Lipid-eiwitmembraan structuur-functie karakterisering met behulp van druppelinterface-dubbellagen

Summary

Er wordt een experimenteel protocol gepresenteerd om gramicidine A-gedoopeerde druppelinterface-dubbellagen samen te stellen, elektrisch te stimuleren en te analyseren. Relaties tussen lipide-eiwitstructuur en -functie worden gekwantificeerd door veranderingen in membraanoppervlakte, ionische flux en enkelkanaalgeleidbaarheid te meten, en deze responsen te relateren aan plasticiteitsachtige veranderingen in ionische geleiding in een membraanmodel geïnspireerd door elektrische synapsen.

Abstract

Druppel-interface bilayers (DIB's) bieden een afstembaar platform om de elektromechanische eigenschappen van lipide- en lipidepeptidemembranen te onderzoeken onder gecontroleerde elektrische stimulatie. DIB's maken zowel enkelkanaal- als ensemble-ionengeleidingsmetingen mogelijk over membraangebieden die vele malen groter zijn dan die toegankelijk met traditionele patchclamptechnieken, waardoor membraanniveauanalyses van elektromechanische vervorming en de invloed daarvan op ionengeleidende peptiden mogelijk zijn. Door systematisch de membraanstructuur af te stemmen via de bulk-koolwaterstofoliefase (bijv. hexadecane [C16] versus dodecane/hexadecane [C12/C16] [25%/75%, v/v]), maakt dit bottom-up platform systematische variatie in membraansamenstelling en olieomgeving mogelijk, wat invloed heeft op de viscoelasticiteit en structurele reorganisatie van het membraan, en daarmee op peptide-ionengeleiding. Gedetailleerde procedures zijn beschikbaar voor de assemblage van gramicidine A-gedopeerde 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DPhPC) membranen met verschillende samenstellingen van koolwaterstofolie en voor de toepassing van spanningspulsprotocollen die membranen in metastabiele elektromechanische toestanden brengen. Adaptieve membraanionengeleiding wordt gekarakteriseerd, inclusief kortetermijn-plasticiteitsachtige (STP-achtige) en langetermijnpotentiatie- en depressie-achtige (LTP-achtige/LTD-achtige) responsen in een modelmembraansysteem. In bredere zin biedt dit protocol een robuuste, reproduceerbare benadering om systematisch samenstellingsafhankelijke, membraanniveau elektromechanische bijdragen aan synaptisch-achtige geleidende gedragingen te onderzoeken en om te begrijpen hoe lipidemembraanomgevingen de ionenkanaalfunctie moduleren.

Introduction

Biologische membranen zijn cruciale supramoleculaire structuren die ionische geleiding kunnen reguleren en communicatie tussen neuronen mogelijk maken via elektrische en chemische synapsen ^1,2,3,4. Dit type communicatie wordt verder gecontroleerd door synaptische plasticiteit, waarbij structurele veranderingen aan synapsen hun sterkte en persistentie moduleren over een reeks tijdschalen ^5,6, vaak beschreven in termen van kortetermijnplasticiteit (STP) en langetermijnpotentiatie of depressie (LTP of LTD). Deze fenomenen, die dynamische veranderingen in membraangeleiding omvatten als reactie op neurale activiteit, zijn vaak gekoppeld aan neuroplasticiteit⁷, die ten grondslag ligt aan leren en geheugen⁸. Traditionele modellen van plasticiteit leggen vaak de nadruk op de biochemische regulatie van ionenkanalen via eiwitsynthese, -trafficking of fosforylering⁹. De rol van neuronale plasmamembranen in modellen van plasticiteit is echter grotendeels^{over het hoofd} gezien.

Patch-clamp-methoden worden al meer dan een halve eeuw gebruikt om de elektrofysiologie van enkel-ionenkanaals te bestuderen. Ze kunnen echter alleen membraangebieden onderzoeken die veel kleiner zijn dan intacte synapsen of grootschalige synthetische modellen. Als zodanig vormen ze een technische beperking voor het bestuderen van mesoschaalmembraanreorganisatie en -vervorming. De mesoschaal wordt steeds meer erkend als een kritische lengteschaal voor het begrijpen van veel aspecten van membraanbiofysica^12,13.

Er wordt een methodologie gepresenteerd voor het gebruik van 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DPhPC) druppelinterface-bilayers (DIBs)^14,15, gedoteerd met het monovalente peptide kationionofore, gramicidin-A (gA), om ionische geleiding te modelleren, vergelijkbaar met wat plaatsvindt in een elektrische synaps. Dit systeem biedt verschillende belangrijke voordelen: (i) DIB's bieden een afstembaar lipiden- en olieplatform dat systematische membraanreorganisatie mogelijk maakt¹⁶; (ii) DIB's maken het mogelijk om single-channel en ensemble-channel gebeurtenissen te bestuderen over een reeks lengteschalen^17,18; en (iii) DIB's maken het mogelijk om submillimeter^2-grote membraanpatches te onderzoeken die collectief elektromechanisch geïnduceerde membraanherstructurering vastleggen, terwijl het vermogen behouden blijft om enkelkanaals ionengeleidingsgebeurtenissen^{op te lossen 19,20}. Deze methode is het meest geschikt voor studies die gelijktijdige elektrische en optische onderzoeken van membraanelektromechanica vereisen over membraangebieden groter dan die toegankelijk met conventionele patchclamp, terwijl het vermogen behouden blijft om discrete kanaalgebeurtenissen op te lossen. Het is vooral nuttig wanneer het experimentele doel is te onderzoeken hoe membraansamenstelling, olieomgeving en opgelegde spanningsgolfvormen de collectieve membraanherstructurering en peptidegeleiding beïnvloeden. De methode is minder geschikt voor experimenten die een native cellulaire architectuur of directe moleculaire uitlezingen van eiwitconformationele veranderingen in intacte biologische membranen^vereisen 19,20,21.

Door fysiologisch relevante elektrische stimulatie toe te passen, worden DIB's in niet-evenwichtsstationaire toestanden gedreven, waarin dynamische elektromechanische herstructurering de geleiding van peptide-ionenkanaal verandert. Deze opkomende veranderingen in ionische geleiding zijn beschrijvend analoog aan neurologische STP-, LTP- en LTD-fenomenen die besproken worden in neurowetenschap 22,23,24. In de huidige studie worden deze gedragingen voornamelijk geïnterpreteerd als fysieke reacties op membraanniveau op elektrische stimulatie die geassocieerd worden met intrinsieke membraanmechanische eigenschappen, zoals viscoelasticiteit en samendrukbaarheid in een modelmembraansysteem²⁵. Opmerkelijk is dat de hier beschreven studie voortbouwt op eerder bewijs dat lipide-dubbellagen fundamenteel elektrisch geheugen kunnen vertonen door persistente conductantieverschouningen en capacitieve ladingsopslag na stimulatie 14,15,25,26,27,28,29,30,31,32,33^{, 34}, waarin nieuwe inzichten worden geboden in mechanismen waarmee lipide-dubbellagen adaptieve, synaptisch-achtige functionaliteit kunnen ondersteunen in afwezigheid van complexe cellulaire mechanismen. Ten slotte maakt deze methodologie ook directe analyse mogelijk van structuur-functierelaties en hoe emergent macroschaalgedrag ontstaat uit eenvoudige structurele reorganisatie 21,25,27.

Protocol

Maak al het glaswerk en voorbereidende apparatuur grondig schoon met geschikte laboratoriumdetergenten en spoel af met gedestilleerd water voordat je het monster voorbereidt. Draag altijd een veiligheidsbril en nitril- of latexhandschoenen om besmetting te voorkomen. Voer al het chemische afval af volgens de veiligheidsrichtlijnen van de instelling. Zorg ervoor dat vluchtige oplosmiddelen correct worden opgeslagen volgens de veiligheidsrichtlijnen van de instelling. Zorg ervoor dat de laboratoriumruimte en hardware voor experimenten (Figuur 1A), het experimenteervat (Figuur 1B) en elektrische en optische verbindingen (Figuur 1C) vrij en vrij van obstakels blijven.

