Generatie van polyacrylamide en siliconen extracellulaire matrixsubstraten met gedefinieerde stijfheid voor toepassingen in de celbiologie

Samenvatting

Hoewel de stijfheid van de extracellulaire matrix (ECM) een belangrijke regulator is van cellulair gedrag, blijven de onderliggende sensor- en transductiemechanismen onduidelijk. Om dit aan te pakken, bieden we protocollen aan voor het creëren van polyacrylamide- en siliconengebaseerde substraten met afstembare stijfheid, om ons begrip van cel-ECM-overklank te vergroten.

Samenvatting

De extracellulaire matrix (ECM) is een cruciale regelaar van celgedrag, waarbij ECM-stijfheid dient als een belangrijke mechanische aanwijzing die de cellulaire signalering, morfologie en het lot bepaalt. Experimenteel onderzoek naar stijfheidsafhankelijke cellulaire responsen wordt echter vaak beperkt door de beschikbaarheid van reproduceerbare, kosteneffectieve en toegankelijke kweekplatforms met nauwkeurig afstembare mechanische eigenschappen. Dit protocol beschrijft polyacrylamide (PA)- en siliconengebaseerde methoden voor het vervaardigen van ECM-substraten met instelbare stijfheid. De procedures beschrijven substraatvoorbereiding, oppervlaktefunctionalisatie en ECM-eiwitconjugatie om consistente celadhesie te waarborgen over een fysiologisch relevant stijfheidsbereik. PA-gebaseerde substraten zijn compatibel met downstream biochemische assays, waaronder eiwit- en RNA-extractie, evenals hoogresolutie fluorescentiebeeldvorming. Siliconengebaseerde substraten zijn geoptimaliseerd voor totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopie, waardoor de visualisatie van cel-ECM-interacties op het basale membraan mogelijk is. Daarnaast kunnen zachte substraten worden aangepast om sferoidculturen te ondersteunen die binnen een consistent beeldvlak zijn geplaatst, wat consistente beeldverwerving mogelijk maakt. Deze methoden bieden robuuste, kosteneffectieve en reproduceerbare platforms om systematisch te onderzoeken hoe ECM-stijfheid cellulaire processen reguleert, wat mechanistisch inzicht geeft in cel-ECM crosstalk in zowel fysiologische als ziektecontexten.

Inleiding

De extracellulaire matrix (ECM) is een fundamentele structurele en biochemische steiger die de mechanische eigenschappen van weefsels definieert en hun biologische functies ondersteunt. Zo zijn elastische weefsels zoals de longen en slagaders verrijkt met collageen- en elastine-gebaseerde ECM, die de mechanische veerkracht biedt die nodig is voor herhaalde rek-terugslagcycli tijdens de ademhaling. Daarentegen bevat het centrale zenuwstelsel glycosaminoglycaanrijke ECM die een zeer compliant milieu creëert, geoptimaliseerd voor neuronale differentiatie en signalering¹. Over verschillende weefsels in het lichaam strekt de stijfheid van het weefsel zich uit over meerdere ordes van grootte, variërend van honderden pascals in zachte weefsels zoals de hersenen en longen tot megapascal- en gigapascalniveaus van stijfheid in pezen en bot, respectievelijk ^2,3. Deze mechanische verschillen zijn niet alleen structureel, maar spelen ook een cruciale rol bij het reguleren van celgedrag ^4,5. Zo ondergaan mesenchymale stamcellen een stijfheidsafhankelijke lijnspecificatie, waarbij ze neuronale lotgevallen op zachte substraten aannemen, myogene lotgevallen op tussenliggende substraten en osteogene lotgevallen op stijve substraten⁶. Pathologische veranderingen in ECM-stijfheid kunnen ook abnormale cellulaire reacties aansturen en bijdragen aan het ontstaan en progressie van de ziekte ^7,8,9. Op dezelfde manier veranderen veranderingen in ECM-eigenschappen rond cellen ook de functie van organelen en verschillende celgedragingen^10,11. Ondanks het erkende belang van ECM bij het sturen van signaaloverdracht, organelfunctie en ziektepathogenese, blijven de mechanismen waarmee cellen ECM-signalen waarnemen en omzetten in biochemische signalen nog steeds onvolledig begrepen.

