Methodenartikel

Fabricage en chirurgische toepassing van verrijkte, foto-gekruiste gelatine–riboflavine hydrogels voor herstel van hoornvlieswonden bij konijnen

218 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70579

⸱

24 april 2026

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, School of Medicine and Nursing, University of the Basque Country UPV/EHU, 2BEGIKER Ophthalmology Research Group, IIS Biobizkaia, 3Department of Ophthalmology, University Hospital of Cruces

In dit artikel

Samenvatting

Er wordt een reproduceerbaar protocol gepresenteerd voor de bereiding, verrijking en toepassing van een in situ blauwlicht-crosslinkable gelatine-riboflavine hydrogel voor het herstel van corneale stromale wonden bij konijnen, inclusief procedurele stappen voor chirurgische behandeling, gedeeltelijke tarsorrofie en postoperatieve zorg.

Samenvatting

Dit artikel presenteert een stapsgewijs protocol om een in situ blauwlicht-crosslinkbare gelatinehydrogel te vervaardigen, aan te vullen en chirurgisch toe te passen voor het herstel van de wond van het hoornvlinstom bij konijnen. De hydrogelprecursor bestaat uit gelatine met 5% (w/v) en riboflavinefosfaat met 0,01% (w/v), bereid onder steriele en lichtbeschermde omstandigheden, steriel gefilterd en verwarmd voor gebruik om injecteerbare viscositeit te bereiken. Optionele toevoeging van humaan amniotisch membraanextract of konijnautologe serum wordt gedetailleerd beschreven. On-demand gelatie wordt op het oogoppervlak geactiveerd met blauw licht bij λ = 420–480 nm voor een totaal van 2 minuten. De in vivo methode omvat een reproduceerbare anterieure stromale keratectomie (trefinediameter 6,5 mm; diepte ongeveer 187 μm), gevolgd door hydrogelvulling, lichtactivatie en een gedeeltelijke laterale tarsorrhapie om de behandeling te stabiliseren, wondgenezing te bevorderen en postoperatieve zorg te standaardiseren. Representatieve in vitro uitkomsten tonen gelachtig visco-elastisch gedrag met schuifdunner worden en snel herstel, en een hoge optische transmissie (> 90%) boven 500 nm, wat wijst op geschiktheid voor gebruik van het hoornvlieren. In vivo ondersteunen hydrogel-gebaseerde behandelingen progressieve epitheelsluiting, goede oculaire tolerantie (lage Draize-scores na 3 en 7 dagen) en tijdsafhankelijk verlies van zichtbare hydrogel dat consistent is met biodegradatie en weefselvervanging. Kritieke stappen en pauzepunten worden benadrukt om reproduceerbaarheid te waarborgen, waaronder temperatuurregeling tijdens oplossen en filtratie, bescherming tegen licht en lamppositie tijdens crosslinking. Het protocol maakt hechtevrije, precies geplaatste, lichtgeactiveerde hydrogelstabilisatie mogelijk, compatibel met toevoeging van meerdere bioactieve supplementen. Het biedt een praktisch platform voor preklinische evaluatie van de volgende generatie oogheelkundige biomaterialen en faciliteert de vertaling van fotocrosslinkbare hydrogeltherapieën voor het herstel van hoornvlieswonden.

Inleiding

Het hoornvlies is een transparante, avasculaire structuur die ongeveer tweederde van de brekingskracht van het oog uitmaakt, waardoor de structurele en functionele integriteit essentieel is voor het zicht1. Door de directe blootstelling aan de externe omgeving is het hoornvlies zeer gevoelig voor trauma, infectie, chemische schade en postoperatieve complicaties 2,3. Het niet snel en effectief herstellen van de epitheelintegriteit kan leiden tot aanhoudende epitheeldefecten (PED's) en chronische hoornvlieszweren, wat uiteindelijk resulteert in stromale smelting, perforatie, littekenvorming en onomkeerbaar gezichtsverlies 4,5. Conventionele therapieën—waaronder glijmiddelen, antibiotische profylaxe en autologe serumdruppels voor de oog—bieden vaak slechts gedeeltelijk voordeel en bevorderen stromale reparatie bij matige tot ernstige defecten 6,7,8 niet adequaat.

Om deze beperkingen aan te pakken, zijn biomateriaalgebaseerde therapieën naar voren gekomen als veelbelovende alternatieven vanwege hun vermogen om de wond te beschermen, epitheelherstel te ondersteunen en stromaal weefsel te herstellen 9,10,11,12,13,14. Hydrogels zijn bijzonder aantrekkelijk vanwege hun biocompatibiliteit, optische transparantie, instelbaar mechanisch gedrag en het vermogen om therapeutische middelen te bevatten. Zowel natuurlijke als synthetische hydrogels, waaronder gelatine 15,16,17, collageen18,19, chitosan20,21, polyethyleenglycol (PEG)22,23 en hyaluronzuur 18,24, hebben aangetoond potentieel te bevorderen voor de genezing van hoornvlinnervijnwonden. Onder deze zijn gelatine-gebaseerde hydrogels vooral waardevol vanwege hun collageenafgeleide samenstelling en intrinsieke celadhesiemotieven.