1. Bereiding van een waterige bufferoplossing

1. Weeg de juiste hoeveelheid 3-(N-morfolino) propansulfonzuur (MOPS) en kaliumchloride (KCl) om de gewenste eindconcentraties te verkrijgen (bijv. 10 mM MOPS, 0,1 M KCl in 500 mL).
2. Voeg de MOPS en KCl toe aan ~450 mL gedestilleerd water in een 500 mL volumetrische kolf of gegradueerde cilinder en roer met een magnetische roerstaaf tot het volledig is opgelost.
3. Meet de pH met een gekalibreerde pH-meter. Stel de pH aan naar 7,4 door 1 M kaliumhydroxide (KOH) of zoutzuur (HCl) toe te voegen in stappen van 0,25 mL terwijl je continu roert.
4. Breng het totale volume tot 500 mL met gedestilleerd water en meng grondig. Zet de buffer over in een schone, gelabelde fles, sluit af en bewaar bij 4 °C.
   OPMERKING: Gebruik de buffer tot ~2 maanden. Controleer en stel de pH voor elk gebruik opnieuw aan naar 7,4.

2. Bereiding van gramicidine-bouillonoplossing

1. Voeg in een chemische dampkap 5 mg gramicidine A (gA) toe aan een schoon glazen flesje van 20 mL. Voeg 10 ml methanol toe met een glas- of gasdichte spuit en laat het vortex totdat het peptide volledig is opgelost. Label het flesje als "gA stock" en bewaar het bij -80 °C.
   OPMERKING: Ensemble-experimenten gebruiken lipide-peptide molaire verhoudingen van ~1:^10-4. Enkelkanaalexperimenten gebruiken ~10–100 keer lagere peptiden (1:^10-5–^10-6) om individuele gebeurtenissen binnen korte opnametijden (<1 min) op te lossen. Het voorbereiden van een verdunde kolf verbetert de pipetnauwkeurigheid bij lage molaire verhoudingen (< ~ 1:^10-4).
2. Spoel twee extra schone 20 mL glazen flesjes met argongas voor ~5 seconden elk om stof te verwijderen.
3. Met een schoone, gasdichte spuit doseer je 9,9 mL methanol in elk gezuiverd flesje.
4. Pipetteer 100 μL van de gA-voorraadoplossing met een steriele gasdichte spuit in één flesje om een totaalvolume van 10,0 mL te verkrijgen. Label dit flesje als "A". Concentratie = 2,66 μM gA in methanol.
5. Pipette 100 μL oplossing "A" in het tweede glazen flesje om een totaal volume van 10,0 mL te verkrijgen. Label dit flesje als oplossing "B". Concentratie = 26,6 nM gA in methanol.
6. Sluit de flesjes af met doppen en wikkel in met parafilm.
7. Bewaar alle gA-oplossingen op -80 °C tot gebruik.

3. Bereiding van lipidepeptideblaasjes

1. Spoel een schoon glazen flesje van 20 mL met argongas ~5 seconden in.
2. Voeg 4 mg 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DPhPC) lipide toe aan het flesje.
3. Voeg in een dampafzuigkap 1 ml methanol toe met een glazen pipet. Draai of draai zachtjes rond tot alle lipiden zijn opgelost.
4. Voeg met een gasdichte spuit van 500 μL 178 μL oplossing "A" toe (voor ensemble-niveau STP-experimenten; DPhPC:gA molaire verhouding = 1:^10-4) of 890 μL van oplossing "B" (voor enkelkanaalsexperimenten; DPhPC:gA molaire verhouding = 1:5×^10-6) in de DPhPC methanoloplossing. Zachtjes vortexen om te mengen.
5. Onder een zachte argonstraal in de dampkap verdamp je de methanol totdat er een dunne, uniforme lipidefilm ontstaat op de bodem van het flesje.
6. Plaats het geopende flesje in een vacuümoven van 40 °C en trek een volledig vacuüm gedurende 10–12 uur of een nacht om het resterende oplosmiddel te verwijderen.
7. Haal het buisje uit de vacuümoven en voeg 2 mL van de 0,1 M KCl-buffer toe die in Sectie 1 is voorbereid voor STP-experimenten, wat resulteert in een uiteindelijke lipide- en gramicidineconcentratie in suspensie van respectievelijk 2,36 mM en 236 nM. Voor enkelkanaalexperimenten voeg je 2 mL van een 1 M KCl-buffer toe zoals voorbereid in Sectie 1. Vortex om de lipidefilm te rehydrateren en een 2 mg/mL lipidesuspensie te verkrijgen, wat resulteert in een uiteindelijke lipide- en gramicidineconcentratie in suspensie van respectievelijk 2,36 mM en 11,8 nM.
8. Vries het flesje minstens 6 minuten in op -80 °C, ontdooi het daarna op een kookplaat van 40 °C of in een waterbad voor 6 minuten. Vortex even om te mengen. Herhaal deze vries-dooicyclus zes keer om de vorming van multilamellaire blaasjes te bevorderen.
9. Assembleer een lipideblaas-extruder met een poriediameter spoorgeëtst membraan van 0,1 μm volgens de instructies van de fabrikant. Laat 500 μL buffer drie keer door de extruder lopen om het membraan te hydrateren, controleer of er geen lekkages zijn, en gooi de buffer weg.
10. Laad 1 mL van de ontdooide lipidepeptide-suspensie in de extruder en voer 31 passes uit door het 0,1 μm membraan om unilamellaire blaasjes met een diameter van ~100 nm te verkrijgen en zo de grootte homogeniteit te waarborgen.
11. Breng de geëxtrudeerde blaasjes (grote unilamellaire blaasjes, LUV) over in een 1 mL PCR-buis, label en bewaar bij 4 °C. Gebruik binnen 2 weken na voorbereiding.
12. Sluit eventuele resterende niet-geëxtrudeerde lipide-eiwitsuspensie af in het originele flesje, wikkel in met parafilm en bewaar bij -80 °C voor later gebruik.
13. Als je eerder bevroren, niet-geëxtrudeerde monsters gebruikt, smelt dan opnieuw bij 40 °C met een hete plaat of laat het monster opwarmen tot kamertemperatuur, en extrudeer het monster.

4. Bereiding van agarosegel

1. Plaats een schone glazen beker van 50 mL op een kookplaat. Voeg één agarosetablet toe aan 50 mL van dezelfde buffer die wordt gebruikt om de lipidefilm te hydrateren (bijv. 10 mM MOPS, 0,1 M KCl, pH 7,4) om een 1% agarosegeloplossing te vormen.
2. Voeg een schone Teflon-roerreep toe en roer krachtig totdat de tablet is verspreid.
3. Bedek de beker met aluminiumfolie en doorboor een klein ventilatiegat met een metalen spatel. Stel de temperatuur van de warme plaat in op 220–230 °C. De oplossing wordt helder en kookt snel, wat wijst op volledige oplossing van agarose.
4. Zet de verwarming uit en verwijder voorzichtig de folie. Haal elke oppervlakkige film af met een schone metalen spatel. Gebruik de hete agaroseoplossing direct voor elektrodecoating of laat het afkoelen en stollen in de beker voor later gebruik.
5. Na het bedekken van elektrode-agarose wordt de gestolde agarose afgedekt met folie, afgedicht met parafilm, gelabeld en opgeslagen bij 4 °C. Verwarm indien nodig tot het kookpunt is en roerend tot het volledig opnieuw gesmolten is.

