Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Goedkope optie voor het onderzoeken van sociale voorkeur bij zebravissen (Danio rerio) met behulp van de 3-kamer open-tank free-swim taak

194 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70610

⸱

7 augustus 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Christopher Newport University, 2Virginia Governor's School for Science and Technology, 3Bay Path University

In dit artikel

Samenvatting

Taken voor sociale voorkeur in meerdere kamers zijn aangepast van knaagdieren naar zebravissen, wat de studie van sociaal gedrag bij modelorganismen vergemakkelijkt. Dit protocol valideert een goedkope open-tank taak met 3 kamers met webcams en open-source software om de sociale voorkeur van zebravissen te meten, waardoor het toegankelijk wordt voor undergraduate onderzoek en onderwijs.

Samenvatting

Het begrijpen van sociaal gedrag is een kernactiviteit in neurogedragsonderzoek, vaak bestudeerd met behulp van sociale voorkeurstaken. Deze taken, oorspronkelijk ontwikkeld voor knaagdieren en later aangepast voor zebravissen, worden veel gebruikt om sociale dynamiek en reacties te onderzoeken. De 3-kamer open-tank free-swim task (OTFST) bestaat uit een centraal reservoir geflankeerd door twee stimulustanks met een camera die het gedrag van het onderwerp in het centrale aquarium vastlegt en polariserende film en achtergrondverlichting om de videokwaliteit en validiteit te verbeteren. Dit protocol maakt gebruik van een goedkope opstelling met USB-webcams en gemakkelijk verkrijgbare materialen. We maken gebruik van DeepLabCut, een open-source markerloze pose schattingstool die nauwkeurige videotracking van dierbewegingen mogelijk maakt en positionele tijdreeksgegevens biedt die geanalyseerd kunnen worden voor diverse meetpunten. Pilotsessies valideren het vermogen van het systeem om robuust sociaal voorkeursgedrag vast te leggen. Deze budgetvriendelijke aanpak biedt een toegankelijk en schaalbaar platform voor laboratoria die sociale interactie bij zebravissen onderzoeken, en de veelzijdigheid en relatieve eenvoud van de 3-kamer OTFST maken het geschikt voor undergraduate onderwijslaboratoria en onderzoeksprojecten.

Inleiding

Sociale voorkeur is de neiging van een individu om sociale prikkels te betrekken, te zoeken of te vermijden en is een fundamenteel aspect van sociaal gedrag dat een cruciale rol speelt bij het vestigen van banden en hiërarchieën binnen groepen dieren, waaronder mensen 1,2,3,4. Het begrijpen van sociale voorkeur is essentieel om de neurale en gedragsmatige mechanismen te karakteriseren die aan sociale interactie ten grondslag liggen. Eerder onderzoek wijst uit dat tekorten in sociale voorkeuren geassocieerd kunnen worden met neuro-ontwikkelings- en psychiatrische stoornissen 5,6,7,8. Diermodellen kunnen inzicht geven in de biologische basis van sociaal gedrag en helpen bij de ontwikkeling van translationele hulpmiddelen voor het diagnosticeren en behandelen van sociale beperkingen. Deze diermodellen, variërend van knaagdieren 9,10 tot aquatische soorten11,12, bieden nuttige raamwerken voor ontdekking.

Knaagdieren werden voor het eerst gebruikt voor gedragsonderzoek in het begin van de19e eeuw 13, vanwege hun fysiologische overeenkomsten met mensen14,15. Hoewel gedragingen zoals agressie oorspronkelijk werden bestudeerd, bleven systematische maatstaven van sociale voorkeur minimaal. Onderzoekers vulden deze kloof op door de driekamer-sociale voorkeurstaak te ontwikkelen, geïntroduceerd door Nadler et al.16. Het apparaat bestaat uit drie onderling verbonden kamers. Gewoonlijk bevat één zijkamer een nieuwe conspeciaal, terwijl de andere kamer leeg blijft. Het subject mag alle kamers vrij verkennen, waarbij de tijd in elke kamer wordt geregistreerd en geëvalueerd als voorkeursindicator. Dit apparaat en deze procedure, samen met verschillende variaties, werden zeer populair en zijn gebruikt om diverse aspecten van sociale prestaties 17,18,19 en sociale tekorten in knaagdiermodellen voor autismespectrumstoornis 5,20,21 te bestuderen. Studies met knaagdieren zijn echter duurder en vereisen aanzienlijke ruimte. Daarom zijn veel onderzoekers zich in plaats daarvan gaan richten op het gebruik van aquatische soorten voor neurogedragsonderzoek.

Watersoorten, met name zebravissen (Danio rerio), beschikken over een uitgebreid gedragsrepertoire, inclusief complexe sociale interacties22. Vanwege hun bruikbaarheid als biomedisch onderzoeksmodel en het belang van sociale interactie in hun gedragsecologie, bieden zebravissen een betekenisvol kader voor sociale reacties dat kan worden gebruikt in vergelijking met mensen23. Zebravissen zijn steeds populairder geworden voor gedragsneurowetenschappelijk onderzoek omdat ze goedkoop te onderhouden zijn en een relatief kleine houdruimte vereisen, waardoor deze soort een kosteneffectief en praktisch model is voor grootschalige studies naar sociaal gedrag en voorkeur24. In sommige studies werd een aangrenzende tankconfiguratie gebruikt voor het bestuderen van sociale interacties bij aquatische soorten25,26; Deze opzet bood echter een enigszins beperkte doorvoer voor het beoordelen van sociale voorkeur, aangezien slechts één stimulus werd gepresenteerd. Deze beperking werd aangepakt door de aanpassing van de muis-driekamertaak voor zebravissen in 201827. Het aangepaste apparaat voor de 3-kamer open-tank free-swim task (OTFST) bestond uit een enkele acrylamide tank verdeeld met vaste acrylamide barrières om een neutrale startzone te creëren, en twee zijkamers, waarbij elke zijkamer een bekende of nieuwe contype bevatte. Om sociale voorkeur te meten werd de cumulatieve tijd die nabij elke zijkamer werd doorgebracht geregistreerd, wat aantoonde dat ethanolblootstelling en sam2-knockout de nieuwigheidsvoorkeur bij zebravissenverminderden. Hoewel de knaagdier 3-kamer sociale interactietest complexe multimodale interacties mogelijk maakt tussen het subject en de testconspecifie(s) via de visuele, chemische, tactiele en akoestische modaliteiten, reduceert het gebruik van aparte kamers voor de aquatische 3-kamer OTFST de interactie tussen het subject en stimulusdieren tot alleen de visuele modaliteit. Hoewel deze interactie tussen één modaliteit mogelijk minder ecologische validiteit heeft, biedt het wel meer experimentele controle en vergroot het de eenvoud voor projecten uitgevoerd door undergraduate onderzoekers. In de literatuur hebben verschillende onderzoekers sindsdien aanpassingen van de 3-kamer OTFST onderzocht om genetische en omgevingsfactoren te onderzoeken die het sociale gedrag bij zebravissenbeïnvloeden 28,29,30,31,32.

