Method Article

Het ontcijferen van het epitranscriptoom: In Silico Inzichten in het m6A-regulerend netwerk bij borstkanker

DOI:

10.3791/70545

⸱

June 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, College of Science and General Studies, Alfaisal University, 2Department of Biological and Biomedical Sciences, Aga Khan University, 3College of Medicine, Alfaisal University, 4Affiliated Hospital of Hunan University, School of Biomedical Sciences, Hunan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een benadering voor het uitvoeren van in silico genetische, moleculaire en prognostische analyses van m6A-modificatieregulatoren door mutatieprofielen, kopienummerveranderingen, genexpressie en klinische uitkomsten te integreren met behulp van publiek beschikbare datasets van de Cancer Genome Atlas (TCGA), het Genotype-Tissue Expression (GTEx) project en microarrayplatforms.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N6-methyladenosine (m6A) is de meest voorkomende interne RNA-modificatie in eukaryote transcripten en speelt een cruciale rol in RNA-metabolisme, genexpressie en cellulaire homeostase. Ontregeling van m6A-regulatoren, waaronder "schrijvers", "gummen" en "lezers", wordt steeds meer betrokken bij kankerbiologie; hun uitgebreide rol bij borstkanker moet echter nog duidelijk worden. Het primaire doel van dit artikel, waar deze methoden werkt, is om beginners in de bio-informatica een stapsgewijs kader te bieden voor het gebruik van publiek beschikbare kankerdatasets om mutatieanalyses uit te voeren, veranderingen in genexpressie te beoordelen en hun relaties met patiëntoverleving te onderzoeken. Als casestudy werden m6A-regulatoren bij borstkanker geanalyseerd met behulp van datasets van de Cancer Genome Atlas (TCGA), het Genotype-Tissue Expression (GTEx) project en microarrayplatforms. Transcriptomische profielen werden systematisch geanalyseerd om workflows aan te tonen voor het evalueren van de prognostische relevantie van m6A-regulerende componenten bij borstkanker. Met dit analytische kader werden duidelijke patronen van genetische veranderingen en differentiële expressie onder belangrijke m6A-regulatoren geïdentificeerd. Verschillende regulatoren, waaronder METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 en RBMX, waren geassocieerd met een betere overleving van patiënten, terwijl YWHAG geassocieerd was met een slechte algehele overleving. Deze studie biedt een uitgebreid overzicht van systeemgenomica van m6A-regulatorische genen bij borstkanker en demonstreert een praktische en reproduceerbare webgebaseerde bio-informatica-workflow. Deze bevindingen bevorderen het begrip van epitranscriptomische regulatie bij borstkanker en vormen een basis voor de ontwikkeling van nieuwe m6A-gebaseerde diagnostische en therapeutische strategieën.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitranscriptomische modificaties vormen een belangrijke laag van post-transcriptionele genregulatie en dragen bij aan diverse cellulaire processen en ziektetoestanden. Van de meer dan 170 tot nu toe geïdentificeerde RNA-modificaties is N6-methyladenosine (m6A) het meest voorkomend en goed gekarakteriseerd in eukaryote mRNA's1. Geïnstalleerd door "writer"-complexen waaronder METTL3/METTL14, verwijderd door "erasers" waaronder FTO en ALKBH5, en geïnterpreteerd door "reader"-eiwitten waaronder leden van de YTH- en IGF2BP-familie, orkestreert m6A RNA-splicing, stabiliteit, transport en translatie, en beïnvloedt zo belangrijke biologische processen zoals ontwikkeling, differentiatie en stressrespons 2,3.