De vooruitgang in het begrijpen van cel-ECM crosstalk is deels belemmerd door de beperkte beschikbaarheid van experimentele platforms die nauwkeurige controle bieden over ECM-eigenschappen en toch volledig compatibel blijven met standaard biochemische assays en beeldvormingsworkflows. Daarnaast wordt het bestuderen van cel-ECM-interacties vaak als technisch uitdagend ervaren, omdat het interdisciplinaire expertise vereist op het gebied van materiaalkunde, celbiologie en bio-engineering. Deze methode is bedoeld om deze uitdagingen aan te pakken door stapsgewijze protocollen te bieden voor het genereren van PA- en siliconengebaseerde ECM-substraten met gedefinieerde mechanische eigenschappen, die gemakkelijk kunnen worden voorbereid in de meeste wet-lab omgevingen.

PA-hydrogels met instelbare stijfheid zijn basisprincipes van de mechanobiologie; hun bruikbaarheid wordt echter vaak belemmerd door hoge kosten van reagentia voor ECM-conjugatie, inconsistente oppervlaktefunctionalisatie en slechte compatibiliteit met grootschalige biochemische workflows. Daarnaast zijn praktische en gestandaardiseerde benaderingen voor monsterverzameling en beeldvorming op substraten met verschillende stijfheid niet goed vastgesteld. Deze knelpunten kunnen worden aangepakt met ons beschreven PA-gelplatform, dat wordt gekenmerkt door vier belangrijke innovaties: (i) aanzienlijke kostenbesparing, (ii) reproduceerbare functionalisatiechemie, (iii) schaalbare productie via herbruikbare hardware, en (iv) naadloze integratie met veel conventionele celbiologie- en biochemische assays. Deze benadering maakt gebruik van verschillende verhoudingen van acrylamide en bisacrylamide om hydrogels te genereren met verschillende mechanische eigenschappen (Tabel 1). PA-gels zijn inert en kunnen niet direct conjugeren met ECM-eiwitten. Daarom wordt een door UV geïnitieerde vrije-radicale polymerisatiereactie gebruikt om een dun, kruisverbonden netwerk van di(trimethylolpropaan) tetraacrylaat, acrylzuur N-hydroxysuccinimideester (NHS-acrylaat) en bisacrylamide te conjugeren op het oppervlak van PA-gels (Figuur 1). Dit netwerk creëert een dual-action adhesie-oppervlak voor ECM-eiwitten: het NHS-acrylaat zorgt voor stabiele covalente verankering voor ECM-eiwitten, terwijl het tetraacrylaat uniforme ECM-eiwitadsorptie¹² faciliteert. Daarnaast bieden we methoden die aantonen hoe eiwitten en nucleïnezuren zoals RNA uit deze substraten kunnen worden gewonnen, op een manier die compatibel is met downstream celbiologische analyses zoals western blotting en reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). Bovendien ondersteunen de resulterende compliant PA-substraten ook de vorming van sferoïden en positioneren ze sferoïden binnen een consistent focale vlak, waardoor systematische analyse van 3D-cellulair gedrag mogelijk is¹³.

Daarentegen beperken de optische beperkingen van PA-hydrogels hun gebruik in geavanceerde beeldvormingsmethodes, met name totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopie¹⁴. Om aan deze beperking te voldoen, ontwikkelden we mechanisch afstembare silicone-gebaseerde ECM-substraten geoptimaliseerd voor TIRF-beeldvorming. Deze materialen vertonen een brekingsindex die nauw overeenkomt met glas, terwijl ze de afstembare stijfheid over een breed bereik behouden (Figuur 2A). Een dunne laag siliconengel, met verschillende componentverhoudingen, wordt met spin-coating op een afdekglas gespind vóór ECM-conjugatie (Figuur 2B en Tabel 2). De intrinsieke hydrofobiciteit en chemische inertie van siliconen sluiten echter directe ECM-conjugatie uit. Daarom implementeren we een surface modification-strategie om covalente hechting van ECM-liganden mogelijk te maken. Zuurstofplasmabehandeling introduceert hydroxylgroepen op het siliconenoppervlak (Figuur 2C). Vervolgens zet (3-aminopropyl)triethoxysilaan (APTES) deze hydroxylgroepen om in reactief amine. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiamide hydrochloride (EDC), een carbodiamide-crosslinker met nul lengte, faciliteert vervolgens de vorming van covalente amidebindingen tussen de aminegroepen op het geloppervlak en de carboxylgroepen op ECM-eiwitten.

