Intracraniële borstkanker hersenmetastasen Muizenmodel voor karakterisering van immuun- en stromale cellen in meningen en olfactorische bol

Samenvatting

Het protocol stelt borstkankermetastasen vast via intracraniële inoculatie en karakteriseert via flowcytometrie belangrijke lymfatische en immuuncelsubsets die de hersenimmuniteit reguleren. Deze analyses bieden inzicht in de dynamiek van immuun- en stromale cellen die de hersenmicro-omgeving vormgeven, en informeren de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën.

Samenvatting

Het centrale zenuwstelsel (CZS) wordt omringd door gespecialiseerde immuuninterfaces, waaronder de hersenvlies en de olfactorische bol, die zowel kunnen dienen als permissieve routes voor metastatische kolonisatie als als toegangspunten voor anti-tumor immuunreacties. Het begrijpen hoe de dynamiek van immuuncellen binnen deze structuren evolueert tijdens de metastaserende progressie is essentieel om mechanismen te identificeren die de tumorgroei in de hersenen ondersteunen of beperken. Dit protocol beschrijft de vestiging van een borstkanker-hersenmetastasen (BCBM) muismodel door intracraniële injectie van E0771-borstkankercellen in C57BL/6-muizen. Na de ontwikkeling van de tumor worden de meningen en de reukbol zorgvuldig ontleed, enzymatisch verteerd en verwerkt tot eencellige suspensies. Deze populaties worden vervolgens geanalyseerd met behulp van multiparametrische spectrale flowcytometrie om lymfoïde, myeloïde en stromale celsubsets binnen CNS-geassocieerde immuunniches volledig te karakteriseren. Deze workflow maakt vergelijkende analyses mogelijk tussen tumordragende en niet-tumorcontroles, waarbij veranderingen binnen de immuuninterfaces van het CZS worden geïdentificeerd die ten grondslag kunnen liggen aan tumor-immuunontwijking en potentiële therapeutische doelwitten kunnen zijn. Over het algemeen biedt het protocol een reproduceerbare benadering om BCBM te bestuderen en immuunregulatie te onderzoeken op interfaces tussen het centrale zenuwstelsel en het perifere immuunsysteem. Het kan worden aangepast voor aanvullende kankercellijnen, immunotherapieën of genetische muismodellen om immuunresistentiemechanismen en therapeutische respons binnen de hersenmicro-omgeving te onderzoeken.

Inleiding

Hersenmetastasen zijn de meest voorkomende kwaadaardige tumoren die het centrale zenuwstelsel (CZS) aantasten en vaker voorkomen dan primaire hersentumoren. Longkanker, borstkanker en melanoom zijn de belangrijkste kankers die het vaakst uitzaaien naar^{de hersenen}. Hiervan vormen borstkanker-hersenmetastasen (BCBM) een grote klinische uitdaging, die 10%–30% van de patiënten met metastaserende ziekte treft en een toenemende incidentie vertoont door verbeterde systemische therapieën en vooruitgang in neuroimaging². De prognose voor patiënten met BCBM blijft slecht, aangezien beschikbare behandelingen – waaronder chirurgie, radiotherapie en chemotherapie – grotendeels palliatief zijn en neurologische symptomen een ernstige impact hebben op de levenskwaliteit³. Hoewel gerichte therapieën en immunotherapieën worden onderzocht als complementaire strategieën, blijft het klinische voordeel van immunotherapie bij hersenmetastasen beperkt ^4,5,6.

