Methodenartikel

Metabole labeling van het ontluikende transcriptoom in de vroege embryogenese van Xenopus

DOI:

10.3791/70591

⸱

27 maart 2026

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bieden gedetailleerde methoden om beginnende transcripten metabolisch te labelen en te zuiveren voor transcriptoomanalyse in vroege embryo's van Xenopus met behulp van 5-ethynyl-uridine (5-EU).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vroege embryogenese vereist nieuwe transcriptie van zygotische genen uit het aanvankelijk slapende zygotische genoom na bevruchting. Een grote uitdaging was om de nieuwe transcripten nauwkeurig te detecteren en hun expressietijd tijdens zygotische genoomactivatie (ZGA) te bepalen. Hier geven we gedetailleerde procedures voor metabole labeling van de onthullende transcripten met 5-ethynyl-uridine (5-EU) in vroege Xenopus laevis-embryo's . Na bevruchting wordt 5-EU gemicroïnjecteerd in de embryo's in het 1-celstadium om de nieuw getranscribeerde RNA's tijdens ZGA metabolisch te labelen. De ontluikende EU-RNA's worden vervolgens gezuiverd na biotinylatie via klikchemie-gemedieerde reacties, en het beginnende transcriptoom wordt bepaald met behulp van next-generation sequencing. Belangrijk is dat deze methode een hoge gevoeligheid en specificiteit heeft, waardoor de karakterisering van laag geactiveerde genen mogelijk is. Deze benadering biedt dus een krachtig hulpmiddel om de dynamiek van gentranscriptie tijdens de vroege ontwikkeling te bestuderen, en kan worden gegeneraliseerd naar andere embryonale systemen of weefsels.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na bevruchting staat het embryo onder controle van maternale factoren die in de eicel zijn afgezet, terwijl het zygotische genoom gedurende een bepaalde periode transcriptieloos is; Het wordt geactiveerd om honderden tot duizenden genen te transscriberen die essentieel zijn voor de verdere ontwikkeling, waaronder celfatspecificatie en kiemlaagvorming 1,2,3,4,5,6. Dit fenomeen van zygotische genoomactivatie (ZGA) tijdens de maternale-naar-zygotische overgang (MZT) is sterk bewaard gebleven bij alle metazoa-soorten, hoewel de timing van ZGA varieert tussen soorten 1,2,3,4,5,6. Begrijpen hoe ZGA wordt gereguleerd is niet alleen belangrijk voor ons begrip van de fundamentele principes van vroege ontwikkeling, maar biedt ook mogelijkheden voor het ontwikkelen van nieuwe strategieën voor het diagnosticeren en behandelen van ontwikkelingsstoornissen en het vergroten van de voortplantingsgezondheid.

Een grote uitdaging bij het bestuderen van ZGA is geweest om nieuwe transcripten nauwkeurig te detecteren en hun aanvangstijd tijdens zygotische genoomactivatie (ZGA) te bepalen. Door de overheersing van maternale transcripten in vroege embryo's7, kunnen de hoge niveaus van deze transcripten de detectie van nieuwe transcripten tijdens ZGA maskeren, vooral voor die laag geactiveerde genen, met conventionele bulk RNA-seq. Om deze uitdaging te overwinnen, ontwikkelden we een methode om het ontluikende transcriptoom te meten door metabole labeling van de ontluikende transcripten met 5-ethynyl-uridine (5-EU), gevolgd door biotinylatie van de ontluikende EU-RNA's via klikchemie en het zuiveren ervan voor sequencing (EU-RNA-seq)8,9,10. In vergelijking met andere beginnende transcriptprofileringsmethoden, zoals die met 4-thiouridine (4sU)11,12, is 5-EU-labeling zeer specifiek via klikchemie, kan het worden gebruikt voor zowel beeldvorming als sequencing, en vereist het geen chemische conversie. Bovendien is de prille EU-RNA-seq zeer gevoelig en detecteert het honderden genen, waarvan de activatie niet kan worden gedetecteerd door de conventionele bulk RNA-seq8. Deze aanpak stelde ons ook in staat om nauwkeurig het begin van individuele zygotische genactivatie te bepalen en de verschillende ruimtelijke temporele patronen van ZGA tijdens de vroege embryogenese8 te profileren.