Fotocrosslinkbare hydrogels bieden een extra voordeel doordat ze direct op het oogoppervlak on-demand solidatie mogelijk maken, wat precieze plaatsing en verbeterde mechanische stabiliteit zonder hechtingen mogelijk maakt. Riboflavine-gemedieerde crosslinking, oorspronkelijk ontwikkeld voor keratoconusbehandeling, is recentelijk aangepast voor hydrogelfotopolymerisatie vanwege de uitstekende biocompatibiliteit, oftalmische veiligheid en het vermogen om reactieve zuurstofsoorten te genereren die crosslinking induceren onder zichtbaar of UV-licht25,26. Blauw licht (≈445 nm) is bijzonder voordelig voor corneale toepassingen, omdat het efficiënte crosslinking mogelijk maakt zonder UV-gerelateerde risico's 27,28,29.

Dit artikel presenteert de fabricage, verrijking en chirurgische toepassing van een foto-crosslinkbare hydrogel bestaande uit 5% (w/v) gelatine en 0,01% (w/v) riboflavinefosfaat (RFP). Er is een gedetailleerd protocol gegeven voor in vitro hydrogelpreparatheid, inclusief optionele opname van humaan amniotisch membraanextract (HAMe) of autolog serum (AS), evenals in vivo toepassing in een konijnenstromale keratectomiemodel. HAMe staat bekend om ontstekingsremmende, antifibrotische en pro-regeneratieve effecten op het oogoppervlak te hebben, terwijl autologe serum traanvormige concentraties van vitamine A, EGF, fibronectine en andere groeifactoren levert die essentieel zijn voor epitheelregeneratie. Samen ondersteunen deze elementen re-epithelialisatie, verminderen ontstekingen en voorkomen mogelijk stromale degradatie39,40.

Hoewel de beschreven aanpak gecontroleerde fotopolymerisatie en aanpasbare bioactiviteit biedt, is de toepasbaarheid momenteel beperkt tot oppervlakkige en middenstromale defecten en vereist het blootstelling aan blauw licht in het zicht, wat het gebruik in ondoorzichtige of diep geïnfiltreerde weefsels kan beperken. Door hydrogelvoorbereiding en verrijking, oogheelkundige behandeling en postoperatieve zorg, inclusief gedeeltelijke laterale tarsorrafie, te integreren, biedt dit artikel een reproduceerbare benadering die het herstel van het hoornvlies ondersteunt, de vertaling van lichtgeactiveerde hydrogeltechnologieën naar de klinische praktijk faciliteert en bijdraagt aan de ontwikkeling van gestandaardiseerde platforms voor regeneratief onderzoek naar het hoornvlies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Menselijke placenta's zijn verkregen van donoren met geïnformeerde toestemming, in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en met goedkeuring van de Ethische Commissie van het Universitair Ziekenhuis van Cruces (goedkeuringsnummer CEIC E15/03). Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dieronderzoek van de Universiteit van Baskenland (UPV/EHU) (goedkeuringsnummer CEEA M20/2023/038) en voldeden aan de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visueel onderzoek. Alle procedures werden uitgevoerd in de UPV/EHU dierenfaciliteit (SGIker), waarbij de steriele techniek gedurende de hele tijd werd gehandhaafd (Klasse II bioveiligheidskast bij het hanteren van biologische producten).

1. Hydrogelsynthese

  1. Gelatine-riboflavine precursoroplossingen (5% en 10% w/v)
    OPMERKING: Werk onder zwak licht of gebruik amberkleurige flessen of flessen die in aluminiumfolie zijn gewikkeld om de oplossing te beschermen tegen lichtblootstelling. Voer alle stappen uit onder steriele omstandigheden in een laminaire stroomkap wanneer de hydrogel bedoeld is voor biologisch gebruik.
    1. Weeg de benodigde hoeveelheden gelatine en riboflavinefosfaat (RFP): voor 10 mL van 5% (w/v) + 0,01% (w/v) RFP-voorloper, weeg 500 mg gelatine en 1 mg RFP. Voor 30 mL van 10% (w/v) + 0,02% (w/v) RFP-voorraad, weeg 3 g gelatine en 6 mg RFP.
    2. Voeg de gelatine en RFP toe aan het bijbehorende volume gedeïoniseerd water (≈90% van het uiteindelijke volume). Roer voorzichtig totdat het poeder volledig is verspreid.
    3. Stel de pH aan naar 7,0 met 1 M NaOH, voeg de basis toe druppelgewijs terwijl je de pH monitort. Noteer het gebruikte volume NaOH en het uiteindelijke aangepaste volume. Na pH-aanpassing breng je de oplossingen met gedeïoniseerd water naar hun uiteindelijke volume.
    4. Oplos en homogeniseer de oplossing bij 80 °C onder magnetisch roeren bij 200 rpm gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: Hanteer hete oplossingen (>70–80 °C) met hittebestendige handschoenen.
    5. Laat de oplossingen afkoelen tot 30–40 °C en filter ze door 0,22 μm polyethersulfon (PES) hydrofiele membraanfilters in steriele amberkleurige flessen.
      OPMERKING: Verwarm viskeuze oplossingen voorzichtig (≈ 40–50 °C) vóór filtratie indien nodig; voorkom oververhitting.
    6. Label de flessen met de samenstelling, datum en operatorinitialen. Bewaar de gefilterde hydrogeloplossingen bij 4 °C tot gebruik, waarbij de opslagperiode niet langer duurt dan 2 weken vanaf het moment van bereiding.
  2. Gelatinehydrogels aangevuld (eindvolume: 10 mL)
    1. Bereid autoloog serum (AS) of humaan amnionmembraanextract (HAMe) voor volgens de procedures beschreven in secties 4 en 5. Houd extracten steriel en gekoeld tot gebruik.
    2. Voor elke 10 mL verrijkte hydrogel mengt u 5 mL van de 10% (w/v) gelatine + 0,02% (w/v) RFP-voorraad, en 5 mL van het bijbehorende biologische extract (AS of HAMe).
      OPMERKING: Verwarm viskeuze oplossingen voorzichtig (≈ 40–50 °C) vóór filtratie indien nodig; voorkom oververhitting.
    3. Filter de warme oplossing via een 0,22 μm PES hydrofiel membraanfilter in steriele amberkleurige flessen.
    4. Label en bewaar de hydrogels bij 4 °C tot gebruik. Zorg ervoor dat de opslagperiode niet langer duurt dan 2 weken vanaf het moment van bereiding.
      OPMERKING: Voer al het afval af volgens de institutionele bioveiligheidsvoorschriften.

