Een toxine-gebaseerd tegenselectiesysteem voor markerloze gendeletie en mutagenese van hoogdichtheid Tn5-transposon in Pectobacterium brasiliense

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van ongemarkeerde gendeleties en het construeren van genoom-brede Tn5-insertiemutantenbibliotheken in Pectobacterium brasiliense, een fytopathogeen die verantwoordelijk is voor aardappelzwarte poot en zachte rot. Deze aanpak maakt efficiënte omgekeerde genetische analyse mogelijk en vergemakkelijkt de functionele karakterisering van virulentie-geassocieerde genen in dit organisme.

Samenvatting

Pectobacterium brasiliense is een sterk pathogene bacterie die verantwoordelijk is voor zachte rot van aardappelknollen, blackleg en luchtstenkelrot. Het ophelderen van de pathogene mechanismen is essentieel voor ziektebestrijding; Echter, genetische hulpmiddelen voor dit organisme blijven beperkt. Er werd een toxine-gebaseerd tegenselectiesysteem ontwikkeld om markerloze gendeletie en high-density Tn5 transposonmutagenese mogelijk te maken. Het vmi480-toxine afkomstig van het pLP12-plasmide werd gebruikt als tegenselectiemarker om de zelfmoordvector pKV2 te construeren. Met dit systeem werd het recA-gen in de P. brasiliense SM-stam succesvol verwijderd. De resulterende recA-mutant diende als ouderlijke stam voor de constructie van een Tn5-insertiebibliotheek met meer dan 12.000 mutanten via conjugatie met de RHO3-hulpstamme die pKV2-LLtnp draagt. In dit afgeleide plasmide werd het vmi480-toxine vervangen door een hyperactieve Tn5-transposase onder controle van een naar buiten gerichte lacpromotor om polaire effecten te verminderen. Hoogwaardige knolinoculatie-assays maakten de identificatie mogelijk van pathogeniteitsdeficiënte mutanten, inclusief inserties in het type II secretiesysteem, een belangrijke virulentiebepalende factor die de secretie van enzymen die de plantenwand afbreken bemiddelt. Dit platform ondersteunt functionele genomica en faciliteert het onderzoek naar virulentiemechanismen in deze economisch belangrijke pathogeen.

Inleiding

P. brasiliense is een van de meest agressieve soorten binnen het geslacht Pectobacterium en is de oorzaker van aardappelzachte rot, blackleg en luchtstengelrot¹. Deze ziekten leiden tot een geschatte opbrengstverlies van 30% in aardappel, een gewas dat de derde belangrijkste voedselbron ter wereld is en een belangrijk onderdeel van het Chinese landbouwproductiesysteem². Ondanks de economische impact blijven de moleculaire mechanismen die de pathogeniciteit van P. brasiliense reguleren onvoldoende begrepen, grotendeels door het gebrek aan efficiënte en reproduceerbare genetische manipulatietools voor deze soort ^3,4,5.

Functionele genomische studies in veel fytopathogene bacteriën zijn afhankelijk van robuuste alleluitwisselings- en transposonmutagenesesystemen; echter, vergelijkbare genetische instrumenten voor P. brasiliense blijven beperkt of inefficiënt. In het bijzonder zijn effectieve tegenselectiemarkers die compatibel zijn met deze soort schaars. Hoewel het sacB-gen veel wordt gebruikt als tegenselectiemarker voor gendeletie bij verschillende bacteriën, kan P. brasiliense een hoge tolerantie tot 50% sucrose vertonen tijdens het selectieproces⁵. Deze tolerantie weerspiegelt waarschijnlijk een gebrek aan gevoeligheid voor toxines, mogelijk door de enzymatische omzetting van sucrose in suikerpolymeren. Bovendien kunnen hoge sucroseconcentraties schadelijke osmotische shock⁶ veroorzaken. Bovendien zijn efficiënte grootschalige mutagenesemethoden, zoals de constructie van Tn5-transposon-insertiebibliotheek, nog niet goed gevestigd voor dit organisme.

Om deze technische beperkingen aan te pakken, werd een toxine-gebaseerd tegenselectiesysteem ontwikkeld en werd een robuuste Tn5-mutagenesescreeningsworkflow voor P. brasiliense opgezet. In vergelijking met traditionele sucrose-gebaseerde methoden biedt deze op toxine gebaseerde benadering duidelijke voordelen, waaronder een verhoogde selectiestrengheid, een verbeterde specificiteit in het identificeren van dubbele crossover-gebeurtenissen en het elimineren van verstorende osmotische stress. Vergelijkbare vmi480-toxine-antitoxine-gebaseerde systemen zijn met succes geïmplementeerd om selectiebarrières in Vibrio-soort ⁷ te overwinnen. De gevestigde methodologie is zeer toepasbaar voor de high-throughput functionele karakterisering van onbekende genen en biedt een veelzijdig platform dat kan worden aangepast aan andere verwante zachte rot Pectobacteriaceae.