Hier beschrijven we de gedetailleerde procedures voor het voorbereiden van monsters voor de EU-RNA-seq om het ontluikende transcriptoom te profileren met behulp van vroege embryo's van Xenopus laevis als model. Dit protocol is aangepast van een eerdere methode10,13 met kleine optimalisaties in de procedures, waaronder de micro-injectie van 5-EU in embryo's in het 1-celstadium, biotinylatie van beginnende EU-RNA's via klikreactie en het zuiveren ervan voor sequencing (Figuur 1). Om reproduceerbaarheid te waarborgen, moet afhankelijk van de stadia van vroege embryo's met variërende hoeveelheid beginnende transcripten 1–10 μg totaal RNA als input worden gebruikt, hoewel een lagere hoeveelheid nog steeds kan worden gebruikt. Dit protocol kan worden toegepast in andere embryonale systemen, zoals Drosophila14 en zebrafish15, en andere weefsels13. Deze methode is een krachtig hulpmiddel voor ons begrip van gentranscriptie en regulerende mechanismen in diverse biologische processen, waaronder het onthullen van nieuwe principes van vroege embryogenese.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het dierwerk dat in deze studie wordt beschreven, is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of South Carolina. Laboratoriumveiligheid en afvalverwerking moeten voldoen aan de institutionele regelgeving.

1. Bereiding van reagentia en buffers

  1. 20x MMR (Marc's Modified Ringer) oplossing: Mix 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2 en 40 mM CaCl2. Stel de pH in op 7,8 met NaOH. Autoclaaf en bewaren op kamertemperatuur.
  2. 3% Ficoll (met v/kleur)/0,5x MMR: Voeg langzaam 1,5 g Ficoll 400 toe aan 50 mL 0,5x MMR terwijl je voorzichtig roert met een magnetische roerbalk totdat de Ficoll volledig is opgelost. Autoclaaf en houd het op 4 °C tot gebruik.
  3. 5-ethynyl uridine (5-EU) voorraadoplossing: Om de 50 mM voorraadoplossing te maken, voeg 372,8 μL buffer toe (let op dat elke buffer die compatibel is met micro-injectie kan worden gebruikt, bijvoorbeeld 1x TBS, pH 7,6) aan het 5 mg buisje. Meng goed en maak 2 μL aliquots. Bewaar bij -80 °C.

2. Micro-injectie van 5-EU in 1-cel embryo's

  1. Om Xenopus-embryo's te verkrijgen, volgt u standaardprotocollen voor het uitvoeren van in-vitrofertilisatie (IVF) (bijv. zie Sive et al., 2007)16. Het embryo zou in 0,1x MMR moeten zitten, klaar voor gebruik.
  2. Voeg 1 mL 3% Ficoll/0,5x MMR toe aan een microinjectiekamer gemaakt van een standaard glazen slede (25 mm x 75 mm). Gebruik een plastic transferpipet om 20 (of meer indien nodig) embryo's in het midden van de microinjectiekamer te plaatsen.
  3. Gebruik een fijne pincet om voorzichtig het zeer dunne uiteinde van de glazen naald af te snijden en steek de naald verticaal (met het uiteinde naar beneden) tegen de boetseerklei aan de wand. Gebruik de P2-pipet met de microloadertip om 0,5 μL 50 mM 5-EU van de bovenkant van de glazen naald toe te voegen.
  4. Zet de naald in elkaar op een micromanipulator. Gebruik de P10-pipet om 10 μL halocarbonolie toe te voegen aan een stage-micrometer en plaats deze onder een stereomicroscoop.
  5. Om het injectievolume te kalibreren, gebruik je eerst de voet om het pad op de vloer te drukken die aan de microinjector is gekoppeld en injecteer je een druppel in de halocarbonolie op de micrometer. Afhankelijk van de druppelgrootte wordt de druk en injectietijd op de microinjector aangepast om het injectievolume van 10 nL te bepalen, dat wil zeggen 0,27 mm in diameter op de micrometer.
  6. Gebruik een pincet in één hand om het embryo vast te houden, gebruik de andere hand om de micromanipulator vast te houden, en injecteer 10 nL 50 mM EU in embryo's in het 1-celstadium. De uiteindelijke concentratie van 5-EU in het embryo is ~0,5 mM.
  7. Na micro-injectie gebruik je een plastic transferpipet om de embryo's uit de injectiekamer in een nieuwe glazen schaal met 3% Ficoll/0,5x MMR te verplaatsen. Houd de geïnjecteerde embryo's in Ficoll voor ~1 uur.
  8. Verwijder voorzichtig de Ficoll-oplossing en vervang het medium door 0,1x MMR. Houd embryo's in 0,1x MMR tot verder gebruik. Houd de ontwikkeling van de embryo's voortdurend in de gaten en verwijder indien nodig abnormale embryo's.
  9. Wanneer de embryo's de gewenste ontwikkelingsstadia bereiken, gebruik je een plastic transferpipet om 10 embryo's in een 1,5 mL microcentrifugebuis te plaatsen. Gebruik een P200-pipet om voorzichtig eventueel restmateriaal in de buis te verwijderen en vries de embryo's in vloeibare stikstof in een snap.
    Opmerking: Om de rigor en reproduceerbaarheid te waarborgen, verzamel je alleen de embryo's die normaal zijn op basis van hun uiterlijk in vergelijking met de controle. Verwijder en sluit abnormale embryo's uit van verdere analyse. Indien nodig, verzamel ook hetzelfde aantal embryo's zonder microinjectie als negatieve controles.
  10. Bewaar de embryo's in een vriezer van -80 °C tot verder gebruik.

