden PIK3CA, TP53, CDH1 en GATA3 opgenomen als referentiecontrolegenen (Figuur 1A). Opvallend was dat veranderingen in het m6A-regulerende mechanisme niet beperkt waren tot borstkanker. Analyse van 10.967 monsters van 10.953 patiënten uit 32 studies in de TCGA Pan-Cancer Atlas toonde geconserveerde mutatiepatronen aan in een breed scala aan kankertypen. Onlangs is aangetoond dat de m6A-route vaak veranderd is bij prostaatkanker (PCa) en over het algemeen een pro-oncogene rol32 uitoefent. Deze bevindingen geven aan dat mutaties die genen beïnvloeden die coderen voor de schrijvers, lezers en gummen van m6A RNA-modificatie een veelvoorkomend kenmerk zijn bij meerdere kankers (Figuur 2).

Afwijkende genexpressieprofielen bij borstkanker

Opkomend bewijs wijst op transcriptomische verstoringen als belangrijke bijdragers aan tumorgenese, waarbij abnormale genexpressie potentieel biedt als biomarkers bij borstkanker. Om dit te onderzoeken werden transcriptniveaus van genen die m6A-modificatie reguleren geanalyseerd met behulp van gegevens van de TCGA en het Genotype Tissue Expression (GTEx)-project dat normaal borstweefsel vertegenwoordigt. Zoals geïllustreerd in Figuur 3A, vertoonden verschillende m6A-geassocieerde genen significante dysregulatie in borstkankermonsters. Zowel upregulatie als downregulatie werden waargenomen in tumorweefsels vergeleken met normale controles. METTL3 en WTAP, beide componenten van het writer-complex, werden gedownreguleerd naast andere genen, terwijl verschillende andere genen, waaronder VIRMA, YTHDF1 en YTHDF3, werden opgereguleerd. Figuur 3B geeft verder een duidelijke weergave van de differentiële expressieprofielen van individuele genen over de TCGA- en GTEx-cohorten. Gezamenlijk geven deze bevindingen aan dat genen die m6A-methylatieschrijvers, lezers en gums coderen voor uitgebreide transcriptionele deregulatie ondergaan bij borstkanker, wat hun potentiële relevantie voor de ziekteprogressie onderstreept.

m6A-machinegenen en hun rol in de prognose van patiënten

Naar aanleiding van de observatie dat genetische veranderingen en veranderingen in genexpressie zeer veel voorkomen bij kankerpatiënten, werd de prognostische relevantie van deze expressieveranderingen bij borstkanker onderzocht. Met behulp van het Kaplan-Meier (KM) Plotter-instrument30, dat microarray-datasets integreert, werd de algehele overleving (OS) beoordeeld in een cohort van 1880 borstkankerpatiënten op basis van de expressie van m6A-regulatorgenen. Deze analyse toonde aan dat verhoogde expressie van METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 en RBMX significant geassocieerd was met een verbeterde algehele overleving. Daarentegen correleerde YWHAG-overexpressie met slechte overlevingsuitkomsten (Figuur 4). Als controles werden CCND2 en TOP2A, bekende markers van respectievelijk een betere en slechte prognose, opgenomen. Andere genen die m6A-regulatoren coderen, vertoonden geen statistisch significante correlaties met de overleving van de patiënt (aanvullende figuur). Deze bevindingen benadrukken een subset van m6A-methyleringsregulerende genen met potentieel nut bij de prognose van borstkanker.

figure-results-1
Figuur 1: Genetische veranderingen bij m6A-schrijvers, lezers en gumgenen bij borstkanker. (A) De verdeling van veranderingen over 996 borstkankerpatiënten wordt getoond, waarbij elke grijze lijn een individueel geval vertegenwoordigt. De kleurgecodeerde balken geven verschillende alteratietypen aan, waaronder missense-mutaties, diepe deleties, amplificaties, in-frame mutaties en afkapende mutaties. Goed gekarakteriseerde genen, PIK3CA, TP53, CDH1 en GATA3, worden als positieve controles opgenomen vanwege hun vastgestelde mutatiefrequenties. (B) Algehele alteratiefrequentie voor m6A-regulerende genen over de patiëntencohort. (C) Genetische veranderingspatronen in m6A-regulatorgenen door subtypen borstkanker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

figure-results-2
Figuur 2: Frequentie van genetische veranderingen in genen die m6A-schrijvers, lezers en gummen coderen over diverse kankertypen. De analyse is gebaseerd op gegevens uit de TCGA pankankeratlas, bestaande uit 10.967 monsters van 10.953 patiënten verspreid over 32 kankerstudies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

