Methodenartikel

Een gestandaardiseerd protocol voor het induceren van door stress veroorzaakte voortijdige veroudering in primaire menselijke melanocyten met behulp van tert-butylhydroperoxide

265 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70595

⸱

29 mei 2026

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Biomedical Aging Research, Universität Innsbruck, 2Center for Molecular Biosciences Innsbruck (CMBI), 3European Innovation Center, Proya Europe

In dit artikel

Samenvatting

Een gestandaardiseerd protocol voor het induceren van voortijdige veroudering in HNM met behulp van tBHP, gestandaardiseerde protocollen voor het analyseren van belangrijke senescentiemarkers, waaronder groeistop, SA-β-galactosidase-activiteit en SASP-factoren.

Samenvatting

Omgevingsstressfactoren, waaronder UV-straling, luchtvervuiling of sigarettenrook, stimuleren de veroudering van de extrinsieke huid. Blootstelling aan deze extrinsieke verouderingsfactoren bevordert de ophoping van senescente cellen, wat bijdraagt aan de vorming van rimpels en pigmentatiestoornissen. Melanocyten, die primaire UV-bescherming bieden, vertonen met de leeftijd minder activiteit. Senescente melanocyten hopen zich op in de verouderde huid en dragen bij aan het verouderende uiterlijk ervan; Er zijn echter weinig modellen om melanocytenscentie te bestuderen, en dit werk heeft als doel een reproduceerbaar model te ontwikkelen voor verder onderzoek. In deze studie presenteren we een senescentiemodel van menselijke neonatale melanocyten (HNM) met behulp van tert-butylhydroperoxide (tBHP), een goed gekarakteriseerde oxidatieve stressinducer. tBHP verstoort de redoxhomeostase door de cellulaire antioxidantenverdediging aan te tasten en radicale overproductie te bevorderen, wat resulteert in DNA- en eiwitschade. We karakteriseren het senescencefenotype van met tBHP behandelde melanocyten door de analyse van gevestigde senescentiemarkers, waaronder beperkt groeipotentieel, morfologische veranderingen en SA-β-Galactosidase-activiteit. Dit model biedt een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van door stress veroorzaakte voortijdige veroudering in melanocyten, en geeft inzicht in hun rol bij extrinsieke huidveroudering en pigmentatiestoornissen.

Inleiding

Huidveroudering bestaat uit twee verschillende factoren: intrinsieke en extrinsieke veroudering 1,2. Intrinsieke veroudering wordt veroorzaakt door natuurlijke chronologische processen en genetische factoren, terwijl extrinsieke veroudering het gevolg is van cumulatieve blootstelling aan omgevingsstressoren, voornamelijk ultraviolet straling, maar ook luchtvervuiling, sigarettenrook en chemische stoffen, die het verouderingsproces versnellen boven normale chronologische snelheden 3,4. Blootstelling aan omgevingen veroorzaakt oxidatieve stress die de cellulaire antioxidantafweer overbelast, wat leidt tot DNA-schade, eiwitoxidatie en lipideveroksidatie. Deze moleculaire veranderingen veroorzaken aanhoudende DNA-schaderesponsen en cellulaire disfunctie, wat uiteindelijk leidt tot voortijdige veroudering 5,6. Deze door stress veroorzaakte veroudering draagt bij aan de klinische kenmerken van verouderde huid, waaronder rimpels, ongelijkmatige pigmentatie, verminderde elasticiteit en verminderde barrièrefunctie.

Melanocyten bevinden zich in de basale epidermis en dienen als primaire verdediging van de huid tegen UV-geïnduceerde schade door melanine te synthetiseren en over te brengen naar omliggende keratinocyten. Paradoxaal genoeg maakt deze beschermende rol hen bijzonder kwetsbaar voor oxidatieve stress en voortijdige veroudering tijdens extrinsieke veroudering 8,9. Het melanogeneseproces zelf genereert aanzienlijke reactieve zuurstofsoorten als bijproducten van tyrosinase-cataliseerde reacties, wat een inherente oxidatieve last creëert die verder wordt versterkt door omgevingsblootstelling zoals UV-straling en vervuiling 10,11. Als gevolg hiervan kan chronische omgevingsstress oxidatieve schade, mitochondriale disfunctie en uiteindelijk cellulaire senescentieveroorzaken. Ondanks hun belang blijven er belangrijke vragen over de moleculaire routes die melanocyten senescentie regelen en hoe oxidatieve stress dit proces in gang zet. Bovendien is de invloed van senescente melanocyten op de omringende huidmicro-omgeving als aanjager van leeftijdsgebonden huidveranderingen, met name door de afgifte van SASP-factoren, onvoldoende begrepen13,14.