5. Voorbereiding van elektroden

1. Sneed 0,125 mm diameter zilverdraad in ~70 mm lengtes voor headstage-elektroden en ~130 mm lengtes voor aardelektroden.
2. Met een open vlam (bijvoorbeeld handaansteker of bunsenbrander) houd je één uiteinde van elke zilverdraad horizontaal in de heetste centrale kegel van de vlam totdat de punt smelt en een bolvormige bol van ~0,2 mm diameter vormt (Figuur 2A).
3. Plaats de draden op een schoon oppervlak en controleer onder een microscoop of de ballen bolvormig en vergelijkbaar groot zijn. Als een bal langwerpig of onregelmatig is, snijd dan de punt af en herhaal het smelten (Stap 5.2).
4. Plaats de uiteinden van beide zilveren draden in een glazen container met verse huishoudelijke bleekmiddel (natriumhypochloriet, NaClO). Zorg dat de ballen volledig ondergedompeld zijn en minstens 1 uur incuberen om het oppervlak te chloreren en Ag/AgCl te vormen. Een dof bruingrijs uiterlijk bevestigt geslaagde chlorering (Figuur 2B).
5. Verwijder de draden uit het bleekmiddel zodra de uiteinden van de bal dof grijs van kleur zijn, spoel grondig af met gedestilleerd water en leg ze op een schone, pluisvrije ondergrond om te drogen.
6. Koop één pipethouder voor hoofdstage en één aardelektrodehouder. Snijd een 100 mm borosilicaatglascapillaire (1,0 mm buitendiameter, 0,58 mm diameter) doormidden met een glassnijder.
7. Steek een halfcapillair in de pipethouder van het hoofdpodium en draai deze strak aan om deze vast te zetten. Monteer een volledige 100 mm capillaire op de aardelektrodehouder en zet die vast.
8. Steek het niet-balvormige uiteinde van de 130 mm zilveren draad in de aardelektrodecapillaire totdat ~20 mm van het kogeluiteinde uitsteekt. Plak het andere uiteinde van de draad aan de houder, zodat ~5 mm blootgesteld blijft voor aardverbinding.
9. Herhaal de volgende stap met een 70 mm draad voor de headstage-elektrode, waarbij je stevig contact hebt tussen de draad en de headstage-connector (goudkleurig stuk). Knip overtollige draad van het uiteinde van de headstage-connector af.
10. Doop elke gechloreerde zilveren bal in de agarose, net boven de bol-asverbinding, om een dunne, uniforme laag te vormen. Kom minstens 10 keer in en uit de buurt.
11. Haal de elektrode eruit en laat de agarose gelen bij kamertemperatuur. Herhaal het dippen indien nodig om een gladde, gelijkmatige agaroseschaal van tientallen micrometers dik te krijgen. Vermijd een te hoge of te lage coating op de draad (Figuur 2C).
12. Bevestig de hoofd- en aardelektroden op micromanipulatoren. Verbind de blootliggende aarddraad (~5 mm) met de massa van de versterker met een alligatorclip.
13. Buig met een pincet elke elektrode voorzichtig halverwege het uiteinde van de bal en de capillaire ruimte, zodat het uiteinde van de bal loodrecht staat op het microscoopstadium. Vermijd bochten groter dan 90° om optische vervorming in de visuele en videobeelden van de microscoop te minimaliseren.
14. Pas de oriëntatie van de elektrode in hun houders zo aan dat de met agarose gecoate boluiteinden loodrecht op het beeldvlak van de microscoop staan (Figuur 3A).

6. Vorming van druppelinterface-dubbellagen (DIB's)

1. Plaats een schone, heldere petrischaal op het podium van een omgekeerde microscoop. Vul de schaal met alkaanolie (bijvoorbeeld 100% hexadecane, of 25%/75% v/v dodecane/hexadecane) tot een diepte van ~5 mm (Figuur 1B).
2. Met behulp van de micromanipulatorbediening laat je beide met agarose gecoate kogeluiteinden in de olie zakken tot een diepte van ~2,5 mm onder het olieoppervlak. Vermijd snelle beweging met de micromanipulator om botsingen tussen elektrode en bolkop met de petrischaal te voorkomen.
3. Stel de microscoopfocus aan totdat beide baluiteinden en hun agarosecoatings scherp scherp zijn. Plaats de elektroden dicht bij de rand van het gezichtsveld zodat beide gelijktijdig kunnen worden waargenomen.
4. Met een gekalibreerde 2 μL pipet aspireert u de geëxtrudeerde lipidepeptideblaas-suspensie. Doseer langzaam 250 nL van de ophanging direct op elk met agaroze gecoate baluiteinde met een aparte pipettip voor elk, zonder de agaroseschaal met de pipettip aan te raken.
   OPMERKING: Om handtrillingen te minimaliseren en de stabiliteit te vergroten, veranker beide ellebogen aan de anti-vibratietafel. Stabiliseer de pipetterende pols met de niet-pipeterende hand, dompel de pipet langzaam onder in de olie en nader de elektrode geleidelijk. Kort ademhouden tijdens het laden van druppels kan onbedoelde bewegingen verder verminderen.
5. Laat de druppels zich verspreiden en de agaroseschaal bedekken en onder de zwaartekracht van de elektrode wegzakken. Let op doorzakken van de zijkant door de Petrischaalwand als het vrij is (Figuur 3B).
   OPMERKING: De tijd die nodig is om te zakken hangt af van de verdeling van de blaasgrootte, temperatuur en agarosetopografie. Voor DPhPC DIBs, wacht minstens 5 minuten na^{druppeldepositie 15}.
6. Duw voorzichtig tegen de anti-vibratietafel om de druppelparaatheid te beoordelen. Bevestig dat de doorhangende druppels met een lichte vertraging bewegen ten opzichte van de elektrodebeweging, wat wijst op de vorming van volledig gecoate lipidemonolaagdruppels.
   OPMERKING: De vertraagde beweging ontstaat doordat de vorming van een lipidenmonolaag rond de waterige druppel de oppervlaktespanning aanzienlijk verlaagt, waardoor de fysieke reactie bij het bewegen van de elektrode in olie vertraagt.
7. Als dit gedrag niet wordt waargenomen, wacht dan nog eens 2–3 minuten en herhaal het proces.