2. Hydrogeltoepassing in vitro

  1. Bereid de hydrogelformuleringen voor zoals beschreven in Sectie 1 en houd ze op 32 °C vóór het aanbrengen om voldoende viscositeit te behouden.
  2. Met behulp van de steriele techniek pipetten we het benodigde volume hydrogel in de doelput, schimmel, schaal of substraat (Figuur 1A).
  3. Plaats de Led-C uithardingslamp 2 cm boven het hydrogeloppervlak. Start in situ crosslinking door de hydrogel bloot te stellen aan blauw licht (λ = 420–480 nm) en een lichtopbrengst van 850-1000 mW/cm² voor een totale duur van 2 minuten. Geef de verlichting als zes pulsen van 20 s, met 5–10 s pauzes tussen de pulsen om lokale verwarming te voorkomen (Figuur 1B).
  4. Controleer de volledige gelatie visueel en door het oppervlak voorzichtig aan te raken met een steriel instrument om de vorming van een vaste, manipuleerbare hydrogel te waarborgen (Figuur 1C,D).
  5. Gebruik de crosslinked hydrogel direct of bewaar bij 4 °C onder steriele omstandigheden die geschikt zijn voor de downstream toepassing.
    OPMERKING: Houd de aseptische techniek aan gedurende de hele procedure. Vermijd directe blootstelling van huid of ogen aan blauwlichtbestraling.

3. Aanname van het menselijk amnionmembraan (HAM)

OPMERKING: Gebruik alleen placenta's van seronegatieve donoren die geïnformeerde toestemming hebben gegeven en voldoen aan institutionele en ethische eisen.

  1. Geschiktheid en toestemming van donoren
    1. Bevestig dat elke donor is gescreend en negatief getest op hiv type 1 en 2, hepatitis B en C, en syfilis.
    2. Verkrijg schriftelijke geïnformeerde toestemming van elke donor vóór de operatie.
    3. Ontvang menselijke placenta's direct na een electieve keizersnede van gezonde donoren.
  2. Verzameling en eerste verwerking
    1. Verzamel elke placenta direct na de bevalling in een steriele roestvrijstalen verpakking.
    2. Spoel in de operatiekamer de placenta grondig af met een steriele zoutoplossing om bloedstolsels te verwijderen. Identificeer het amnion — het binnenste transparante membraan dat de vruchtholte bekleedt — en scheid het voorzichtig van het chorion door voorzichtig naar de placenta-rand te pellen met een steriele pincett.
      OPMERKING: Behandel de membranen voorzichtig om scheuren te voorkomen.
    3. Na volledige scheiding bevestig je steriele nitrocellulosefilterstukken aan het stromale oppervlak van de HAM om de manipulatie te vergemakkelijken en de deling te standaardiseren. Verdeel de HAM in drie gedefinieerde gebieden (Figuur 2A,B): distale amnion: 10 cm brede doorsnede, mediale amnion: 10 cm brede doorsnede, proximale amnion: doorsnede die doorloopt tot aan de placentarand.
  3. Vervoer
    1. Plaats elk HAM-fragment in een steriele fles en dompel het onder in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), aangevuld met 1,25 μg/mL amfotericine B, 50 μg/mL penicilline-streptomycine en 50 μg/mL neomycine.
    2. Label elke fles duidelijk met donorcode, datum en de regio van herkomst (distal, mediaal of proximaal).
    3. Transporteren de monsters onmiddellijk naar het laboratorium onder schone en aseptische gekoelde omstandigheden (4 °C).
      OPMERKING: Transporteer de membranen in verzegelde, drievoudig verpakte verpakkingen die voldoen aan UN 3373 (Biologische Stof, Categorie B), in overeenstemming met de institutionele bioveiligheidsvoorschriften die menselijk weefsel reguleren.
  4. Laboratoriumverwerking
    OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit in een Klasse II biologische veiligheidskast onder steriele omstandigheden.
    1. Snijd elk distale, mediale en proximale HAM-fragment in vierkanten van 4,0–4,5 × 4,0–4,5 cm met een steriele schaar.
    2. Dompel de fragmenten onder in het eerder genoemde antibiotica-aanvulde DMEM en borstel voorzichtig met steriele klemmen om bloedresten te verwijderen. Was in DMEM met 50 μg/mL penicilline-streptomycine gedurende 2 x 5 minuten.
    3. Was je in DMEM zonder antibiotica gedurende 2 x 5 minuten.
    4. Was deze geselecteerde fragmenten in steriele fosfaatgevulde zoutoplossing (PBS).
    5. Breng elk fragment over in een 5 mL steriele buis zonder kweekmedium. Bevries de monsters direct bij –80 °C tot verder gebruik.