Recent werk heeft ons begrip van hersenimmuniteit verfijnd en de interesse in functionele lymfebanen die samenhangen met het CZS vernieuwd, waaronder lymfevaten in het meninges⁷ en neusmucosa⁸. Deze structuren vormen een continu lymfenetwerk rondom de hersenen en lopend naast de reukbol en de cribriforme plaat, en verbinden uiteindelijk met de cervicale lymfeklieren. Dit systeem speelt een sleutelrol in vloeistofhomeostase, immuunsurveillance en de overdracht van immuuncellen tussen het CZS en perifere lymfoïde organen⁹. Naarmate de interesse in immunotherapeutische benaderingen voor hersentumoren en metastasen toeneemt, komen deze lymfatisch-immuun interfaces naar voren als veelbelovende, maar nog onderbelichte, routes waarlangs systemische immuniteit kan communiceren met intracraniële laesies. Daarnaast zijn de mechanismen die de rekrutering van immuuncellen in de hersentumormicroomgeving regelen en hoe deze cellen in deze unieke omgeving interageren nog slecht begrepen. Samen onderstrepen deze hiaten de noodzaak van preklinische modellen en procedures die een uitgebreide analyse van tumor-immuuninteracties mogelijk maken en de ontwikkeling van strategieën ondersteunen om de antitumorimmuniteit tegen hersenmetastasen te verbeteren.

Hier beschrijven we een protocol dat de generatie van een reproduceerbaar, immunocompetent BCBM-muismodel combineert via stereotaxische intracraniële inoculatie van E0771-cellen met de isolatie en dissociatie van de meningen en de olfactorische bol voor immunofenotypie door spectrale flowcytometrie. Deze aanpak maakt gecontroleerde modellering van BCBM mogelijk om de veiligheid en effectiviteit van therapeutische interventies te beoordelen en maakt diepgaande karakterisering mogelijk van immuun- en stromale populaties op het lymfatisch-immuun interface van de hersenen, wat inzicht geeft in de cellulaire actoren die de microomgeving van hersentumoren vormen en de behandelingsresponsen beïnvloeden.

Diermodellen blijven onmisbaar voor het bestuderen van hersenmetastasen, aangezien veel cruciale aspecten van metastatische progressie niet in vitro kunnen worden gerepliceerd. Verschillende in vivo muismodellen zijn ontwikkeld om hersenmetastases te genereren, elk met specifieke voordelen en beperkingen¹⁰. Spontane metastasemodellen, waaronder orthotopische implantatie of genetisch gemodificeerde muismodellen, bootsen de klinische ziekteprogressie nauwer na, maar veroorzaken zelden intracraniële laesies, vereisen lange experimentele tijdlijnen en leveren vaak hoge variabiliteit op door wijdverspreide extracraniële ziekten. Systemische benaderingen, waaronder intracardiale, intracarotid- of staartveninjecties, brengen tumorcellen in de circulatie en bootsen zo hematogene verspreiding, bloed-hersenbarrière-extravasatie en kolonisatie beter na. Deze modellen vatten echter niet de vroege stappen van de primaire tumorinvasie en veroorzaken vaak uitgebreide en variabele extracraniële metastasen, met name in de longen. Onder systemische modellen heeft intracarotisinjectie de laagste variabiliteit, maar vereist geavanceerde chirurgische expertise. Alternatief biedt intracraniële injectie verschillende voordelen, waaronder nauwkeurige controle over de locatie van de tumor, snelle en reproduceerbare tumorontwikkeling en verminderde variabiliteit tussen experimenten. Deze aanpak kan ook worden aangevuld met orthotopische primaire tumorimplantatie gevolgd door chirurgische resectie om het metastatische verloop nauwkeuriger na te bootsen. Hoewel intracraniële injectie de volledige metastatische cascade niet herhaalt en niet geschikt is voor het bestuderen van vroege invasie en verspreiding, biedt het een robuust model om therapeutische effectiviteit te evalueren tegen gevestigde laesies en om interacties binnen de hersenmicro-omgeving te onderzoeken. Een bekende beperking is dat de injectie zelf lokale neuro-ontsteking kan veroorzaken, wat mogelijk invloed heeft op immuunuitslagen, die kunnen worden beoordeeld door immuunprofielen te vergelijken bij geïnjecteerde en niet-geïnjecteerde muizen.