Hoewel melanocyten bijzonder gevoelig zijn voor oxidatieve stress-geïnduceerde senescentie, blijven experimentele modellen om dit proces te bestuderen beperkt15,16. De meeste senescentieonderzoek blijft vertrouwen op replicatieve of door stress veroorzaakte senescentiemodellen in fibroblasten, maar deze benaderingen vangen de specifieke biologie van melanocyten of hun potentieel om huidveroudering te beïnvloeden door kruisspraak met naburige cellen en hun eigen SASP-profiel17 niet te beïnvloeden. Deze kloof benadrukt de noodzaak van melanocyt-specifieke senescentiemodellen die hun fysiologische reacties op omgevingsstressorennauwkeuriger weergeven 18,19 en hun bijdrage aan de veroudering van de menselijke huid.

Ondanks de beschikbaarheid van stress-geïnduceerde senescentie-methoden, blijft de implementatie ervan in primaire menselijke melanocyten technisch uitdagend en wordt vaak geassocieerd met aanzienlijke variabiliteit. Melanocyten zijn bijzonder gevoelig voor oxidatieve stress, wat resulteert in een smal experimenteel venster tussen effectieve senescentie-inductie en overmatige cytotoxiciteit. Daarnaast dragen donorafhankelijke verschillen in primaire celpreparaten verder bij aan inconsistente uitkomsten tussen de studies. Deze uitdagingen worden vaak ondergerapporteerd en protocollen zijn vaak onvoldoende gestandaardiseerd, wat de reproduceerbaarheid beperkt. Het huidige protocol vult deze kloof aan door een geoptimaliseerd en reproduceerbaar behandelregime te bieden, een gedefinieerd doseringsschema en gestandaardiseerde uitlezingen voor betrouwbare inductie en beoordeling van senescentie in primaire menselijke melanocyten.

Tert-butylhydroperoxide (tBHP) is een goed gekarakteriseerde inducer van oxidatieve stress die veroudering bevordert door reactieve zuurstofsoorten te genereren en de cellulaire antioxidantafweer te verminderen. Het is veel gebruikt om senescentie te induceren bij dermale fibroblasten, waarbij het kenmerkende senescentiemarkers activeert terwijl de cellevensvatbaarheidbehouden blijft. Omdat tBHP aanhoudende oxidatieve stress veroorzaakt via gedefinieerde biochemische routes, biedt het een reproduceerbaar en toegankelijk systeem voor het bestuderen van door oxidatieve stress veroorzaakte senescentie en het onderzoeken van de moleculaire mechanismen die oxidatieve schade koppelen aan verouderingsprocessen22,23. In tegenstelling tot UV-gebaseerde modellen is tBHP bijzonder voordelig wanneer een gecontroleerde, reproduceerbare inductie van oxidatieve stress vereist is, onafhankelijk van bestralingsparameters en zonder gespecialiseerde apparatuur.

HNM biedt een relevant model voor het bestuderen van extrinsieke verouderingsmechanismen24. Als primaire cellen afkomstig van de voorhuid behouden ze intacte stress-responspaden en vermijden ze artefacten die geassocieerd zijn met genetische modificatie of onsterfelijkheid25. Neonatale melanocyten bieden een optimaal experimenteel model omdat ze minimale basisschade vertonen, waardoor een duidelijke beoordeling van door omgevingsstressoren veroorzaakte senescentiepadenmogelijk is 26,27.

Deze studie maakt gebruik van door tBHP geïnduceerde oxidatieve stress in primaire menselijke neonatale melanocyten, waarmee de beperkingen van niet-melanocytische en onsterfelijke celmodellen die vaak in senescentieonderzoek worden gebruikt, wordt overwonnen. Het biedt een gestandaardiseerd platform voor het onderzoeken van melanocyt-specifieke senescentiemechanismen en het karakteriseren van het senescentie fenotype met vastgestelde markers. Al met al biedt dit protocol een reproduceerbaar, fysiologisch relevant model voor het bestuderen van door oxidatieve stress veroorzaakte senescentie in melanocyten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol is geoptimaliseerd voor onderzoek naar primaire menselijke neonatale melanocyten (HNM) om de mechanismen van stress-geïnduceerde voortijdige veroudering geïnduceerd door tBHP te bestuderen (Figuur 1). De melanocyten zijn afkomstig van neonatale blanke voorhuid (lichtpigmentatie-fototype) en afkomstig van een commerciële bron. Volgens de documentatie van de leverancier worden menselijke weefsels verzameld van donoren die volledig geïnformeerd zijn en toestemming hebben gegeven, in overeenstemming met vastgestelde ethische en juridische kaders, waaronder de Verklaring van Helsinki en de toepasbare gegevensbeschermingsregels. De cellen werden in een gede-identificeerde vorm verstrekt. Voor het gebruik ervan in deze studie was geen extra ethische goedkeuring vereist. Alle experimenten werden uitgevoerd met dezelfde melanocytenlijn om consistentie te waarborgen. Let op dat bij het gebruik van verschillende primaire cellijnen de kweekcondities, evenals concentraties en behandelingsprocedures, mogelijk verder moeten worden aangepast.