Protocol

1. Generatie van een markerloze recA-deletiemutant in P. brasiliense

1. Extractie genomisch DNA uit P. brasiliense SM en pKV2-plasmide (pLP12 afgeleid met aanpassing van de antibioticaselectiemarker en meervoudige kloningsplaats) uit de E. coli-donorstam met standaard DNA-voorbereidingsprocedures.
2. Controleer de kwaliteit en concentratie van het geëxtraheerde genomische DNA en plasmide-DNA via agarosegelelektroforese en NanoDrop-spectrofotometrie.
3. Lineariseer plasmide pKV2 door dubbele vertering met EcoRI en NheI bij 37 °C gedurende 5 uur. Controleer volledige vertering door agarosegelelektroforese en zuiver het lineaire plasmide.
4. Identificeer ongeveer 800 bp-regio's stroomopwaarts en stroomafwaarts van het recA-gen met behulp van genoomanalysesoftware en ontwerp de overeenkomstige primerparen LBF/LBR en RBF/RBR (zie materiaaltabel voor alle primers die in deze studie zijn gebruikt).
5. Versterk beide homologe armen onder standaard PCR-cyclische omstandigheden en zuiver de PCR-producten. Een PCR van 50 μL levert doorgaans 2,5 μg product op.
   OPMERKING: De Tm-waarden en GC-inhoud van primers kunnen worden aangepast door de grenzen van de homologe regio's aan te passen.
6. Stel het recombinante zelfmoordplasmide pKV2-recA samen met een DNA-assemblagekit door de gezuiverde homologe armen te ligeren met de lineariseerde plasmidruggengraat.
7. Transformeer het assemblagemengsel door hitteshock in chemisch competente E. coli S17-1 λpircellen, haal de cellen terug in LB-medium en plat op LB-agar met kanamycine (LB + kan).
   OPMERKING: De uiteindelijke gebruikte concentraties zijn 50 mg/mL kanamycine, 0,2% (w/v) glucose, 0,3% (w/v) arabinose en 0,3 mM 2,6-diaminopimelzuur (DAP).
8. Valideer positieve klonen door restrictieve vertering of kolonie-PCR. (Zie Tabel van materialen voor alle mediumrecepten die in deze studie worden gebruikt).
9. Extraheer het bevestigde pKV2-recA plasmide en transformeer het in E. coli WM3064 met behulp van hitteschoktransformatie (verwachte transformatiesnelheid > 10⁶ cfu/μg).
10. Selecteer transformanten op LB-agar met kanamycine en diaminopimelzuur (DAP).
11. Voer biparental conjugatie uit door nachtkweken van de donorstam (WM3064 pKV2-recA) en de ontvangende P. brasiliense SM te mengen in een verhouding van 1:1 (v/v), wat doorgaans resulteert in 10⁴ tot 10⁶ transconjuganten per milliliter donor- en ontvangercellen.
12. Was de gemengde cultuur één keer met steriel water, plaats het mengsel op LB-agar aangevuld met kanamycine en DAP, en breng het uit bij 28 °C gedurende 48–72 uur.
    OPMERKING: Als er geen transconjuganten worden waargenomen, kan de donor-ontvangerverhouding worden verhoogd tot 2:1 (v/v) om de conjugatie-efficiëntie te verbeteren. Als er een hoge achtergrondgroei wordt waargenomen, kan de resterende DAP worden verwijderd door de gemengde cultuur twee keer te wassen met steriel water.
13. Herstel het conjugatiemengsel en plat op LB-agar met kanamycine en glucose (zonder DAP) voor tegenselectie.
14. Kies 6–8 kolonies en plak ze op zowel LB + kan als LB + kan + arabinose.
15. Selecteer kolonies die groeien op LB + kan maar niet groeien op LB + kan + arabinose; Dit zijn kandidaten voor de eerste crossover.
16. Inoculeer bevestigde eerste crossover-stammen in LB-medium en broed 's nachts uit. Plat de culturen op LB-agar met L-arabinose om de tweede homologe recombinatie te induceren.
17. Kies meerdere kolonies en repliceer ze op LB + arabinose en LB + kan. Selecteer kolonies die groeien op LB + arabinose maar niet op LB + kan; dit zijn veronderstelde recA-deletiemutanten .
    OPMERKING: Als er na het tweede crossover-evenement geen kolonies worden waargenomen, moet de potentiële essentiële waarde van het doelgen voor bacteriële groei worden geëvalueerd. Alternatief kunnen de upstream en downstream homologe gebieden worden uitgebreid tot 1.200 bp om de efficiëntie van homologe recombinatie te verbeteren.
18. Bevestig de recA-mutanten door kolonie-PCR met primer pair checkF/checkR die ontworpen is om te amplificeren over de recA-promotor - en terminatorregio's om de in-frame deletie van het doelgen te verifiëren. Sequencen het PCR-product om de precieze verwijdering van recA in het frame te bevestigen.
19. Succesvolle deletie wordt aangegeven door een verkleining van de PCR-productgrootte, die overeenkomt met de lengte van het wildtypefragment minus de specifieke lengte van het verwijderde gensegment.