De immuunkarakterisering van de meninges en de reukbol blijft een relatief nieuw en onderontwikkeld onderzoeksgebied. De meeste studies baseren zich op monsters^van de hele hersenen of cervicale lymfeklieren, die er niet in slagen de specifieke cellulaire samenstelling en gespecialiseerde immuunfuncties van deze lymfatisch geassocieerde weefsels te vatten. Het terugvinden van beide structuren biedt een breder en informatiever beeld van de hersenimmuniteit. In combinatie met multiparametrische spectrale flowcytometrie ondersteunt deze workflow high-throughput profilering van overvloedige en zeldzame immuuncelpopulaties die betrokken zijn bij CNS-perifere immuuncommunicatie. Dit omvat kwantificering van oppervlakte- en intracellulaire markers om celsubsets te identificeren, activatietoestanden te beoordelen en door behandeling veroorzaakte veranderingen te evalueren. Andere methodologieën voor CNS-immuunanalyse die niet door dit protocol worden behandeld, zijn onder andere immunohistochemie (IHC) en immunofluorescentie (IF), die de ruimtelijke verdeling van immuuncellen behouden maar worden beperkt door lage markermultiplexing, subjectieve kwantificatie en ondervertegenwoordiging van zeldzame celtypen¹². Meer recentelijk heeft single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) het vermogen om CNS-immuunpopulaties te profileren uitgebreid door de ontdekking van cellulaire toestanden en transcriptieprogramma's met hoge resolutie mogelijk te maken. Ondanks het bieden van krachtige transcriptomische inzichten, wordt scRNA-seq beperkt door kosten, dissociatieartefacten, transcriptuitval en verlies van eiwitresolutie^13,14. Flowcytometrie, hoewel het ruimtelijke analyse ontbreekt en gevoelig is voor dissociatie-gerelateerde effecten, biedt superieure fenotypische resolutie via een geavanceerd multiparametrisch paneel en biedt robuuste kwantitatieve immuunprofilering.

Samen bieden de hier beschreven methodologieën een flexibel en krachtig platform voor het modelleren van BCBM en het onderzoeken van immuundynamiek op lymfatische interfaces van het centraal zenuwstelsel, ter ondersteuning van preklinische ontwikkeling van therapieën gericht op zowel de hersentumormicro-omgeving als de bijbehorende immuunregulerende routes.

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Faculteit Farmacie, Universiteit van Lissabon. De protocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Portugese bevoegde autoriteit voor dierenbescherming, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (Referentie 0421/000/000/2021).

1. Voorbereiding van E0771-cellen voor in vivo implantatie

1. In een steriele kap kweek je E0771-cellen in een T75-kolf met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), aangevuld met 10% (v/v) foetaal rundserum (FBS) en 1% (v/v) penicilline en streptomycine (PEST).
   1. Zorg ervoor dat cellen worden geauthenticeerd door STR-profilering bij ontvangst van de leverancier en door routinematig testen bevestigd als mycoplasma-vrij. Kweek tumorcellen minstens 2–8 gangen na ontdooiing vóór hersenimplantatie.
2. Zorg er op de dag van implantatie voor dat de cellen gezond zijn en voor 80-90% samenvloeiend. Verwijder het medium en was de cellen met fosfaatgebakken zoutoplossing (PBS).
3. Voeg trypsine toe aan de kolf en laat het 5 minuten incuberen bij 37 °C. Voeg vervolgens drie keer het volume van het aangevuld medium toe (DMEM met 10% v/v FBS en 1% v/v PEST) om trypsine te neutraliseren en cellen te dissociëren.
4. Cellen overbrengen naar een buis en centrifugeren op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Verwijder supernatant en suspendeer het pelletje opnieuw in PBS voor celtelling.
5. Centrifugeer opnieuw (300 x g voor 5 minuten), gooi supernatant weg en suspendeer cellen opnieuw in PBS met een concentratie van 1 x 10^{à 5} E0771-cellen in 2 μL per dier. Houd de celsuspensie op ijs tot de tumor inentatie. Bereid de celsuspensie direct voor de injectie voor.