De huidige aanpassing van de 3-kamer OTFST is ontworpen om te dienen als een veelzijdig en bachelorvriendelijk modelapparaat. The FishLab, een volledig undergraduate laboratorium, heeft deze opstelling ontwikkeld en toegepast en heeft aangetoond dat het effectief is als een hoogdoorvoertool voor het onderzoeken van sociale voorkeur bij zebravissen. Studies die deze opzet gebruiken, hebben meerdere facetten van de sociale voorkeur van zebravissen onderzocht als reactie op manipulaties van verschillende onafhankelijke variabelen. De eerste studie toonde aan dat zebravissen levende versus gesimuleerde sociale stimuli33 kunnen detecteren, terwijl de tweede de voorkeur voor gevestigde scholen ten opzichte van nieuw gevormde scholen34 onderzocht. De meest recente studie onderzocht het vermogen van zebravissen om onderscheid te maken tussen chemisch gealarmeerde en niet-alarmeerde scholen35. Samen behandelen deze studies verschillende aspecten van sociaal gedrag, waaronder realisme, vertrouwdheid en dreigingsdetectie, terwijl ze overeenkomsten in scholenvoorkeuren aantonen en reacties op predatierisico beoordelen. De opstelling die voor deze eerdere studies werd gebruikt, maakte echter gebruik van digitale IP-camera's gemonteerd op professionele camera-rigging, een speciaal aquatisch rackhuisvestingssysteem en eigen software voor zowel video-opname als analyse, met een totale kosten die mogelijk te hoog waren voor onderzoekers/instructeurs met kleine operationele budgetten. Met de komst van open-source software en hoogwaardige USB-gebaseerde webcams is een goedkope versie nu haalbaar voor onderzoekers die deze techniek willen toepassen bij undergraduate onderzoekers, met een totale prijs (ongeveer US$2.000; exclusief de computer) die aanzienlijk lager is dan de kosten van het dure systeem (ongeveer US$20.000+, exclusief de computer).

Het volgende protocol beschrijft de ontwikkeling en toepassing van een goedkope versie van de 3-kamer OTFST voor zebravissen. De betaalbaarheid, eenvoud en veelzijdigheid maken het een nuttig hulpmiddel voor kleine laboratoria of onderwijsinstellingen met beperkte financiering. In combinatie met goedkope huisvesting, zoals algemeen beschikbare aquaria's van 10 gallon, kost de huidige opstelling aanzienlijk minder om te installeren en te onderhouden. Daarnaast biedt het gebruik van open-access software zoals het open broadcasting system (OBS) voor het opnemen van experimentele sessies en diverse trackingapplicaties (bijv. DeepLabCut, SLEAP, enz.) een goedkop, toegankelijk kader voor het vastleggen van video en het genereren van tijdreeksgegevens van sociale interacties van zebravissen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele procedures zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan Christopher Newport University (Protocol #2025-23).

1. Dieren

  1. Volwassen kortvin wildtype zebravissen 23,36,37 verkrijgen, hoewel andere stammen ook gebruikt kunnen worden. Alternatief kun je embryo's verkrijgen en ze intern grootbrengen.
  2. Houd de vissen in vrijstaande aquaria van 10 gallon (38 L) met een dichtheid van ongeveer twee vissen per gallon (3,8 L) water. Rust tanks uit met actieve biofilters, luchtstenen en dompelverwarmers. Of houd huisvissen op een aquatisch racksysteem.
  3. Houd waterkwaliteitsparameters binnen de volgende bereiken: pH 7,0–8,0, geleidbaarheid 400–700 μS, temperatuur 25–27 °C, <40 ppm nitraten, <0,2 ppm nitrieten en 0,01–0,1 ppm ammoniak.
  4. Houd dieren onder een 12-uur licht-12-uur donker fotoperiode en voer één keer per dag met commerciële vlokken.
  5. Kies dieren willekeurig uit deze tanks voor experimentele toewijzing.
  6. Na voltooiing van het experiment worden de dieren hergebruikt voor andere onderzoeks- en onderwijsdoeleinden, of geëuthanaseerd door ze 30 minuten lang onder te dompelen in 250-500 mg/mL gebufferde tricaïne, gevolgd door een fysieke methode (bijv. onthoofding) om de dood te verzekeren. Gebruik de geëuthanaseerde dieren voor latere bioassays en/of neurochemische analyses.