1. Voorbereidingen

OPMERKING: Om tBHP-behandeling te starten, moeten melanocyten minstens drie dagen van tevoren worden ontdooid om voldoende herstel en samenvloeiing mogelijk te maken. De behandelingsfase duurt 4 dagen, waarbij de zaaidag wordt aangeduid als Dag 0. Details van alle materialen die in deze studie zijn gebruikt, zijn te vinden in de Materiaallijst.

  1. Om het kweekmedium te bereiden, combineert u melanocytenbasaal medium met de bijbehorende groeifactoren. Vlam het deksel van elk flesje voordat je de inhoud aan het medium toevoegt om besmetting te minimaliseren. Voeg 1% (v/v) PenStrep toe aan het voorbereide medium en bewaar het tot gebruik op 4 °C.
  2. Bereid voor het zaaien de trypsineremmeroplossing voor door de sojabonen-trypsineremmer in DPBS te verdunnen. Filter de oplossing door een membraan van 0,22 μm, aliquot, en bewaar bij −20 °C. Na ontdooiing kan het tot 10 dagen worden gebruikt.

2. Celontdooien (Dag -3)

VOORZICHTIG: Alle materialen die in contact zijn met menselijke cellen moeten als biologisch besmet worden beschouwd en worden afgevoerd volgens de institutionele bioveiligheidsrichtlijnen. Om de senescentie te beoordelen, gebruiken we complementaire assays die groeistop, SA-β-galactiviteit en aanvullende moleculaire markers evalueren. Hier presenteren we de protocollen voor deze assays en de verwachte uitkomsten bij het werken met deze senescentie-indicatoren.

  1. Pipetteer 20 mL Dulbecco's fosfaatbufferzoutoplossing (celkweekkwaliteit) in een 50 mL conische buis bij kamertemperatuur. Houd het flesje met cellen ijs tot het ontdooien is.
  2. Vlam het deksel voordat je het flesje met de cellen opent, schroef los en vlam de zijkanten opnieuw om mogelijke besmetting te voorkomen.
  3. Breng 500 μL DPBS over in het buisje met de cellen. Ontdooi de cellen voorzichtig door op en neer te pipetten, en breng vervolgens de volledige inhoud over in de buis.
  4. Centrifugeer op 100 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De resulterende pellet moet beige tot bruinachtig lijken (of donkerder, afhankelijk van de etniciteit van de donor).
  5. Maak een T75-fles klaar met 14 ml melanocytmedium.
  6. Vlam een glazen Pasteur-pipet (vlam elke keer bij het hanteren van melanocyten), aspireer voorzichtig de DPBS en suspendeer de pellet opnieuw in 1 mL medium.
  7. Overbrengen naar de eerder voorbereide fles.
  8. Incubeer bij 37 °C, 5% CO₂, en observeer dagelijks onder de microscoop. Vervang het medium minstens elke 48 uur.
    OPMERKING: Elk gecryopreserveerd flesje bevat ongeveer 1 × 10 à6 primaire menselijke melanocyten. Alle experimenten werden uitgevoerd met cellen in passage 9.

