Het onderzoek naar het mechanisme van Guben Pingchuan-granulet bij de behandeling van bronchiale astma

Samenvatting

Dit protocol onderzoekt het werkingsmechanisme van Guben Pingchuan-granules bij bronchiale astma met behulp van netwerkfarmacologie, moleculaire koppeling en in vivo. Validatie.

Samenvatting

Deze studie onderzoekt het werkingsmechanisme van Guben Pingchuan-granules bij de behandeling van bronchiale astma met behulp van netwerkfarmacologie, moleculaire koppeling en experimentele validatie. Actieve ingrediënten en bijbehorende doelwitten werden geïdentificeerd met behulp van TCMSP-, HERB- en SymMap-databases. Bronchiale astma-gerelateerde doelen werden verzameld van GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank en PharmGKB. Overlappende doelen werden geïdentificeerd en component–doelwit en eiwit–eiwit interactie (PPI) netwerken werden geconstrueerd. Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verrijkingsanalyses werden uitgevoerd met correctie van false discovery rate (FDR). Moleculaire koppeling werd uitgevoerd om de bindingsaffiniteit te evalueren, gevolgd door in vivo validatie. In totaal werden 121 actieve componenten en 234 geneesmiddelgerelateerde doelen geïdentificeerd, wat resulteerde in 155 overlappende doelen. Kerndoelen waren onder andere TP53, AKT1, TNF en IL6. KEGG-analyse toonde een significante verrijking van de PI3K–Akt signaalroute, die werd geselecteerd voor experimentele validatie. Moleculaire koppeling toonde een sterke bindingsaffiniteit tussen kerncomponenten en AKT1. Bij ovalbumine-geïnduceerde astmatische ratten verlaagde Guben Pingchuan-granula de serum IL-4 en IL-10 niveaus, verhoogde de FoxP3-expressie in longweefsel en verhoogde het de PI3K - en AKT mRNA-niveaus. Deze bevindingen geven aan dat Guben Pingchuan-granula bronchiale astma verlicht door de PI3K–Akt. signaalroute te moduleren, ontstekingscytokines te reguleren en de functie van regulerende T-cellen te verbeteren.

Inleiding

Bronchiale astma is een heterogene chronische luchtwegaandoening die wordt gekenmerkt door luchtwegontsteking, hyperresponsiviteit in de luchtwegen, slijmhypersecretie en^{remodelering van} de luchtwegen. De pathogenese ervan omvat complexe interacties tussen activatie van immuuncellen, ontstekingsmediatoren en meerdere signaalroutes. Klinisch gezien presenteert astma zich met terugkerende piepende ademhaling, dyspneu, benauwdheid op de borst en hoest. Luchtwegontsteking is een centraal mechanisme achter het ontstaan en de progressie van de ziekte, gekenmerkt door verhoogde secretie van pro-inflammatoire cytokines zoals IL-6, IL-4, IL-17 en TNF-α., infiltratie van ontstekingscellen waaronder eosinofielen en neutrofielen, en structurele veranderingen zoals de proliferatie van gladde spieren in de luchtweg, verdikking van het basale membraan en slijmklierhyperplasie^2˒3. Deze pathologische processen leiden uiteindelijk tot obstructie van de luchtwegen en een verstoorde luchtstroom.

De pathofysiologie van astma wordt gereguleerd door meerdere interactieve signaalroutes in plaats van één enkel mechanisme. De PI3K–Akt-signaalweg speelt een sleutelrol bij het moduleren van het immuunbalans, met name de Treg/Th17-as, door de expressie van FoxP3 te reguleren. Deze route werkt ook samen met IL-17- en TNF-signaalroutes om ontstekingsreacties en luchtwegremodellering te versterken, wat bijdraagt aan ziekteheterogeniteit en behandelingsresistentie ^3,4. Epidemiologische gegevens wijzen op een voortdurende wereldwijde toename van de prevalentie van astma, met meer dan 358 miljoen getroffen personen wereldwijd en ongeveer 45,7 miljoen volwassen patiënten in China ^5,6. Huidige behandelstrategieën zijn voornamelijk gebaseerd op ingeademde β₂-agonisten en glucocorticoïden; Deze therapieën richten zich echter op beperkte pathologische mechanismen en kunnen bij bepaalde patiënten leiden tot bijwerkingen en glucocorticoïderesistentie. Dysregulatie van routes zoals PI3K–Akt. is in verband gebracht met verminderde therapeutische responsiviteit, wat de noodzaak van multi-target therapeutische benaderingen benadrukt ^7,4.