2. Constructie van pKV2-LLtnp voor Tn5-mutagenese in P. brasiliense

1. Versterk de Tnp-transposasecassette van pMCS2-LLtnp⁸ met primerpaar Tnp-F/Tnp-R, en versterk de oriγR6K Tn5-ruggengraat van pKV2 met primerpaar ori-F/ori-R. Zuiver alle PCR-producten met een DNA-zuiveringskit.
2. Assembleer de gezuiverde Tnp-cassette en oriγR6K Tn5-ruggengraat met behulp van een DNA-assemblagekit. Transformeer het assemblagemengsel door hitteshock in chemisch competente E. coli S17-1 λpircellen, herstel in LB-medium en plat op LB-agar aangevuld met kanamycine (LB + kan).
3. Valideer positieve klonen door kolonie-PCR met primerparen ori-F/ori-R en Tnp-F/Tnp-R.
4. Bereid E. coli RHO3-competente cellen voor door één kolonie in LB-medium te inoculeren en deze een nacht te laten incuberen. Verdun de cultuur 1:100 tot vers LB-medium en laat het groeien tot een OD₆₀₀ van 0,6.
5. Koel de cultuur op ijs en was de cellen drie keer met voorgekoelde 0,1 M CaCl₂. Sussief de uiteindelijke pellet opnieuw in 500 μL voorgekoelde glycerol van 20% en bewaar bij −80 °C.
6. Transformeer 10 μL van het gevalideerde recombinante plasmide (pKV2-LLtnp) in 100 μL RHO3-competente cellen door hitteshock (verwachte transformatiesnelheid > 106^cfu /μg). Broed 30 minuten op ijs, laat 45 seconden hitteshock op 42 °C en laat het dan 2 minuten afkoelen op ijs.
7. Voeg 500 μL LB medium toe en incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur met roeren. Plat op LB-agar met kanamycine en DAP (LB + kan + DAP) en incubeer bij 37 °C gedurende de nacht.
8. Valideer positieve RHO3-transformanten door kolonie-PCR met behulp van Tnp-F/Tnp-R.