3. Celzaaiing (Dag 0)

  1. Zorg voor samenvloeiing van 80–90% van de cellen op de zaaidag.
  2. Aspiraat het medium uit de kolf en was twee keer met DPBS.
  3. Verwijder cellen door 2 mL trypsine-EDTA-oplossing toe te voegen en 5 minuten te incuberen bij 37 °C, 5% CO₂.
  4. Tik voorzichtig op de kolf en observeer onder de microscoop om volledige celloslating te bevestigen (incubeer indien nodig langer).
  5. Stop de reactie door 1,5 keer het volume trypsineremmer toe te voegen.
  6. Breng de celsuspensie over in een 15 mL conische buis en verdun met DPBS tot een eindvolume van 10 mL.
  7. Centrifugeer de celsuspensie op 100 × g gedurende 5 minuten.
  8. Aspireer het supernatant en susseer opnieuw tot het gewenste volume in medium.
  9. Voor met tBHP behandelde platen, zaad 6 × 105 cellen per schaal van 10 cm. Voor controleplaten, zaad je 4 × 10 à5 cellen per plaat.
    OPMERKING: Voor met tBHP behandelde platen moet een hogere celdichtheid worden zaad om voldoende cellen beschikbaar te stellen voor de experimenten, aangezien hun groeisnelheid tijdens de behandeling geleidelijk zal afnemen. Bij het zaaien van cellen op dekfolies voor microscopie-experimenten, moeten dekfolies worden bedekt met 0,1 mg/mL poly-D-lysine en volledig gedroogd worden voordat de cel wordt gezaaid.
  10. Incubeer 's nachts bij 37 °C met 5% CO₂. Vervang medium elke 48 uur voor bedieningsplaten.

4. tBHP-behandeling (Dag 1–4)

  1. Bereid een 10 mM werkoplossing voor van tBHP-materiaal (verdund in DPBS of media).
    OPMERKING: tBHP is lichtgevoelig: bedek de container bij het werken ermee. De werkende oplossing kan tot een week worden gebruikt als deze correct wordt bewaard op 4 °C. Behandelschema: Dag 1 (de dag na het zaaien) markeert het begin van blootstelling aan tBHP. Melanocyten worden tweemaal daags behandeld met een interval van minstens 4 uur tussen de toepassingen. Dit regime wordt herhaald van dag 1 tot dag 4, in totaal 4 dagen behandeling. De geselecteerde tBHP-concentratie en behandelschema werden aangepast uit eerder onderzoek bij dermale fibroblasten, waarbij lagere concentraties voldoende waren om senescentie te induceren. In primaire melanocyten waren echter hogere concentraties vereist om robuuste senescentie-inductie te bereiken, en 100 μM tBHP werd als optimaal geïdentificeerd op basis van titratie-experimenten die senescentie-inductie en cellevensvatbaarheid in balans brachten
  2. Voeg 100 μM tBHP toe aan cellen gedurende 1 uur per behandeling (Voor de start voeg je het juiste volume werkoplossing toe en zorg je ervoor dat je in het vloeibare medium pipetteert).
  3. Beweeg de plaat heen en weer en van links naar rechts om de tBHP gelijkmatig over het medium te verdelen.
    OPMERKING: Vermijd cirkelvormige bewegingen, omdat dit een ongelijke verdeling van tBHP door het medium kan veroorzaken.
  4. Incubeer precies 1 uur bij 37 °C met 5% CO₂.
  5. Om de tBHP-behandeling te beëindigen, aspireer je het medium.
  6. Was de borden twee keer met voorverwarmde DPBS (37 °C).
  7. Voeg het juiste volume verse medium toe aan de borden.
  8. Laat cellen in de couveuse minstens 4 uur herstellen voordat de volgende behandeling wordt gestart.
  9. Herhaal deze procedure op dezelfde dag voor de tweede behandeling en ga door met de resterende dagen. Houd de cellen na afronding van de behandeling in cultuur tot dag 9 om de ouderdomsmarkers te beoordelen.
  10. Monitor bedieningsplaten en doorgangen als ze samenkomen.

5. Groeicurveanalyse

  1. Tel tBHP-behandelde cellen en controles volgens het zaaiprotocol.
  2. Zaai dezelfde begindichtheid of alle cellen opnieuw in als je minder dan de 6 × 105 cellen voor tBHP-platen telt.
  3. Voer celtellingen uit op dag 4, 9 en 15 van de kweek.
  4. Bereken de groeicurve met de volgende formule:
    lg (telling) - log (zaad) / 0,301 + cPDL
    Telling: aantal cellen verkregen aan het einde van de passage.
    zaad: aantal cellen die aanvankelijk aan het begin van de passage zijn geplateerd.
    cPDL: cumulatief bevolkingsverdubbelingsniveau overgenomen uit eerdere passages.