2. 3-kamer open-tank vrij zwemapparaat en software

  1. Bouw van testkamers
    1. Verwijder voorzichtig de plastic afwerking van de bodem van elk aquarium van 5,5 gallon. Gebruik een roterend gereedschap met een afsnijwiel om het plastic in de hoeken te snijden om het verwijderen te vergemakkelijken. Zodra de kunststof afwerking is gesneden, scheid je het plastic van de siliconenlijm met een gewone plamuurmes.
    2. Om de achtergrondverlichting te diffuseren, bedek je de achterkant van alle drie de tanks, het linkeruiteinde van de ene tank en het rechteruiteinde van de andere tank met de witte kleefplankvoering. Laat de uiteinden onbedekt op het aquarium dat als centrale kamer wordt gebruikt.
    3. Plaats een zwarte horizontale lijn om het vulniveau 4,5 cm onder de bovenrand aan te geven aan de voorkant van elke kamer met een emaille marker of met zwarte grafische layouttape.
    4. Snijd één vel polarisatiefilter af om op de onbedekte zijzijde van elke flankerende tank te passen. Oriënteer de filterplaten 90° ten opzichte van elkaar. Gebruik transparante tape langs alle vier de randen om te voorkomen dat er water in de ruimte tussen het aquariumglas en het filtermateriaal komt.
      OPMERKING: De offset oriëntatie van de polarisatiefilters voorkomt dat stimulusdieren in de ene flankerende stimuluskamer de dieren (of andere stimuli) in de andere flankerende stimuluskamer kunnen zien, terwijl ze toch het onderwerp kunnen zien. Het subject in het centrale reservoir kan de visuele prikkels in beide flankerende kamers zien.
    5. Bouw de polyvinylchloride (PVC) bodem om de exacte plaatsing van de tanks op de opstelbank uit te lijnen. Snijd de onderkant van de basis uit een 1/4 inch (0,635 cm) dik wit PVC-plaatje van 21 cm x 122,5 cm en zag de eindstukken uit 1 x 2 PVC-afwerking van 21 cm lang.
    6. Test de uiteinden op de basis met alle drie de tanks op hun plaats. Zorg voor een eenvoudige invoeging en verwijdering van de scheidingspanelen (hieronder) en controleer of de flankerende tanks niet strak tegen de zijkanten van de middentank aankomen. Zodra de testmontage klaar is, verbind je de eindstukken met PVC-cement aan de PVC-basis.
    7. Om de doorzichtige deksels voor elke kamer te maken, snijd je het polycarbonaatvel in drie stukken die passen bij de buitenafmetingen van de bovenrand van de 5,5-gallon tank (40 cm × 21 cm). Snijd een rabbetkanaal (6 mm × 4 mm) rond de rand van elk deksel om een veilige positie van het deksel bovenop de kamer te garanderen.
    8. Bedek de kamers met de deksels telkens wanneer dieren in de kamers worden vastgehouden. Plaats een dompelkachel en een luchtsteen die zijn aangesloten op een aquariumluchtpomp terwijl dieren in hun respectievelijke kamers worden vastgehouden om temperatuurregeling en beluchting te bieden. Gebruik een drieweg-luchtventiel om de luchtstroom over alle drie de luchtstenen in balans te brengen.
    9. Maak eenvoudige ondoorzichtige scheidingsmiddelen voor plaatsing tussen de centrale kamer en elke flankerende kamer om te controleren wanneer proefpersonen visuele blootstelling krijgen aan sociale prikkels door twee vellen lichtgekleurd A4-karton te lamineren.
    10. Bereid de scheidingsdelen voor voor ophangen en op afstand verwijderen door twee gaten van 85 mm en 125 mm te ponsen langs één 210 mm rand van elk gelamineerd plaatje.
    11. Knip twee stukken touw van 75 cm door en rijg het touw door elk gaatje en bind de overgebleven uiteinden aan elkaar, waarbij je de twee platen in een centrale juk verbindt.
    12. Knip een touw van 6 meter door. Bind één uiteinde van het 6 m lange touw aan het juk om een centrale vastgemaakte lijn te creëren, en rijg het vrije uiteinde van het touw door een draaibare katrol.
    13. Bevestig de draaibare poelie aan het plafond boven het middelste aquarium en zorg ervoor dat het uiteinde van het touw aan de buitenkant van de experimentele opstelling hangt (Figuur 1A).
  2. Constructie van verlichtingsinstallatie
    1. Maak een frame van 0,635 cm (1/4 inch) dik wit PVC-plaatje voor de paneellamp. Knip twee eindstukken (10 cm × 31,5 cm) en een bovenkant en een onderkant (10 cm × 122 cm). Test de frameonderdelen zo in elkaar te passen dat het paneel in het frame past. Zodra de pasvorm is getest, verbind je de framedelen met PVC-cement.
    2. Laat een gekwalificeerde elektricien een drieaderig snoer aan het paneellicht toevoegen.
    3. Laat een gekwalificeerde elektricien de schuifdimmer aansluiten om het uitgangsstopcontact in de waterdichte behuizing te regelen. Steek het paneellampje in dit stopcontact.
    4. Stel de schuifdemper in om de helderheid van de achtergrondverlichting op 350 lux te zetten. Vul de kamers met water en verplaats de schuifdemper om de helderheid aan de voorkant van de kamers aan te stellen naar 15 lux.
      OPMERKING: Onderzoekers moeten de verlichting vóór, tijdens en na een onderzoek controleren om te zorgen dat de helderheidsinstellingen zijn behouden.
  3. Constructie van gordijn en cameraframe
    1. Stel de testbank in met het paneellicht, het tankbasispaneel en de drie kamers. Plaats en stel de twee zeilpalen verticaal zodat ze elk strak passen van vloer tot plafond, minstens 75 cm van de voorkant van de tanks.
    2. Maak een bovenste zak voor elk gordijn door één uiteinde van het laken over 60 cm te vouwen en een rechte steek 6 cm vanaf de bovenste vouw te naaien om een zak te maken waar het framestuk in kan schuiven.
    3. Meet de afmetingen van de dwarsverbindingen en stabilisatiesecties van de frameopstelling op basis van de breedte en diepte van het te gebruiken gebied.