De traditionele Chinese geneeskunde (TCM) classificeert astma als het "Xiao-syndroom," dat geassocieerd wordt met tekorten in long-, milt- en nierfunctie, gecombineerd met externe pathogene factoren. TCM-formuleringen zijn veel gebruikt in astmabehandeling vanwege hun multicomponent, multi-target kenmerken ^8,9. In tegenstelling tot farmacologische middelen met één doel, hebben TCM-verbindingen therapeutische effecten door de regulatie van meerdere biologische routes te coördineren, in lijn met de complexe pathofysiologie van astma¹⁰. Netwerkfarmacologie biedt een systeemniveau-benadering voor het analyseren van interacties tussen geneesmiddelcomponenten, doelwitten en ziekteroutes, waardoor belangrijke bioactieve verbindingen en moleculaire mechanismen kunnen worden geïdentificeerd¹¹. Moleculaire koppeling vult deze aanpak verder aan door de bindingsaffiniteit tussen kleine moleculen en doeleiwitten te evalueren.

Guben Pingchuan-granulet is een traditionele Chinese medicinale formulering die bestaat uit acht kruidencomponenten, waaronder Ephedra sinica (Ephedra-kruid), Psoralea corylifolia-vrucht , Prunus armeniaca-zaad (abrikozenzaad), Pseudostellaria heterophylla-wortel , Perilla frutescens-fruit , Eriobotrya japonica-blad (Loquat-blad), Lilium brownii-bol en Epimedium brevicornum. Deze formulering wordt traditioneel gebruikt om vitale energie te versterken, slijm op te lossen en piepende ademhaling te verlichten. Eerdere klinische studies hebben de therapeutische effectiviteit ervan aangetoond bij bronchiale astma, met hogere responspercentages vergeleken met conventionele behandelingen¹².

Om het onderliggende werkingsmechanisme te verduidelijken, wordt een geïntegreerde aanpak toegepast die netwerkfarmacologie, moleculaire docking en in vivo experimentele validatie combineert. Netwerkfarmacologie wordt gebruikt om actieve componenten en potentiële doelwitten te identificeren die geassocieerd zijn met bronchiale astma. Moleculaire koppeling wordt toegepast om interacties tussen sleutelverbindingen en doeleiwitten te evalueren. Experimentele validatie in een diermodel wordt vervolgens uitgevoerd om de regulerende effecten op kritieke signaalroutes te beoordelen, met name de PI3K–Akt. -route. Deze benadering heeft als doel mechanistische inzichten te bieden in de multi-target therapeutische effecten van Guben Pingchuan-granula en de toepassing ervan bij de behandeling van bronchiale astma te ondersteunen.

Protocol

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Liaoning University of Traditional Chinese Medicine (Goedkeuringsnummer: 21000042023058) en uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen. De onderzoeksinstrumenten die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Databases en software

1. Toegang tot de volgende databases en software: TCMSP, HERB, SymMap, PubChem, STRING, GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank, PharmGKB, DAVID, UniProt en Cytoscape (versie 3.9.1).

2. Verwerving van componentdoelstellingen

1. Haal chemische bestanddelen van Ephedra-kruid, abrikozenzaad, Pseudostellaria-wortel, perillavrucht, Loquatblad, Lilium-soorten en epimedium op uit de TCMSP-database¹³. Haal verbindingen van Psoralea op uit de HERB- en SymMap-databases.
2. Screenen van actieve verbindingen met orale biobeschikbaarheid (OB ≥ 30%) en geneesmiddelgelijkheid (DL ≥ 0.18)^14,15.
3. Voorspel doelgenen met behulp van TCMSP. Standaardiseer alle doelen met behulp van de UniProt-database door Homo sapiens te selecteren. Verwijder dubbele en ongeldige doelen, waaronder niet-menselijke vermeldingen, niet-geannoteerde eiwitten en verouderde identificaties.