6. SA-β-galactosidase activiteit

  1. Was op dag 9 cellen twee keer in PBS voordat je fixeert met 2% formaldehyde en 0,4% glutaraldehyde.
  2. Was cellen twee keer met PBS.
  3. Incubeer vaste cellen met een kleuringsoplossing met een pH van 6,0 (150 mM NaCl, 2 mM MgCl, 5 mM kaliumferricyanide, 5 mM kaliumferrocyanide, 40 mM citroenzuur, 12 mM natriumfosfaat en 1 mg/mL 5-brom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactoside (X-gal).
  4. Na 18 uur incubatie bij 37 °C in afwezigheid van CO₂, was je cellen twee keer met PBS.
  5. Afbeelding met lichtmicroscopie.
  6. Kwantificeer het aantal blauw gekleurde cellen onder de microscoop door het aantal blauwe cellen te tellen en te delen door het totale aantal cellen in een veld. Druk de resultaten uit als een percentage positieve cellen.

7. Immunofluorescentiekleuring

VOORZICHTIG: Formaldehyde, glutaraldehyde en afval dat paraformaldehyde bevat, moet worden behandeld als gevaarlijk chemisch afval en worden afgevoerd volgens de institutionele veiligheidsvoorschriften.

  1. Gebruik cellen die op dekfolies zijn gekweekt en vooraf zijn bedekt met 0,1 mg/mL poly-D-lysine.
  2. Op dag 9 was je cellen twee keer en doe je daarna 15 minuten 4% paraformaldehyde.
  3. Was cellen twee keer met PBS.
  4. Permeabilize met 0,3% Triton-X en 0,1% natriumcitraat in PBS.
  5. Blok met 1% BSA in PBS-T gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Incubeer cellen met het primaire antilichaam γH2AX om permanente DNA-schaderespons 's nachts te detecteren bij 4 °C in een bevochtigde kamer.
  7. De volgende dag was je twee keer met PBS.
  8. Breng een secundair antilichaam aan gedurende 1 uur op kamertemperatuur.
  9. Kleurt de kernen met DAPI indien gewenst.
  10. Twee keer wassen met PBS-T, gevolgd door twee wasbeurten met PBS en twee keer met ddH2O.
  11. Monteer dekfolies en laat ze volledig drogen voordat je beeldvorming neemt.
  12. Analyseer de gemiddelde fluorescentieintensiteit en/of γH2AX-brandpunten met behulp van de ImageJ-software.

8. RNA-isolatie en RT-qPCR

VOORZICHTIG: β-mercaptoethanol is zeer giftig en moet worden behandeld in een dampkap. Afval dat β-mercaptoethanol bevat, moet worden afgevoerd als gevaarlijk chemisch afval.

  1. Op dag 9 trypsiniseer je cellen met 2 ml trypsine-EDTA.
  2. Stop de reactie door 1,5 keer zoveel trypsineremmer toe te brengen.
  3. Breng de celsuspensatie over in een 15 mL conische buis en centrifugeer op 100 x g gedurende 5 minuten.
  4. Aspireer voorzichtig het supernatant.
  5. Lyse-celpellets door te resuspenderen in een 350 μL RLT-buffer met 1% β-mercaptoethanol.
  6. Isoleer RNA met behulp van een kolomgebaseerde RNA-zuiveringskit.
  7. Bepaal de RNA-concentratie met een spectrofotometer (260 nm).
  8. Voor cDNA-synthese gebruik je 1 μg RNA voor reverse transcriptie in een totaal reactievolume van 10 μL met een standaard reverse transcriptiemix (inclusief RT-buffer, dNTP's, random primers, reverse transcriptase en RNase-remmer), gevolgd door thermische cycluscondities volgens de instructies van de fabrikant.
  9. Voer RT-qPCR uit voor SASP-factoren
    OPMERKING: De geselecteerde SASP-factoren (IL-8, IL-6 en MMP-1) vormen goed gevestigde componenten van het senescentie-geassocieerde secretorisch fenotype en zijn gekozen op basis van hun relevantie voor huidbiologie, waaronder inflammatoire signalering en extracellulaire matrixremodellering
    IL-6 (Voord: 5' AAGCCAGAGGTGTGCAGATGAGTA 3' Rev: 5' TGTCCTGCAGCCACTGGTTC 3')
    IL-8 (Voord: 5' ACCGGAAGGAACCATCTCAC 3' Rev: 5' AAACTGCACCTTCACACACAGAG 3')
    MMP-1 (Vooraandrijving: 5' CATCGTGTTGCAGCTCATGA 3' Rev: 5' ATGGGCTGGACAGGATTTTTG 3')
    GAPDH (Voorwiel: 5' GAGTCAACGGATTTGGTCGT 3' Rev: 5' GATCTCGCTCCTGGAAGATG 3')
  10. Analyseer relatieve mRNA-expressie met behulp van de ΔΔCt-methode met normalisatie naar het huishoudgen GAPDH.