3. Totale RNA-extractie en concentratiemeting

OPMERKING: Gebruik een op silicamembraan gebaseerde totale RNA-extractiekit om totale RNA's uit vroege embryo's te isoleren en een fluorescentie-gebaseerde hooggevoeligheid RNA-kwantificatiekit om de concentraties RNA's te bepalen. Volg de instructies van de kit, en de volgende stappen zijn licht aangepast ten opzichte van de handleiding. Alle oplossingen en reagentia die in de volgende stappen worden gebruikt, moeten vrij zijn van RNase.

  1. Leg de monsters uit de -80 °C vriezer op ijs.
  2. Voeg 700 μL van de Buffer RLT toe uit de RNA-extractiekit in elke buis. Gebruik een P1000-pipet om minstens 15 keer op en neer te pipetten, of totdat alle embryo's zijn opgelost.
  3. Houd de monsters 20 minuten op ijs. Meng voorzichtig opnieuw door minstens 10 keer op en neer te pipetteren om de embryo's volledig te homogeniseren.
  4. Voeg 700 μL van 70% ethanol toe aan de gehomogeniseerde embryo's. Pipetteer op en neer om goed te mengen en breng de 700 μL van het mengsel over in een spinkolom.
  5. Centrifugeer de kolom op 10.000 x g gedurende 1 minuut. Gooi de doorstroming weg. Herhaal de centrifuge totdat de rest van het mengsel compleet is.
  6. Voeg 350 μL van de Buffer RW1 toe en centrifugeer de kolom op 10.000 x g gedurende 1 minuut. Gooi de doorstroming weg.
  7. Voeg voorzichtig 80 μL DNase I toe aan het midden van het membraan in de kolom. Incubeer 15 minuten op kamertemperatuur.
  8. Voeg 350 μL Buffer RW1 toe en centrifugeer de kolom op 10.000 x g gedurende 1 minuut. Gooi de doorstroming weg.
  9. Voeg 500 μL Buffer RPE toe en centrifugeer de kolom op 10.000 x g gedurende 1 minuut. Gooi de doorstroming weg. Herhaal de wasbeurt nog een maar.
  10. Droog de kolom door opnieuw te centrifugeren op 10.000 x g gedurende 2 minuten.
  11. Breng de kolom over naar een nieuwe RNase-vrije buis. Voeg voorzichtig 35 μL RNase-vrije H2O toe aan het middenvan het membraan in de kolom.
  12. Centrifugeer de kolom op 10.000 x g gedurende 1 minuut. Verzamel het geëlueerde RNA en bewaar het op ijs.
  13. Om de RNA-concentratie te meten, bereidt u eerst de werkoplossing voor met behulp van de RNA-kwantificatiekit door het RNA-reagens (kleurstof) te verdunnen op 1:200 in de RNA-buffer. Bereken het totale volume van de werkoplossing afhankelijk van het totale aantal standaarden en bereid 200 μL voor voor elke standaard of monster.
  14. Zet een 0,2-mL 8-buisstrip op. Om elke standaard te verdunnen, voeg je 10 μL toe aan 190 μL van de werkoplossing. Om elk monster te verdunnen, voeg je 1 μL toe aan 199 μL van de werkoplossing. Meng goed.
  15. Steek de 8-buisstrip in een fluorometer. Selecteer de RNA-assay, kalibreer met de standaarden en lees de concentraties van de monsters af.