7. Elektrische installatie en dubbellaagbewaking (visueel en elektrisch)

1. Zorg ervoor dat de microscoop, anti-vibratietafel, Faraday-kooi en alle elektrische componenten, waaronder de versterker, digitizer, functiegenerator en computer, op een gemeenschappelijke aarde zijn aangesloten (Figuur 1).
2. Organiseer de instrumentverbindingen volgens de installatiehandleiding van de fabrikant. Gebruik Figuur 1C als schematische referentie voor de essentiële elektrische en optische configuratie. Raadpleeg de gedetailleerde instructies over aarding³⁵, hardware/softwareconfiguratie en pipetverschoffingsaanpassing voor DIB-experimenten.
   OPMERKING: Volg de apparatuur-specifieke opstelinstructies voor alle software en hardware die in de Materiaaltabel staan.
3. Verbind de headstage- en aardelektroden met de patchclamp-versterker.
4. Configureer een externe functiegenerator (of het uitgangskanaal van de acquisitiesoftware) om een 10 Hz, 10 mV driehoekige spanningsgolf te genereren. Controleer de amplitude en frequentie op een verbonden oscilloscoop en in de acquisitiesoftware.
5. Nadat de druppels ~ 10 minuten hebben gehangen, gebruik je de micromanipulatoren om de twee druppels zachtjes in contact te brengen. Pas de elektrodeposities zo aan dat het contactoppervlak van de druppels aanvankelijk niet groter is dan ~ 1/^{4 van hun} diameter.
6. Zet de 10 Hz, 10 mV driehoekige golfvorm aan en monitor de capacitieve stroomrespons met de versterker en de acquisitiesoftware.
7. Wacht op spontane vorming van de dubbellaag, elektrisch aangegeven door een uitdijende piek-tot-piek capacitieve stroomrespons en optisch door een toenemende interne reflectie (ovaal verschijning) van het contact met de dubbellaag (Figuur 4). Bevestig dat zuivere lipide-dubbellagen rechthoekige stroomplateaus ten opzichte van de driehoekige spanningsstimulus vertonen, terwijl gA-gedopte dubbellagen bij ~1:^10-4 lipiden: peptiden schuine plateaus vertonen die ensemble-ionische geleiding weerspiegelen.
8. Pas het druppelcontactoppervlak aan door de elektroden licht te verplaatsen totdat de piek-tot-piek capacitieve stroomrespons op de 10 Hz, 10 mV driehoeksgolfvorm tussen ~100–200 pA ligt voor ~250 nL DIB's in C16- of C12/C16-oliën, wat overeenkomt met een capaciteitsbereik van ~250–500 pF³³.
   OPMERKING: Hoogfrequente pulsen of niet-nul gelijkstroom-houdspanningen kunnen elektrobevlechting en overmatige dubbellaaguitbreiding veroorzaken, wat leidt tot druppelcoalescentie en een dubbele laagruptuur. Het bereik van 100–200 pA biedt een balans tussen dubbellaagstabiliteit en signaal-ruis, waardoor voldoende oppervlakteuitbreiding tijdens stimulatie mogelijk is.
9. Als de DIB samenkomt, haal dan de elektroden uit de olie. Spoel de elektrodekoppen grondig af met dezelfde waterige buffer die wordt gebruikt voor de lipidemonsters en agarose.
10. Verwijder alle waterige druppels uit de petrischaal met een steriele spuit. Vul indien nodig met verse olie, dompel elektroden opnieuw onder. Laad de LUV-oplossing opnieuw op de elektroden zoals beschreven in Sectie 6 en herhaal het proces.
11. Zodra stabiele capacitieve of geleidende responsen zijn bevestigd, schakel je de driehoekgolfvorm uit en laat je de DIB minstens 15 minuten in balans zijn voordat stimulatieprotocollen worden toegepast.

8. Elektrische stimulatieprotocollen

1. Pulsexperimenten (ensemble STP-achtige en LTP/LTD-achtige reacties)
   1. Configureer de functiegenerator of acquisitiesoftware om spanningspulsen van de gewenste amplitude, duur en interval tussen pulsen te leveren (bijv. PPF [gepaarde-puls facilitatie] en PPD [gepaarde-puls depressie] patronen).
   2. Open de video-opnamesoftware. Selecteer de juiste camera- en objectieflensinstellingen. Stel de framerate in op minstens 20 frames/s en controleer of deze stabiel blijft tijdens het opnemen.
   3. Stel in de data-acquisitiesoftware de bemonsteringsfrequentie in op minstens 5 kHz voor het huidige signaal.
   4. Klik op Acquiriëren > Nieuw Protocol om een nieuw protocol aan te maken, of Acquire > Edit Protocol om een bestaand protocol te wijzigen. Selecteer in het tabblad Acquisitiemodus Episodische Stimulatie. Stel runs/trial op 1 en sweeps/run op 1.
   5. Stel de sweep-duur in op 4 seconden langer dan de totale experimentele duur. Voor een 120 s STP-protocol (60 s PPF + 60 s PPD), stel de sweep-duur in op 124 s om 2 s pre- en post-stimulus baseline mogelijk te maken.
   6. Wijs in het tabblad Ingangen het opnamekanaal toe aan de huidige ingang. Wijs in het tabblad Uitgangen het stimulatiekanaal toe aan de spanningsuitgang die de elektroden aanstuurt.
   7. Open het tabblad Waveform . In kolom A zet je Type op Stap, Eerste Niveau op 0 mV en Eerste Duur op 2000 ms om een pre-stimulatiebaseline te definiëren.
   8. In kolom B (PPF) zet je Type op Step. Specificeer de gewenste spanningsamplitude (bijv. +100 mV), pulsduur (bijv. 100 ms) en Treinsnelheid om het interval tussen pulsen in te stellen dat overeenkomt met de doelduty cycle (bijv. 90,9%).
   9. In kolom C (PPD) zet je op vergelijkbare wijze Type op Step met dezelfde amplitude en pulsduur, maar verhoog je de treinsnelheid of interpulsinterval om de gewenste lagere duty cycle te bereiken (bijv. 28,6%).
   10. In kolom D configureer je een post-stimulatiebaseline identiek aan kolom A (0 mV, 2000 ms).
       OPMERKING: Als de totale duur van alle epochs in het tabblad Golfvorm groter is dan de sweepduur in het tabblad Modus/Snelheid , verhoog dan de sweep-duur iets totdat de fout is opgelost.
   11. Sla het protocol op met een beschrijvende naam (bijvoorbeeld "STP_120s").
   12. Begin met video-opname en start direct elektrische acquisitie/stimulatie door op de rode cirkel "Opnemen"-knop te klikken om data op te nemen. Alternatief kunt u een digitale trigger zo instellen dat het stimulatie-begin gelijktijdig de video-opname en elektrische opname activeert.
   13. Voor de eerste 60 seconden van stimulatie (PPF) neemt de gemeten stroomrespons doorgaans toe vanaf de eerste puls en kan een zichtbaar plateau bereiken met t = 60 s, terwijl voor de laatste 60 seconden van stimulatie (PPD) de gemeten stroomrespons doorgaans afneemt (Figuur 5). Stop aan het einde van het protocol gelijktijdig met elektrische acquisitie en video-opname.
2. Enkelkanaalexperimenten
   1. Op het voorpaneel van de patchclampversterker zet je de External Command Input-schakelaar op UIT. Stel de houdspanning in op +200 mV. Stel het ingebouwde laagdoorlaatfilter van de versterker in op 1 kHz. Stel in de acquisitiesoftware de bemonsteringssnelheid in op 10–50 kHz en kies een continue "gap-free" opnamemodus.
      OPMERKING: Hoge bemonsteringsfrequenties kunnen de signaal-ruisverhouding van de verkregen data verminderen. Het gebruik van hogere bemonsteringsfrequenties bij het oplossen van snelle gating-overgangen of kortstondige flikkerende toestanden is belangrijk. De gemiddelde open levensduur van gramicidine A ligt doorgaans tussen 0,1 s en 10 s, terwijl flikkerende toestanden kunnen optreden op sub-ms en μs tijdschalen; daarom kunnen bemonsteringssnelheden van ~50 kHz nodig zijn om dergelijke gebeurtenissen³⁶ vast te leggen. Latere enkelkanaals idealisatieanalyse met JSMURF maakt robuuste gebeurtenisdetectie mogelijk in opnames met variabele signaal-ruisverhoudingen³⁷.
   2. Zonder externe opdracht wordt geactiveerd, begin met het opnemen van het basisstroomsignaal. Op de versterker schakelt u het spanningscommando van UIT naar "+" om een +200 mV DC-spanning over de DIB toe te passen.
   3. Record voor ~15 s om enkelkanaalsgebeurtenissen vast te leggen terwijl baseline drift wordt beperkt. Bij de lipid:gA-molaire concentratie van 1:5×^10-6 _{lijkt de} geregistreerde stroom stapvormig door de vorming en eliminatie van kanaalconductantie-gating.
   4. Voordat je de opname stopt, zet je het Voltage Command van "+" terug naar UIT. Stop met gegevensverzameling en sla de opname op met een beschrijvende bestandsnaam (bijv. "DIB_C16_postPPF_200mV.abf").
      OPMERKING: Enkelkanaalopnames van bepaalde duur kunnen ook worden uitgevoerd via een geprogrammeerde episodische stimulatie, met vaste amplitude en duur zoals beschreven in sectie 8 voor PPF/PPD. Voor "post-PPF" enkelkanaalsexperimenten wordt episodische stimulatie met een +200 mV DC-spanning direct na de 60 seconden PPF gepiggybacked.