Gezamenlijk bieden deze ECM-platforms kosteneffectieve, reproduceerbare en schaalbare systemen om ECM-stijfheidsafhankelijke signaalmechanismen te onderzoeken. Hun flexibiliteit maakt naadloze integratie mogelijk met biochemische assays, hoge-resolutie beeldvorming en high-throughput workflows, waardoor onderzoek mogelijk is hoe ECM-stijfheid het cellulaire gedrag beïnvloedt en de ziekteprogressie aanstuurt.

Protocol

1. Generatie van PA-gebaseerde ECM-hydrogels

1. Functionalisatie van glasoppervlakken voor PA-gel-bevestiging
   OPMERKING: Voer alle stappen uit bij kamertemperatuur op een orbitale shaker. Spoel grondig af met water van hoge kwaliteit tussen de stappen door.
   1. Maak de glazen oppervlakken 3 uur lang schoon met 10% bleekmiddel in een chemisch bestendige schaal (bijvoorbeeld polystyreen). Gebruik voldoende volume om het glas volledig te bedekken en zorg dat er geen opgesloten belletjes of droge plekken zijn.
      VOORZICHTIG: Bleekmiddel is een zeer corrosieve en reactieve chemische stof. Volg de veiligheidsinstructies van de fabrikant.
   2. Incubeer de dekfolies in 0,2 m zoutzuur (HCl) gedurende 16 uur met zachte roering op een shaker.
      VOORZICHTIG: HCl is zeer corrosief en kan huidbrandwonden veroorzaken. Draag passende PBM.
   3. Voeg 0,1 M NaOH toe en incubeer 1 uur.
      VOORZICHTIG: NaOH-oplossingen zijn corrosief en kunnen huidbrandwonden veroorzaken. Draag passende PBM.
   4. Incubeer de coverslips in 0,5% APTES in hoogwaardig water gedurende 30 minuten.
      VOORZICHTIG: APTES is giftig. Werk met APTES in een dampkap met geschikt PBM.
   5. Spoel dekfolies af met een grote hoeveelheid water om eventuele achtergebleven APTES te verwijderen.
      OPMERKING: Onvolledige wasbeurt veroorzaakt in de volgende stap een reactie tussen APTES en glutaraldehyde en leidt tot witte neerslagen die de activatie van het glasoppervlak belemmeren.
   6. Incubeer de coverslips in 0,5% glutaraldehyde in PBS gedurende 1 uur.
      VOORZICHTIG: Glutaraldehyde is giftig. Werk met glutaraldehyde in een dampkap met geschikt PBM.
   7. Droog de dekfolies een nacht op absorberend materiaal (bijvoorbeeld keukenpapier). Bewaar de dekfolies in een schone, afgesloten container tot gebruik.
2. Bereiding van PA hydrogeloplossing en gelgieten
   OPMERKING: De formuleringen die nodig zijn om hydrogels met de gespecificeerde elasticiteitsmodulus te verkrijgen, zijn weergegeven in Tabel 1. Aanbevolen gelvolumes en glasafmetingen voor verschillende experimentele toepassingen worden weergegeven in Tabel 3.
   1. Meng PA-hydrogelcomponenten in een microcentrifugebuis van 1,7 mL, exclusief ammoniumpersulfaat (APS) en tetramethylethyleendiamine (TEMED).
      OPMERKING: Bereid geen grote hoeveelheden voor omdat gels met een hogere stijfheid snel polymeriseren en kunnen uitharden voordat het gieten voltooid is.
   2. Ontgassen het PA-gelmengsel, APS en TEMED-buizen in een vacuümkamer op 25 mmHg gedurende 30 minuten.
   3. Bereid de hydrofobe bovenste dekfolies voor door waterafstotende coating aan te brengen om dekfolies schoon te maken met een wattenstaafje. Zorg ervoor dat dekfolies vrij zijn van vlekken om een consistente gelpolymerisatie te behouden.
   4. Voeg APS en TEMED toe aan de ontgassde oplossing en pipetteer het mengsel vervolgens voorzichtig op de geactiveerde dekmantels.
   5. Leg de hydrofobe dekfolies bovenop de oplossing om een uniforme, dunne hydrogellaag te creëren. Laat de gels 35 minuten polymeriseren bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat er geen belletjes tussen de dekfolies vastzitten en dat de oplossing niet over de randen heen stroomt.