2. Intracraniële tumorinoculatie met behulp van een stereotaxisch apparaat

1. Neem vrouwelijke C57BL/6 muizen (6-8 weken oud) aan en breng ze minstens 7 dagen voor de operatie in de dierenfaciliteit. Houd huismuizen onder gecontroleerde omstandigheden met een 12-uur licht/donker cyclus en zorg voor voedsel en water ad libitum.
   OPMERKING: Minimaal vijf dieren per experimentele groep wordt aanbevolen om voldoende statistische kracht te garanderen voor zinvolle vergelijkende immuunprofilering tussen tumordragende en controleomstandigheden.
2. Bereid het operatieveld en alle benodigde materialen voor voordat u met de procedure begint:
   1. Chirurgische instrumenten: scalpelbladen, schaar, pincet, naaldhouders, hechtdraad.
   2. Apparatuur en andere apparatuur: stereotaxisch instrument, glazen spuit, boormachine, scheerapparaat, wattenstaafjes, warmtekussen.
   3. Anesthesie: Bereid ketamine-xylazine (K-X) (respectievelijk 25 mg/mL en 2 mg/mL) voor in PBS in een buisje van 15 mL.
   4. Analgesie: Bereid buprenorfine voor bij 15 μg/mL in PBS in een 15 mL buis.
   5. Andere oplossingen: povidonjodium, waterstofperoxide 3% v/v (H₂O₂), oogzalf.
      VOORZICHTIG: H2_O2 is schadelijk als het wordt doorgeslikt en kan huidirritatie veroorzaken.
3. Verdoof de muis door intraperitoneale (i.p.) injectie van K-X (100 μL per 10 g lichaamsgewicht). Bevestig voldoende verdoving door het ontbreken van reactie op het knellen van de teen.
4. Breng oogzalf aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen en plaats de muis gedurende de procedure op een warmtekussen.
5. Schaf de hoofdhuid en desinfecteer het operatiegebied met povidonjodium. Maak een lengtesnede van 1 cm langs de middenlijn om de schedel bloot te leggen.
6. Maak de blootgestelde schedel schoon met H₂O_{2 met} een wattenstaafje in een cirkelvormige beweging om bregma te visualiseren. Als er te veel schuim ontstaat, verwijder het dan met een droog wattenstaafje.
7. Plaats de muis in het stereotaxische frame. Stel de bregma als referentiepunt in (0,0) en meet 2,5 mm lateraal en 0,5 mm vooraan de bregma. Markeer de injectieplaats.
8. Verwijder de muis en boor een klein gaatje bij de gemarkeerde coördinaten. Vermijd te diep boren om hersenschade te voorkomen.
9. Bevestig de spuit op de injector. Suspensie cellen opnieuw en laad de glazen spuit met genoeg volume voor twee injecties (4–5 μL). Bereid niet meer dan twee injecties tegelijk voor om celvestiging te voorkomen.
10. Herplaats de muis in de stereotaxic, lijn de naald uit met het gaatje en laat deze langzaam zakken tot een diepte van 3,0 mm in het hersenparenchym. Injecteer cellen (of steriele PBS voor schijncontrole) bij 1 μL/min.
11. Na de injectie houd je de naald minstens 1 minuut op zijn plaats, trek je 1,5 mm terug, houd je nog een minuut vast en trek je dan helemaal terug. Dit minimaliseert terugstroming en zorgt voor een juiste celdepositie.
12. Sluit de incisie met hechtingen en breng povidonjodium aan. Geef buprenorfine (100 μL) subcutaan.
13. Houd de muis op een warmtekussen tot het volledig hersteld is van de narcose. Breng de muis terug in een schone kooi en houd dagelijks in de gaten op stress, neurologische tekenen of infecties.

3. Muis intracardiale perfusie

1. Verdoven muizen door een i.p. injectie van K-X (100 μL per 10 g lichaamsgewicht). Bevestig voldoende verdoving door het ontbreken van reactie op het knellen van de teen.
2. Maak met een schaar een incisie van 5–6 cm door de buikwand en twee incisies door de ribbenkast tot aan het sleutelbeen. Zorg ervoor dat je geen grote bloedvaten doorsnijdt.
3. Met het hart blootgelegd, snijd je het rechter atrium door om bloedstroom mogelijk te maken. Injecteer ijskoude PBS in de linker ventrikel met een 20 mL spuit uitgerust met een naald van 25G × 1 inch.
4. Stop met perfusie wanneer de vloeistof vrij is van bloed. Voor volwassen muizen is ongeveer 20 mL PBS nodig.