9. Membraanoppervlak en flux-extrapolatie

1. Aan het einde van elk ensemble-experiment (STP, LTP/LTD) beweeg je langzaam één elektrode lateraal met de micromanipulatoren om de DIB los te koppelen.
2. Maak de houder van de micromanipulator-elektrode los en draai de elektrode in zijn houder met ~45° zodat de zilverdraad van 125 μm in het beeldvormingsvlak ligt.
3. Stel de elektrodehoogte aan totdat de draad scherp scherp is onder de microscoop. Maak een stilstaande afbeelding of screenshot van de gefocuste zilverdraad met de camerasoftware. Bewaar de schaalafbeelding voor latere kalibratie van de pixelgrootte tot millimeters.
4. Verwerk de opgenomen stroomsporen volgens procedures beschreven in ref. 28 om continue, artefactvrije stroom-tegen-tijdgegevens te verkrijgen (Figuur 6A).
5. Bepaal de frame-to-time mapping door frame-indices te delen door de gemeten framerate en het te matchen met de verwervingstijdstempels.
6. Importeer het kalibratiebeeld van de schaal en de experimentele frames in beeldanalysesoftware.
7. Gebruik de bekende draaddiameter (125 μm) uit het kalibratiebeeld van de schaal om de ruimtelijke schaal in te stellen met behulp van de softwarekalibratiefunctie (Analyze > Set Scale).
8. Voor fluxberekeningen voor elk experiment kies je N tijdspunten die de totale stimulatieperiode beslaan (bijvoorbeeld 30 tijdspunten over het 120 seconden experiment). Zorg ervoor dat het eerste tijdstip overeenkomt met de eerste stimuluspuls.
9. Meet op elk tijdstip de diameter van de DIB door een lijn te trekken over het kruispunt van de bilayer en de lengte ervan in gekalibreerde eenheden te registreren.
10. Zet elke gemeten diameter om in membraanoppervlak (A), uitgaande van cirkelvormige geometrie of gebruik de juiste geometrische schaalfactor voor de specifieke lipide-olieconfiguratie. Gebruik de resulterende gebieden om de evolutie van membraangebieden in de tijd te beoordelen voor verschillende experimentele omstandigheden (Figuur 6B).
11. Voor elk tijdstip deel je de overeenkomstige stroomwaarde door het oppervlak om flux (I/A) te verkrijgen. Divisie alle N fluxdatapunten door de eerste fluxwaarde om flux te verkrijgen die genormaliseerd is naar de eerste puls, (I/A) / (I₀/A₀), wanneer genormaliseerde fluxanalyse gewenst is (Figuur 6C).
12. Plot flux of genormaliseerde flux versus tijd of pulsgetal versus tijd. Herhaalde fluxanalyse voor alle ensemble-experimenten (STP, LTP/LTD) (Figuur 6D).
13. Interpreteer aanhoudende verhogingen van flux of genormaliseerde flux ten opzichte van de eerste puls tijdens PPD of langer dan 2 minuten als verbeterde geleiding, terwijl terugkeer naar de basislijn of dalingen onder de waarde van de eerste puls een verlaagde geleiding aangeeft. Gebruik de resulterende tijdschalen om reacties te classificeren als kortetermijn-plasticiteitsachtig gedrag (<2 min) of langetermijnpotentiatie- / depressieachtig gedrag (> ~5 min).

10. Enkelkanaalanalyse

1. Importeer ruwe single-channel opnames in een voorkeursanalyseomgeving of de clampSeg-interface en raadpleeg³⁷ voor volledige beschrijvingen en uitleg van softwarefuncties.
2. Pas een digitaal laagdoorlaatfilter toe dat overeenkomt met het experimentele verwervingsfilter (bijv. 1 kHz Bessel).
3. Parameterconfiguratie.
   1. Stel alfa (α) = 0,05 in, waarbij het statistische betrouwbaarheidsniveau wordt gedefinieerd zodat elke gedetecteerde stap <5% kans heeft om een willekeurige ruisfluctuatie te zijn.
   2. Specificeer 5.000-10.000 Monte Carlo-iteraties per segment van één seconde om de ruisverdeling te schatten en de statistische robuustheid van gebeurtenisdetectie te verbeteren.
      OPMERKING: Gebruik parallelle computationele verwerking in 1 s "chunks" indien beschikbaar, om de analysetijd te verkorten.
   3. Voer het JSMURF-algoritme uit op de gefilterde stroomtrace.
4. Modelvalidatie.
   1. Leg de geïdealiseerde (vierkantgolf) geleidingsspoor over de gefilterde stroomspoor en bevestig visueel dat stapovergangen samenvallen met abrupte veranderingen in het experimentele signaal.
   2. Gebruik de bekende laagdoorlaatfilterkenmerken om een geconvolveerde reconstructie van de geïdealiseerde spoor te genereren en leg deze over de ruwe spoor³⁷. Bevestig dat het gereconstrueerde signaal nauwkeurig overeenkomt met de timing en amplitude-envelope van de geregistreerde stroom.
5. Kwantificering van geleiding en levensduur.
   1. Definieer het laagste stabiele plateau in de geïdealiseerde spoor als de gesloten basistoestand. Identificeer de eerste niet-nul plateauamplitude als de primaire open-state geleiding (enkelkanaalniveau).
   2. Classificeer hogere gehele veelvouden van deze amplitude als multi-kanaals open toestanden (2+, 3+, enz.). Identificeer tussenplateaus die stabiel zijn maar lager dan volledig open niveaus als subconductantietoestanden.
   3. Haal de amplitude en duur van elk evenement uit de geïdealiseerde trace en pak ze in om geleidingsamplitude-histogrammen en levensduurhistogrammen te genereren.
6. Amplitudehistogrammen en levensduurverdelingen
   1. Vergelijk de geïdealiseerde conductantie-amplitude-histogrammen met amplitude-histogrammen die direct uit de gefilterde data worden gegenereerd. Bevestig dat de geïdealiseerde histogrammen scherpere, beter gescheiden pieken tonen die overeenkomen met discrete geleidingstoestanden³⁷.
   2. Voor elke experimentele voorwaarde bereken je de overlevingsfunctie N(t)/N(0), waarbij N(0) het totale aantal open gebeurtenissen (volledig en subconductantie) is en N(t) het aantal gebeurtenissen met een duur langer dan t. Sluit gesloten-toestandsintervallen uit van deze analyse.
   3. Plot N(t)/N(0) versus tijd en pas exponentiële vervalfuncties aan met behulp van een niet-lineaire kleinste-kwadraten-routine in een voorkeurssoftware.
   4. Interpreteer rechtsverschuivingen in pieken van de conductantieverdeling in amplitudehistogrammen als verhoogde conductantie, langere vervaltijdconstanten in N(t)/N(0) versus tijdplotten als verhoogde opentoestandstabiliteit, en linksverschoven verdelingen als kortere kanaallevensduur.
      OPMERKING: Minimaliseer omgevingsverstoringen zoals luchtstromen, trillingen en bewegende objecten in de buurt. Vermijd leunen op de optische tafel en houd gesprekken weg van de experimentele opstelling. Houd mobiele telefoons, tablets, laptops en andere persoonlijke elektronische apparaten minstens 1,5 meter van de Faraday-kooi om elektromagnetische interferentie te verminderen. Gebruik een optisch helder oliereservoir en optimaliseer de belichting en het contrast van de microscoop om de randen van druppels en dubbellagen te verscherpen. Verkrijg en/of exporteer video's in grijswaarden als dit het grensverschil verbetert en handmatige metingen van de DIB-diameter vereenvoudigt. Voor experimenten die geen temperatuureffecten onderzoeken, zorg ervoor dat de laboratoriumomgeving, de microscoopstandaard en de olie op 21–22 °C worden gehouden.