      OPMERKING: Volg de aanbevolen volumes voor gelgieten om de juiste dikte te garanderen; Te dunne gels stellen cellen in staat het onderliggende glas¹⁵ te detecteren. Controleer voordat je de gelsandwich uit elkaar haalt het restmengsel in de microcentrifugebuis om polymerisatie te bevestigen.
   6. Doe de hydrogelsandwich onder in PBS om de lagen te scheiden. Zorg ervoor dat de hydrogel aan de geactiveerde onderste deklaag blijft bevestigd, en dat de hydrofobe bovenste deklaag gemakkelijk loskomt.
3. Functionalisatie van hydrogels met ECM-liganden
   OPMERKING: Alle stappen in deze sectie moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast.
   1. Steriliseer de hydrogels door ze onder te dompelen in 70% ethanol en breng ze vervolgens over in plasticwaren met steriele PBS.
      OPMERKING: Laat hydrogels niet langdurig in ethanol zitten, omdat dit de gels zal dehydrateren en de ECM-conjugatie zal verstoren.
   2. Bereid een master mix functionalisatieoplossing voor die bestaat uit water, ethanol, HEPEES en bisacrylamide (Tabel 4).
      VOORZICHTIG: Bisacrylamide is giftig bij inademing of inname.
   3. Bereid verdunde oplossingen voor van UV-fotoinitiator en tetraacrylaat. Beide reagentia zijn opgelost in ethanol (Tabel 4).
      OPMERKING: Voer telkens seriële verdunningen van tetraacrylaat uit, omdat te grote hoeveelheden kunnen leiden tot overpolymerisatie en zichtbare zwarte oppervlakafzettingen (zie Figuur 3A).
   4. Weeg de benodigde hoeveelheid NHS-acrylaat met een analytisch weeggewicht. Suspendeer NHS-acrylaat direct voor gebruik opnieuw in 50% ethanol/50% water.
      OPMERKING: Een overmatige hoeveelheid NHS-acrylaat zal resulteren in de vorming van zichtbare zwarte oppervlakteafzettingen en kan leiden tot een ongelijke ECM-coating (Figuur 3B).
   5. Voeg UV-fotoinitiator, tetraacrylaat en NHS-acrylaatoplossingen toe aan de hoofdmix die in Stap 1.3.2 is bereid. Aspiraat de PBS en voeg de mastermix toe aan de gels, zodat ze volledig bedekt zijn.
   6. Blootstel de hydrogels (zonder deksels van weefselkweekschotel) 400 seconden aan UV-licht (UV-lichtbron met een golflengte van minder dan 365 nm).
      VOORZICHTIG: Draag geschikte oogbescherming bij het werken met UV-licht.
   7. Verwijder de gels en leg ze op ijs. Aspireer de functionalisatieoplossing, was de gels daarna drie keer met voorgekoelde steriele 25 mM HEPES (pH 6,0), gevolgd door drie washes met voorgekoelde steriele 0,9% NaCl.
   8. Incubeer de hydrogels met de ECM-ligand van keuze in voorgekoelde steriele 100 mM HEPES (pH 8,0) met 100 mM NaCl 's nachts bij 4 °C op een orbitale shaker.
      OPMERKING: De concentratie ECM-liganden kan naar eigen inzicht worden gekozen; het is echter cruciaal om identieke ligandconcentraties te behouden over alle substraten met wisselende stijfheid binnen dezelfde batch.
   9. Aspiraat voorzichtig de ECM-ligandoplossing 16 uur later. Was de hydrogels drie keer met PBS en voeg serumvrije basismedia (of PBS) toe om ze gehydrateerd te houden. Incubeer de gels een nacht in een weefselkweekincubator om de steriliteit te verifiëren voordat je met celzaaien begint.
      OPMERKING: Het medium zal na een nachtelijke incubatie bij 37 °C in basiskweekmedia troebel lijken als er besmetting aanwezig is.
   10. Gebruik de gels direct voor celzaaiing of bewaar ze op 4 °C in basismedium voor maximaal 3 weken.