Veranderingen in m6A-regulerende componenten zijn gerapporteerd over een breed spectrum van maligniteiten4. Bij veel kankers veroorzaakt afwijkende m6A-activiteit kwaadaardige fenotypen; bijvoorbeeld, verhoogde expressie van METTL3 bevordert de initiatie en progressie van prostaatkanker door het moduleren van de hedgehog-route en MYC RNA-methylering 5,6. Aanvankelijk werd vastgesteld dat FTO betrokken was bij het uitoefenen van oncogene effecten bij acute myeloïde leukemie, maar het bleek tumorprogressie te stimuleren bij lever-, long- en colorectale kanker 7,8,9,10. Echter, contextafhankelijke rollen van FTO en ALKBH5 werden geïdentificeerd die de dubbele aard van m6A-gemedieerde regulatie illustreren, die zowel de oncogene als tumorsuppressieve signalering kan bevorderen 11,12,13,14. M6A-lezers, waaronder YTHDF1/2/3, heterogene nucleaire ribonucleoproteïnen (hnRNP's) en insuline-achtige groeifactor-2 mRNA-bindende eiwitten (IGF2BP1-3), zijn ook geassocieerd met carcinogenese 15,16,17.

Bij borstkanker wijst er steeds meer bewijs op dat m6A-regulatoren vaak ontregeld zijn en mogelijk geassocieerd zijn met tumorsubtypes, immuungerelateerde kenmerken en klinische uitkomsten18,19. Meerdere mechanistische studies positioneren METTL3 als een vaak geupreguleerde pro-oncogene factor bij borstkanker. METTL3-gemedieerde m6A-installatie kan de translatie van transcripten stabiliseren of versterken die proliferatie, epitheliaal-mesenchymale overgang (EMT), metastase en chemoresistentiebevorderen. Er is ook aangetoond dat METTL3 de progressie van borstkanker bevordert door te richten op Bcl-221. ALKBH5 is betrokken bij de regulering van kankerstam-programma's via NANOG en andere stam-gerelateerde moleculen, maar de invloed ervan kan variëren per tumorcontext22.

Nu de lijst van m6A-regulatoren de afgelopen jaren blijft groeien, is een update nodig over hoe de nieuw geïdentificeerde regulatoren mogelijk ontregeld zijn bij borstkanker. Tabel 1 geeft een lijst van m6A-regelaars die schrijvers, lezers en gummen van m6A-modificatie bevatten. Daarnaast zijn nieuwe m6A-regulatoren, waaronder LRPPRC en YWHAG, geïdentificeerd met implicaties voor kankerprogressie 23,24,25. Daarom is een uitgebreide genetische en moleculaire karakterisering van alle bekende m6A-regulatoren uitgevoerd bij borstkanker met behulp van instrumenten die door onderzoekers met beperkte bio-informatische achtergrond kunnen worden gebruikt.

Het doel van dit artikel over Methodes is om een stapsgewijs, platformgebaseerd bio-informaticaprotocol te presenteren voor het analyseren van m6A-regulatoren bij borstkanker met behulp van publiek beschikbare bronnen voor kankergenomica. Met behulp van datasets van The Cancer Genome Atlas (TCGA) (www.cancer.gov/tcga), het Genotype Tissue Expression (GTEx) project26 en webgebaseerde analyseplatforms zoals cBioPortal en UCSC Xena, demonstreert dit protocol reproduceerbare workflows voor het beoordelen van mutatieprofielen, genexpressieveranderingen en de associatie met patiëntoverleving. Deze gevisualiseerde en toegankelijke aanpak is bedoeld om de adoptie van epitranscriptomische data-analyse door onderzoekers die nieuw zijn in kankerbio-informatica te vergemakkelijken.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: De lijst van genen die coderen voor m6A-methylatieregulatoren, gecategoriseerd als schrijvers, lezers en gummen, wordt gepresenteerd in Tabel 1. Alle genoemde genen werden opgenomen in de daaropvolgende analyses van mutaties, expressiepatronen en algehele overleving. Alle software en hulpmiddelen die in deze studie worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaallijst.