9. Eiwitisolatie en Western blot

  1. Op dag 9 verzamel eiwitlysaten.
  2. Aspiraat medium en was platen twee keer met koude DPBS.
  3. Lysecellen mechanisch met behulp van een celschraper na toevoeging van 150 μL RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS en 2 mM EDTA) werden aangevuld met proteaseremmers en overgebracht naar een 1,5 mL buis.
  4. Voer drie cycli van invriezen en ontdooien uit, gevolgd door een incubatie van 30 minuten op ijs.
  5. Centrifugeer op 9600 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten.
  6. Bepaal de eiwitconcentratie van het supernatant met behulp van de BCA-assay.
  7. Scheid gelijke hoeveelheden (20 μg) eiwit op polyacrylamidegels en breng over naar geactiveerde PVDF-membranen.
  8. Blokkeer membranen in 5% magere melk in TBS-T.
  9. Incubeer met primaire antilichamen pRB en LaminB1 's nachts bij 4 °C.
  10. De volgende dag was je de membranen 3 keer in TBS-T.
  11. Incubeer in HRP-geconjugeerde geschikte secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  12. Eiwitten detecteren door chemiluminescentie en dichtheidsanalyse uitvoeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

tBHP-behandeling veroorzaakt groeistop in menselijke neonatale melanocyten.
tBHP-behandeling remt de proliferatie van melanocyten vergeleken met onbehandelde controles (n = 3) (Figuur 2A). Op dag 9 bereiken de behandelde cellen slechts 1,4 cPDL, terwijl de controles 3,1 cPDL bereiken. Deze divergentie neemt in de loop van de tijd toe, waarbij behandelde melanocyten op dag 15 een plateau van 1,9 cPDL naderen, terwijl controles blijven uitb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol stelt een gestandaardiseerde benadering vast voor het induceren van stress-geïnduceerde voortijdige senescentie (SIPS) in menselijke neonatale melanocyten met behulp van tBHP, en biedt een robuust model voor het bestuderen van senescentie specifiek in dit celtype. Consistente veranderingen in proliferatie, morfologie, SA-β-gal activiteit, DNA-schademarkers en SASP-componenten ondersteunen het geïnduceerde fenotype. Door zich te richten op melanocyten, cellen die ondanks hun ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs geven geen concurrerende financiële belangen aan. Lieve Declercq is verbonden aan Proya Europe; Het bedrijf had echter geen invloed op het onderzoeksontwerp, het verzamelen van gegevens, de analyse, interpretatie of de beslissing om te publiceren. De auteurs stellen verder dat kunstmatige intelligentie (AI)-tools uitsluitend werden gebruikt om taalbewerking en tekstverfijning te ondersteunen. Alle wetenschappelijke inhoud, experimenteel ontwerp en data-interpretatie zijn ontwikkeld en gevalideerd door de auteurs.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door financiering van het Tiroler Wissenschaftsfonds (ZAP746010, F.33287/10-2021, F.50279/7-2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 µm membrane filterMerck SLGVR33RS
1 M citroenzuur Merck K91567844bereid in aq. dest.
1 M MgCl2MerckA649033bereid in aq. dest.
1 M Na2HPO4MerckK56036736bereid in aq. dest.
10 M NaOHLab Honeywell30620bereid in aq. dest.
37% formaldehydeSigma252549
4% paraformaldehydeCarlRoth0335.3
5 M natriumchloride SigmaS3014bereid in aq. dest.
50% glutaraldehydeSigmaG6403
5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal)SigmaB9146
Alexa Fluor-geconjugeerd secundair antilichaam 2 mg/mLInvitrogenA11008
BSA (runderserumalbumine)SigmaA7030
Chemiluminescent substraatSigmaWBKLS0500
Costar CellLifter Corning3008
Dekvlakken voor celkweek/microscopieEprediaCB00200RA120MNZ0
DermaLife basaal mediumCellSystemsLM-0004
DermaLife M melanocytkit CellSystemsLS-1041
Dulbecco's fosfaatbuffer met zout SigmaD8537
Menselijke neonatale melanocytenCellSystemsFC-0023
LaminB1 antilichaam (konijn)AbcamAB16048Verdunning 1:1000 in 5% BSA
Montagemiddel met DAPIAbcamAB104139
Penicilline-streptomycine oplossing SigmaP4333
Polyacrylamide-gradiëntgelsBio-Rad456-8095
Poly-D-Lysine, 0.1 mg/mL GibcoA38904-01
KaliumferricyanideSigmaP8131
KaliumferrocyanideSigmaP-9387
pRB antilichaam (konijn)CellSignalling93085Verdunning 1:1000 in 5% BSA
Protease-remmercocktailzelf bereidN/A500 mM NaF; 2 µg/ml Aprotinine; 1 mM PMSF; 1 mM geactiveerde Na-Orthovanadate
RIPA-buffer zelf bereidN/Abevat: 50 mM Tris-HCl; 1% NP-40; 0.5% Na-deoxycholaat; 0.1% SDS; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA
RLT-bufferQiagen1015762Inbegrepen in RNeasy Mini Kit 
RNeasy Mini KitQiagen74106
Magermelkpoeder (voor 5% melk in TBS-T)Sigma70166
Natriumcitraat (voor 0,1% oplossing)SigmaS4641
Sojatrypsine-remmer, 0.5 mg/mL Thermofisher17075-029
tert-Butylhydroperoxide (tBHP)Sigma458139
Triton X-100 (voor 0,3% oplossing)SigmaT9284
Trypsine-EDTA-oplossingSigmaT3924
β-mercaptoethanolCarlRoth4227.3
γH2AX antilichaam (konijn)CellSignalling2577SVerdunning 1:200 