4. Isolatie van de muismeningen en reukbol

1. Na intracardiale perfusie onthoofd je de muis met een chirurgische schaar. Verwijder de hoofdhuid volledig om de schedel bloot te leggen.
2. Knip met een schaar de schedel in het dwarsvlak van het achterste gebied naar de ogen, waarbij je erop let dat het onderliggende hersenweefsel niet beschadigd raakt. Haal voorzichtig de hersenen eruit met fijne pincetten, waarbij je contact met of schraap van het binnenste schedeloppervlak vermijdt.
3. Na het verwijderen van de hersenen blijven de durale meningen aan het binnenoppervlak van de schedel bevestigd. Dompel de schedel onder in ijskoude PBS voor minstens 5 minuten om een intacte scheiding van de meningen te vergemakkelijken.
4. Ontleed de reukbol uit het voorste deel van de hersenen en plaats deze in ijskoude PBS voor tijdelijke opslag tot de verwerking.
5. Met fijne pincetten maakt u de meningen voorzichtig los van het binnenoppervlak van de schedel door het dunne weefsellaagje voorzichtig op te tillen en te pellen. Overbreng de meninges naar ijskoude PBS tot verdere verwerking. Vermijd het scheuren van het weefsel om een optimaal herstel van de downstream cel te garanderen.

5. Weefseldissociatie in enkele cellen

1. Meninges
   1. Breng meningen over naar 3 mL RPMI 1640 met 0,05% collagenase II en DNase I. Incubeer 20 minuten bij 37 °C, waarbij je elke 10 minuten zachtjes beweegt. Oververtering vermindert de levensvatbaarheid van cellen en moet worden vermeden.
   2. Voer verteerd weefsel door een 40 μm celzeef in een buis van 50 mL. Dissocieer het resterende weefsel mechanisch door voorzichtig een spuitzuiger tegen de zeef te drukken en was met 5 mL PBS.
   3. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi supernatant weg en susser de pellet opnieuw in 3 mL PBS.
   4. Herhaal centrifugatie. Gooi supernatant weg, suspendeer de laatste pellet opnieuw in het resterende volume en breng het over op een U-bodemplaat met 96 wellen.
2. Reukbol
   1. Verwijder PBS en dissocieer het weefsel mechanisch met een spuit-zuiger. Voeg 3 mL digestieoplossing toe met 0,02% collagenase II in Hanks' gebalanceerde zoutoplossing (HBSS). Broed 20 minuten uit bij 37 °C, en beweeg elke 10 minuten zachtjes om.
   2. Voer celsuspensatie door een 70 μm zeef in een 50 mL buis en spoel met 10 mL PBS.
   3. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi supernatant weg en suspendeer de laatste pellet opnieuw in het resterende volume. Overbrengen naar een U-bodemplaat met 96 putten.
3. Bewaar de platen op 4 °C tot ze beitsen.
   OPMERKING: Voer de kleuring op dezelfde dag uit om optimale levensvatbaarheid van de cel te waarborgen.