2. Generatie van mechanisch afstelbare siliconen-gebaseerde ECM-substraten

1. Voorbereiding van glazen coverslips voor siliconengelcoating
   1. Maak glazen dekfolies schoon met 3 M NaOH gedurende 20 minuten.
   2. Was vijf keer grondig met water van hoge kwaliteit en aspiraat het water aan het einde. Laat ze aan de lucht drogen en gebruik een stikstofluchtstraal om eventuele resterende druppels of vuil te verwijderen.
2. Bereiding van siliconengel
   1. Weeg component A en component B van het tweecomponentige siliconenelastomeer volgens de gewichtsverhouding die in Tabel 2 is gespecificeerd, met behulp van een analytisch gewicht. Gebruik een gesneden pipettip om de viskeuze oplossingen te aspireren.
   2. Meng Component A en Component B grondig met een pipettip om volledige incorporatie te garanderen.
   3. Ontgass het mengsel in een vacuümkamer op 25 mmHg gedurende 10 minuten.
3. Gelgieten op glazen deksleuven
   1. Plaats een dekmantel op een rubberen mat die op de spincoat is geplaatst, zodat deze goed gecentreerd is.
      OPMERKING: De rubberen mat zorgt voor een goede vacuümafsluiting. Zonder een adequate afdichting kan de deklaag verplaatst raken en breken. Onjuiste centrering kan resulteren in een niet-uniforme coating.
   2. Zet de stofzuiger in om de dekmantel vast te zetten.
   3. Voeg 100 μL van het gelmengsel toe aan het midden van de deklaag. Spin coat bij 500 rpm voor 10 s, gevolgd door 8.000 rpm voor 60 s.
   4. Bak de gecoate deklaag 2 uur op 80 °C. Laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
      OPMERKING: Bewaar tot een maand op kamertemperatuur voor gebruik.
4. Functionalisatie van de siliconengel met ECM-liganden
   1. Blootstel de met siliconengel gecoate dekmantels 5 minuten aan zuurstofplasma bij 11 W vermogen.
      OPMERKING: Blootstelling aan zuurstofplasma gedurende een langere periode of een hogere kracht kan leiden tot barsten in de gels. De optimale combinatie van vermogen en tijd moet mogelijk worden getest, afhankelijk van de gebruikte apparatuur.
   2. Bereid een silanisatieoplossing voor met 95% ethanol, 0,5% APTES en 4,5% dH_2O.
      OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast.
      VOORZICHTIG: APTES is giftig. Werk met APTES in een dampkap met geschikt PBM.
   3. Incubeer de gel-gecoate coverslip met de silanisatieoplossing gedurende 10 minuten.
   4. Was vijf keer grondig met PBS.
   5. Bereid de ECM-oplossing voor met 100 μg/mL EDC en de ECM naar keuze in de gewenste concentratie in PBS.
      OPMERKING: EDC is onstabiel in oplossing en gevoelig voor vocht. Bereid het vers voor gebruik voor gebruik en bewaar het stevig gesloten op een koele, droge plek, beschermd tegen vocht en direct zonlicht.
      VOORZICHTIG: EDC is schadelijk als het wordt doorgeslikt en giftig als het wordt ingeademd. Draag de juiste PBM en werk in een dampkap.
   6. Incubeer de coverslip met de ECM-oplossing gedurende 1 uur bij 37 °C of 's nachts bij 4 °C.
   7. Was het dekmantel vijf keer met PBS. Spoel af met basismedium en voeg cellen toe.
      OPMERKING: Optimale celdichtheid hangt af van de specifieke cellijn en experimentele doelen (bijv. subconfluent voor morfologie of monolaag voor cel-celadhesie). Zo wordt een dichtheid van 0,1 x 10^{6 cellen} /cm^² vaak gebruikt voor fibroblasten om binnen 48 uur 50% confluentie te bereiken.