4. Menselijke amnionmembraanextract (HAMe) bereiding

OPMERKING: Voer alle stappen uit onder aseptische en koude omstandigheden om eiwitafbraak en besmetting te minimaliseren.

  1. Haal de buizen met menselijke amnionmembraan (HAM)-fragmenten die zijn opgeslagen bij −80 °C. Dompel de buisjes 5 minuten onder in vloeibare stikstof om het weefsel te verharden.
  2. Plaats elk bevroren fragment in een voorgekoelde vijzel (−80 °C) en maal het grondig met een stamper totdat er een zacht, homogeen poeder is verkregen.
  3. Weeg het poedervormige monster onmiddellijk op een balansplaat om ontdooien te minimaliseren. Breng het gewogen poeder over in een buisje van 5 ml en susseer het opnieuw in 3 ml PBS, aangevuld met een proteaseremmercocktail van 5 μL/mg.
    OPMERKING: Houd alle buizen tijdens de verwerking op ijs om de eiwitintegriteit te behouden.
  4. Sonicate elk monster gedurende 20 minuten op 90% amplitude met de sonicator en een 1,5 mm diameter probe, waarbij je 15 s aan/15 s uit cycli toepast om oververhitting te voorkomen.
  5. Centrifugeer de lysaten op 3.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verzamel het supernatant zorgvuldig zonder de pellet te verstoren.
  6. Filter het supernatant door een 0,22 μm PES hydrofiel membraanfilter onder steriele omstandigheden. Aliquot de gefilterde HAMe in 0,2 mL microbuizen. Bewaar de aliquots bij −80 °C tot verder gebruik.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de opslagperiode niet langer duurt dan 6 maanden vanaf het moment van voorbereiding.

5. Extractie van bloedafgeleid autoloog serum uit konijnen

OPMERKING: Voer alle procedures uit voor in vivo assays bij Nieuw-Zeelandse witte konijnen (≈2 kg) onder goedkeuring van de Animal Research Ethics Committee van de betreffende instelling en in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.

  1. Verdoof het konijn lokaal met lidocaïne (topisch of subcutaan) op de venipunctuurplaats.
  2. Verzamel bloed uit de centrale oorslagader in 4,5 mL bloedverzamelbuizen met een polymeergel-separator (Figuur 3A, B). Laat het bloed 2 uur bij RT stollen zonder onrust (Figuur 3C).
  3. Centrifugeer de monsters op 1.000 × g gedurende 15 minuten bij RT. Verzamel het supernatant (serum), dat het konijnautologe serum (AS) vormt (Figuur 3D).
  4. Filter het serum door een 0,22 μm PES hydrofiel membraanfilter. Aliquot in steriele 0,2 mL buizen en bewaar bij −80 °C tot gebruik.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de opslagperiode niet langer duurt dan 6 maanden vanaf het moment van voorbereiding.

6. In vivo chirurgische ingreep

OPMERKING: Voer alle experimentele procedures uit in overeenstemming met de Ethische Commissie voor Dieronderzoek van de betreffende instelling en voldoen aan de beginselen van de Verklaring van Helsinki en de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visueel onderzoek.