      OPMERKING: Voor de huidige opstelling in The FishLab zijn de verticale zeilstokken 146,5 cm van de achterwand in de hoek van het lab geplaatst. De binnenste zeilpaal staat 6,5 cm van de zijwand, terwijl de buitenste zeilpaal 142,5 cm van de muur staat.
    4. Snijd drie secties elektrische metalen buis (EMT) buis van 143 cm door, die als stabilisatiesecties voor de zijkanten van het frame worden gebruikt. Steek een sectie door de bovenste zak van het beweegbare gordijn en plaats het horizontaal 190 cm boven de vloer.
    5. Bevestig het gedeelte aan de buitenste zeilpaal met een T-klem aan het ene uiteinde en de op maat gemaakte 3D-geprinte dop aan het andere uiteinde. Bevestig de 3D-geprinte dop met schroeven aan de achterwand. Bevestig de andere twee secties aan de binnenste zeilpaal.
    6. Steek het bovenste gedeelte door de bovenste zak van een van de vaste gordijnen en plaats het 190 cm boven de vloer. Bevestig aan de binnenste zeilpaal met een T-klem aan het ene uiteinde en aan het andere uiteinde een 3D-geprinte dop.
    7. Bevestig de 3D-geprinte dop met schroeven aan de zijwand. Plaats het uiteindelijke stabilisatiegedeelte 120 cm boven de vloer en bevestig het op een vergelijkbare manier als de andere twee stabilisatiesecties.
    8. Snijd een extra sectie EMT-leiding van 127 cm door als stabilisatiesectie voor de voorkant van het frame. Steek dit gedeelte door de bovenste pocket van het tweede vaste gordijn en monteer het 193 cm boven de vloer door elk uiteinde met een T-klem aan de zeilpalen te bevestigen.
    9. Snijd het resterende stuk EMT-leiding op 145 cm door om te gebruiken als cameramontagestang. Plaats dit gedeelte horizontaal op 88 cm boven de vloer om de camera's uit te lijnen met het midden van de tanks. Zet één uiteinde in een 3D-geprinte dop, die aan de muur wordt vastgeschroefd, en gebruik de op maat gemaakte 3D-geprinte kruisklemmen om de camerastang stevig tegen de zeilpalen te houden (Figuur 1B).
  4. Constructie van de camera-opstelling
    1. Klem één camerahouder op de camerastang zodat de horizontale en verticale centra van de camera uitlijnen met de overeenkomstige horizontale en verticale centra van de middenkamer.
      OPMERKING: Extra camera's kunnen voor elke flankerende kamer worden gemonteerd als onderzoekers digitale video willen verkrijgen van de reacties van levende dieren die als visuele prikkels worden gebruikt. De eenvoudigste opstelling houdt in dat een enkele camera wordt geplaatst om video vast te leggen van de centrale experimentele kamer. Voor live sociale prikkels in de stimuluskamers kunnen onderzoekers ook video van de kamers verzamelen.
    2. Bevestig elke camera op de schroefdraad van elke camerahouder. Stel elke camera zo af dat het beeld gecentreerd is op de observatiezone van de betreffende kamer.
    3. Bevestig de USB-kabels van elke camera op de camerastang met bandjes of linten om te voorkomen dat de kabels bungelen, wat kan leiden tot een verkeerde uitlijning van de camera's.
    4. Knip een stuk draadrek van 140 cm lang en bevestig dit verticaal aan de buitenkant van de voorkant van het frame om te voorkomen dat de camera's uit de lijn raken. Monteer de "camerakooi" met T-klemmen die aan de zeilpalen zijn bevestigd.
      OPMERKING: Een tweede camerakooi kan aan de binnenkant van het frame worden bevestigd om te voorkomen dat de camera's uit de lijn worden gestoten; Een klein stuk draadrooster moet mogelijk worden verwijderd als de voorkant van de camera's is "gekooid" om afsluiting van de tankbeelden te voorkomen.
  5. Laad en configureer acquisitiesoftware - Open Broadcaster Studio (OBS)
    1. Download OBS en installeer het op een door Windows beheerde lokale computer. Start OBS Studio en voer de Auto-Configuration Wizard uit om instellingen te optimaliseren voor de specifieke opnamebehoeften, hardwarebronnen en netwerkcondities.
      OPMERKING: Deze tool is beschikbaar onder de Tools > Auto-Configuration Wizard.
    2. Controleer de basisinstellingen voordat je de camera configureert. Stel de basisresolutie (Canvas) in die overeenkomt met de weergaveresolutie, en stel de Output (geschaalde) resolutie in op de opnameresolutie (bijv. 720 pixels).
    3. Maak een scène aan door met de rechtermuisknop in het Scenes-vak te klikken (of gebruik het kruis onderaan). Ken een naam toe aan de scène. Gebruik de scène om de stream-indeling te definiëren.
    4. Voeg een nieuwe bron toe door met de rechtermuisknop op het Bronnen-vakje te klikken (of gebruik het plus-symbool onderaan). Selecteer Video Capture Device om een webcam toe te voegen. Ken elke camera een eigen naam toe (bijv. "camera-links", "camera-midden", "camera-rechts"). Herhaal dit proces voor extra camera's of bronnen indien nodig.
    5. Plaats en verander de grootte van bronnen in het previewvenster. Zorg ervoor dat de camera zichtbaar is door te bevestigen dat hij boven andere bronnen in de Bronnenlijst wordt vermeld. Om het camerabeeld op het canvas te centreren, selecteer je de bron in de Bronnenlijst (er verschijnt een rood begrenzend vak) en druk je op CTRL+D (Centreren naar Scherm).
    6. Vul het hele scherm met een bron door op CTRL+F (fit to Screen) of CTRL+S (stretch to Screen) te drukken, indien gewenst. Snijd de bron bij door de Alt-toets ingedrukt te houden terwijl je het begrenzingsvak sleept. Controleer het croppen door te controleren of de randen groen worden.
    7. Pas video-eigenschappen zoals helderheid en contrast aan door dubbel te klikken op de geselecteerde camera in de Bronnenlijst en selecteer Video Configureren. Pas instellingen aan via het eigenschappenmenu .