6. Celkleuring en verwerving van flowcytometrie

1. Paneelontwerp
   1. Zie Tabel 1.
      OPMERKING: Het paneel in dit protocol is ontworpen voor een spectrale flowcytometer uitgerust met 4 lasers (violet, blauw, geelgroen en rood) en in totaal 51 detectoren (48 fluorescentie + 3 verstrooiingskanalen). Het paneel moet worden ontworpen op basis van de configuratie van de flowcytometer en de eiwitten/markers van interesse.
2. Celkleuring
   1. Centrifugeer de U-bodemplaten van 96 putten op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi supernatant voorzichtig weg. Vanaf deze stap bescherm je platen tegen licht.
   2. Voeg 50 μL levensvatbaarheidskleurstof toe (FVD, verdunning 1:5000 in PBS) om geschikte putten te gebruiken en 20 minuten te incuberen bij RT. Was met 150 μL PBS, centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, en gooi supernatant weg. Voeg alleen levensvatbaarheidskleurstof toe aan levensvatbaarheidscontroles en monsters.
   3. Blokkeer Fc-receptoren door cellen te incuberen met 30 μL anti-CD16/CD32-antilichaam (0,01 μg/mL in FACS-buffer: PBS met 2 mM EDTA en 0,5% BSA) gedurende 10 minuten op ijs. Was met 170 μL FACS-buffer, centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, en gooi supernatant weg.
   4. Voeg 30 μL antistofmix of eenkleurige controles toe (bereid volgens de antistofverdunningen vermeld in de Materiaaltabel, in FACS-buffer) en incubeer 20 minuten op ijs. Was met 170 μL FACS-buffer, centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, en gooi supernatant weg.
   5. Fixeer cellen met 100 μL 2% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 20 minuten bij RT. Was met 100 μL PBS, centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, en gooi supernatant weg.
      OPMERKING: Voor intracellulaire markers vervang deze stap door fixatie en permeabilisatie met een commerciële bufferset, en voer vervolgens intracellulaire kleuring uit voordat de definitieve opsuspensie wordt uitgevoerd.
   6. Sussen eindcelpellets opnieuw in 200 μL FACS-buffer. Bewaar platen op 4 °C tot ze op de flowcytometer worden geïntroduceerd.
3. Eenkleurige en Fluorescentie Minus Een (FMO) controles
   1. Enkelkleurige gekleurde monsters zijn vereist voor ontmengenoptimalisatie. Cellen worden gebruikt voor enkelkleurige gekleurde monsters voor de markers die positieve en negatieve pieken vertonen. Anders wordt het gebruik van compensatiekralen aanbevolen en het wordt aanbevolen om een optimale ontmenging te bereiken. Bereid compensatiekralen voor fluorescerend geconjugeerde antilichamen volgens het protocol van de fabrikant.
      OPMERKING: Het voorbereiden van FMO-controles is een belangrijke stap om een goede gating te bereiken, vooral voor de markers die geen duidelijke positieve en negatieve pieken laten zien. Maak meerdere FMO-monsters klaar voor verschillende fluorochromen indien nodig.
   2. Bereid FMO-monsters voor celoppervlakteantigenen voor door de stappen in Deel 6.2 te volgen, maar sluit het antilichaam van belang uit uit de antilichaammix bij stap 6.2.4.
4. Acquisitie en analyse van flowcytometrie
   1. Zet de cytometer AAN, start de software voor het verkrijgen van de flowcytometer en bereid de kwaliteitscontrolekralen (QC) voor (1 druppel in 300 μL PBS) in een 12 x 75 mm monsterbuis terwijl de machine opwarmt (minstens 30 minuten).
   2. Maak het instrument schoon door te draaien: 3 min 10% v/v bleekmiddel, 30 min H₂O bij een hoog debiet. Zet de debiet weer laag voor de volgende stappen.
   3. Selecteer het QC-tabblad, laad de buis en laat de kralen lopen door op start te drukken. Zodra de QC klaar is, verschijnt er een melding met "Passed".
   4. Ga naar het tabblad acquisitie, selecteer of maak het experiment aan en begin de acquisitie door cellen per FSC en SSC te gateren. Haal ongekleurde en eenkleurige besturing, start de ontmengenwizard en sla de instellingen op. Ga verder met het verzamelen van gekleurde monsters.

Resultaten

Na intracraniële inenting van E0771-cellen ontwikkelden muizen een gelokaliseerde borstkankerlaesie op de beoogde stereotaxische coördinaten. De stereotaxische coördinaten gericht op het striatale parenchym (2,5 mm lateraal, 0,5 mm voor bregma en 3,0 mm ventraal van bregma) werden geselecteerd op basis van standaard hersenatlassen van muizen en eerder beschreven intracraniële implantatiebenaderingen^15,16. Dit gebied wordt veel gebruikt voor intracraniële tumorimp...

