Een in vitro systeem voor het toepassen van trekkracht op skeletstamcellen met behulp van een cyclisch celstress-spanningssysteem

Samenvatting

Muizenperiostale skeletstamcellen (SSC's) werden geïsoleerd met FACS en in vitro gekweekt. Er werd een beheersbaar experimenteel systeem opgezet om cyclische trekmechanische stimulatie toe te passen op SSC's, wat resulteerde in een verminderde expressie van de cellulaire senescentie-geassocieerde genen, specifiek p16 en p21.

Samenvatting

Bot is een belangrijk mechanosensitiv orgaan dat continu reageert op fysieke signalen in het lichaam. Hoewel mechanische stimulatie een belangrijke rol speelt in skeletontwikkeling, homeostase en herstel van verwondingen, blijven de specifieke reacties van skeletstamcellen (SSC's) op mechanische stress onvolledig begrepen. Om deze vraag te beantwoorden, hebben we een in vitro model ontwikkeld om muis periostale SSC's te isoleren en mechanische stimulatie toe te passen. Muizenperiostale cellen werden eerst verkregen door enzymatische vertering, en SSC's werden vervolgens geïsoleerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) op basis van gevestigde oppervlaktemarkers. Na hechting aan kweek werden SSC's onderworpen aan trekmechanische stimulatie met behulp van een cyclisch celstress-spanningssysteem. Dit systeem maakt de reproduceerbare toepassing van trekkracht op gekweekte cellen mogelijk en biedt een platform voor het analyseren van SSC-reacties op mechanische input. Met deze benadering ontdekten we dat de expressie van de cellulaire senescence-geassocieerde genen p16 en p21 bij SSC's duidelijk was verminderd na mechanische stimulatie. Deze bevindingen suggereren dat trekstimulatie invloed kan hebben op altering-gerelateerde veranderingen in SSC's onder in vitro omstandigheden. Al met al biedt dit protocol een nuttig en geschikt platform om het gedrag van SSC onder mechanische stimulatie te bestuderen en om te onderzoeken hoe mechanische signalen de SSC-functie beïnvloeden.

Inleiding

Als het grootste en belangrijkste ondersteunende orgaan in het menselijk lichaam biedt het skeletsysteem niet alleen aanhechtingsplaatsen en bescherming voor andere organen, maar dient het ook als basis voor motorische functie. Daarom wordt het skeletsysteem voortdurend blootgesteld aan diverse mechanische prikkels uit zowel interne als externe omgevingen. Mechanische stimulatiesignalen zijn even cruciaal voor botontwikkeling als functioneel onderhoud. Al in 1893 werd voorgesteld dat er een zekere positieve correlatie bestaat tussen botdichtheid en de mechanische kracht die botten dragen, wat Wolff's wet¹ is. In recente jaren hebben sommige studies het belang aangetoond van het skeletsysteem dat mechanische krachten draagt voor de normale ontwikkeling van botten 2,3,4,5. De reactie van het skeletstelsel op mechanische kracht hangt deels af van de cellulaire componenten in het bot⁶. Osteocyten vormen 85% tot 90% van de cellulaire componenten in het skeletstelsel. Vanwege hun brede verspreiding en unieke dendritische celmorfologie zijn osteocyten momenteel het meest grondig bestudeerde type skeletcellen qua mechanische respons ^7,8. Naast het algemeen erkende vermogen van osteocyten om te reageren op mechanische kracht, spelen skeletprecursorcellen ook een onmisbare rol hierin. Er werd vastgesteld dat de respons van periostale precursorcellen op mechanische signalen hun lotstransformatie reguleerde, waardoor het herstel van weefselschade⁹ werd beïnvloed.