Results

DIB experimentele opstelling
Het opnamesysteem is ondergebracht in een Faraday-kooi op een anti-trillingstafel, met elektrische en videogegevens verzameld door twee aparte computers (Figuur 1A), hoewel één computer met split-screen mogelijkheid kan worden gebruikt. De DIB-monsteromgeving bestaat uit twee met agarose gecoate elektroden die zijn ondergedompeld in een gedefinieerd volume alkaanolie (Figuur 1B). Figuur 1C toont een schema van de essentiële elektrische en optische verbindingen voor de experimentele opstelling die in dit manuscript wordt beschreven.

Figuur 1: Experimentele opstelling. (A) Anti-trillingstafel en Faraday-kooibehuizing met belangrijke componenten aangegeven, waaronder versterker, digitizer, ruisfilter, functiegeneratoren en een dual-computerinterface voor elektrische en video-opname. (B) Bovenaan beeld van de omgeving en elektroden van het DIB-monster. (C) Schema van elektrische en optische verbindingen die verband houden met de experimentele opstelling beschreven in dit manuscript. Alle afzonderlijke componenten delen een gemeenschappelijke basis in het laboratoriumgebouw. Alle experimenten werden uitgevoerd bij kamertemperatuur (21–22 °C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Voorbereiding en kwaliteitscontrole van Ag/AgCl-elektroden
Het smelten van de zilverdraadpunt vormt een bolvormige bal (Figuur 2A); slechtwaardige smelten lijken langwerpig of onregelmatig. Chlorering in bleekmiddel produceert een dof bruingrijs Ag/AgCl-oppervlak (Figuur 2B). Een dunne, uniforme agaroselaag van ongeveer tientallen micrometers dik op de bal is essentieel voor stabiele druppelondersteuning en elektrochemische koppeling met lage impedantie, terwijl een ongelijke coating leidt tot slechte druppelhechting (Figuur 2C).

Figuur 2: Elektrodevoorbereiding. (A) Microscoopbeelden van goede en slechte kwaliteit elektrodesmelten. (B) Vergelijking van niet-gechloreerde en gechloreerde elektrodekoppen. (C) Voorbeelden van goede en slechte kwaliteit agarosecoatings. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Elektrode-opstelling. (A) Bovenaanzicht van de hoek van gemonteerde elektroden. (B) Zijaanzicht van het vergelijken van niet-doorzakkende druppels direct na LUV-belasting met doorzakkende druppels na monolaagvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Positionering van elektroden en het doorzakken van de druppel
Top-down weergaven tonen de juiste hoekpositie van elektroden om optische vervorming te minimaliseren (Figuur 3A). Zijaanzichten vergelijken niet-doorhangende (direct na het laden van de LUV-oplossing) en slappe lipidenbeklede druppels (na 5 minuten) (Figuur 3B). Slappe druppels die worden gebruikt om een DIB te vormen, vertonen een vertraagde fysieke reactie op beweging door een significante afname van de oppervlaktespanning van de lipidenmonolagen, wat visueel de vorming bevestigt van een suspente waterige druppel die volledig bedekt is met een lipidenmonolaag. Nadat doorzakking is gevestigd, wordt driehoekgolfstimulatie gebruikt om elektrische bevestiging van de vorming van de dubbele laag en stabiliteit^te geven.

Figuur 4: Droplet interface bilayer vorming. (A) Time-lapse sequentie die de vorming en uitzetting van de dubbele laag toont na druppelcontact. (B) Interne membraanreflectie gebruikt voor de schatting van de diameter en oppervlakte van de dubbele laag. DIB-beeldvorming wordt uitgevoerd van onder de opstelling via een omgekeerde microscoop. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

DIB-vorming en oppervlaktemeting
Opeenvolgende beelden leggen spontane dubbellaag-"rits" en gebiedsuitbreiding vast wanneer twee doorhangende druppels in contact worden gebracht (Figuur 4A). De heldere, innerlijke ovaalvormige reflecties bij het druppelcontact worden gebruikt om de diameter van de dubbellaag en daarmee de membraanoppervlakte in de tijd te schatten (Figuur 4B).

Figuur 5: STP-protocol—stimulatie en respons. Vertegenwoordigende stroomresponsen tijdens gepaarde pulsfacilitatie (PPF, 0–60 s, rood) en gepaarde pulsdepressie (PPD, 60–120 s, blauw) worden getoond (boven), samen met het bijbehorende stimulatieprotocol (onder). PPF- en PPD-pulsen duren 100 ms met uit-tijden van respectievelijk 10 ms en 250 ms, wat leidt tot duty cycles van 90,9% en 28,6%. Facilitatie komt overeen met netto toename van de ionische stroom; depressie komt overeen met netto afnames. Huidige antwoorden worden alleen geregistreerd tijdens ON-periodes; Voor visualisatie worden gegevens tussen pulsen geïnterpoleerd om de algemene trends in de huidige te benadrukken. Pulsschematische tijdslengtes en aantal pulsen binnen PPF- en PPD-fasen zijn niet op schaal getekend en worden geïllustreerd voor visualisatiedoeleinden. Representatieve current-response data gereproduceerd uit Podar PT et al.,²⁵ onder CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 De auteur(s). Uitgegeven door PNAS. Stimulatieschema aangepast voor het huidige manuscript. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Elektrisch stimulatieprotocol voor het induceren van kortdurend plasticiteitsachtig gedrag (STP-achtig)
De hier aangeduide stimulatiepatronen vertegenwoordigen gepaarde pulsfacilitatie (PPF) en depressie (PPD) in analogie met neurowetenschappelijke terminologie, vergelijkbaar met Koner en Najem ^28,29. Gepaarde-puls facilitatie (PPF; 0–60 s) en gepaarde-puls depressie (PPD; 60–120 s) worden toegediend met 100 ms pulsen met OFF-tijden van respectievelijk 10 ms en 250 ms, wat overeenkomt met duty cycles van 90,9% voor PPF en 28,6% voor PPD. Het bovenste paneel toont representatieve huidige responsen tijdens ON-periodes, terwijl het onderste paneel het stimulatiepatroon toont.

Stroom-, area- en ionenflux tijdens STP en daaropvolgende langdurige stimulatie
Genormaliseerde stroom (I/I₀) voor gA-gedopeerde DPhPC-dubbellagen in C16- en C12/C16-oliën wordt getoond tijdens PPF en PPD (Figuur 6A). Genormaliseerde membraanoppervlakte (A/A₀) gemeten op 30 tijdspunten toont een vergelijkbare oppervlakteontwikkeling in beide oliecondities, ondanks verschillende stromingen (Figuur 6B). Gegevens voor genormaliseerde stroom en gebied worden weergegeven als respectievelijk gemiddelde ± S.D.-wolken en -balken, over 28 onafhankelijke DIB's per olieconditie. Genormaliseerde flux, J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀), scheidt oppervlakte-onafhankelijke veranderingen in conductantie en is consistent met veranderingen in membraangeleiding voorbij eenvoudige oppervlakte-uitbreiding (Figuur 6C). Deze veranderingen kunnen echter bijdragen weerspiegelen van zowel enkelkanaals geleiding als het aantal actieve geleidende kanalen. Langdurige PPD-stimulatie tot 30 minuten veroorzaakt langdurig depressieachtig (LTD) gedrag in C16-membranen, maar handhaaft een verhoogde flux die consistent is met LTP-achtig gedrag in C12/C16-membranen (Figuur 6D). Samen tonen deze gegevens aan dat membraansamenstelling zowel korte- als langetermijnveranderingen in ionenflux moduleert, vergelijkbaar met plasticiteit.