  1. Preoperatieve voorbereiding
    OPMERKING: Gebruik Nieuw-Zeelandse witte konijnen (≈2 kg) als dierenmodel.
    1. Geef voorafgaand aan de operatie algehele narcose via intramusculaire injectie in het dijbeen van de dieren met: ketamine bij 1 mL/kg (50 mg/mL) en Xylazine bij 0,3 mL/kg (20 mg/mL). Controleer de afwezigheid van de corneale en voetreflex voordat je verder gaat.
    2. Plaats het dier in een laterale decubituspositie op een steriel chirurgisch platform en desinfecteer het perioculaire gebied met povidon-jodiumoplossing. Plaats een ooglidspeculum op het operatieve oog om tijdens de procedure continu blootgesteld te blijven aan het oogoppervlak.
  2. Anterieure stromale keratectomie
    1. Centreer een vacuümtrephine met een diameter van 6,5 mm op het hoornvlies van het konijn (Figuur 4A). Pas zuigkracht toe om het apparaat te stabiliseren en draai de trefine driekwart windingen, waardoor een ongeveer stromale diepte van 187 μm wordt bereikt.
    2. Voer een anterieure stromale keratectomie uit binnen het trephinede gebied met behulp van een halvemaanmes, waarbij de epitheliale en voorste stromale lagen worden verwijderd totdat een glad wondbed is verkregen (Figuur 4B).
  3. In vivo hydrogeltoepassing
    1. Vul het hoornvliesdefect met 50 μL van de bijbehorende hydrogelformulering, voorverwarmd tot 32 °C om optimale viscositeit te garanderen (Figuur 4C).
    2. Start in situ crosslinking door het hoornvliesoppervlak 2 minuten lang te belichten met blauw licht (λ= 420–480 nm). Geef zes pulsen van 20 seconden met pauzes van 5–10 seconden tussen pulsen om lokale verwarming te beperken (Figuur 4D).
  4. Laterale gedeeltelijke tarsorrhapie
    1. Identificeer het nasale derde van de boven- en onderranden van het ooglid om mediale blootstelling voor observatie en behandeling mogelijk te maken.
    2. Plaats de eerste hechting (gebruik 1–2 hechtingen afhankelijk van de benodigde ooglidlengte en stabiliteit) (Figuur 4E).
      1. Pak de laterale bovenste ooglidrand vast met een tang. Steek de naald door de grijze lijn / ooglidrand van de huidzijde tot de conjunctivale zijde, neem een volledige beet maar vermijd indien mogelijk diepe penetratie in de tarsale plaat.
      2. Steek de naald door het overeenkomstige punt van de onderste ooglidrand van de conjunctivale kant naar de huidzijde om de ooglidranden te plaatsen.
      3. Bind de hechting vast met een stevige chirurgenknoop en twee vierkante knopen, waarbij de knoop op het huidoppervlak iets aan de buitenkant van de ooglidrand ligt in plaats van direct eroverheen.
      4. Plaats een tweede hechting ongeveer 3–4 mm mediaaal van de eerste als extra stabiliteit nodig is, met dezelfde volledige U-vormige hechting of een eenvoudige onderbroken steek.
      5. Trim de hechten tot 3–4 mm om irritatie te verminderen, zodat er genoeg lengte overblijft voor latere verwijdering.
      6. Controleer of de ooglidappositie het behandelde hoornvlies beschermt en tegelijkertijd toegang geeft tot het mediale en temporale conjunctiva/hoornvlies voor inspectie en behandeling met oogdruppels. Zorg ervoor dat de tarsorrhaphy niet te strak zit en dat de oogleden van het dier niet ischemisch zijn (Figuur 4F).
  5. Postoperatieve monitoring en zorg
    1. Dien buprenorfine toe met 0,05 mg/kg via subcutane injectie vóór keratectomie en elke 12 uur gedurende 72 uur om pijnstillende werking te geven.
    2. Geef 3 mg/mL Tobramycine oogdruppels twee keer per dag tot de wond volledig is gesloten om infectie te voorkomen.
    3. Breng vier keer per dag een druppel 0,2% hyaluronzuur (HA) kunsttranen aan op alle ogen, inclusief controles, om de hoornvliehydratatie te behouden.
    4. Controleer de tarsorrhaphy minstens twee keer per dag op tekenen van loskomen van hechtingen, infectie, lokale weefselnecrose of overmatige spanning. Houd het dier onder observatie op normaal gedrag, voeding en tekenen van oculaire ongemakken.
    5. Na 72 uur na de procedure knip je de hechtknoop door en trek je voorzichtig elke hechting terug met een tang, waarbij je erop let dat er geen verontreinigingen over het bindvliesoppervlak worden getrokken.
    6. Controleer de randen van het ooglid op een juiste genezing en het hoornvliesoppervlak op epitheelintegriteit. Ga door met de behandeling van de oculaire behandeling indien nodig totdat volledige epitheelsluiting is bereikt.
    7. Monitor en registreer oculaire genezing en klinische signalen van dag 3 tot dag 7, waarbij epitheelsluiting, opaciteit en neovascularisatie worden beoordeeld met behulp van spleetlampmicroscopie en fluoresceïnekleuring.
      OPMERKING: Als er tekenen van ischemie, wonddehisscensie of ernstige irritatie optreden, verwijder dan onmiddellijk de hechtingen(s) en behandel die dienovereenkomstig.
  6. Draize acute oogirritatie beoordeling
    1. Houd het konijn voorzichtig vast met een handdoek of deken. Onderzoek eerst de iris en het bindvlies onder wit licht.
    2. Score conjunctivale roodheid, chemose (oedeem) en afscheiding volgens de Draize-schaal (zie Tabel 1 en Tabel 2).
    3. Noteer alle zes Draine-parameters op het datablad. Bereken de oculaire irritatie-index (OII) als de som van componentscores; OII varieert van 0 tot 110, waarbij hogere waarden wijzen op een sterkere irritatie.
    4. Classificeer elk oog volgens Kay–Calandra-categorieën op basis van de OII; Noteer de categorie in de dataset.
  7. Fotografische documentatie van wondgenezing
    1. Breng fluoresceïneoplossing (5 μL) in de onderste conjunctivale zak.
    2. Verlicht het oog met blauw licht en beoordeel de hoornvliesdichtheid (dichtheid en oppervlakte) en de mate van fluoresceïnekleuring.
    3. Stel de camera in met handmatig aangepaste witbalans, optische zoom uitgeschakeld, en positioneer de camera ongeveer 3 cm van het oog om alle beelden te maken met identieke parameters gedurende sessies. Maak beelden na fluoresceïne-instillatie met en zonder blauw licht om epitheeldefecten te onderscheiden. Maak beelden op dag 0 (pre-tarsorrafie) en dagelijks vanaf dag 3 (na verwijdering van de tarsorrhafie) tot volledige epitheelsluiting.
    4. Analyseer de beelden met ImageJ-software en kwantificeer het gebied van fluoresceïne-gekleurde gebieden.
      OPMERKING: Fotografische documentatie op dag 1 en 2 is doorgaans niet haalbaar vanwege de gedeeltelijke tarsorrhafie. Geef aan dat beelden van dag 1 en 2 ontbreken in de dataset en meld eventuele bijwerkingen (bijv. incidentele hoornvliesschauring).
  8. Euthanasie en weefselverzameling
    1. Op dag 21 (na de evaluatieperiode van beide ogen) doof je dieren diep met ketamine (2 mL/kg) en xylazine (0,6 mL/kg) toegediend intramusculair.
    2. Euthanasatie door intraveneuze injectie van 10 mL verzadigd kaliumchloride (KCl) in de marginale oorvene.
    3. Bevestig overlijden door het begin van rigor mortis en afwezigheid van vitale reflexen voordat je doorgaat met weefseloogst.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hydrogelsynthese en karakterisering
De hydrogel werd gesynthetiseerd en in vitro geëvalueerd om de reologische en optische eigenschappen te bepalen vóór en na fotocrosslinking. Schuifrheologie werd gebruikt om viscoelasticiteit, vloei en stromingsgedrag te karakteriseren. Frequentiesweeps toonden aan dat G′ hoger bleef dan G" over alle geteste frequenties, wat wijst op vaststofachtig gedrag (Figuur 5A). Amplitudesweeps bij 10 rad...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het huidige protocol biedt een reproduceerbare workflow voor de voorbereiding, het laden en aanbrengen van een foto-crosslinkbare gelatine-riboflavine hydrogel voor het genezen van hoornvlieswonden. Verschillende in vitro stappen zijn cruciaal voor het bereiken van consistente gelkwaliteit en verdienen nadruk omdat zij de meest voorkomende bronnen van variabiliteit zijn. Ten eerste zorgt het handhaven van de precursoroplossing op 80 °C tijdens het roeren voor volledige oplossing...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Dankbetuigingen