3. Constructie van de Tn5 transposon mutantenbibliotheek in P. brasiliense

1. Kweek P. brasiliense ΔrecA in LB-medium bij 28 °C en kweek RHO3/pKV2-LLtnp in LB-medium aangevuld met kanamycine en DAP (LB + kan + DAP) bij 37 °C. Laat beide stammen een OD₆₀₀ van 1 bereiken.
2. Meng 100 μL P. brasiliense ΔrecA met 100 μL RHO3/pKV2-LLtnp, centrifugeer het mengsel, gooi het supernatant weg en suspendeer de gewassen pellet opnieuw in 10 μL LB-medium.
3. Plaats het opnieuw gesuspendeerde mengsel op een LB-agarplaat aangevuld met DAP en incubeer 8 uur bij 28 °C om conjugatie mogelijk te maken.
4. Haal het conjugatiemengsel terug door het plaatoppervlak af te spoelen met 1 mL steriel LB-medium. Centrifugeer kort, gooi het supernatant weg en spoel de pellet twee keer met LB-medium om DAP te verwijderen.
5. Suspensie de gewassen pellet opnieuw in 300 μL LB-medium en plaats 10x seriële verdunningen op LB-agar aangevuld met kanamycine en glucose (LB + kan + glucose; zonder DAP) om te selecteren voor transconjuganten.
6. Incubeer de platen bij 28 °C gedurende 48 uur. Kies vijf kolonies en valideer elk met kolonie-PCR met primerparen ori-F/ori-R en Tnp-F/Tnp-R om de succesvolle introductie van de Tn5-transposon te bevestigen. Sequencen alle vijf kolonies om de Tn5-insertie in het genoom te verifiëren.
   OPMERKING: Voorafgaand aan de formele bouw van de mutantenbibliotheek werden zes losse kolonies willekeurig geselecteerd uit de conjugatieplaat. Plasmide-reddingsassays werden uitgevoerd om de insertieplaatsen te bepalen, waarbij twee verschillende restrictie-enzymen afzonderlijk als twee parallelle controlegroepen werden gebruikt. In totaal werden 36 sequencing reads verkregen. Een enkele Tn5-insertiegebeurtenis werd alleen gevalideerd wanneer de zes insertieplaatsen voor elke individuele kolonie identiek waren.
7. Schat de capaciteit van de mutantenbibliotheek door de conjugatiestap te herhalen en het aantal kolonies te tellen. Zorg ervoor dat de totale bibliotheekgrootte meer dan 12.000 kolonies bedraagt om voldoende genomische dekking te bereiken voor downstream screening.
   OPMERKING: Als een lage mutagenesefrequentie wordt waargenomen, moet het gebruik van een hyperactieve Tn5-transposasevariant, zoals de E54K/M56A/L372P-mutant, worden overwogen om de transpositie-efficiëntie te verbeteren.
8. Overdracht van individuele mutantenkolonies die in stap 6 zijn verkregen naar 96-wellplaten met 200 μL LB + kan per put. Incubeer de platen een nacht op 28 °C met schudden bij 200 rpm.
9. Voeg 133 μL steriele 50% glycerol toe aan elke put om een uiteindelijke concentratie van ongeveer 20% te bereiken. Sluit en bewaar de platen met 96 putten bij −80 °C voor langdurige conservering.

4. Hoogdoorvoerpathogeniteitstests via aardappelknol- en potinoculatie

1. Bereid aardappelknollen (cv. Favorita) voor door te spoelen met steriel water, kort onder te dompelen in 75% ethanol en aan de lucht te drogen op een schone bank. Snijd de knollen in ~8 mm dikke stukken en plaats de plakjes in steriele petrischaaltjes van 90 mm. Bereid minstens drie plakjes voor voor biologische replica's.
2. Inoculeer 1 μL van elke mutantstam op aardappelschijfjes met een multikanaals pipet, volgens de plaatindeling van de 96-wells mutantbibliotheek. Neem P. brasiliense ΔrecA op als positieve controle en LB + kan als negatieve controle.
3. Breng de ingeënte aardappelschijfjes uit bij 28 °C gedurende 7–8 uur. Mutanten vertonen zichtbaar verminderde maceratie of kleinere laesiegebieden vergeleken met de ΔrecA-controle . Kwantificeer het laesiegebied door de lengte en breedte te meten. Wijs deze aan als kandidaten voor primaire selectie.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat OD_600-waarden van mutantenculturen en controles worden genormaliseerd tot 0,8 vóór de inenting.
4. Voor secundaire screening inoculeer 5 μL van elke kandidaatstam op verse aardappelschijfjes (6 stammen per schijf, gelijke afstand). Bereid drie biologische replicaten voor voor elke stam. Incubeer bij 28 °C gedurende 7–8 uur en registreer de grootte van de laesie om de demping te bevestigen.
5. Isoleer stammen met consistente virulentievermindering door ze te stripen op LB + kan-platen. Incubeer de platen bij 28 °C 's nachts en bewaar gevalideerde mutanten met verminderde virulentie bij 4 °C voor latere analyse.
6. Voor validatie van hele planten inoculeer aardappelstengels met 150 μL bacteriële suspenties genormaliseerd tot 1 x 10⁸ CFU/mL. Injecteer suspenties in het basale stengelgebied met een steriele spuit. Observeer de ontwikkeling van de ziekte na 48 uur. Voer biologische replicaties uit op drie individuele planten.
7. Beoordeel de ernst van de ziekte met behulp van de Blackleg disease-schaal ("een 6-punts ordinale schaal: 0, 1, 3, 5, 7, 9") en bereken de ziekte-index als:
   1. Graad 0: Geen ziekteverschijnselen op de hele plant.
   2. Graad 1: Stengellaesies bedekken niet meer dan 1/3 van de stengelomtrek en/of individuele bladeren zijn verwelkt.
   3. Graad 3: Stengellaesies bedekken niet meer dan de helft van de stengelomtrek, en/of minder dan de helft van de bladeren vertonen lichte verwelking, en/of enkele onderste bladeren hebben laesies.
   4. Graad 5: Stengellaesies bedekken meer dan de helft van de stengelomtrek en/of meer dan de helft van de bladeren vertonen lichte verwelking.
   5. Graad 7: Stengellaesies omringen de gehele stengelomtrek en/of meer dan 2/3 van de bladeren is verwelkt.
   6. Graad 9: Alle bladeren van de plant zijn verwelkt of dood.
      
