Methodenartikel

Fysieke manipulatie om Xenopus mini-embryo's te genereren

215 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70602

⸱

10 april 2026

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een fysieke constrictiemethode om mini-embryo's te maken van Xenopus laevis 1-cel embryo's.

Samenvatting

Een bepalend kenmerk van vroege embryogenese is de snelle, exponentiële afname van individuele celgrootte terwijl het totale embryovolume constant blijft. De nucleocytoplasmatische (N:C) verhouding speelt een cruciale rol bij het reguleren van cellulaire en moleculaire activiteiten die essentieel zijn voor vroege embryogenese. Fysieke manipulatie van de embryogrootte is daarom een belangrijke manier om deze ontwikkelingsmechanismen te onderzoeken. De grote omvang (~ 1,2 mm in diameter) en hoge ontwikkelingsplasticiteit van vroege embryo's van Xenopus laevis maken ze tot een ideaal model voor fysieke dissectie en manipulatie om de regulerende mechanismen van ontwikkeling te onderzoeken. Hier beschrijven we een benadering om mini-embryo's te genereren met veranderd cytoplasmatisch volume en N:C-verhouding door 1-cel Xenopus laevis-embryo's samen te trekken met haarknopen. De resulterende mini-embryo's hebben aangetoond dat ze vroege zygotische genoomactivatie (ZGA) initiëren, direct geïnduceerd door celgrootte-verkleining en groei van de N:C-verhouding. Deze mini-embryo's, die kunnen worden gegeneraliseerd naar andere embryonale systemen, bieden daarom een uniek, krachtig hulpmiddel om grootte-gemedieerde mechanismen van vroege embryoontwikkeling te dissecten.

Inleiding

Een van de meest opvallende kenmerken van vroege embryogenese is de exponentiële vermindering van individuele celgrootte binnen een embryo, die een constant volume handhaaft. Snelle DNA-synthese en reductie van celgrootte leiden tot een toename van de nucleocytoplasmatische verhouding (N:C-verhouding), die een belangrijke rol speelt bij het reguleren van verschillende kenmerkende activiteiten van de mid-blastula-overgang (MBT) in modelembryonale systemen, waaronder het transcriptie van zygotische genen, celcyclusverlenging en celmotiliteit 1,2,3,4 . Manipulaties van de N:C-verhouding door DNA-ploidie te veranderen ondersteunen het functionele belang ervan in vroege embryogenese over verschillende modelsystemen 3,4,5,6.

Fysieke manipulatie van embryogrootte is een belangrijke techniek voor het bestuderen van regulerende mechanismen in de vroege embryonale ontwikkeling7. Cytoplasmatische verwijdering door aspiratie, die de N:C-verhouding in vroege muisembryo's verandert, induceert voortijdige verdichting8. Bovendien onthulde het verkleinen van de embryo's van zebravissen door hakken een nieuw gradiëntgebaseerd mechanisme van somiet-schaal9. Bovendien onthulde het verminderen van cytoplasmatisch volume in Xenopus-embryo's de N:C-verhoudingsafhankelijke celcyclusdynamiek10. Belangrijk is dat we, door Xenopus mini-embryo's te genereren via celgrootte-reductie en het labelen van beginnende transcripten met 5-ethynyl-uridine (5-EU) in individuele cellen, aantoonden dat het verkleinen van celgrootte zygotische genoomactivatie (ZGA) op een dosisafhankelijke manier induceert11. Deze resultaten ondersteunen de cruciale rol van celgrootte in de vroege embryogenese.

Hier beschrijven we een gedetailleerde procedure voor het genereren van Xenopus laevis mini-embryo's door fysieke manipulatie met haarknopen (Figuur 1)10,11. Deze benadering bouwt voort op het fundamentele gebruik van haarlusconstrictie door Newport en Kirschner (1982) op vroege Xenopus-embryo's 1, en biedt een duidelijk, betrouwbaar protocol voor het genereren van mini-embryo's als experimentele instrumenten. Daarnaast is deze methode toepasbaar op andere embryonale systemen7, wat het ontdekken van nieuwe mechanismen van vroege embryogenese zou vergemakkelijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het hier beschreven dierenwerk is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of South Carolina.