Figuur 6: Stroom, oppervlakte en berekende ionische flux van DIB's tijdens STP en overgang naar LTP/LTD. (A) Genormaliseerde stroom (I/I₀) tijdens PPF (0–60 s, witte achtergrond) en PPD (60–120 s, grijze achtergrond) voor gA-gedopeerde DPhPC-membranen in C16 (oranje) en C12/C16 (blauwe) oliën, waarbij elke voorwaarde bestaat uit n = 28 onafhankelijk gevormde DIB's. (B) Genormaliseerde membraangebieden (A/A₀), gemeten op 30 tijdstippen, met vergelijkbare gebiedstrajecten ondanks verschillende stroomresponsen; gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± S.D. over dezelfde n = 28 onafhankelijke DIB's per olieconditie. (C) Genormaliseerde flux, J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀)), wordt berekend uit de bijbehorende stroom- en oppervlaktemetingen, waarbij veranderingen in conductantie buiten de oppervlakte-effecten worden benadrukt. (D) Langetermijngedrag onder langdurige PPD-stimulatie: na de initiële 120 s STP (grijs getint) werden DIB's onderworpen aan 30 minuten PPD met ON = 100 ms en OFF = 250 ms (solide rood/groen) of 30 s (oranje/grijs) pulsen. De flux neemt af naar of onder de basislijn in C16-membranen, wat wijst op LTD-achtig gedrag, maar blijft verhoogd in C12/C16-membranen, wat wijst op aanhoudend LTP-achtig gedrag. Gearceerde gebieden vertegenwoordigen de voortgezette fout van I/I₀ en A/A₀. Uitgebreide PPD-datasets in (D) werden verkregen uit n = 6 onafhankelijke DIBs per olieconditie voor het 120 s-protocol, gevolgd door 3 DIB's per uitgebreide PPD-conditie. Alle datapunten zijn alleen voor visualisatiedoeleinden verbonden. Panelen A, B en D werden gereproduceerd onder CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 De auteur(s). Uitgegeven door PNAS. Paneel C is nieuw gegenereerd voor het huidige manuscript op basis van gegevens gerapporteerd in Podar PT et al., ²⁵. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Representatieve 15 s enkelkanaals stroomtrace van een gA-gedopeerde DIB gevormd in C16-olie na PPF-stimulatie
De trace bevat het ruwe signaal dat op 50 kHz is vastgelegd met een 1 kHz laagdoorlaatfilter, een 250 Hz 8-polige Bessel-gefilterde trace, en de geïdealiseerde JSMURF-pasvorm. Het laagste stabiele niveau definieert de gesloten toestand, en hogere niveaus komen overeen met enkelkanaals-, meerkanaals- en subgeleidingsgebeurtenissen. Deze sporen vormen de basis voor de analyse van conductantie-amplitude en levensduur. De voorbeeld-conductantietoestand verblijftijd vertegenwoordigt de duur van een specifiek conductantieniveau, waarvan de amplitude en duur de gecombineerde bijdrage weerspiegelen van meerdere gelijktijdige volledige en/of subconductantiegebeurtenissen.

Verdelingen van conductantieamplitude en levensduur
Geleidingsamplitudehistogrammen voor C16- en C12/C16-membranen (Figuur 7A–B) vergelijken pre-PPF- en post-PPF-condities bij een DPhPC:gA-molarverhouding van 1:5×^10-6. Gaussiaanse benaderingen onder de gegevens geven verschuivingen aan in gemiddelde conductantiepieken na PPF en lossen afzonderlijke pieken op die overeenkomen met subconductantie en multikanaalstoestanden. Statistische vergelijkingen van conductantieverdelingen werden uitgevoerd op gepoolde gebeurtenisniveaugegevens met behulp van Welch's t-test en Mann-Whitney U-test (α = 0,05), waarbij elke voorwaarde 3 onafhankelijke DIB-opnames bestond en N voor een gegeven conductantietoestand het totale aantal gedetecteerde gebeurtenissen over die opnames aanduidde. Levenslange kansverdelingen, N(t)/N(0), voor en na (Figuur 7C–D) tonen aan dat C12/C16-membranen langerstaartige conductantieverdelingen ontwikkelen en veranderde levensduur ten opzichte van C16, wat wijst op veranderingen in kanaalstabiliteit. Histogramgegevens zijn representatief voor de gefilterde 15 s spoor (rode spoor) die voor elke aandoening is verkregen. Conductantie-toestandsverdelingen werden gegenereerd uit 3 onafhankelijke DIB-opnames per conditie; gestippelde krommen duiden individuele replica's aan, en vaste krommen duiden globale exponentiële passen aan op N(t) / N(0) versus t.

Figuur 7: Geleidingsamplitude-histogrammen en conductantie-toestand verblijftijdverdelingen. Geleidingsamplitude-histogrammen voor gA-activiteit in membranen van (A) C16 en (B) C12/C16 vergelijken pre-PPF (grijs) en post-PPF (oranje/blauw) condities bij een molaire verhouding van 5 × 10-6 gA:lipide. Gaussiaanse benaderingen onder de histogrammen geven verschuivingen aan in gemiddelde conductantiepieken en standaarddeviaties voor enkel- en meerkanaalstoestanden. Verschuivingen in gemiddelde conductantie na PPF worden aangegeven door gestippelde lijnen (zwart = pre-PPF; blauw/oranje = post-PPF) en pijlen. Elke voorwaarde vertegenwoordigt 3 onafhankelijke DIB-opnames. Statistische vergelijkingen van conductantieverdelingen werden uitgevoerd op gepoolde gebeurtenisniveaugegevens met behulp van Welch's t-test en Mann-Whitney U-test (α = 0,05), waarbij N voor een gegeven conductantietoestand het totale aantal gedetecteerde gebeurtenissen over die drie opnames aangeeft. Subconductantie-evenementen werden ook meegenomen in de analyse, waarbij representatieve subconductantieverdelingen links van de eerste open-state piek voor elke membraanconditie werden aangegeven. Levenslange kansverdelingen van conductantietoestandsgebeurtenissen in C16 (C) en C12/C16 (D) membranen vóór (oranje / blauw) en na PPF-stimulatie (donkeroranje / donkerblauw) bij 5×10-6 M gA:lipide komen overeen met de conductantie-analyses getoond in Figuur 7A–B. Hier vertegenwoordigt N(t) het cumulatieve aantal volledige en subconductantie-gebeurtenissen met duurder dan tijd t. Gestreepte lijnen duiden levenslange verdelingen aan van individuele replicaten (n = 3 onafhankelijke DIC's per conditie), en vaste insets tonen globale exponentiële fits uitgevoerd met niet-lineaire curvefittingsoftware. Panelen A–D overgenomen uit Podar PT et al., ²⁵ en samengesteld voor het huidige manuscript onder CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 De auteur(s). Uitgegeven door PNAS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Probing single-channel gedrag—current response trace voor DIBs in C16 na PPF-stimulatie. (A) Voorbeeld 15 s stroomspoor met ruwe data (blauw), gefilterd met een 250 Hz 8-polige Bessel laagdoorlaatfilter (rood), en de geïdealiseerde spoor (groen) gebruikt om geleidingstoestanden te identificeren. Het laagste stabiele niveau definieert de basistoestand van de "gesloten" toestand. (B) Representatieve subgeleidingsniveaus gedetecteerd tussen het^2e en^3e volledige geleidingsniveau, bevestigd door duidelijke tussenliggende pieken in het amplitudehistogram (zie Figuur 7A, oranje). Conductantie-verblijftijden worden afgeleid uit de duur van elk geïdentificeerd conductantieniveau (exclusief de gesloten toestand) om N(t)/N(0) levensduurverdelingen te genereren. Overgenomen uit Podar PT et al., ²⁵ onder CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 De auteur(s). Uitgegeven door PNAS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Na PPF vertonen C12/C16-membranen een uitgesproken verschuiving naar rechts in conductantie-amplitudeverdelingen, wat wijst op een verbeterde enkelkanaals conductantie, vergezeld van een linkswaartse verschuiving in conductantie-toestandslevensverdelingen, consistent met kortere kanaalopentijden. Deze veranderingen zijn consistent met elektromechanische verdunning van de C12/C16-dubbellaag tijdens PPF, zoals ondersteund door directe mechanische en diktemetingen gerapporteerd in ref. 25, die de energetische barrière voor ionentransport door gA verlaagt en de ionendoorvoer per opening verhoogt, terwijl de kanaalstabiliteit afneemt. Daarentegen vertonen C16-membranen minimale veranderingen in beide verdelingen, wat hun beperkte structurele aanpassingsvermogen benadrukt. Samen tonen deze resultaten aan dat het DIB-platform zowel ensemble- als enkelkanaalcorrelaten van membraanelektromechanische aanpassing vastlegt, inclusief STP-achtige en LTP/LTD-achtige veranderingen in ionische geleiding die voortkomen uit membraansamenstellingsafhankelijke dynamiek (Figuur 8).