Skeletstamcellen (SSC's) zijn een type weefselspecifieke stamcellen met zelfvernieuwingsvermogen, die kunnen differentiëren tot rijpe botcellen die nodig zijn voor botgroei, onderhoud en herstel. In 2015 werden er¹⁰ oppervlaktemarkergenen voor muis-SSC's geïdentificeerd. Vervolgens hebben meerdere studies ook aangetoond dat SSC's een zeer belangrijke rol spelen in diverse aspecten zoals botontwikkeling, homeostase en botletselherstel^11,12. Vanwege de eigenschap van het skeletsysteem dat reageert op mechanische krachten, kunnen we mechanische krachtsignalen beschouwen als een onmisbare factor bij het reguleren van de functie van skeletstamcellen. Om de gedragsveranderingen van SSC's onder mechanische stimulatie te bestuderen, moeten we een geschikt experimenteel systeem opzetten voor het toepassen van mechanische kracht in vitro.

De belangrijkste methoden van in vitro mechanische stimulatie voor cellen zijn vloeistofafschuifspanning, drukspanning, trekkracht, hydrostatische druk, matrixstijfheid en matrixtopologie ^6,13. Op basis van de oppervlaktemarkergenen van muis-SSC's verkregen we muisperiostale SSC's door middel van flowcytometrie-sortering, aangezien de SSC's die betrokken zijn bij breukherstel voornamelijk afkomstig zijn van het periosteum¹⁴. Vervolgens werd een geschikte trekkracht uitgeoefend op de periostale SSC's via een cyclisch celspanningssysteem. Na trekkrachtstimulatie kunnen celmonsters worden verkregen en multi-omics-analyses worden uitgevoerd, waaronder transcriptoomsequencing, proteoomsequencing en ATAC-seq. Daarom biedt het opstellen van dit protocol een solide basis voor het bestuderen van SSC-reacties op mechanische stimulatie.

Protocol

De muisexperimenten in dit protocol zijn allemaal goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van het Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academie van Wetenschappen (SIBCB-S350-2312-41).

1. Isolatie van periostale cellen bij muizen

1. Plaats muizen van 4 tot 6 weken oud in een CO₂-euthanasiedoos en stel ze 3 minuten lang continu bloot aan CO₂ totdat de ademhaling stopt.
2. Desinfecteer het oppervlak van de muizenlichamen met 75% alcohol. Gebruik een oogschaar om de achterpoten te scheiden. Gebruik vervolgens een puntige tang en een oogschaar om de skeletspieren van de achterpoten te verwijderen, zodat de gewrichtsgebieden van het dijbeen en het scheenbeen intact blijven.
3. Bewaar de geïsoleerde botten in gekoelde PBS en bedek vervolgens beide uiteinden met laagsmeltende agarose (5-10% in TAE-buffer).
4. Verteer de dijbeen en scheenbeenbeen in minimaal essentiële medium alfa (α-MEM) met 1 mg/mL collagenase, 2 mg/mL dispase II en 0,1 mg/mL DNase I bij 37°C en 0,3 × g gedurende 30 minuten twee keer. Verzamel de verteerde cellen in het kweekmedium (α-MEM + 10% fotaal rundserum (FBS)).
5. Filter de celsuspensie door een 40 μm celzeef en centrifugeer vervolgens op 500 × g gedurende 5 minuten om het supernatant te verwijderen.
6. Sussifiseer de celprecipitatie opnieuw met een rode bloedcel lysebuffer voor 2 minuten en beëindig de reactie met een flowcytometriebuffer (PBS + 2% FBS).
7. Centrifugeer de cellen op 500 × g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg. Sussief de cellen opnieuw met een flowcytometriebuffer bij 1 × 10^{7 cellen} /mL voor celsortering.