Deze onderzoeksstudie werd ondersteund door subsidies van het Ministerie van Volksgezondheid van de Baskische overheid (2023111027 en IT524-22). C.R.-V. werd ondersteund door een fellowship van de Universiteit van het Baskenland UPV/EHU. De technische ondersteuning bij dierenverzorging en de Analytische en Hoogresolutie Microscopiedienst van SGIker (UPV/EHU) wordt met dank erkend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Amphotericin BGibco (Thermo Fisher Scientific)15290018Eindconcentratie: 1.25 μg/mL
Autoloog serum, konijn (AS)Bereidt in-house-Bereidt uit vol bloed; gefilterd door 0.22 μm PES
Blauwe LED-uithardingslampWoodpecker Medical Instrument CoLED.C modelGolflengte: λ=420–480 nm; Afstand: 1–2 cm; Lichtoutput: 850-1000 mW/cm2
Buprenorfine (Buprecare)Ecuphar578950Dosis: 0.05 mg/kg, subcutane injectie elke 12 h voor 72 h
CameraPanasonicLUMIX TZ35Camera uitgerust met Leica-optiek
Cimarec Digital Stirring HotplateThermo Fisher ScientificSP131320-33220-240 V, Max temperatuur: 540 °C
Crescent microchirurgische mesBVI Medical373807-
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)Gibco (Thermo Fisher Scientific)11966025-
Eppendorf buisjes (0,2 mL)Merck KGaA30124707Koud bewaard voor HAMe-voorbereiding; aliquotering
Eppendorf buisjes (5 mL)Merck KGaA30119606Koud bewaard voor HAMe-voorbereiding; aliquotering
Fluoresceïne-oplossing NovartisColorcusi Fluotest2% Fluorescein-oplossing, 5 µl oogdruppels
Gibco NeomycinMerck KGaAN1142Eindconcentratie: 50 μg/mL
GelatinepoederSigma AldrichG1890Opgelost bij 80 °C; pH aangepast tot 7,0
Hyaluronzuur kunstmatige tranen (0,2%)Chem.-pharm. Fabrik GmbHHylo-Tear-
ImageJ-beeldverwerkingssoftwareNational Institute of Mental Health-Ontwikkeld door Wayne Rasband bij de Research Services Branch
Ketamine (Ketolar)Pfizer631028.1
LidocaineVet OneNDC 13985-222-04Topisch of subcutaan injectie
Penicilline-StreptomycineGibco (Thermo Fisher Scientific)15140-122Eindconcentratie: 50 μg/mL
PES-spruitspuitfilters, 0.22 μm0.22μm (Millex)Merck KGaASLGP033RS-
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)Sigma AldrichP4417-100TAB-
Protease-remmercocktailSigma AldrichP8340Toegevoegd bij 5 μL per mg weefsel
Povidon-jood-oplossingMeda pharma7167204Preoperatieve desinfectie
Riboflavinefosfaat (RFP)Sigma AldrichR0630000Concentraties: 0.01% w/v (eind); 0.02% w/v (voorraad)
SonicatorBandelein electronicSonoplus GM mini20-
Sonicator-sondeBandelein electronicMS 1.51,5 mm diameter sonde, 63 mm lengte.
Tarsorrhaphienaalden (niet-oplosbaar)Alcon 80653080011–2 hechtingen indien nodig
Tobramycine oogdruppels (3 mg/mL)NovartisTobrexDosering: tweemaal daags tot sluiting
Hessburg-Barron trepheen, 6,5 mm diameterJedmed21-8265-
Vacutainer bloedafnamebuisjes met polymeergelscheiderBD (Becton, Dickinson and Company)367704-
XylazinesoplossingLaboratorios Calier SAXylagesicDosis: 5 mg/kg intramusculaire injectie