3. Gedragstesten

  1. Acclimatie
    1. Vul alle drie de kamers met water uit de huistanks. Plaats ondoorzichtige barrières tussen elke kamer en laat deze gedurende de hele acclimatisatieperiode op hun plaats staan. Breng een proefpersoon over naar de centrale experimentele kamer en laat deze minimaal 1 uur acclimatiëren voordat je test.
      OPMERKING: De acclimatisatieperiode voor de representatieve resultaten werd vastgesteld op 3 uur. De acclimatisatieperiode is noodzakelijk zodat dieren kunnen herstellen van eventuele momentane overdrachtsstress en zich kunnen aanpassen aan de kameromgeving voorafgaand aan gedragstesten.
    2. Aan het begin van de acclimatieperiode plaats je de sociale prikkels in de flankerende stimuluskamers. Centreer de kunstmatige sociale stimuli in de linker stimuluskamer en breng een kleine school van 4 vissen (2 mannetjes en 2 vrouwtjes van vergelijkbare grootte, leeftijd en bekendheid) over naar de rechter stimuluskamer.
      OPMERKING: De posities van de kunstmatige sociale stimuli en de live sociale stimuli waren vast en niet gecompenseerd in het huidige protocol, aangezien eerdere studies33,34 geen effect van stimuluspositie met behulp van OTFST detecteerden. Tegenwicht in dit geval zou vereisen dat het aantal dieren dat voor onderzoek wordt gebruikt onnodig verdubbelt, wat haaks staat op de "3R's" van dieronderzoek. Dit protocol biedt flexibiliteit in de aard van de te testen stimuli, bijvoorbeeld statische modellen, sympatrische of nieuwe soorten, enzovoort.
    3. Tijdens de acclimatie voorzien je alle kamers met levende dieren van een dompelverwarmer (ingesteld op 26 °C), een bubbler-steen verbonden met de aquariumluchtpomp en een tankdeksel om stabiele houdomstandigheden te behouden. Verwijder de verwarming en bubblerstenen voordat je een experimentele sessie begint.
  2. Experimentele tests
    1. Controleer de activiteitsstatus van de sociale prikkels die worden getest in elk van de flankerende tanks en het proefpersoon in het centrale aquarium. Gebruik de enkele camera op de middelste tank om video op te nemen voor elk proefpersoon.
      OPMERKING: De representatieve resultaten in dit protocol zijn een replicatie van één enkele aandoening uit Velkey et al.33 om de voorkeur van zebravissen te testen tussen low-fidelity (mobiele modellen) en high-fidelity (live shoal) sociale prikkels.
    2. Open OBS Studio om een sessie op te nemen. Verander de grootte van het middencamerabeeld zodat het het scherm vult door op de hoeken van de video te klikken en te slepen. Selecteer Opname starten onder Bediening rechtsonder in het scherm.
    3. Direct nadat de opname is gestart, verwijder je de ondoorzichtige barrières via het katrol-snaarsysteem. Blijf 10 minuten opnemen en laat het subject gelijktijdig worden blootgesteld aan beide sociale prikkels terwijl het zich vrij beweegt in de centrale experimentele kamer.
    4. Beëindig de sessie door Stop Recording te selecteren onder Controls. Toegang tot opgenomen sessies door Bestand te selecteren in het linkerbovenmenu en Opnames weergeven in het keuzemenu te kiezen.
      OPMERKING: De resulterende video's leveren ongestructureerde data die geschikt is voor diverse analyses.
    5. Breng levende vissen over naar opslagbakken, haal het water uit alle drie de kamers, spoel grondig af met water (voorkom dat er water tussen de gepolariseerde films komt), spuit elke kamer met 5% citroenzuur om te desinfecteren, laat de kamers een nacht aan de lucht drogen en spoel aan het begin van de volgende experimentele dag voordat je ze weer op de testbank plaatst.

4. Het verkrijgen van gestructureerde data voor analyses

  1. Selecteer een bewegingsanalyse-softwaretoepassing (bijv. DeepLabCut; zie https://www.mackenziemathislab.org/deeplabcut). Installeer DeepLabCut op de computer, volgens de gebruikershandleiding op https://deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/installation.html. Raadpleeg de informatie en gebruikershandleiding van de geselecteerde software voor verdere instructies als je DeepLabCut niet gebruikt.
  2. Laad vier tot vijf video's in DeepLabCut voor modeltraining en haal 20–30 frames per video uit. Definieer ten minste drie primaire volgpunten (bijv. hoofd, trunk, staart) en train het netwerk om deze punten over frames te volgen.
    OPMERKING: Voor meer informatie, raadpleeg de DeepLabCut-gebruikershandleiding op https://deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/standardDeepLabCut_UserGuide.html. De representatieve resultaten gebruiken 22 frames gelabeld uit vijf video's met 3 trackingpunten.
  3. Gebruik een neuraal netwerk gebaseerd op ResNet-101 om het model te trainen. Bepaal het aantal iteraties dat nodig is om de training te voltooien (tussen de 100.000 en 200.000 worden aanbevolen). Bepaal een p-cutoffwaarde tussen 0,5 en 1.
    OPMERKING: Voor de representatieve resultaten werden 150.000 iteraties gebruikt om het model te trainen met een p-cutoff van 0,7. Als het getrainde netwerk onder de 0,7 p-cutoff valt, zal het verhogen van het videocontrast of het wijzigen van de labelconventie dit probleem oplossen.
  4. Zet het volledig getrainde DeepLabCut-model in op de resterende experimentele video's. Haal positiegegevens uit voor elke proef. Volg de gebruikershandleiding op https://deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/beginner-guides/Training-Evaluation.html.
    OPMERKING: Voor de representatieve resultaten valideerden we met 2 shuffles en bepaalden we dat de testfout 2 pixels was: train 4 pixels (met een beeldgrootte van 1600 x 820 pixels). Het netwerk werd vervolgens gebruikt om de experimentele video's te analyseren die uit de huidige experimentele opstelling waren verkregen.
  5. Gebruik codeersoftware, zoals Python, om beweging te definiëren en te analyseren over de drie verticale arenazones van gelijke breedte om de voorkeur te kwantificeren. Meet de tijd in de zone aan de hand van ten minste twee lichaamspunten binnen de geïdentificeerde zone om trackinggeluid te verminderen. Gebruik de formule: Totale tijd in zone = (Totaal aantal frames in zone)/(Totaal aantal frames).
  6. Als een meting van thigmotaxis gewenst is, kwantificeer dan zones met de volledige lichaamslengte van een zebravis vanaf de wanden van het aquarium, wat een maat geeft voor de passieve neiging van proefpersonen om dicht bij een verticale grens te blijven. Deze maatregel is het meest geschikt voor relatief grotere experimentele tanks.
  7. Gebruik dezelfde coderingssoftware om tijd die stil wordt doorgebracht (bijvoorbeeld bevriezen) te definiëren en te meten. Definieer de bewegingsdrempel van 2–5 pixels per frame met een minimaal opeenvolgend aantal frames van 15 frames.
    OPMERKING: Voor de representatieve resultaten werd bevriezing vastgesteld aan een drempel van 3 pixels per frame voor 15 frames.
  8. Verzamel en exporteer meetinstrumenten voor statistische analyse en visualisaties.
    OPMERKING: Voor data-analyse verwijs je naar https://github.com/farhanaugustine/DeepLabCut-Analysis-Jupyter-Scripts. Wij