Referenties

  1. Hussein, R. S., Bin Dayel, S., Abahussein, O., et al. Influences on skin and intrinsic aging: biological, environmental, and therapeutic insight. J Cosmet Dermatol. 24, e16688 (2025).
  2. Dorf, N., Maciejczyk, M. Skin senescence-from basic research to clinical practice. Front Med (Lausanne). 11, 1484345 (2024).
  3. Grenier, A., Morissette, M. C., Rochette, P. J., et al. The combination of cigarette smoke and solar rays causes effects similar to skin aging in a bilayer skin model. Sci Rep. 13, 17969 (2023).
  4. Varani, J., Dame, M. K., Rittie, L., et al. Decreased collagen production in chronologically aged skin: roles of age-dependent alteration in fibroblast function and defective mechanical stimulation. Am J Pathol. 168, 1861-1868 (2006).
  5. Zhang, S., Duan, E. Fighting against skin aging: the way from bench to bedside. Cell Transplant. 27, 729-738 (2018).
  6. Hussen, N. H. a., Abdulla, S. K., Ali, N. M., et al. Role of antioxidants in skin aging and the molecular mechanism of ROS: a comprehensive review. Aspects Mol Med. 5, 100063 (2025).
  7. Addor, F. A. S. Beyond photoaging: additional factors involved in the process of skin aging. Clin Cosmet Investig Dermatol. 11, 437-443 (2018).
  8. Mucha, M., Skrzydlewska, E., Gęgotek, A. Natural protection against oxidative stress in human skin melanocytes. Commun Biol. 8, 1283 (2025).
  9. Hughes, B. K., Bishop, C. L. Current understanding of the role of senescent melanocytes in skin ageing. Biomedicines. 10, 3111 (2022).
  10. Kamiński, K., Kazimierczak, U., Kolenda, T. Oxidative stress in melanogenesis and melanoma development. Contemp Oncol (Pozn). 26, 1-7 (2022).
  11. Jiménez-Cervantes, C., Martínez-Esparza, M., Pérez, C., et al. Inhibition of melanogenesis in response to oxidative stress: transient downregulation of melanocyte differentiation markers and possible involvement of microphthalmia transcription factor. J Cell Sci. 114, 2335-2344 (2001).
  12. Dańczak-Pazdrowska, A., Gornowicz-Porowska, J., Polańska, A., et al. Cellular senescence in skin-related research: targeted signaling pathways and naturally occurring therapeutic agents. Aging Cell. 22, e13845 (2023).
  13. Green, K. J., Pokorny, J., Jarrell, B. Dangerous liaisons: loss of keratinocyte control over melanocytes in melanomagenesis. Bioessays. 46, e2400135 (2024).
  14. Ali, L., Al Niaimi, F. Pathogenesis of melasma explained. Int J Dermatol. 64, 1201-1212 (2025).
  15. Low, E., Alimohammadiha, G., Smith, L. A., et al. How good is the evidence that cellular senescence causes skin ageing. Ageing Res Rev. 71, 101456 (2021).
  16. Chin, T., Lee, X. E., Ng, P. Y., et al. The role of cellular senescence in skin aging and age-related skin pathologies. Front Physiol. 14, 1297637 (2023).
  17. Gerasymchuk, M., Robinson, G. I., Kovalchuk, O., et al. Modeling of the senescence-associated phenotype in human skin fibroblasts. Int J Mol Sci. 23, 7124 (2022).
  18. Zimmermann, T., Pommer, M., Kluge, V., et al. Detection of cellular senescence in human primary melanocytes and malignant melanoma cells in vitro. Cells. 11, 1489 (2022).
  19. Tang, J., Li, Q., Cheng, B., et al. Primary culture of human face skin melanocytes for the study of hyperpigmentation. Cytotechnology. 66, 891-898 (2014).