1. Materialen voorbereiden

  1. Oplossingen voorbereiden
    1. Bereid 20× MMR voor door 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2 en 40 mM CaCl2 te mengen. Stel de pH in op 7,8 met NaOH. Autoclaaf en bewaren op kamertemperatuur.
    2. Bereid een oplossing van 3% dichtheidsgradiënt medium (wt/vol) door 1,5 g dichtheidsgradiënt medium te mengen in 50 mL van 0,5× MMR. Roer voorzichtig met een magnetische roerbalk totdat het polymeer is opgelost. Houd het op 4 °C tot gebruik.
    3. Bereid 1% agarosegel in een petrischaal van 60 mm door 0,5 g agarose te mengen in 50 mL van 0,1× MMR. Verwarm met een magnetron om agarose op te lossen, voeg dan 5 ml agarose toe om de bodem van een 60 mm petrischaal in een dunne laag te bedekken.
  2. Haarknopen voorbereiden voor het samentrekken van embryo's
    1. Neem wat dunne haren en knip ze in stukken van ~5 cm.
    2. Gebruik een pincet om één uiteinde van het haar in een P10-punt van ongeveer ~1 cm diep te steken.
    3. Doe was op een lepel en verwarm het om de was te smelten. Doop snel de aan haar vastzittende P10-tip in de was en laat het 1 minuut drogen. Zorg dat het haar aan het uiteinde van de P10-tip vastzit.
    4. Gebruik een pincet om voorzichtig een overhandse knoop van het haar te maken. Stel de grootte van de lus aan op ~1,5 mm. Knip de overhang indien nodig bij. Leg de knoop opzij voor toekomstig gebruik.
    5. Herhaal bovenstaande stappen om indien nodig meer haarknopen te maken.

2. Het maken van Xenopus mini-embryo's

  1. Om Xenopus-embryo's te verkrijgen, volgt u een standaardprotocol voor het uitvoeren van in-vitrofertilisatie (IVF) (zie bijvoorbeeld Sive et al., 2007)12). Het embryo zou in 0,1× MMR moeten zijn, klaar voor gebruik.
  2. Om ZGA te visualiseren in individuele cellen van vroege embryo's en hun regulerende mechanismen te bestuderen, microinjecteer je de embryo's in het 1-celstadium met 5-ethynyl-uridine (5-EU) om de ontstaande transcripten11,13 metabolisch te labelen voordat je doorgaat met de volgende procedures.
  3. Wanneer embryo's zich ~1 uur na bevruchting (HPF) bevinden, gebruik dan een plastic transferpipet om ~20 embryo's te plaatsen in een 60 mm Petrischaal (bedekt met 1% agarosegel) met ~15 mL van 3% dichtheidsgradiënt medium/0,5× MMR.
  4. Gebruik een pincet in één hand om een embryo ongeveer ~45–60 graden onder een stereomicroscoop te draaien om toegang te krijgen tot de plantaardige pool (de bleke hemisfeer). Houd het gekantelde embryo vast met de pincet en gebruik een naald van 30 G in de andere hand om voorzichtig de plantaardige pool te doorboren. Laat wat cytoplasma los door het embryo voorzichtig te drukken.
  5. Bedek zorgvuldig een haarknoop die in een P10-punt op een embryo is gemonteerd, zodat de dierlijke paal (de donkere halfrond) binnen de haarknoop zit. Pas de positie van de knoop aan volgens de gewenste grootte van het mini-embryo.
  6. Houd de P10-pipet met één hand vast en gebruik een pincet in de andere hand om de twee bovenhandse uiteinden van de knoop in tegengestelde richtingen te trekken. De haarknoop zal zich strakker maken rond het embryo, tussen de dierlijke pool (intact) en de plantaardige pool (met het vrijgegeven cytoplasma). Knip de haarknoop af op de plek waar het aan de P10-punt vastzit.
  7. Herhaal stappen 2.4–2.6 hierboven om de gewenste hoeveelheid mini-embryo's te maken.
  8. Laat de embryo's in 3% dichtheidsgradiënt medium/0,5× MMR blijven voor ~1–2 uur. Verwijder vervolgens het medium met een P1000-pipet zonder de embryo's te verstoren en vul het aan met 15 mL van 0,1× MMR.
  9. Laat de embryo's zich ontwikkelen tot de gewenste stadia en gebruik vervolgens een pincet om voorzichtig de knopen van de mini-embryo's te verwijderen.
  10. Verzamel de embryo's voor gewenste analyse, zoals het visualiseren van de ZGA in enkele cellen11,13.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Xenopus laevis-embryo's in het 1-celstadium werden samengeperst met de haarknopen zoals hierboven beschreven. De controle- en mini-embryo's in ~Stadium 9 (8,5 hpf bij 23 °C) werden onder een stereomicroscoop gefotografeerd. Zoals te zien is in Figuur 2, is het volume van sommige mini-embryo's ~1/3 van dat van de controle-embryo's. Dit resultaat suggereert dat de vroege Xenopus-embryo's gemanipuleerd kunnen worden om mini-embryo's te generer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we een methode om mini-embryo's in Xenopus te genereren door 1-celstadium embryo's fysiek samen te trekken met haarknopen. Deze benadering levert direct bewijs dat het verkleinen van celgrootte ZGA induceert in een modelembryo11.