1. Identificatie van genetische veranderingen in m6A-regulatoren

  1. Toegang tot het cBioPortal voor kankergenomica. Ga naar de cBioportal-website (www.cbioportal.org)27,28. Selecteer vanaf de homepage het tabblad "Query" om een nieuwe analyse te starten.
  2. Selecteer de juiste kankerstudie en cohort.
  3. In de zoekbalk "Select Studies for Visualization and Analysis" typ je "Breast Invasive Carcinoma" en selecteer je "Breast Invasive Carcinoma (TCGA, Pan-Cancer Atlas)".
  4. Selecteer onderaan "Query by Gene".
    CRUCIAAL: Zorg ervoor dat de geselecteerde cohort (996 monsters) zowel mutatie- als copy-number alteration (CNA)-gegevens bevat.
  5. Definieer de genetische vraag. In de "Enter Gens" voer je de HUGO-gensymbolen in voor de volledige lijst van m6A-regulatoren die worden onderzocht.
    OPMERKING: Genen kunnen worden ingevoerd als een lijst gescheiden door spaties (spaties gescheiden). Onder "Selecteer genomische profielen" wordt gecontroleerd op de volgende twee datatypen: mutaties en kopienummerveranderingen.
  6. Kies onder "Selecteer patiënt/casusset" de standaard steekproefset die overeenkomt met de cohort met alle profielcasussen.
  7. Klik op de blauwe knop "Query indienen".
  8. Haal de gegevens over genetische veranderingen op en interpreteer ze. Bij het indienen wordt het resultaat geladen op het tabblad "samenvatting". De centrale "OncoPrint"-visualisatie geeft een direct overzicht van genetische veranderingen in alle geraadpleegde genen in de cohort, die gedownload kunnen worden.
  9. Naast de OncoPrint vindt u de grafiek "Cancer Type Summary". Dit geeft een kwantitatieve uitsplitsing van veranderingen tussen de subtypen van borstkanker.
  10. Voer een pankankeranalyse uit. Ga terug naar de cBioPortal-homepage en selecteer "TCGA PanCancer Atlas Studies" onder het tabblad "Query".
  11. In het geninvoervak voer je dezelfde lijst van m6A-regulatorgenen in.
  12. Klik op "Query indienen" en ga op de resultatenpagina naar het tabblad "Cancer Types Summary". Dit geeft een pankanker-perspectief.

2. Vergelijkende transcriptomische analyse van m6A-regulatoren met behulp van UCSC Xena.

  1. Toegang tot het UCSC Xena Platform. Ga naar de UCSC Xena-website (https://xena.ucsc.edu)29.
  2. Klik vanaf de homepage op de knop "Launch Xena" om de hoofdanalysebrowser te openen.
  3. Klik in de Xena-browser op "DATA SETS".
  4. Selecteer onder de datasets "TCGA TARGET GTEx". Dit bevat uniform verwerkte RNA-Seq-gegevens uit de normale weefsels van de TCGA- en GTEx-projecten.
  5. Klik op de volgende pagina op "VISUALISEER".
  6. Definieer de fenotype (steekproefgroep) variabele. Selecteer in de "Selecteer uw eerste variabele" "Hoofdcategorie" in het fenotypische datatype.
  7. Klik op "TO SECOND VARIABLE". Vervolgens vinkt u in het genomische datatype "Genexpressie" aan in de dataset. Voeg de genenlijst toe in het vakje "Gen of Positie toevoegen". Klik op "Klaar".
  8. Visualiseer expressiepatronen met een heatmap.
  9. Om de borstmonsters (TCGA+GTEx) te scheiden van de TCGA TARGET GTEx, typ je "Borst" en gebruik je de filteroptie om monsters te bewaren.
  10. De heatmap is nu zichtbaar en kan als PDF worden gedownload.
  11. Genereer vergelijkende boxplots voor individuele genen. Om expressieverschillen voor een specifiek gen te kwantificeren en te visualiseren, gebruik je de "View as chart". Met deze optie kunnen gegevens worden bekeken als een boxplot, een dotplot en een vioolplot, waarbij de expressieverdeling tussen de twee steekproefgroepen wordt vergeleken.
  12. Gebruik de optie "Download als PDF" om de grafieken te downloaden.
  13. Statistische significantie (p-waarde) kan worden verkregen door op "STATISTICS" te klikken.