figure-results-3
Figuur 3: Expressie-anomalieën in genen die m6A-schrijvers, lezers en gummen coderen. (A) De overexpressie (rode balken) en onderexpressie (blauwe balken) van alle genen worden weergegeven. Gegevens van GTEx en TCGA werden gebruikt om normale versus borstkankermonsters te vergelijken. (B) Deze figuur toont een vergelijking van individuele genexpressie bij normale versus borstkankerpatiënten. Xena gebruikt Welchs t-test om de p-waarden voor elk gen te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Expressieprofielen van m6A-schrijvers, lezers en gummen en hun verband met prognose bij borstkanker. Kaplan-Meier overlevingscurves geven de algehele patiëntoverleving weer met de X-as, waarbij de X-as de tijd (maanden) aangeeft en de Y-as de algehele overlevingskans. Rode lijnen vertegenwoordigen de groep met hoge expressie, terwijl zwarte lijnen de groep met lage expressie vertegenwoordigen. De patiënten werden gestratificeerd op basis van de mediane genexpressieniveaus. p-waarden werden bepaald met behulp van de Log-Rank test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur: Leden van m6A-regulatoren vertonen geen significante correlatie met de algehele overleving van patiënten, zoals blijkt uit de Kaplan-Meier overlevingscurves. Rode lijnen vertegenwoordigen de groep met hoge expressie, terwijl zwarte lijnen de groep met lage expressie vertegenwoordigen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

TypeGensymbool
SchrijversMETTL3
METTL14
ZC3H13
WTAP
RBM15
RBM15B
METTL16
CBLL1
KIAA1429/VIRMA
LezersYTHDF1
YTHDF2
YTHDF3
YTHDC1
YTHDC2
HNRNPA2B1
HNRNPC
HNRNPG/RBMX
IGF2BP1
IGF2BP2
IGF2BP3
CNBP
ELAVL1
SND1
PRRC2A
PRRC2B
PRRC2C
EIF3A
FMR1
FXR1
FXR2
LRPPRC
MSI2
GummenALKBH5
FTO

Tabel 1: Genen die schrijvers, lezers en gummen van m6A coderen. Tabel 1 geeft een overzicht van de belangrijkste genfamilies die verantwoordelijk zijn voor het installeren, herkennen en verwijderen van m6A-modificatie in eukaryot RNA.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het artikel van deze methode biedt een uitgebreide, toegankelijke en geïntegreerde workflow voor de systematische multi-omics profilering en klinische vertaling van elke gensignatur in kankeronderzoek, hier aangetoond door de analyse van m6A RNA-methylatieregulatoren bij borstkanker. Door deze grote publieke bio-informaticaplatforms te combineren, stelt deze aanpak onderzoekers in staat efficiënt van genomische ontdekking naar klinisch relevante hypothesen te gaan zonder geavanceerde computationele expertise te vereisen.

De belangrijkste kracht van deze methodologie is de modulaire, hypothesegenererende pijplijn. Het protocol leidt de gebruiker door een logische volgorde; eerst het identificeren welke genen genetisch veranderd zijn (met behulp van cBioPortal), vervolgens het beoordelen van expressiedysregulatie in een batch-gecorrigeerde omgeving (met UCSC Xena), en tenslotte het evalueren van de klinische impact van die disregulatie op de overleving van patiënten (met behulp van de Kaplan-Meier Plotter). Deze stapsgewijze analyse, van DNA naar RNA tot klinische uitkomst, geeft effectief prioriteit aan kandidaatgenen voor verder onderzoek. Zo identificeerde het toepassen van deze workflow op m6A-regulatoren efficiënt genen zoals YWHAG (frequent alteration, prognostic for poor survival) als prioriteitsdoelen voor functionele validatie.

Het ontwerp van het protocol voor pankankeranalyse vergroot de bruikbaarheid verder, waardoor onderzoekers snel kunnen bepalen of een moleculaire signatuur specifiek is voor één kanker of een gedeeld kenmerk van tumorigenese is, zoals werd waargenomen bij wijdverspreide veranderingen in m6A-mechanismen in deze studie. Pankankeranalyse toonde aan dat mutaties die m6A-schrijvers, lezers en gummen aantasten, niet beperkt waren tot borstkanker, maar gedeeld worden over meerdere maligniteiten. Dit sluit aan bij steeds meer bewijs dat abnormale m6A-regulatie een onderscheidend kenmerk is van oncogenese over diverse tumortypen, omdat het meerdere kenmerken van kanker en fysiologische processen beïnvloedt, waaronder RNA-splicing, stabiliteit, translatie en niet-coderende RNA-activiteit33.

Deze methodologische aanpak is zeer aanpasbaar. Hoewel aangetoond met m6A-regulatoren, kan dezelfde workflow direct worden toegepast om immuuncontrolepuntgenen, metabole enzymen of nieuwe gensignaturen uit RNA-seq-experimenten in elk kankertype binnen deze databases te karakteriseren. Dit stapsgewijze formaat verlaagt de drempel voor wet-lab wetenschappers om geavanceerde in silico-analyses uit te voeren, waardoor de overgang van genomische data naar biologische inzichten wordt versneld.