Verschillende aspecten van dit protocol zijn cruciaal om mini-embryo's succesvol te genereren. Om haarknopen te maken, is het belangrijk om dun, duurzaam haar te gebruiken, bij voorkeu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteur verklaart geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

Wij danken het Matthew Good-lab aan de University of Pennsylvania voor het bieden van training. Dit werk werd deels ondersteund door het Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (R03HD105802).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
30-G naaldBD Medical305128Voor het puncteren van embryo's
60 mm Wegwerp Petri-schalenVWR25384-092Voor het incuberen van embryo's
ACCU-SCOPE 3075 Zoom StereomicroscopenVWR470351-130Voor het visualiseren van embryo's
AgaroseSigma-AldrichA-9414Voor het coaten van petrischalen
Dumont Pincet, Stijl 5Electron Microscopy Sciences72701-DVoor het tweaken en vasthouden van embryo's
Ficoll 400Sigma-AldrichGE17-0300-10Voor het incuberen van embryo's
TipOne Pipettip, 10 µLUSA Scientific1111-3700Voor het monteren van de haarknopen
Was Blok, ZwartCarolina Biological Supply Co.974228Voor het monteren van de haarknopen

Referenties

  1. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  2. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
  3. Kane, D. A., Kimmel, C. B. The zebrafish midblastula transition. Development. 119 (2), 447-456 (1993).
  4. Lu, X., Li, J. M., Elemento, O., Tavazoie, S., Wieschaus, E. F. Coupling of zygotic transcription to mitotic control at the Drosophila mid-blastula transition. Development. 136 (12), 2101-2110 (2009).
  5. Jevtic, P., Levy, D. L. Both nuclear size and DNA amount contribute to midblastula transition timing in Xenopus laevis. Sci Rep. 7 (1), 7908(2017).
  6. Edgar, B. A., Kiehle, C. P., Schubiger, G. Cell cycle control by the nucleo-cytoplasmic ratio in early Drosophila development. Cell. 44 (2), 365-372 (1986).
  7. Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
  8. Lee, D. R., Lee, J. E., Yoon, H. S., Roh, S. I., Kim, M. K. Compaction in preimplantation mouse embryos is regulated by a cytoplasmic regulatory factor that alters between 1- and 2-cell stages in a concentration-dependent manner. J Exp Zool. 290 (1), 61-71 (2001).
  9. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145 (11), dev161257(2018).
  10. Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
  11. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  12. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, pdb prot4737(2007).
  13. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  14. Meaders, J. L., Burgess, D. R. Microtubule-based mechanisms of pronuclear positioning. Cells. 9 (2), 505(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Manipulatie van embryogroottenucleocytoplasmatische ratiovroege embryogenesegenoomactivatiefysieke constrictiecytoplasmatisch volumein vitro fertilisatiestereomicroscopiecelgrootte regulatie

Gerelateerde artikelen