3. Acquisitie van bronchiale astma-doelen

1. Zoek op GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank en PharmGKB met het trefwoord "bronchiale astma." Stel de relevantiescore van GeneCards in op >4. Meng alle teruggehaalde doelen en verwijder duplicaten.

4. Identificatie van snijpunten

1. Importeer geneesmiddeldoelen en ziektedoelen in een online Venn-analysetool. Identificeer overlappende doelen en noteer het totale aantal voor latere analyse.

5. Constructie van het component–doel-netwerk

1. Importeer snijdoelen in Cytoscape 3.9.1. Bouw het component–doel-netwerk. Pas de grootte en kleur van de knoop aan op basis van graadwaarden.

6. Constructie van een eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerk

1. Upload intersectiedoelen naar de STRING-database. Selecteer Homo sapiens en stel de betrouwbaarheidsscore in op ≥0,900. Exporteer het netwerk en importeer het in Cytoscape.
2. Bereken topologische parameters (gradencentraliteit, tussenheidscentraliteit en nabijheidscentraliteit). Identificeer kerndoelen met behulp van mediane drempels en graad >20.

7. GO- en KEGG-verrijkingsanalyse

1. Upload overlappende doelen naar de DAVID-database of analyseer met het R-pakket clusterProfiler.
2. Voer genontologie (GO) verrijkingsanalyses uit voor categorieën biologische processen, cellulaire componenten en moleculaire functies.
3. Voer KEGG-routeverrijkingsanalyse uit. Pas false discovery rate (FDR)-correctie toe en stel de significantiedrempel in op FDR < 0,05.
4. Visualiseer de meest verrijkte termen met behulp van staafdiagrammen of bubbelgrafieken.

8. Moleculaire koppeling

1. Download 2D-structuren van kernverbindingen van PubChem. Genereer 3D-structuren met ChemOffice en sla op als mol2-bestanden.
2. Download eiwitstructuren uit de RCSB PDB-database. Verwijder watermoleculen en liganden met PyMOL.
3. Voer moleculaire docking uit met AutoDock Vina. Definieer gridbox-parameters en voer docking-simulaties uit.
4. Registreer bindingsenergieën (kcal/mol) en sleutel interactiele residuen. Visualiseer dockingresultaten met behulp van moleculaire modellering, visualisatie en simulatieplatforms.