8. Bereid langdurig opslagvoorraden van bevestigde verzwakte mutanten voor door culturen te mengen met een gelijk volume steriel 50% glycerol tot een uiteindelijke concentratie van 25%, en bewaar bij -80 °C.

5. Identificatie van Tn5-inzetplaatsen door plasmidredding

1. Kweek de Tn5-mutant van interesse en extraheer genomisch DNA met behulp van een bacteriële genomische DNA-extractiekit. Kwantificeer de DNA-concentratie om voldoende input te garanderen voor de latere vertering.
2. Digesteer 1–2 μg genomisch DNA met EcoRI in een reactie van 100 μL met een reactiebuffer van 10× en 5 μL enzym, en incubeer het mengsel bij 37 °C gedurende minimaal 3 uur. Controleer de voltooiing van de spijsvertering met behulp van een agarosegel.
3. Precipiteer het verteerde DNA door 1/10 volume 3 M natriumacetaat en 3 volumes absolute ethanol toe te voegen. Meng grondig en laat het 1 uur incuberen bij -20 °C.
4. Centrifugeer op 13.500 x g gedurende 5 minuten en was de pellet achtereenvolgens met 75% ethanol en absolute ethanol. Laat de pellet aan de lucht drogen en opnieuw ophangen in 17 μL steriel water.
5. Zelf ligateer de verteerde DNA-fragmenten door 2 μL 10× T4 DNA-ligasebuffer en 1 μL T4 DNA-ligase toe te voegen. Voeg een negatieve controle (geen ligase) toe om de achtergrondtransformatie te controleren. Incubeer de ligatureactie 's nachts bij 4 °C om de circularisering van restrictiefragmenten te bevorderen.
6. Transformeer 10 μL van het ligatiemengsel in chemisch competente E. coli S17-1 λpir met behulp van hitteschoktransformatie zoals eerder beschreven. Haal cellen 1 uur terug in LB en plaat op LB-agar met kanamycine (LB + kan) om plasmiden te selecteren die de Tn5-cassette dragen.
7. Kies vijf willekeurige kanamycineresistente kolonies en extraheer plasmid-DNA met een standaard plasmid miniprep-kit. Valideer plasmidestructuur door 500 ng van elk plasmide te verteren met HindIII en 5 uur te incuberen bij 37 °C. Analyseer verteringspatronen met agarosegel-elektroforese.
8. Als de plasmidbandgroottes overeenkomen met de verwachte fragmentpatronen, voer dan Sanger-sequencing uit met de 5' ME-primer die zich binnen de Tn5-uiteinden bevindt.
9. Identificeer de precieze Tn5-insertieplaats door de 50-100 bp flanksequentie stroomafwaarts van de Tn5 5'-ME-regio uit te lijnen met het P. brasiliense SM-genoom met behulp van BLAST- of genoomanalysesoftware.
10. Bevestig dat alle vijf onafhankelijke sequencingreacties voor elke mutant worden afgestemd op dezelfde genomische coördinaat (> 98% sequentie-identiteit).
11. Als een van de vijf sequencing-reacties op een andere genomische coördinaat wordt afgestemd, duidt dit op de aanwezigheid van meerdere Tn5-insertieplaatsen in die mutant. In zulke gevallen analyseer je extra kolonies om alle inzetposities te bepalen. Alternatief kun je Southern blotting of whole-genome sequencing uitvoeren om meer definitieve insertie-site mapping te verkrijgen.
12. Wijs mutanten aan met één consistente insertieplaats over alle sequencingreacties als bona fide Tn5 single-insertion mutanten die geschikt zijn voor downstream fenotypische of genetische analyses.