Concluderend biedt dit protocol een robuust kader voor de contextualisering van kankergerelateerde genen. Naast het afbakenen van het mutatielandschap, toonden de bevindingen bidirectionele expressieveranderingen in de regulatoren van m6A. Deze bevinding onderstreept de complexiteit van het epitranscriptoom en versterkt het gevestigde paradigma van contextafhankelijke functie, zoals geïllustreerd door de dubbele rollen die zijn gerapporteerd voor METTL3- en YTHDF-familie-eiwitten in verschillende kankers34,35. Van de m6A-as is ook aangetoond een rol te spelen bij het reguleren van proliferatie, metastase en immuunontwijking bij triple-negatieve borstkanker 36,37. Interessant genoeg identificeerde de overlevingsanalyse een subset van m6A-regulatoren met prognostische significantie. Verhoogde expressie van METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 en RBMX was geassocieerd met gunstige uitkomsten, terwijl YWHAG-expressie correleerde met een lage algehele overleving. Deze bevindingen ondersteunen het potentiële klinische nut van m6A-regulatoren als prognostische biomarkers. CBLL1 werd ook geïdentificeerd als een van de factoren met een gunstige prognose in een eerdere studie38. De huidige analyse waarin bijgewerkte leden van m6A-regulatoren zijn opgenomen, heeft echter extra leden geïdentificeerd, zoals RBMX en YWHAG, met respectievelijk een betere en slechtere algehele overleving. De observatie dat verschillende regulatoren zowel een negatieve als gunstige prognose kunnen voorspellen, onderstreept de dubbele en contextspecifieke functies van m6A-modificaties in de kankerbiologie. Hoewel YTHDF1 en YTHDF3 significant worden opgereguleerd in tumoren, kan hun gebrek aan correlatie met de algehele overleving functionele redundantie bij de lezers, contextafhankelijke rollen over kankersubtypes of de noodzaak om hun verhouding of het netto m6A-regulatienetwerk te overwegen in plaats van individuele expressieniveaus. Bovendien vertoonde VIRMA de hoogste alteratiefrequentie (12%, voornamelijk amplificatie), maar de expressie correleerde niet significant met de algehele overleving bij borstkanker. Een mogelijke verklaring is dat hIgh VIRMA-expressie slechts een verhoogd potentieel voor m6A-afzetting aangeeft, niet of de vereiste downstream readers of doel-mRNA's aanwezig zijn om dit te vertalen naar agressief tumorgedrag. Opmerkelijk is dat, terwijl YTHDF1 en YTHDF3 in de groep overexpressief waren, YTHDC1 en YTHDC2 significant werden gedownreguleerd. Dit mismatched expressiepatroon suggereert dat de functionele combinatie van specifieke schrijvers en lezers die nodig is voor oncogene output mogelijk niet werkzaam is bij borstkanker. Ondanks de hoge expressie kan VIRMA in deze context niet als dominante drijvende kracht dienen (aanvullende figuur).

De auteurs erkennen een primaire beperking van deze in silico-pijplijn . De analyses zijn inherent correlatief; Ze identificeren sterke associaties, maar stellen geen mechanistische causaliteit vast. Dergelijke causaliteit kan worden vastgesteld via functionele genomica of door gebruik te maken van kleine-molecuulremmers die zich richten op componenten van de m6A-route39. Opmerkelijk is dat de eerste METTL3-gerichte peptideremmer, RSM3, onlangs is ontwikkeld en antikankerpotentieel heeft aangetoond in prostaatkankermodellen in vivo40. Deze methodologische workflow vormt daarom een waardevol hulpmiddel om kandidaatdoelen te identificeren en patiëntenpopulaties te stratificeren die het meest waarschijnlijk baat hebben bij deze therapeutische interventies.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Delen van dit manuscript zijn herzien met behulp van AI-gebaseerde taaltools om de duidelijkheid en leesbaarheid te verbeteren. Alle inhoudelijke inhoud, interpretatie, analyses en conclusies zijn van de auteurs zelf. Wij verklaren dat er geen belangenconflict is.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een subsidie van Alfaisal University (IRG 25450) aan RM wordt gelukkig erkend.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
cBioPortalMemorial Sloan-Kettering Cancer Centerhttps://www.cbioportal.org
Genotype-Tissue Expression (GTEx)GTEx Consortiumhttps://gtexportal.org
Kaplan-Meier PlotterGyorffy lab/A5 Genetics Ltdhttps://kmplot.com
The Cancer Genome Atlas (TCGA)National Cancer Institute (NCI)https://www.cancer.gov/tcga
UCSC Xena BrowserUniversity of California Santa Cruzhttps://xenabrowser.net

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

m6A ModificationEpitranscriptomic RegulationBreast CancerRNA Methylationm6A RegulatorsBioinformatics WorkflowGene Expression AnalysisCancer GenomicsPrognostic BiomarkersTCGA Datasets

Related Articles