4. Ontluikende EU-RNA biotinylatie en zuivering

OPMERKING: Een op klikchemie gebaseerde beginnende RNA-vangkit wordt gebruikt om de prille EU-RNA's te bionisera en naar beneden te halen. Volg de instructies van de kit en de volgende stappen worden licht aangepast. RNA's van niet-geïnjecteerde embryo's, evenals EU-RNA's zonder biotinylering, kunnen dienen als achtergrondcontroles voor pulldown-specificiteit.

  1. RNA-biotinylering en reiniging
    1. Voor elk monster wordt de volgende componenten gemengd in een 1,5 mL microcentrifugebuis om een klikreactie van 50 μL te maken: totaal RNA (1–10 μg), 1x EU-buffer, 2 mM CuSO4, 0,25 mM biotineazide, 10 mM additief 1 en 12 mM additief 2.
    2. Incubeer het reactiemengsel 30 minuten op kamertemperatuur op een nutator.
    3. Voeg bij elke bovenstaande reactie 1 μL glycogeen, 50 μL 7,5 M ammoniumacetaat en 700 μL gekoeld 100% ethanol toe. Pipette 5 keer op en neer om ze goed te mengen.
    4. Zet de tube in een vriezer van -80 °C en bewaar hem een nacht.
    5. Centrifugeer de buis op 13.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant voorzichtig zonder de pellet te verstoren.
    6. Voeg 700 μL 75% ethanol toe en meng voorzichtig om de pellet opnieuw te laten ophangen. Centrifugeer de buis op 13.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant voorzichtig zonder de pellet te verstoren. Herhaal de wasbeurt nog een maar.
    7. Laat de pellet 5–10 minuten aan de lucht drogen op kamertemperatuur. Suss de pellet opnieuw in 10 μL RNase-vrije H2O.
  2. EU-RNA Zuivering
    1. Om de onthullende EU-RNA's naar beneden te halen, geef je per monster 5 μL streptavidine-gecoate magnetische kralen in een nieuwe 1,5 mL microcentrifugebuis.
    2. Voeg 9 μL Wash Buffer 2 toe. Meng goed en plaats de buis op een magnetisch rek. Laat het 2 minuten staan. Verwijder het supernatant. Herhaal het wassen nog twee keer. Sussie de kralen opnieuw in 5 μL Wash Buffer 2.
    3. Bereid de volgende mastermix voor in een nieuwe 1,5 mL microcentrifugebuis (15 μL per monster): 12,5 μL RNA-bindingsbuffer (Component G), 0,2 μL 1:10 verdund RNase OUT en 2,3 μL RNase-vrije H2O. Voeg 15 μL van het mengsel toe aan elke buis met het RNA-monster.
    4. Incubeer 5 minuten op een warmteblok bij 69 °C. Zet de buis op ijs.
    5. Voeg 5 μL van de hierboven genoemde voorgewassen kralen toe aan elke buis met het RNA-monster. Breng 30 minuten uit op een nutator op kamertemperatuur.
    6. Voeg 50 μL Wash Buffer 1 toe. Meng goed en plaats de buis op een magnetisch rek. Laat het 2 minuten staan. Verwijder het supernatant. Herhaal het wassen nog vier keer.
      Opmerking: Het supernatant na de eerste was, dat vermoedelijk alleen de maternale transcripten bevat, kan worden verzameld voor het meten van het maternale transcriptoom.
    7. Voeg 50 μL Wash Buffer 2 toe. Meng goed en plaats de buis op een magnetisch rek. Laat het 2 minuten staan. Verwijder het supernatant. Herhaal het wassen nog vier keer.
    8. Sussie de kralen opnieuw in 5 μL Wash Buffer 2. De kralen, die de prille EU-RNA's bevatten, zijn klaar voor directe cDNA-synthese en bibliotheekvoorbereiding.
      Opmerking: Voordat men overgaat tot bibliotheekvoorbereiding, kan de verrijking van beginnende transcripten worden beoordeeld door de expressie van bekende individuele genen te meten met behulp van reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).