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de hierboven beschreven goedkope methoden te valideren, is een voorwaarde uit de experimenten uitgevoerd in Velkey et AL.33 werd gerepliceerd met de huidige goedkope opzet. Proefpersonen (N = 23, 11 mannen en 12 vrouwen) kregen de kunstmatige bewegende mobiele (laag-fideliteit) sociale stimuli aan de linkerkant en de live shoal (high-fidelity) sociale stimuli aan de rechterkant te zien (Figuur 2); aangezien eerdere studies

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het huidige protocol toont aan dat de huidige goedkope aanpassing van de 3-kamer OTFST betrouwbaar sociale voorkeur bij volwassen zebravissen kan karakteriseren, gemeten aan de hand van tijd in zone. Met goedkope bouwmaterialen, een USB-verbonden webcam en open-source acquisitie- en analysesoftware, heeft het huidige systeem met succes de bevinding gerepliceerd dat zebravissen een school levende contypes verkiezen boven bewegende modellen met lagere nauwkeurigheid. Deze resultaten valide...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs geven geen belangenconflicten aan. De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie; bij het verzamelen, analyseren of interpreteren van gegevens; bij het schrijven van het manuscript; of bij de beslissing om de resultaten te publiceren.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Rommel Pagkalinawan, Robby Buck, Elizabeth Hiltz, Haley Dewitt, Maia Tankersley, Alexis Thai-Nguyen, Grady Fleming, Jacob Young en Jack Medlin van het FishLab-team aan Christopher Newport University bedanken voor hun bijdragen aan veeteelt en gegevensverzameling voor het validatie-experiment. De auteurs willen ook Samantha Commons bedanken voor haar hulp tijdens haar Community Captains Summer 2025 Program, waaronder het maken van de inventarisatie van alle onderdelen van de bestaande dure en goedkope opstelling. De auteurs willen ook het Office of Student Research and Creative Activity aan Christopher Newport University bedanken voor de financiering die aan K.K. is verstrekt onder het undergraduate Summer Scholars Program. Figuur 2 werd gemaakt in BioRender door Kinslow, K. (2025). https://BioRender.com/wbf0wph.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10-Gallon AquariumAqueon, Inc. Franklin, WI, USA#100110010aankoop bij lokale dierenwinkel (1 tot 4)
12 stuks 1-inch T-buisklemmenJoyHua Trade, ChinaASIN #B0DF19DJF1aankoop bij Amazon.com (1)
2-gang elektrische doosSigma Engineered Solutions, Raleigh, NC, USA# 14350aankoop bij lokale bouwmarkt (1)
3/4" Zilver-Metallisch elektrische metaal (EMT) Leiding - 10-voetWheatland Tube, Inc., Wheatland, PA, USA #0550110000aankoop bij lokale bouwmarkt (3)
3-leider snoerUtilitech, Inc., Charlotte, NC, USAUT010710aankoop bij lokale bouwmarkt (1)
3-polige stopcontactEaton, Inc., Beachwood, OH, USA#270W-SP-LWaankoop bij lokale bouwmarkt (1)
3-weg luchtklepPenn-Plax, Inc. 35 Marcus Blvd. Hauppauge, NY, USAModel VN3aankoop bij lokale dierenwinkel (1)
A4 Cardstock (wit), gelamineerdvarieertvarieertaankoop bij campusboekhandel (2)
Actieve bio-filter Penguin 100Spectrum Brands Pet, LLC, Blacksburg, VA, USA#PF00100Baankoop bij lokale dierenwinkel (1 tot 4)
LuchtstenenPenn-Plax, Inc. 35 Marcus Blvd. Hauppauge, NY, USAModel AS6Qaankoop bij lokale dierenwinkel (3)
Aquarium LuchtslangPenn-Plax, Inc. 35 Marcus Blvd. Hauppauge, NY, USAModel STD8aankoop bij lokale dierenwinkel (1)
Zwarte Stof Twin Lakens (167,6 cm X 243,8 cm)Royale Linens, Inc., Melville, NY, USA#00011342258875aankoop bij Amazon.com (3)
Brio 4k WebcamLogitech International S.A., Lausanne, Zwitserland960-001419aankoop bij Amazon.com (1 tot 3)
Computer (voldoende voor het draaien van Open Broadcaster Studio & 1-3 Webcams)Dell, Inc., Round Rock, TX, USAOptiPlex Micro 7010aankoop bij dell.com (1)
Dimbare lichtemitterende diode (LED) vlakpanellichtLithonia Lighting-Acuity Brands, Inc. Conyers, GA, USACTCL-153P-WHaankoop bij Amazon.com (1)
E-Z Up Stofbeheersingspool (2-pack)Trimaco, Inc., Cary, NC, USA# 00047034547330aankoop bij Amazon.com (1)
Feet Hardware TwinevarieertVariesaankoop bij lokale bouwmarkt (1)
Lineaire polariserende filtersB&H Foto & Electronics, Inc., New York, NY USARosco #7300aankoop online (7)
Open Broadcaster SoftwareOBS Projectv32.0.0download van https://obsproject.com (1)
Polycarbonaatblad (0,38"/9,6mm dik)Spectraglass, ltd., Perth, SchotlandUPC # 608037376817aankoop bij Amazon.com (1)
polyvinylchloride (PVC) Cement, 4 oz busThe AZEK Co, Chicago, IL, USA#ARAD0004OZaankoop bij lokale bouwmarkt (1)
Randloos 5,5-Gallon AquariumAqueon, Inc. Franklin, WI, USA#100541424aankoop bij lokale dierenwinkel (3)
Zelfklevende witte plastic folie CON-TACT Brand, La Miranda, CA, USA#16F-C9A952-06aankoop bij lokale bouwmarkt (1)
Slider Dimmer schakelaarLutron, Inc., Cooperburg, PA, USA#LECL-150H-WHaankoop bij lokale bouwmarkt (1)
kleine katrolvarieertVariesaankoop bij lokale bouwmarkt (1)
Submersible 50W verwarmers (vooraf ingesteld op 26C)Aqueon, Inc. Franklin, WI, USA#100106251aankoop bij lokale dierenwinkel (3 tot 7)
Super Clamp Camera MountJINSUI, ChinaX0040GEYLRaankoop bij Amazon.com (1 tot 3)
Tetra Whisper 10 Aquarium LuchtpompSpectrum Pet, Home & Garden, Inc., Middleton, WI, USAUPC #046798778516aankoop bij lokale dierenwinkel (1)
Weerbestendige 2-gang elektrische behuizingHubbell, Inc., Shelton, CT, USA#MM2420Caankoop bij lokale bouwmarkt (1)
Witte PVC Plaat 1/4" x 24" 48"Royal Building Products, Bristol, TN, USA#3101aankoop bij lokale bouwmarkt (2)
Witte PVC Profillijst, nominaal 1 x 2 (0,75" x 1/5" x 96")Royal Building Products, Bristol, TN, USA#7832-8aankoop bij lokale bouwmarkt (1)