3. Voorbereiding van ECM-substraat voor immunokleuring en beeldvorming

1. Immunokleuring en beeldvorming op PA-gebaseerde substraten
   OPMERKING: Achttien millimeter PA hydrogels bieden over het algemeen voldoende beeldbaar oppervlak voor kwantitatieve analyse. Voor beeldvormingstoepassingen giet je de hydrogels af en voer immunokleuring uit in "oranje kamers" die zijn voorbereid uit 15 mL buizen. Hergebruik de oranje kamers voor meerdere rondes gelgieten en beitsen, mits deze structurele integriteit behouden.
   1. Ponsringen van polycarbonaatfolie en siliconenrubberfolie gebruiken een buitendiameter van 18 mm en 14 mm binnengatperforators om afstandhouders en pakkingen voor te bereiden.
   2. Snijd een opening in het midden van een 15 mL centrifugebuisdop met een schaar om een kamer te creëren voor gelgieten en kleuren.
   3. Ik zag de centrifugebuis op het 14 mL-punt. Knip oneffen randen af met een scalpel en vijl de rand van de kap zodat deze in een standaard 12-vels plaat past.
   4. Assembleer de hydrogel-coverslip sandwich (zoals beschreven in Sectie 1), waarbij de afstandsring op de geactiveerde coverslip wordt geplaatst.
   5. Haal de sandwich uit elkaar zodra de gels volledig gepolymeriseerd zijn.
   6. Steriliseer de 18 mm hydrogels en breng ze over op een 12-put tissuecultuurplaat met steriele PBS.
   7. Voer ECM-ligandfunctionalisatie uit zoals beschreven in sectie 1.
   8. Zaai cellen en fixeer ze met 4% formaldehyde.
      OPMERKING: Vermijd alcoholhoudende fixatieven, omdat ze de gels uitdrogen en de structurele integriteit aantasten.
      VOORZICHTIG: Formaldehyde is giftig en moet altijd in een dampkap worden gebruikt.
   9. (Optioneel) Zet de monsters weer samen op de centrifugebuisdopkamer. Gebruik een siliconen pakking om de kamer af te sluiten.
      OPMERKING: Voer enkele uren een lektest uit met PBS voordat je het kleurt. Hoewel deze methode misschien arbeidsintensiever lijkt, bevordert het een uniforme kleuring en vermindert het de antistofconsumptie.
   10. Ga verder met immunofluorescentiekleuring volgens de door de gebruiker gewenste protocollen.
   11. Na de kleuring bewaar je monsters in PBS aangevuld met 50% glycerol. Maak zo snel mogelijk een foto van de monsters.
       OPMERKING: Vermijd standaard montagemedia die hard worden, omdat ze hydrogels na verloop van tijd kunnen laten barsten en monsters kunnen beschadigen. De intensiteit van de fluorescentie neemt in de loop van de tijd af; beeld binnen 1 week voor optimale signaalkwaliteit.
   12. Breng een klein druppeltje PBS (of montagemedium) op het glasoppervlak van een weefselkweekschaal. Draai voorzichtig de gekleurde hydrogels om op de druppel zodat de cellen naar het afdekglas gericht zijn en ga verder met beeldvorming.
2. Immunokleuring en beeldvorming op siliconengebaseerde ECM-substraten
   1. Fixeer de monsters met 4% formaldehyde en kleur ze direct op een glazen bodemschaal met een standaard immunofluorescentieprotocol. Vermijd alcoholhoudende fixatieven, omdat die de ECM-substraten kunnen barsten.
   2. Beeldmonsters direct met een traditionele fluorescentiemicroscoop.