  20. Kučera, O., Endlicher, R., Roušar, T., et al. The effect of tert-butyl hydroperoxide-induced oxidative stress on lean and steatotic rat hepatocytes in vitro. Oxid Med Cell Longev. 2014, 752506 (2014).
  21. Wedel, S., Martic, I., Hrapovic, N., et al. tBHP treatment as a model for cellular senescence and pollution-induced skin aging. Mech Ageing Dev. 190, 111318 (2020).
  22. Rabin, D. M., Rabin, R. L., Blenkinsop, T. A., et al. Chronic oxidative stress upregulates drusen-related protein expression in adult human RPE stem cell-derived RPE cells: a novel culture model for dry AMD. Aging (Albany NY). 5, 51-66 (2013).
  23. Shakel, Z., Costa Lima, S. A., Reis, S. Strategies to make human skin models based on cellular senescence for ageing research. Ageing Res Rev. 100, 102430 (2024).
  24. Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. The melanocyte lineage in development and disease. Development. 142, 620-632 (2015).
  25. Goff, P. S., Castle, J. T., Kohli, J. S., et al. Isolation, culture, and transfection of melanocytes. Curr Protoc. 3, e774 (2023).
  26. Martic, I., Wedel, S., Jansen-Dürr, P., et al. A new model to investigate UVB-induced cellular senescence and pigmentation in melanocytes. Mech Ageing Dev. 190, 111322 (2020).
  27. Victorelli, S., Lagnado, A., Halim, J., et al. Senescent human melanocytes drive skin ageing via paracrine telomere dysfunction. EMBO J. 38, e101982 (2019).
  28. Zhang, H., Davies, K. J. A., Forman, H. J. Oxidative stress response and Nrf2 signaling in aging. Free Radic Biol Med. 88, 314-336 (2015).
  29. Birch, J., Gil, J. Senescence and the SASP: many therapeutic avenues. Genes Dev. 34, 1565-1576 (2020).
  30. Kang, H. Y., Ortonne, J. P. What should be considered in treatment of melasma. Ann Dermatol. 22, 373-378 (2010).
  31. Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., et al. ROS, cell senescence, and novel molecular mechanisms in aging and age-related diseases. Oxid Med Cell Longev. 2016, 3565127 (2016).
  32. Almeida, F. V., Douglass, S. M., Fane, M. E., et al. Bad company: microenvironmentally mediated resistance to targeted therapy in melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 32, 237-247 (2019).
  33. Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochem Photobiol. 84, 539-549 (2008).
  34. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., et al. The hallmarks of aging. Cell. 153, 1194-1217 (2013).
  35. Videira, I. F., Moura, D. F., Magina, S. Mechanisms regulating melanogenesis. An Bras Dermatol. 88, 76-83 (2013).
  36. Ratz-Łyko, A., Arct, J. Resveratrol as an active ingredient for cosmetic and dermatological applications: a review. J Cosmet Laser Ther. 21, 84-90 (2019).
  37. Xu, M., Pirtskhalava, T., Farr, J. N., et al. Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age. Nat Med. 24, 1246-1256 (2018).
  38. Ogrodnik, M., Evans, S. A., Fielder, E., et al. Whole-body senescent cell clearance alleviates age-related brain inflammation and cognitive impairment in mice. Aging Cell. 20, e13296 (2021).
  39. Hernandez-Segura, A., de Jong, T. V., Melov, S., et al. Unmasking transcriptional heterogeneity in senescent cells. Curr Biol. 27, 2652-2660.e4 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Melanocytsenescentieoxidatieve stressstress ge nduceerde senescentiesenescentiemarkershuidverouderingSA beta galactosidasepigmentatiestoornissenredox homeostase

Gerelateerde artikelen