Referenties

  1. Seo, H., Lee, D. Neural basis of learning and preference during social decision-making. Curr Opin Neurobiol. 22 (6), 990-995 (2012).
  2. Bray, J., et al. Social bonds predict dominance trajectories in adult male chimpanzees. Anim Behav. 179, 339-354 (2021).
  3. Tibbetts, E. A., Pardo-Sanchez, J., Weise, C. The establishment and maintenance of dominance hierarchies. Philos Trans R Soc B. 377 (1845), 20200450(2022).
  4. Chase, I. D., Tovey, C., Spangler-Martin, D., Manfredonia, M. Individual differences versus social dynamics in the formation of animal dominance hierarchies. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (8), 5744-5749 (2002).
  5. DeLorey, T. M., et al. Gabrb3 gene deficient mice exhibit impaired social and exploratory behaviors, deficits in non-selective attention and hypoplasia of cerebellar vermal lobules: a potential model of autism spectrum disorder. Behav Brain Res. 187 (2), 207-220 (2008).
  6. Lee, J., Green, M. F. Social preference and glutamatergic dysfunction: underappreciated prerequisites for social dysfunction in schizophrenia. Trends Neurosci. 39 (9), 587-596 (2016).
  7. Fortier, A. V., et al. Prefrontal circuits guiding social preference: implications in autism spectrum disorder. Neurosci Biobehav Rev. 141, 104803(2022).
  8. Weiner, J. Social Relationships of Individuals with ADHD Across the Lifespan. Clinical Handbook of ADHD Assessment and Treatment Across the Lifespan. Matson, J. , Springer. Cham. (2023).
  9. Toth, I., Neumann, I. D. Animal models of social avoidance and social fear. Cell Tissue Res. 354, 107-118 (2013).
  10. Guo, M., Sun, L. From rodents to humans: rodent behavioral paradigms for social behavioral disorders. Brain Circ. 9 (3), 154-161 (2023).
  11. Geng, Y., Peterson, R. T. The zebrafish subcortical social brain as a model for studying social behavior disorders. Dis Model Mech. 12 (8), dmm039446(2019).
  12. Ogawa, S., Pfaff, D. W., Parhar, I. S. Fish as a model in social neuroscience: conservation and diversity in the social brain network. Biol Rev. 96 (3), 999-1020 (2021).
  13. Moss, S. M. Notes on the habits of a domesticated white rat, and a terrier dog (Flora), that lived in harmony together. Mag Nat Hist. 9, 182-185 (1836).
  14. Kietzman, H. W., Gourley, S. L. How social information impacts action in rodents and humans: the role of the prefrontal cortex and its connections. Neurosci Biobehav Rev. 147, 105075(2023).
  15. Bryda, E. C. The mighty mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Mo Med. 110 (3), 201-211 (2013).
  16. Nadler, J. J., et al. Automated apparatus for quantitation of social approach behaviors in mice. Genes Brain Behav. 3 (5), (2004).
  17. Yang, M., Silverman, J. L., Crawley, J. N. Automated three-chambered social approach task for mice. Curr Protoc Neurosci. 56, 8.26.1-8.26.16 (2011).
  18. Zhao, C., Gammie, S. C. The circadian gene Nr1d1 in the mouse nucleus accumbens modulates sociability and anxiety-related behaviour. Eur J Neurosci. 48 (3), 1924-1943 (2018).
  19. Arakawa, H. Revisiting sociability: factors facilitating approach and avoidance during the three-chamber test. Physiol Behav. 272, 114373(2023).
  20. Crawley, J. N. Designing mouse behavioral tasks relevant to autistic-like behaviors. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 10 (4), 248-258 (2004).
  21. Ehninger, D., et al. Gestational immune activation and Tsc2 haploinsufficiency cooperate to disrupt fetal survival and may perturb social behavior in adult mice. Mol Psychiatry. 17 (1), 62-70 (2012).
  22. Ward, A. J. W., Kent, M. I. A., Webster, M. M. Social recognition and social attraction in group-living fishes. Front Ecol Evol. 8, 15(2020).
  23. Gerlai, R. Misbehaving fish: the role of these simple vertebrates in the analysis of human brain function and dysfunction. Brain Res. 1863, 149795(2025).
  24. Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. BMC Neurosci. 11 (1), 90(2010).
  25. Faustino, A. I., Tacão-Monteiro, A., Oliveira, R. F. Mechanisms of social buffering of fear in zebrafish. Sci Rep. 7, 44329(2017).
  26. Akinrinade, I. D., Varela, S. A. M., Oliveira, R. F. Sex differences in social buffering and social contagion of alarm responses in zebrafish. Anim Cogn. 26 (4), 1307-1318 (2023).