Referenties

  1. Meek, K., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Prog Retin Eye Res. 49, 1-16 (2015).
  2. Akowuah, P. K., Cruz, A. D. L., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An epithelial abrasion model for studying corneal wound healing. J Vis Exp. (178), e63112(2021).
  3. Mobaraki, M., et al. Corneal repair and regeneration: current concepts and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 7, 135(2019).
  4. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: a review article. Med Hypotheses Discov Innov Ophthalmol. 8 (3), 163-176 (2019).
  5. Wilson, S. E., Goshe, J. M. Prevention and treatment of persistent epithelial defects after common refractive surgery procedures. J Refract Surg. 40 (2), 117-124 (2024).
  6. Wirostko, B., Rafii, M. J., Sullivan, D. A., Morelli, J., Ding, J. Novel therapy to treat corneal epithelial defects: a hypothesis with growth hormone. Ocul Surf. 13 (3), 204-212 (2015).
  7. Zernii, E. Y., Baksheeva, V. E., Yani, E. V., Philippov, P. P., Senin, I. I. Therapeutic proteins for treatment of corneal epithelial defects. Curr Med Chem. 26 (3), 517-545 (2019).
  8. Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wu, J., Singh, V., Wilson, S. E. The corneal fibrosis response to epithelial-stromal injury. Exp Eye Res. 142, 110-118 (2016).
  9. Anitua, E., et al. Progress in the use of plasma rich in growth factors in ophthalmology: from ocular surface to ocular fundus. Expert Opin Biol Ther. 22 (1), 31-45 (2021).
  10. Meng, S., et al. A versatile hydrogel with antibacterial and sequential drug-releasing capability for the programmable healing of infectious keratitis. ACS Nano. 17 (23), 24055-24069 (2023).
  11. Rafat, M., et al. Bioengineered corneal tissue for minimally invasive vision restoration in advanced keratoconus in two clinical cohorts. Nat Biotechnol. 41 (1), 70-81 (2023).
  12. Di Girolamo, N. Biologicals and biomaterials for corneal regeneration and vision restoration in limbal stem cell deficiency. Adv Mater. 36 (42), 2401763(2024).
  13. Huang, J., et al. Biologically inspired bioactive hydrogels for scarless corneal repair. Sci Adv. 10 (51), eadt1643(2024).
  14. Brunel, L. G., et al. In situ universal orthogonal network (UNION) bioink deposition for direct delivery of corneal stromal stem cells to corneal wounds. Bioact Mater. 48, 414-430 (2025).
  15. Sani, E. S., et al. Sutureless repair of corneal injuries using naturally derived bioadhesive hydrogels. Sci Adv. 5 (3), eaav1281(2019).
  16. Sharifi, S., et al. Tuning gelatin-based hydrogel towards bioadhesive ocular tissue engineering applications. Bioact Mater. 6 (11), 3947-3961 (2021).
  17. Li, M., et al. A “T.E.S.T.” hydrogel bioadhesive assisted by corneal cross-linking for in situ sutureless corneal repair. Bioact Mater. 25, 333-346 (2023).
  18. Chen, F., Le, P., Fernandes-Cunha, G. M., Heilshorn, S. C., Myung, D. Bioorthogonally crosslinked hyaluronate collagen hydrogel for suture-free corneal defect repair. Biomaterials. 255, 120176(2020).
  19. McTiernan, C. D., et al. LiQD cornea: pro-regeneration collagen mimetics as patches and alternatives to corneal transplantation. Sci Adv. 6 (25), eaba2187(2020).
  20. Feng, L., et al. Thermo-gelling dendronized chitosans as biomimetic scaffolds for corneal tissue engineering. ACS Appl Mater Interfaces. 13 (41), 49369-49379 (2021).
  21. Tang, Q., et al. Exosomes-loaded thermosensitive hydrogels for corneal epithelium and stroma regeneration. Biomaterials. 280, 121320(2022).
  22. Lee, Y. P., et al. Facile fabrication of superporous and biocompatible hydrogel scaffolds for artificial corneal periphery. Colloids Surf B Biointerfaces. 175, 26-35 (2019).
  23. He, B., et al. 3D printed biomimetic epithelium/stroma bilayer hydrogel implant for corneal regeneration. Bioact Mater. 17, 234-247 (2022).
  24. Fernandes-Cunha, G. M., et al. Supramolecular host-guest hyaluronic acid hydrogels enhance corneal wound healing through dynamic spatiotemporal effects. Ocul Surf. 23, 148-161 (2023).
  25. Wang, Q., et al. Photocurable and temperature-sensitive bioadhesive hydrogels for sutureless sealing of full-thickness corneal wounds. Small Methods. 8 (3), 2300996(2024).
  26. Brar, S., Ganesh, S., Reddy, S. S., Nagesh, B. N., Shahanand, D. A prospective, comparative, clinical study to evaluate the safety and efficacy of two different 0.1% riboflavin solutions used in collagen crosslinking treatment for patients with keratoconus. Clin Ophthalmol. 15, 2607-2617 (2021).
  27. Lee, H. J., Fernandes-Cunha, G. M., Myung, D. In situ-forming hyaluronic acid hydrogel through visible light-induced thiol-ene reaction. React Funct Polym. 131, 29-35 (2018).