9. Experimentele validatie

1. Dieren
   1. Krijg 48 mannelijke Sprague–Dawley-ratten (9 weken oud, 220–240 g). Huisdieren bij 20–25 °C met 55%–60% luchtvochtigheid onder standaardomstandigheden.
2. Geneesmiddelen en reagentia
   1. Bereid Guben Pingchuan-korrels voor die bestaan uit Ephedra-kruid, Psoralea, abrikozenzaad, Pseudostellaria-wortel, perillavrucht, Loquatblad, lilium en epimedium.
   2. Bereid dexamethason, ovalbumine (OVA), aluminiumhydroxide, ELISA-kits, RNA-extractiekits en antilichamen voor zoals vermeld in de Table of Materials.
3. Instrumenten
   1. Bereid standaard laboratoriumapparatuur voor, waaronder een microplaatlezer, elektroforesesysteem, paraffinemicrotoom en beeldvormingssysteem.
4. Diergroepering en behandeling
   1. Ratten worden willekeurig ingedeeld in zes groepen (n = 8): blanco controlegroep, modelgroep, dexamethasongroep (0,3 mg/kg), laag-dosis Chinese geneeskundegroep, middendosis Chinese geneeskundegroep en hoogdosis Chinese geneeskundegroep.
   2. Op dag 1, 7 en 14 dient u 1 mL intraperitoneale injectie van 10% OVA + 10% Al(OH)₃ toe aan ratten in de modelgroep, de groep met lage dosis Chinese geneeskunde, de groep met middendosering in de Chinese geneeskunde, de groep met hoge doses Chinese geneeskunde en de groep dexamethason voor sensibilisatie.
   3. Geef 1 ml intraperitoneale injectie van 0,9% fysiologische zoutoplossing aan ratten in de blanke controlegroep op dag 1, 7 en 14.
   4. Van dag 15 tot 21 voer je eenmaal per dag 20 minuten vernevelde inhalatiestimulatie uit. Geef ratten in de modelgroep, lage dosis Chinese geneeskundegroep, mediumdosis Chinese geneeskundegroep, hoogdosis Chinese geneeskundegroep en dexametasongroep.
   5. Geef 0,9% fysiologische zoutoplossing vernevelde inhalatie aan ratten in de blanke controlegroep van dag 15 tot 21.
   6. Geef behandelingen via orale gavage eenmaal per dag van dag 22 tot 36 volgens de toegewezen behandelgroep.
   7. Houd dagelijks het lichaamsgewicht en de algemene conditie in de gaten tijdens het experiment. De experimentele tijdlijn wordt samengevat in Tabel 1.
5. Histopathologie
   1. Verzamel longweefsel. Fix, embed en sectie van voorbeelden. Voer hematoxyline–eosine kleuring uit.
   2. Voer Masson-kleuring uit om collageenafzetting te evalueren.
6. RT-PCR-analyse
   1. Haal het totale RNA uit het longweefsel.
   2. Homogeniseer bevroren longweefsel onder ultralage temperatuurcondities. Na het wegen van het monster breng je het snel over in een voorgekoelde mortel met vloeibare stikstof en maal je het tot poeder.
   3. Breng het poedervormige monster over in een centrifugebuis. Voeg 1 mL TransZol UP en 0,2 mL RNA-extractiereagens toe aan elke 50–100 mg weefsel. Schud de buis 5 minuten op kamertemperatuur.
   4. Centrifugeer het monster op 1000 × g en 2–8 °C gedurende 15 minuten. Breng de kleurloze waterige fase over in een nieuwe centrifugebuis.
   5. Voeg 1 mL TransZol UP toe tot 0,5 mL isopropanol. Incubeer het mengsel 10 minuten op kamertemperatuur.
   6. Centrifugeer het monster op 1000 × g gedurende 10 minuten. Voeg 1 ml 75% ethanol toe en centrifugeer opnieuw 5 minuten.
   7. Gooi het supernatant weg en laat het neerslag 5 minuten aan de lucht drogen op kamertemperatuur. Los het neerslag op in 50–100 μL RNA-oplossing en incubeer vervolgens 10 minuten.
   8. Bewaar het monster bij −70 °C voor langdurige conservering.
   9. CDNA synthetiseren en kwantitatieve PCR uitvoeren om PI3K en AKT-expressie te meten.
7. ELISA
   1. Ontdooi serummonsters bij 4 °C. Meet IL-4 en IL-10. niveaus met ELISA-kits volgens de instructies van de fabrikant.
8. Immunohistochemie
   1. Gefixeerd longweefsel met 4% paraformaldehyde, ingebed in paraffine, gesneden, ontwaakt en gehydrateerd.
   2. Voer antigeenophaal, blokkering en antilichaamincubatie uit. Kleuring volgens de FoxP3 immunohistochemiekit, DAB-kleuringsoplossing en positieve expressie verschijnt als bruingeel of donkerbruin kleuring.
   3. Observeer en fotografeer onder een microscoop, en gebruik Image J-software voor kwantitatieve statistische analyse van FoxP3-expressie.
9. Statistische analyse
   1. Testgegevensnormaliteit met de Shapiro–Wilk-test en variantiehomogeniteit met behulp van Levene's test.
   2. Analyseer data met behulp van eenrichtings-ANOVA of niet-parametrische tests, indien van toepassing. Druk gegevens uit als gemiddelde ± standaarddeviatie.
   3. Definieer p < 0,05 als statistisch significant. ★★p < 0,01 en ★p < 0,05 versus controlegroep; ◆◆p < 0,01 en ◆p < 0,05 versus modelgroep; ##p < 0,01 en #p < 0,05 versus dexamethasongroep.

Tabel 1: Experimentele tijdlijn. Schema van sensitisatie, uitdaging en behandelprocedures. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Resultaten

Screening van werkzame stoffen
In totaal werden 121 actieve componenten geïdentificeerd uit de TCMSP-database na filtering op doelactiviteit. Deze omvatten 23 componenten van Ephedra Herb, 7 van Psoralea, 19 van abrikozenzaad, 8 van Pseudostellaria-wortel , 16 van Perilla-vrucht, 18 van Loquat-blad, 7 van Lilium en 23 van Epimedium. (Tabel 2). Zestien veelvoorkomende componenten werden geïdentificeerd, waar...