4. Het oogsten van eiwitten en RNA uit cellen die op ECM-substraten zijn geplateerd.

1. Met een tang haal je de gels voorzichtig uit de kweekschaal en dompel je ze onder in steriele PBS om restanten van kweekmedia en serum weg te spoelen.
   OPMERKING: Behandel de dekmantels voorzichtig, want ze zijn extreem fragiel en kunnen gemakkelijk breken.
2. Dep voorzichtig de rand van de hydrogel met doekjes met weinig pluisjes om overtollige PBS te verwijderen.
3. Voeg een passend volume RNA-extractiebuffer toe aan het deksel van een weefselkweekschaal.
   OPMERKING: Reagentia op basis van fenol-guanidine zijn compatibel met RNA-extractie uit PA-gels. Eiwitlysisbuffers kunnen worden gebruikt volgens experimentele eisen. Visualiseer monsters onder een microscoop na de incubatie van de lysisbuffer om volledige celvernieling te garanderen.
4. Leg de deklaag (gelzijde naar beneden) op de lysisoplossing. Tilt en laat de hydrogel voorzichtig meerdere keren zakken om een uniforme lysatie van alle cellen te garanderen.
5. Schraap voorzichtig het geloppervlak om het lysaat los te maken.
   OPMERKING: Gebruik geen commerciële plastic celschrapers, omdat het stijve plastic de zachte hydrogels kan beschadigen en het lysaat kan besmetten met gelstukken. Het zachte plastic dat wordt gebruikt om afstandhouders te maken (zie Stap 3.1.1) is hiervoor geschikt en kan worden hergebruikt om op maat gemaakte schrapers te maken.
6. Bewaar het RNA of eiwitlysaten bij -80 °C tot verdere verwerking met conventionele biochemische methoden of gebruik ze onmiddellijk.

5. Generatie van enkelvoudige sferoïdecultuur

1. Bereid de 75 Pa PA hydrogel voor op 18 mm dekfolies en functioneer het oppervlak met basement membrane extract (BME) of een andere geschikte ECM-ligand om celhechting te vergemakkelijken.
2. Zaad cellen op de ECM-gecoate hydrogels of siliconengels met de gewenste dichtheid.
3. Na 2 uur verwijder je voorzichtig losstaande cellen en voeg je een BME-overlay toe die verdund is in voorgekoeld basaal medium.
   OPMERKING: BME polymeriseert terwijl het opwarmt. Prechill tips voordat je pipettert. Het percentage BME dat wordt ingebouwd wordt bepaald door de gewenste mechanische integriteit en stabiliteit van de resulterende 3D-steiger.
4. Incubeer de culturen bij 37 °C in een weefselkweekincubator gedurende 1,5 uur om BME-polymerisatie mogelijk te maken.
5. Voeg voorzichtig celkweekmedium toe om de 3D-gels volledig te bedekken.
6. Houd de kweek onder standaardomstandigheden. Cellen blijven groeien en zichzelf assembleren tot 3D-sferoïden totdat het gewenste experimentele eindpunt is bereikt.

Resultaten

De stijfheid van de PA-gel, gegenereerd met de formuleringen in Tabel 1 , werd experimenteel getest met een reomometer. Gels met nominale stijfheidswaarden van 0,4 kPa, 6 kPa en 60 kPa, die drie ordes van grootte beslaan, werden geselecteerd. De gemeten stijfheidswaarden waren 363 ± 76 Pa voor 400 Pa gels, 6,41 ± 0,50 kPa voor 6 kPa gels en 36 ± 8 kPa voor 60 kPa gels (Figuur 4A). Om de uniforme ECM-hechting aan de PA-gels te beoordelen, werd fluorescere...