  28. Fernandes-Cunha, G. M., Lee, H. J., Kumar, A., Kreymerman, A., Heilshorn, S., et al. Immobilization of growth factors to collagen surfaces using pulsed visible light. Biomacromolecules. 18 (10), 3185-3196 (2017).
  29. Schuldt, C., et al. Dose-dependent collagen cross-linking of rabbit scleral tissue by blue light and riboflavin treatment probed by dynamic shear rheology. Acta Ophthalmol. 93 (5), 328-336 (2015).
  30. Kubo, M., Sonoda, Y., Muramatsu, R., Usui, M. Immunogenicity of human amniotic membrane in experimental xenotransplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (7), 1539-1546 (2001).
  31. Garfias, Y., Zaga-Clavellina, V., Vadillo-Ortega, F., Osorio, M., Jiménez-Martínez, M. C. Amniotic membrane is an immunosuppressor of peripheral blood mononuclear cells. Immunol Investig. 40 (2), 183-196 (2011).
  32. Yazdanpanah, G., et al. A light-curable and tunable extracellular matrix hydrogel for in situ suture-free corneal repair. Adv Funct Mater. 32 (24), 2113383(2022).
  33. Niknejad, H., Yazdanpanah, G., Ahmadiani, A. Induction of apoptosis, stimulation of cell-cycle arrest and inhibition of angiogenesis make human amnion-derived cells promising sources for cell therapy of cancer. Cell Tissue Res. 363 (3), 599-608 (2016).
  34. Kakavand, M., Yazdanpanah, G., Ahmadiani, A., Niknejad, H. Blood compatibility of human amniotic membrane compared with heparin-coated ePTFE for vascular tissue engineering. J Tissue Eng Regen Med. 11 (6), 1701-1709 (2017).
  35. Basasoro, A., et al. The influence of amniotic membrane proteins on corneal regeneration when delivered directly or using hydrogel platforms. Front Med (Lausanne). 12, 1498319(2025).
  36. Tsubota, K., Goto, E., Shimmura, S., Shimazaki, J. Treatment of persistent corneal epithelial defect by autologous serum application. Ophthalmology. 106 (10), 1984-1989 (1999).
  37. Geerling, G., MacLennan, S., Hartwig, D. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. Br J Ophthalmol. 88 (11), 1467-1474 (2004).
  38. Jeng, B. H., Dupps, W. J. Autologous serum 50% eyedrops in the treatment of persistent corneal epithelial defects. Cornea. 28 (10), 1104-1108 (2009).
  39. Romo-Valera, C., et al. In vitro evaluation of gelatin-based hydrogels as potential fillers for corneal wounds. Biomacromolecules. 26 (6), 3344-3355 (2025).
  40. Romo-Valera, C., et al. Comparison of the regenerative potential of different functionalized gelatin-based hydrogels as fillers of rabbit corneal wounds. Front Med (Lausanne). 12, 1667446(2025).
  41. Wilhelmus, K. R. The Draize eye test. Surv Ophthalmol. 45 (6), 493-515 (2001).
  42. Kay, J., Calandra, J. Interpretation of eye irritation tests. J Soc Cosmet Chem. 13 (6), 281-289 (1962).
  43. Weidinger, A., Poženel, L., Wolbank, S., Banerjee, A. Sub-regional differences of the human amniotic membrane and their potential impact on tissue regeneration application. Front Bioeng Biotechnol. 8, 613804(2021).
  44. Romo-Valera, C., Etxebarria, J., Freire, V., Durán de la Colina, J., Arluzea, J., et al. An in vitro pre-screening model to evaluate the corneal anti-inflammatory effect of human blood-derived products and amniotic membrane extracts incorporated into gelatine-based hydrogels. Experimental eye research. 260, 110617(2025).
  45. Ingraldi, A. L., Audet, R. G., Tabor, A. J. The preparation and clinical efficacy of amnion-derived membranes: a review. J Funct Biomater. 14 (10), 531(2023).
  46. Murri, M. S., et al. Amniotic membrane extract and eye drops: a review of literature and clinical application. Clin Ophthalmol. 12, 1105-1112 (2018).
  47. Shakouri-Motlagh, A., O’Connor, A. J., Kalionis, B., Heath, D. E. Improved ex vivo expansion of mesenchymal stem cells on solubilized acellular fetal membranes. J Biomed Mater Res A. 107 (1), 232-242 (2019).
  48. Acharya, M., Gour, A., Dave, A. Commentary: tarsorrhaphy. Indian J Ophthalmol. 68 (1), 33-34 (2020).
  49. Dhillon, H., Bahadur, H., Raj, A. A comparative study of tarsorrhaphy and amniotic membrane transplantation in the healing of persistent corneal epithelial defects. Indian J Ophthalmol. 68 (1), 29-33 (2020).
  50. Maharjan, S. S., Pant, A. R., Joshi, P., Shrestha, P., Sharma, R. Outcomes of fungal corneal ulcer with impending perforation after temporary suture tarsorrhaphy. Nepal J Ophthalmol. 14 (27), 72-81 (2022).
  51. Bamrolia, N. R., Arora, R., Yadava, U. Unusual presentation of a case of Sjogren’s syndrome with neurological and ocular manifestation. Cont Lens Anterior Eye. 35 (2), 85-88 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Gelatine hydrogelsriboflavine crosslinkingblauw licht crosslinkingkonijnenhoornvlieshydrogel fabricageanterieure stromale keratectomievruchtvliesextractinjecteerbare hydrogeloftalmologische biomaterialen

Gerelateerde artikelen