Resultaten

Om de instabiliteit veroorzaakt door de sucB-mutatie in P. brasiliense te overwinnen, werd het vmi480-toxine uit plasmide pLP12 gebruikt als tegenselectiemarker, en werd de gemodificeerde zelfmoordvector pKV2 (Figuur 1A) geconstrueerd door de antibioticaresistentiecassette te vervangen en de configuratie van de kloonplaats aan te passen. Om een markerloze recA-deletiemutant te genereren, werden ~800 bp linker- en rechterhomologe armen van het recA-gen gekl...

Discussie

De genetische manipulatiestrategie die in deze studie is ontwikkeld, biedt een optie voor functionele genomica in P. brasiliense, een primaire zachte rotziekteverwekker van aardappel ^9,10. Door een toxine-gebaseerd tegenselectiesysteem te integreren in een zelfmoordplasmide-ruggengraat, werd een markerloze ΔrecA-mutant gegenereerd. Deze aanpak biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van traditionele SACB-g...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bacterieel genomisch DNA-extractiekit	Extract bacterieel genomisch DNA	Tiangen	DP302-02
Diaminopimelinezuur	0,3 mM in 1 L medium	Macklin	D836611-5g
DNA-assemblagekit	DNA-assemblage	Vazyme	C116-02
DNA-zuiveringskit	DNA-zuivering	Tiangen	DP214-02
Kanamycine	50 mg/mL	Aladdin	K103025-25g
Glucose	0,2% (w/v)	Aladdin	G116305-250mg
Trypton	10% in 1 L medium	OXOID	LP0042B
Gistextract	5% in 1 L medium	OXOID	LP0021B
NaCl	10% in 1 L medium	Biofroxx	1249KG001
Agar	15% in 1 L medium	Biofroxx	8211GR500
L-arabinose	0,3% (w/v)	Aladdin	A106196-25g
Plasmidecode-miniprepkit	Extract plasmid	Tiangen	DP103-02
EcoRI	Restrictienendonuclease	Yugong Biotech	EG15536
NheI	Restrictienendonuclease	Yugong Biotech	EG15552
HindIII	Restrictienendonuclease	Yugong Biotech	EG15539
T4 DNA ligase	Lineaire DNA-zelfcirkularisatie	Yugong Biotech	EG15205
Centrifuge	RWD	M1324R
PCR Thermal Cycler	BIO-GENER	GET3XG
Digitale camera	SONY	ILCE-7M4
Elektroforesesysteem	LY	DYY-6C
Waterbad	JOANLAB	WB100-1F
Geldocumentatiesysteem	Thermo Fisher Scientific	iBright CL750
Autoclaaf	Yamato	SQ510C
Scheidingsrotator	ZHICHU	ZQZY-AR8
Incubator met constante temperatuur	ZQ	DHP-9272
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	Lite Plus
UV-Vis spectrofotometer	HITACHI	U-3900
Electroporator	BIO-RAD	MicroPulser
Stam en plasmiden
P. brasiliense SM	Aardappelpathogene bacteriën	Laboratoriumstamcollectie
E. coli S17-1 λpir	E. coli competente cellen	WEIDI	DL2010S
E. coli WM3064	E. coli competente cellen	BIO SCI BIO	C1039
E. coli RHO3	E. coli competente cellen	Laboratoriumstamcollectie
pKV2	Het gemodificeerde zelfmoordplasmide	Geconstrueerd in deze studie
pLP12	zelfmoordplasmide	Laboratoriumstamcollectie
pMCS2-LLtnp	Verstrek het fragment dat Tn5 draagt	Laboratoriumstamcollectie
pKV2-LLtnp	Het gemodificeerde plasmide dat het Tn5-fragment draagt.	Geconstrueerd in deze studie
Pimers
LBF (ctgaaagcttctgcaggagctcgctgacccaacaatccttgattaagatgaggc)		Aangepast
LBR (gttcagccaccattctgctcctgtcatgcggcgt)		Aangepast
RBF (caggagcagaatggtggctgaacgggttgtgac)		Aangepast
RBR (gatcctgcagcggagcggccgcgcagatcgcgggcaaggttagtc)		Aangepast
checkF (ctatgcgcttcgcataccgtgc)		Aangepast
checkR (gctcttgctcataattgtcctgg)		Aangepast
TnpF (ggaatctagaccttgagtcgatatcactctcgtttaatgctg)		Aangepast
TnpR (acaaacaaaaccaaattctgtacggcgaag)		Aangepast
ori-F (taatcgccttgcagcacatc)		Aangepast
ori-R (ggtatgagtcagcaacacct)		Aangepast
5’ME (attcattaatgcagctggcacg)		Aangepast