2. Fluorescentie-geactiveerde celsortering

1. Kleur de celsuspensie met de volgende antilichamen als volgt: PerCP/Cy5.5-geconjugeerde anti-muis CD45, PerCP/Cy5.5-geconjugeerde anti-muis CD31, PerCP/Cy5.5-geconjugeerde anti-muis Ter119, FITC-geconjugeerde anti-muis 6C3/Ly-51, Brilliant Violet 605-geconjugeerde anti-muis CD90.2, PE/Cy7-geconjugeerde anti-muis CD105, APC-geconjugeerde anti-muis CD200.
2. Verdun bovenstaande antilichamen met een verhouding van 1:500 en breng ze 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht.
3. Was de cellen met een flowcytometriebuffer en voer celsortering uit met een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder om CD45-CD31-Ter119^- CD90.2-6C3^- CD105-CD200⁺ SSC's te verkrijgen. Verzamel de gesorteerde SSC's met het kweekmedium. Analyseer de verkregen data met FlowJo v10.8.1-software.
4. Breid de gesorteerde SSC's uit in kweekschalen met expansiemedium in een 5%_CO-2-cel incubator. Er kon één passage worden uitgevoerd vóór mechanische stimulatie.
   OPMERKING: Ongeveer 1 × 10^{à 5} periostale SSC's kunnen worden verkregen van elk paar muizen van 6 weken oud.

3. Mechanische stimulatie van SSC's

1. Verdun het rattenstaart type I collageen in gesteriliseerd 0,02 M azijnzuur tot een eindconcentratie van 0,15 mg/mL. Deze oplossing kan 3 keer worden hergebruikt en moet op 4 °C worden gehouden.
2. Voeg 1,5 mL verdund Rat tail type I collageen toe aan elke put van de 6-wells flexibele cultuurplaat. Na het bedekken van de platen 1 uur op kamertemperatuur, aspireer je het overtollige collageen en was je de platen één keer met PBS voor later gebruik.
3. OPMERKING: Voor direct gebruik moet de plaat worden afgespoeld met PBS om eventueel achtergebleven zuur te verwijderen. Voor opslag bij 4 °C moet het bord volledig gedroogd worden met het deksel verwijderd.
4. Verteer de gekweekte muisperiostale SSC's, centrifugeer 5 minuten op 500 × g , laat het celprecipitaat opnieuw in het kweekmedium ophangen tot een celdichtheid van 1 × 10⁵ cellen/mL, voeg 2 ml celsuspensatie toe aan elke put van de 6-put flexibele bodem kweekplaat en plaats deze in de celincubator.
5. 24 uur na het zaaien van de cellen plaats je de kweekplaat met flexibele bodem in de uitgerekte basisplaat, en behoud je een andere kweekplaat met flexibele bodem als controlegroep zonder mechanische krachtstimulatie.
6. Stel de parameters in de FX-6000 versie 1.0 software als volgt in: reksterkte 8%, frequentie 0,1 Hz, golfvorm als vierkante golf, golfvormduty cycle 80%, en rekduur voor 12 uur.
   OPMERKING: Er zijn vier posities op de uitgerekte bodemplaat voor het plaatsen van een 6-velde kweekplaat met flexibele bodems. Als de benodigde cellen voor het experiment minder dan 4 zijn, moeten de lege posities worden gevuld met nieuwe 6-wells kweekplaten met flexibele bodems. Na het toepassen van passende mechanische stimulatie kunnen SSC's functionele tests ondergaan, zoals celdifferentiatie of proliferatie, of kunnen monsters worden geëxtraheerd voor multi-omics sequencing.

4. Real-time kwantitatieve PCR (RT-qPCR)

1. Na voltooiing van de mechanische stimulatie van de cellen wordt het kweekmedium weggegooid, de cellen één keer gewassen met PBS, het totale RNA met TRIzol-reagens extraherend en wordt een RNA-reverse-transcriptie uitgevoerd.
   OPMERKING: Na voltooiing van RNA-extractie kan het worden opgeslagen bij -80 °C. Het cDNA dat uit reverse transcriptie wordt verkregen, kan ook worden opgeslagen bij -20 °C voor latere tests.
2. Voer de RT-qPCR uit met een realtime PCR-systeem. De gebruikte primersets waren als volgt:
   Hprt: vooraan 5'-GTTAAGCAGTACAGCCCCAAA-3',
   Hprt: achterzijde 5'-AGGGCATATCCAACAACAACAAACTT-3',
   p16: vooruit 5'-GGTCACACGACTGGGCGATT-3',
   p16: achterzijde 5'-GCACCGTAGTTGAGCAGAAGAG-3',
   p21: vooraan 5'-GCCTGGTTCCTTGCCACTTCTT-3',
   p21: achteruit 5'-ATTACGGTTGAGTCCTAACTGCCATC-3'.