3. Beoordeling van de prognostische betekenis van m6A-regulatoren met behulp van de Kaplan-Meier-plotter.

  1. Toegang tot de Kaplan-Meier Plotter-tool. Ga naar de Kaplan-Meier Plotter website (https://kmplot.com/analysis)30.
  2. Selecteer vanaf de homepage het tabblad "borstkanker" om een analyse te starten die specifiek is voor borstkankerdatasets.
  3. Configureer de genquery voor één enkel gen.
  4. Zoek in de primaire invoersectie het vakje "Gen-symbool".
  5. Hier komt het officiële symbool van het m6A-regulatorgen dat geanalyseerd moet worden (bijv. METTL3).
    KRITIEK: Direct onder het geninvoervakje, zoek en activeer het selectievakje voor "Only JetSet best probe set". Dit zorgt ervoor dat de meest betrouwbare en specifieke microarray-probe automatisch wordt geselecteerd voor uw gen, waardoor de datakwaliteit en reproduceerbaarheid worden geoptimaliseerd.
  6. Definieer de parameters van de overlevingsanalyse. Selecteer in de sectie "Survival" "Overall survival (OS)" als het primaire eindpunt voor deze analyse. De tool zal automatisch gegevens gebruiken van 1880 borstkankerpatiënten wanneer deze instelling wordt geselecteerd.
  7. Zorg ervoor dat de optie "Patiënten splitsen op" op "mediaan" staat. Dit zal patiënten in twee gelijke groepen indelen; hoge en lage expressie, gebaseerd op de mediane expressiewaarde van het geraadpleegde gen over alle monsters.
  8. "Follow-up threshold" kan worden gebruikt om de follow-up periode te selecteren. Voor deze studie werd 180 maanden geselecteerd.
  9. Genereer en interpreteer het Kaplan-Meier-plot.
  10. Klik op de knop "Kaplan-Meier Plot tekenen".
  11. Er wordt een nieuw venster geladen dat de overlevingscurve toont.
  12. Interpreteer de belangrijkste plotelementen; De X-as geeft tijd in maanden aan, de Y-as toont de kans op totale overleving, de twee gekleurde lijnen stellen de overlevingscurves voor de patiëntengroepen met hoge expressie (rood) en lage expressie (zwart). De log-rang P-waarde wordt weergegeven, wat de statistische significantie van het verschil tussen de twee overlevingscurves aangeeft.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mutatielandschap van m6a-methylatieregulatoren bij borstkanker

In een eerdere studie over de genomische analyse van TCGA-datasets werden recidiverende mutaties in verschillende genen die coderen voor DNA-methylering gerapporteerd31. In de huidige studie werd cBioPortal gebruikt om de dataset "Breast Invasive Carcinoma (TCGA, PanCancer Atlas)" te analyseren om mutatieprofielen van genen te onderzoeken die coderen voor de schrijvers, lezers en gums van m6...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het artikel van deze methode biedt een uitgebreide, toegankelijke en geïntegreerde workflow voor de systematische multi-omics profilering en klinische vertaling van elke gensignatur in kankeronderzoek, hier aangetoond door de analyse van m6A RNA-methylatieregulatoren bij borstkanker. Door deze grote publieke bio-informaticaplatforms te combineren, stelt deze aanpak onderzoekers in staat efficiënt van genomische ontdekking naar klinisch relevante hypothesen te gaan zonder geavanceerde com...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Delen van dit manuscript zijn herzien met behulp van AI-gebaseerde taaltools om de duidelijkheid en leesbaarheid te verbeteren. Alle inhoudelijke inhoud, interpretatie, analyses en conclusies zijn van de auteurs zelf. Wij verklaren dat er geen belangenconflict is.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een subsidie van Alfaisal University (IRG 25450) aan RM wordt gelukkig erkend.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
cBioPortalMemorial Sloan-Kettering Cancer Centerhttps://www.cbioportal.org
Genotype-Tissue Expression (GTEx)GTEx Consortiumhttps://gtexportal.org
Kaplan-Meier PlotterGyorffy lab/A5 Genetics Ltdhttps://kmplot.com
The Cancer Genome Atlas (TCGA)National Cancer Institute (NCI)https://www.cancer.gov/tcga
UCSC Xena BrowserUniversity of California Santa Cruzhttps://xenabrowser.net

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

m6A ModificationEpitranscriptomic RegulationBreast CancerRNA Methylationm6A RegulatorsBioinformatics WorkflowGene Expression AnalysisCancer GenomicsPrognostic BiomarkersTCGA Datasets

Related Articles