  27. Ariyasiri, K., et al. Pharmacological (ethanol) and mutation (sam2 KO) induced impairment of novelty preference in zebrafish quantified using a new three-chamber social choice task. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 88, 53-64 (2018).
  28. Angiulli, E., et al. Increase in environmental temperature affects exploratory behaviour, anxiety and social preference in Danio rerio. Sci Rep. 10 (1), 5385(2020).
  29. Lindeyer, C. M., et al. Nonapeptide influences on social behaviour: effects of vasotocin and isotocin on shoaling and interaction in zebrafish. Behaviour. 152 (7-8), 897-915 (2015).
  30. Landin, J., et al. Oxytocin receptors regulate social preference in zebrafish. Sci Rep. 10 (1), 5435(2020).
  31. Aslanzadeh, M., et al. The body size of stimulus conspecifics affects social preference in a binary choice task in wild-type, but not in dyrk1aa mutant, zebrafish. Zebrafish. 16 (3), 262-267 (2019).
  32. Ribeiro, D. Oxytocin receptor signalling modulates novelty recognition but not social preference in zebrafish. J Neuroendocrinol. 32 (4), e12834(2020).
  33. Velkey, A. J., et al. High fidelity: assessing zebrafish (Danio rerio) responses to social stimuli across several levels of realism. Behav Processes. 164, 100-108 (2019).
  34. Velkey, A. J., Koon, C. H., Danstrom, I. A., Wiens, K. M. Female zebrafish (Danio rerio) demonstrate stronger preference for established shoals over newly-formed shoals in the three-tank open-swim preference test. PLoS One. 17 (9), e0265703(2022).
  35. Velkey, A. J., et al. Zebrafish (Danio rerio) prefer undisturbed shoals over shoals exposed to the synthetic alarm substance hypoxanthine-3N-oxide (C5H4N4O2). Biology. 14 (3), 233(2025).
  36. Canzian, J., Fontana, B. D., Quadros, V. A., Rosemberg, D. B. Conspecific alarm substance differently alters group behavior of zebrafish populations: putative involvement of cholinergic and purinergic signaling in anxiety- and fear-like responses. Behav Brain Res. 320, 255-263 (2017).
  37. Do Nascimento, B. G., Maximino, C. Social investigation and social novelty in zebrafish: roles of salience and novelty. Behav Processes. 210, 104903(2023).
  38. Bolgan, M., O’Brien, J., Gammell, M. The behavioural repertoire of Arctic charr (Salvelinus alpinus (L.)) in captivity: a case study for testing ethogram completeness and reducing observer effects. Ecol Freshw Fish. 25 (2), 318-328 (2016).
  39. Thomsen, H., Jensen, T. H., Ydesen, K., Madsen, N. Use of ethograms to analyse shoaling behaviour of mackerel (Scomber scombrus) in an aquarium. Genet Biodivers J. , (2020).
  40. Rodriguez, A., et al. ToxTrac: a fast and robust software for tracking organisms. Methods Ecol Evol. 9 (3), 460-464 (2018).
  41. Pereira, T. D., et al. SLEAP: a deep learning system for multi-animal pose tracking. Nat Methods. 19 (4), 486-495 (2022).
  42. Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nat Neurosci. 21 (9), 1281-1289 (2018).
  43. Gerlai, R. Social behavior of zebrafish: from synthetic images to biological mechanisms of shoaling. J Neurosci Methods. 234, 59-65 (2014).
  44. Collar, D. C., Thompson, J. S., Ralston, T. C., Hobbs, T. J. Fast-start escape performance across temperature and salinity gradients in mummichog Fundulus heteroclitus. J Fish Biol. 96 (3), 755-767 (2020).
  45. Collar, D. C., Hobbs, T. J., Thompson, J. S. Scaling of fast-start performance and its thermal dependence in mummichog Fundulus heteroclitus. J Fish Biol. 104 (3), 611-623 (2024).
  46. Collar, D. C., Stanley, K. L., Thompson, J. S. Fast-start performance and its dependence on temperature and salinity in sheepshead minnow (Cyprinodon variegatus). Environ Biol Fishes. 108 (10), 1515-1530 (2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Sociaal gedrag van zebravissendrie-kamer-taakDeepLabCut-trackingmarkerloze pose-estimatiegedragsmatige videoanalysesetup met lage kostensociale interactieneurogedragsonderzoek
Goedkope optie voor het onderzoeken van sociale voorkeur bij zebravissen (Danio rerio) met behulp van de 3-kamer open-tank free-swim taak
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.