5. De effecten van kortdurende behandeling van mechanische stress

1. Stel de parameters in de FX-6000 versie 1.0 software als volgt in: reksterkte 8%, frequentie 0,1 Hz, golfvorm als vierkante golf, golfvormduty cycle 80%. De cellen worden gelyseerd met RIPA lysisbuffer I (met fosfatase-remmercocktail en proteaseremmer-cocktail) na 10 en 60 minuten na mechanische spanningsstimulatie.
2. Voer de Western blot uit met Erk en p-Erk antistoffen.

Resultaten

Na de implementatie van dit protocol werd trekkracht met succes toegepast op periostale SSC's van muizen. Ten eerste werden SSC's verkregen uit het periost van muizen door middel van flowcytometrie. De flowcytometrieresultaten toonden aan dat het aandeel SSC's in het periost bijna 30% van Lin^- (CD45^-, CD31^-, Ter119^-) CD90.2-6C3^- (Figuur 1) uitmaakte, wat veel hoger was dan dat in het beenmerg. Gezien de belangrijke...

Discussie

In de afgelopen jaren zijn skeletstamcelmarkergenen uit verschillende delen van botten continu ontdekt ^11,12,17. Toch moet onderzoek naar de directe regulatie van de functie van SSC's nog worden verdiept, vooral op het gebied van regulatie van mechanische krachtstimulatie. Tot nu toe is onderzoek naar de mechanische regulerende effecten van skeletstamcellen/precursorcellen voornamelijk gebaseerd...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
α-MEM	Corning	10-022-CV	periostale celisolatie
APC anti-muis CD200	BioLegend	123809	SSCs sorteren
BioFlex 6-Well Cultuurplaat	Flexcell	BF-3001A	Celcultuur
Brilliant Violet 605 anti-muis CD90.2	BioLegend	140317	SSCs sorteren
Collageenase	Sigma	C0130	periostale celisolatie
Dispase II	Sigma	D4693	periostale celisolatie
DNase I	Sigma	DN25	periostale celisolatie
Foetaal bovien serum	Gibco	A5356701	SSCs sorteren
FITC anti-muis 6C3/Ly-51	BioLegend	108305	SSCs sorteren
Flexcell Spanningssysteem	Flexcell	Flexercell FX-6000	Celspanning
Flow Cytometrie Sorter	BD	BD FACSAria Fusion	SSCs sorteren
MesenCult Expansie Kit (Muis)	Stamcel	05513	Celcultuur
PE/Cy7 anti-muis CD105	BioLegend	120409	SSCs sorteren
PerCP/Cy5.5 anti-CD31	BioLegend	102522	SSCs sorteren
PerCP/Cy5.5 anti-CD45	BioLegend	103132	SSCs sorteren
PerCP/Cy5.5 anti-muis TER-119	BioLegend	116228	SSCs sorteren
PrimeScript RT Reagens Kit	TaKaRa	RR037A	RT-qPCR
Rattenstaart type I collageen	Corning	354236	Celcultuur
real-time PCR systeem	Thermo Fisher Scientific	QuantStudio 1 Plus	RT-qPCR
rode bloedcel lysis buffer	Beyotime	C3702	periostale celisolatie
TRIzol	Sigma	T9424	RT-qPCR
Fosfatase Inhibitor Cocktail II	MCE	HY-K0022	WesterBlot
RIPA Lysis Buffer I	Sangon Biotech	NO. C500005	WesterBlot
Protease Inhibitor Cocktail	MCE	HY-K0010	WesterBlot
p44/42 MAPK (Erk1/2) Antilichaam	Cell Signaling Technology	9102	WesterBlot
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) Konijn Monocloonaal Antilichaam	Cell Signaling Technology	4370	WesterBlot