Discussie

Het beschreven ECM-fabricageprotocol biedt een reproduceerbare, schaalbare en kosteneffectieve workflow en kan eenvoudig in de meeste laboratoria worden geïmplementeerd. Hoewel traditionele glas- en plastic kweekware handig is en snelle gegevensverzameling mogelijk maakt, slagen de synthetische substraten er niet in fysiologisch relevante weefselstijfheid te repliceren. Alternatieve mechanisch afstembare substraten zoals polydimethylsiloxaan (PDMS) of gelatinemethacryloyl (GelMA) zijn ge...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
(3-Aminopropyl)triethoxysilaan (APTES)	919-30-2	-	Thermo Fisher Scientific
1,7 mL microcentrifugebuisjes	-	LMCT1.7B	FroggaBio
12-wells weefselkweekplaten (behandeld)	-	83.3921	Sarstedt
15 mL centrifugebuisjes (voor oranje kamer)	-	CLS430790	Corning
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiofenon (Irgacure)	106797-53-9	-	Thermo Fisher Scientific
2% Bisacrylamide oplossing	110-26-9	-	Bio-Rad
3-(3-Dimethylaminopropyl)-1-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)	25952-53-8	-	Chem Impex International
4′,6-Diamidino-2-fenylindol dihydrochloride	28718-90-3	-	Sigma
4′,6-Diamidino-2-fenylindol dihydrochloride (DAPI)	-	D1306	Invitrogen
40% Acrylamide oplossing	01/06/1979	-	Bio-Rad
50% Glutaraldehyde	111-30-8	-	Thermo Fisher Scientific
6 cm weefselkweekschalen (behandeld)	-	83.3901	Sarstedt
A549 cellen	-	CCL-185	ATCC
Acrylzuur N-hydroxysuccinimide ester	38862-24-7	-	Thermo Fisher Scientific
Alexa Fluor 488 geit anti-konijn antilichaam	-	A11008	Invitrogen
Alexa Fluor 594 NHS ester (tris(triethylammonium zout))	-	A37572	Invitrogen
Ammoniumpersulfaat	7727-54-0	-	Bio-Rad
Doorzichtige slagvaste polycarbonaat folie (0,005 inch; spacer)	-	85585K72	McMaster-Carr
CY 52-276 siliconengel, Componenten A en B	2624028	-	Dow
Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM)	-	11995-065	Thermo Fisher Scientific
Ethanol, anhydrous	64-17-5	-	Greenfield Canada
Fast SYBR Green Master Mix	-	4385612	Thermo Fisher Scientific
Foetaal bovien serum	-	A52567-01	Thermo Fisher Scientific
Fibronectine	-	356008	Corning
Formaldehyde (16%)	-	28908	Thermo Fisher Scientific
HEPES	7365-45-9	-	BioShop
Hoogtemperatuur siliconenrubber plaat (0,020 inch; pakking)	-	86435K452	McMaster-Carr
Zoutzuur	7647-01-0	-	BioShop
Grote holle ponsgereedschapset	-	66000	Mayhew Pro
Matrigel	-	356234	Corning
Mediaopslag borosilicaat glasfles, 250 mL	-	CLS1395250	Corning
Mediaopslag borosilicaat glasfles, 500 mL	-	CLS1395500	Corning
MicroAmp Fast Optical 96-well reactieplaat	-	4346906	Thermo Fisher Scientific
Microscoopglasjes dekglasjes, 18 mm diameter	-	72222-01	Electron Microscopy Sciences
Microscoopglasjes dekglasjes, 50 mm diameter	-	1.84E+16	eBay
PBS (1x)	-	14190144	Thermo Fisher Scientific
PBS (10x)	-	70011044	Thermo Fisher Scientific
Phalloidin	17466-45-4	-	Biotium
Phospho-FAK (Tyr397) antilichaam	-	85567	Cell Signaling Technology
Phospho-MLC (Ser19) antilichaam	-	3671	Cell Signaling Technology
Plasma cleaner	-	PDC-32G	Harrick Plasma
qPCR primers (voorwaarts en achteruit)	-	N/A	Integrated DNA Technologies
qScript cDNA Synthese Kit	-	95047	QuantaBio
Rain-X	-	-	Rain-X
Schroefdopklobben, conische bodem, 15 mL	-	62.554.101	Sarstedt
Schroefdopklobben, conische bodem, 50 mL	-	62.547.205	Sarstedt
Serologische pipette, 10 mL	-	170356N	Thermo Fisher Scientific
Serologische pipette, 25 mL	-	170357N	Thermo Fisher Scientific
Serologische pipette, 5 mL	-	170355N	Thermo Fisher Scientific
Serologische pipette, 50 mL	-	170358N	Thermo Fisher Scientific
Natriumhydroxide	1310-73-2	-	BioShop
SYPRO Ruby proteïne gel kleurstof	-	S12000	Invitrogen
TEMED	110-18-9	-	Bio-Rad
TRIzol reagens	-	15596026	Thermo Fisher Scientific
UV kamer	-	165-5031	Bio-Rad