Discussie

Bronchiale astma is een veelvoorkomende ziekte op de luchtwegafdeling¹⁶. Het is een obstructieve luchtwegaandoening veroorzaakt door allergenen en luchtweghyperresponsiviteit¹⁷. Het heeft een hoge klinische incidentie, is gevoelig voor recidieven en moeilijk te genezen, wat de gezondheid en kwaliteit van leven van patiënten aanzienlijk beïnvloedt. De Global Initiative for Asthma (GINA) 2025 meldt dat ingeademde glucocorticoïdetherapie effec...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
qPCR Kit	Novogene	NQ-001, 2×1mL	Detectie van relatieve mRNA-expressie van doelgenen
aluminum hydroxide Al(OH)3	Shanghai Yubo Biotechnology Co., LTD	YB-AL001, 500g	Immunologisch adjuvans om de antigeen-immuunrespons te versterken
BCA protein Concentratie Test Kit	Fode Biotechnology Co., LTD	FD2001, 100 stuks per doos	Totale eiwitkwantificering om monsterbelasting te standaardiseren
Chemiluminescentie beeldvormingssysteem	Tanon	5200Multi	WB-bandbeeldvorming, gel- en blot-beeldverzameling en -analyse
Color Pre-stained Protein Marker	Biolaibo Technology Co., LTD	BL005, 10-180kDa, 500μL	Eiwitmolecuulgewichtsreferentie voor elektroforese-experimenten
Enhanced RNA Extractie Kit	Whole Golden Branch	ET111-01v2, 50 stuks per doos	Extractie en zuivering van totaal RNA uit weefsels en cellen
Enzyme-linked immunosorbent assay reader	U.S. Biotek Company	Epoch/BioTek	Kwantitatieve detectie van cytokinen en eiwitgehaltes in monsters
FOXP3 primaire antilichaam	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	AG5002, 50ul/stuk	Gerichte binding aan FOXP3-eiwit voor immunoassay
Gel Rapid Preparation Kit	Shanghai Yamei	PG212, 30 sets	Snelle bereiding van scheidingsgel en stacking gel voor elektroforese
masson Kleuringskit	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1340, 100 tablets	Specifieke kleuring voor weefselcollageenvezels en fibrose-observatie
OVA	Beijing Boaotoda Technology Co., LTD.	OVA-10g, ≥98%	Klassiek allergeen voor het opzetten van allergische diermodellen
primair Antilichaam Verdunningsoplossing	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	P0256-100ml	Verdun primair antilichaam, behoud activiteit en verminder niet-specifieke binding
Rat IL-10ELISA Kit	Andy Bio	E-30649, 96T	Kwantitatieve detectie van rat IL-10 anti-inflammatoir factor
Rat IL-4ELISA Kit	Andy Bio	E-30623, 96T	Kwantitatieve detectie van rat Th2 inflammatoire factor IL-4
Reverse Transcriptie Kit	Baori Medical Technology Co., LTD	E047-01A	Omgekeerde transcriptie van RNA in cDNA voor daaropvolgende genanalyse
Verzadigde Oil Red O Kit	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1261, 50mL×2 fles	Specifieke kleuring en detectie van weefsellipidedruppels
Shangyang Anti-Konijn Secundair Antilichaam	Proteintech Biological Co., LTD	SA00001-2, 1mL	Bindt aan konijn primaire antilichaam voor WB-kleurreactie
TBST Buffer	Wuhan Sewell Biotechnology Co., LTD	G2150, 1L / fles	Buffer voor membraanwassing en antilichaamverdunning in Western blot
Transfer Elektroforese Systeem	Shanghai Jingcanshi Precision Machinery Co., Ltd.	PowerPac Basic	Gebaat voor eiwitelektroforese en Western blot membraanoverdracht
Ultra-lage temperatuur koelkast	Zhongke Meiling	MDF-382	Kryoconservering op lage temperatuur van reagentia, eiwitmonsters en weefsels
Verticale elektroforesetank	BIO-RAD	JY-ZY5	Verticale elektroforetische scheiding van eiwit- en nucleïnezuurmonsters