5. RNA-bibliotheekvoorbereiding en sequencing

  1. Gebruik commercieel verkrijgbare kits om de cDNA-bibliotheken voor te bereiden en volg de instructies van de kit. Gebruik de NEBNext Library Quant Kit voor Illumina om de bibliotheken te kwantificeren en te bundelen.
  2. Pool de bibliotheken volgens de instructies van de veelgebruikte next-generation sequencing kits. Verdun de bibliotheken tot ~1,8 pM voordat je ze in de benchtop-sequencer laadt om een optimale clusterdichtheid van ~200k/mm2 tijdens sequencing te bereiken. Sequencen de bibliotheken met behulp van de veelgebruikte next-generation sequencing. Gebruikte paired-end 75-bp sequencing voor ~20 miljoen reads per sample.
  3. Kwantificeer de transcriptomische reads door de sequenties uit te lijnen op het Xenopus laevis-genoombuild 9.2 met zalm17 en voer differentiële genexpressie-analyse uit met DESeq218. Om de pieken in de genoombrowser te visualiseren, koppel je de sequenties aan het genoom met behulp van STAR19 en toon je deze in de Integrative Genomics Viewer (IGV)19.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenopus laevis-embryo's (vier biologische replicata) in de stadia van 5 tot 9 uur na bevruchting (HPF) bij 22 °C, wat de stadia van stadium 5 (met weinig grootschalige ZGA) tot stadium 9 (met hoge ZGA) omvat, werden verwerkt volgens het hierbovengenoemde protocol 8. De totale RNA's, de gezuiverde beginnende EU-RNA's en de doorstroom-RNA's werden gebruikt voor de voorbereiding van de bibliotheken en werden gesequenced. Zoals getoond in

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier hebben we een gedetailleerd protocol gegeven voor het metabolisch labelen van het ontluikende transcriptoom in de vroege embryogenese, inclusief microinjectie van de 5-EU in 1-cel embryo's, het extraheren van totale RNA's en het meten van hun concentraties, en het biotinyleren en zuiveren van de onthullende EU-RNA's voor bibliotheekvoorbereiding en sequencing (EU-RNA-Seq) (Figuur 1). Vanwege de hoge gevoeligheid en specificiteit van de benadering vergel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteur verklaart geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken het Matthew Good-lab aan de University of Pennsylvania voor het bieden van training. Dit werk werd deels ondersteund door het Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (R03HD105802).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
µPUPM MicroinjectorWorld Precision InstrumentsUPUMPVoor micro-injectie (micro-injecteren met druk)
5-ehtynyl uridineThermo Fisher ScientificE10345Voor micro-injectie (labelen van nieuwe traqnscripts)
ACCU-SCOPE 3075 Zoom StereomicroscopenVWR470351-130Voor micro-injectie (visualiseren van embryo's)
AmmoniumacetaatSigma-AldrichA2706Voor RNA-precipitatie
AscorbinezuurSigma-AldrichA7506Voor click reactie
Boorsilicaat glazen capillairenWorld Precision InstrumentsTW100-4Voor micro-injectie (het maken van glazen naalden)
CentrifugeEppendorf5425RVoor centrifuge
Click-iT Nascent RNA Capture KitThermo Fisher ScientificC10365Voor biotinyleren en zuiveren van nieuwe RNA
CuSO4Sigma-Aldrich61230Voor click reactie
DNase IRoche Diagnostics4716728001Voor RNA-extractie
Ficoll 400Sigma-AldrichGE17-0300-10Voor micro-injectie (incuberen van embryo's)
Glazen Petri-schaal (60 mm)VWR75845-542Voor bevruchting
GlycogenThermo Fisher ScientificAM9510Voor RNA-precipitatie
Halocarbon olie 27Sigma-AldrichH8773Voor micro-injectie (kalibreren van injectievolume)
L-cysteïneSigma-Aldrich168149Voor het ontdoen van embryo's van hun dooier
Microloader tipscalibre scientificEPE-5242956003Voor micro-injectie (laden van 5-EU in de glazen naald)
NEBNext Library Quant Kit voor IlluminaNEBE7630Voor bibliotheekkwantificering
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (75 CYS)Illumina20024906Voor sequencing
Qubi Flex FluorometerThermo Fisher ScientificQ33327Voor het meten van RNA-concentratie
Qubit RNA HS Binding KitThermo Fisher ScientificQ32852Voor het meten van RNA-concentratie
RNeasy Mini KitQiagen74104Voor RNA-extractie
Stage MicrometerWard's Science470175-914Voor micro-injectie (kalibreren van injectievolume)
Universele RNA-seq met NuQuantNuGEN0364Voor bibliotheekvoorbereiding