Discussie

Door intracraniële tumorimplantatie te combineren met isolatie, dissociatie en immuunkarakterisering van de hersenvlies en de reukbol, maakt dit protocol gedetailleerd onderzoek mogelijk naar de dynamische wisselwerking tussen de hersentumormicroomgeving en de door het zenuwstelsel geassocieerde immuuninterfaces. De methode biedt reproduceerbare intracraniële tumorvorming, hoogwaardige celsuspensies en robuuste immuunsubsetresolutie. Echter, intracraniële implantatie omzeilt de vroege st...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD45R/B220 antibody (clone RA3-6B2)	BioLegend	103254	used at 1:300 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD8 antibody (clone 53-6.7)	BioLegend	100730	used at 1:50 dilution
APC anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848006	used at 1:80 dilution
Betadine	Selleck Biotechnology GmbH	S4678-100mg	Povidone-jodium
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich	A2153	Om FACS Buffer te bereiden
Brilliant Violet 421 anti-mouse Podoplanin antibody (clone 8.1.1)	BioLegend	127423	used at 1:80 dilution
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD11b antibody (clone M1/70)	BioLegend	101263	used at 1:30 dilution
Brilliant Violet 570 anti-mouse NK1.1 antibody (clone PK136)	BioLegend	108733	used at 1:40 dilution
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD19 antibody (clone 6D5)	BioLegend	115541	used at 1:50 dilution
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD44 antibody (clone IM7)	BioLegend	103057	used at 1:80 dilution
Brilliant Violet 785 anti-mouse F4/80 antibody (clone BM8)	BioLegend	123141	used at 1:40 dilution
Bupaq 3 mg/mL	Bio5	1002241	Buprenorfine
Cell strainer 40-μm	Avantor	732-2757
Cell strainer 70-μm	Avantor	732-2758
Centrifuge 5910 Ri	Eppendorf	5943000011
Collagenase type II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
Corning Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix	Corning	356231
Cytek Aurora Spectral Flow Cytometer	Cytek Biosciences
Dnase I	Worthington Biochemical Corporation	LS002006
Drill	Stoelting Europe	51630
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high-glucose, pyruvate	Gibco	41966029
E0771 cell line	ATCC	CRL-3436
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Merck	E4884	Om FACS Buffer te bereiden
FCS Express Flow Cytometry Software	De Novo Software
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	A5256801
FITC anti-mouse CD3 (clone 17A2)	BioLegend	100204	used at 1:50 dilution
Ghost Dye Red 780	Cytek Biosciences	13-0865-T500	Viabiliteitskleurstof (used at 1:5000 dilution)
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Gibco	14025092
Heating Pad	MOBICLINIC
Hydrogen Peroxide 34.5 to 37% (H2O2)	ACROS	10002780
Ketamax 100 mg/mL	Bio3	1009495	Ketamine
Lubrithal Eye Gel	Bio4	1731329
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) 1M	Gibco	15630080
Paraformaldehyde (PFA) 16 %	Avantor	43368	Om Fixatie Buffer te bereiden
Pacific Blue anti-mouse Ly-6G antibody (clone 1A8)	BioLegend	127612	used at 1:50 dilution
PE anti-mouse Ly-6C antibody (clone HK1.4)	BioLegend	128008	used at 1:300 dilution
PE anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848004	used at 1:80 dilution
PE/Cyanine5 anti-mouse CD11c antibody (clone N418)	BioLegend	117316	used at 1:80 dilution
PE/Cyanine7 anti-mouse CD80 antibody (clone 16-10A1)	BioLegend	104734	used at 1:100 dilution
PE-eFluor 610 anti-mouse CD31 antibody (clone 390)	eBioscience	61-0311-82	used at 1:160 dilution
PE/Fire 810 anti-mouse I-A/I-E (clone M5/114.15.2)	BioLegend	107667	used at 1:300 dilution
Penicillin-Streptomycin (PEST), 10 000 U/mL	Gibco	15140-122
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 antibody (clone 30-F11)	BioLegend	103132	used at 1:80 dilution
Phosphate-buffered saline (PBS) 10X, pH 7.4	Gibco	70011044
Prism (version 10)	GraphPad
RN Needle (27/51/3)S	Hamilton Company	7762-01
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	61870044
Scalpel Blades, carbon steel	B Braun	BB510
Sedaxylan 20 mg/mL	Bio2	1112384	Xylazine
Spark Blue 574 anti-mouse CD4 antibody (clone GK1.5)	BioLegend	100490	used at 1:50 dilution
Stereotaxic Instrument	Stoelting Europe	51730D
Suture wire Silkam black 5/0 10x45 cm	B Braun	C026663