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, M. T., Bonneau, A. R., Giraldez, A. J. Zygotic genome activation during the maternal-to-zygotic transition. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 581-613 (2014).
  2. Jukam, D., Shariati, S. aM., Skotheim, J. M. Zygotic genome activation in vertebrates. Dev Cell. 42 (4), 316-332 (2017).
  3. Vastenhouw, N. L., Cao, W. X., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition revisited. Development. 146 (11), (2019).
  4. Kojima, M. L., Hoppe, C., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition: Reprogramming of the cytoplasm and nucleus. Nat Rev Genet. 26 (4), 245-267 (2025).
  5. Palfy, M., Joseph, S. R., Vastenhouw, N. L. The timing of zygotic genome activation. Curr Opin Genet Dev. 43, 53-60 (2017).
  6. Tadros, W., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition: A play in two acts. Development. 136 (18), 3033-3042 (2009).
  7. Schier, A. F. The maternal-zygotic transition: Death and birth of rnas. Science. 316 (5823), 406-407 (2007).
  8. Chen, H., Good, M. C. Nascent transcriptome reveals orchestration of zygotic genome activation in early embryogenesis. Curr Biol. 32 (19), 4314-4324.e7 (2022).
  9. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  10. Chen, H. Quantifying nascent transcription in early embryogenesis. Methods Mol Biol. 2923, 143-162 (2025).
  11. Heyn, P., et al. The earliest transcribed zygotic genes are short, newly exmaved, and different across species. Cell Rep. 6 (2), 285-292 (2014).
  12. Bhat, P., et al. Slamseq resolves the kinetics of maternal and zygotic gene expression during early zebrafish embryogenesis. Cell Rep. 42 (2), 112070(2023).
  13. Palozola, K. C., Donahue, G., Zaret, K. S. Eu-rna-seq for in vivo labeling and high throughput sequencing of nascent transcripts. STAR Protoc. 2 (3), 100651(2021).
  14. Kwasnieski, J. C., Orr-Weaver, T. L., Bartel, D. P. Early genome activation in drosophila is extensive with an initial tendency for aborted transcripts and retained introns. Genome Res. 29 (7), 1188-1197 (2019).
  15. Chan, S. H., et al. Brd4 and p300 confer transcriptional competency during zygotic genome activation. Dev Cell. 49 (6), 867-881.e8 (2019).
  16. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. , (2007).
  17. Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
  18. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for rna-seq data with deseq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
  19. Dobin, A., et al. Ultrafast universal rna-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  20. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  21. Ma, S., Hong, Y., Chen, J., Xu, J., Shen, X. Single-cell nascent transcription reveals sparse genome usage and plasticity. Cell. 188 (24), 6873-6891.e23 (2025).
  22. Battich, N., et al. Sequencing metabolically labeled transcripts in single cells reveals mrna turnover strategies. Science. 367 (6482), 1151-1156 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Xenopus embryogenesezygotische genoomactivatie5 ethynylurideen labelingmicroinjectietechniekclickchemieRNA zuiveringnext generation sequencinggenexpressiedynamiek

Gerelateerde artikelen