Discussion

In praktische termen biedt deze methode drie belangrijke experimentele mogelijkheden: beheersbare variatie van de dubbellaagsamenstelling via de lipidensamenstelling en oliefase, gelijktijdige optische en elektrische monitoring van membraanherstructurering, en toegang tot een membraanoppervlakteregime dat single-channel elektrofysiologie en mesoschaalmembraanmechanica verbindt 14,15,20,21,25. Deze kenmerken maken de methode bijzonder nuttig voor structuur-functiestudies in vereenvoudigde membraansystemen waarbij membraanelektromechanica, in plaats van volledige cellulaire complexiteit, het experimentele perspectief van belang^is 14,15,20,21,25,39.

Dit protocol beschrijft de assemblage en analyse van gramicidine A-gedoopeerde DIB's in alkaanoliën om het vermogen van lipidemembranen te onderzoeken om te herstructureren onder fysiologisch relevante elektrische stimulatie 14,15,25,35,38. In vergelijking met patch clamp-technieken²¹ ondervraagt het DIB-platform membraanpatches die vele malen groter zijn, terwijl voldoende resolutie behouden blijft om discrete ionenkanaalgebeurtenissen vast te leggen 14,15,19,20,21,28,38. Deze mogelijkheid is bijzonder waardevol voor het oplossen van mesoschaal elektromechanische remodellering (bijvoorbeeld als elektrowetting en elektrocompressie) en het koppelen ervan aan microscopisch kanaalgedrag dat samen leidt tot STP-, LTP- en LTD-achtige membraangeleidingsfenotypes onder fysiologisch geïnspireerde stimulatie 13,25,27,38. Het huidige DIB-systeem is niet bedoeld om de moleculaire complexiteit van biologische synapsen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 te repliceren . Daarom worden termen zoals STP, LTP, LTD, PPF en PPD in een beschrijvende, analogie-gebaseerde betekenis gebruikt om korte- en langetermijnverhogingen en -afnames in membraanionische geleiding aan te duiden onder gedefinieerde stimulatieprotocollen. De belangrijkste bevindingen van dit werk worden daarom het meest direct geïnterpreteerd in termen van membraanelektromechanica, geleidingsaanpassing en samenstellingsafhankelijke niet-evenwichtsherstructurering in DIB's, wat nuttige conceptuele analogieën en fysieke perspectieven op synaptische plasticiteit kan bieden zonder mechanistische gelijkwaardigheid aan neuronale circuits of biochemische synaptische regulatie te impliceren 10,11,25,38.

Verschillende technische stappen zijn cruciaal om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Zorgvuldige voorbereiding van de Ag/AgCl-elektrode, inclusief uniforme smelting van de zilveren bolvormige punt, grondige chlorering en een dunne, gelijkmatige agaroselaag, zorgt voor stabiele druppelhechting en elektrochemische koppeling^met lage impedantie ^20,35. Visuele bevestiging van druppelszakken en correcte oriëntatie van de elektrode minimaliseert optische vervorming tijdens video-opname en verbetert de nauwkeurigheid van membraanoppervlaktemetingen. Kalibratie op schaal na acquisitie met de bekende zilverdraaddiameter biedt een robuuste pixel-naar-millimeter conversie, wat essentieel is voor betrouwbare berekening van membraanoppervlak en ionenflux. In dit werk wordt membraangeleiding (flux) gedefinieerd als stroom per oppervlakte-eenheid (I/A), en omdat het DIB-oppervlak verandert tijdens elektrowetting, vereist nauwkeurige fluxkwantificatie tijdsgematchte stroom- en dubbellaagoppervlaktemetingen ^13,25,27,35.

Deze aanpak ondersteunt ook complementaire ensemble-niveau en single-channel readouts binnen hetzelfde platform 14,15,20,25,35,38. Op ensembleniveau kwantificeren gesynchroniseerde video- en elektrische opnames dynamische veranderingen in oppervlakte (elektrowetting) en stroom, waaruit de ionische flux (stroom/oppervlakte) wordt afgeleid. Bij elektrische stimulatie worden membranen in niet-evenwichtige stationaire toestanden (NESS) gedreven, waarbij samenstellingsafhankelijke membraanherstructurering kortetermijn-plasticiteitsachtige responsen genereert die kunnen evolueren tot langere tijdschaal potentiatie- of depressieachtig gedrag over langere periodes (min)25,26,28,29,30,31,32,^33,38. Op enkelkanaalniveau omvat analyse het idealiseren van stroomsporen tot stapsgewijze geleidingsniveaus (gesloten, enkelkanaals, meerkanaals en subgeleidingstoestanden). Traditionele idealisatietools voor vierkante golf lossen doorgaans slechts een beperkt aantal discrete niveaus op; voor complexere of ruisachtige data worden modelvrije idealisatiemethoden zoals JSMURF³⁷ verkiesd. Korte DC-houdpotentialen geanalyseerd met JSMURF bieden statistisch rigoureuze gebeurtenisdetectie onder heterogene ruis, wat leidt tot geleidingsamplitude-histogrammen (gehele en subconductantieniveaus) en N(t)/N(0) levensduurverdelingen. Het overleggen van geïdealiseerde en gefilterde amplitudehistogrammen maakt visuele en kwantitatieve kruisvalidatie van conductantie-toestandtoewijzingen mogelijk, terwijl geconvolueerde reconstructies (geïdealiseerde sporen die door het bekende laagdoorlaatfilter worden gehaald) parameterkeuzes en gebeurtenisnauwkeurigheid³⁷ bevestigen.

De membraansamenstelling, hier afgestemd via de omringende oliefase (bijv. C16 versus C12/C16), wordt verwacht de viscoelasticiteit en herstructureringscapaciteit van de dubbele laag onder elektrische stimulatie te moduleren, in overeenstemming met directe metingen gerapporteerd in eerder werk 22,25,39. Meer conforme membranen zullen naar verwachting grotere EC-gedreven dunner worden en verbeterde hydrofobe matching met gA vertonen tijdens PPF 22,23,25, wat leidt tot een verhoogde enkelkanaalgeleiding en facilitatie die kan stabiliseren als LTP-achtig gedrag ^25,38. Omgekeerd vertonen stijvere membranen beperkte structurele responsiviteit, kleinere geleidingsveranderingen tijdens PPF en PPD, en een neiging tot LTD bij langdurige pulsering. Deze samenstellingsafhankelijke uitkomsten benadrukken hoe materiaaleigenschappen membranen prediscrimineren voor verschillende, functioneel relevante langetermijnregimes 22,23,25,39.

Het DIB-platform heeft ook belangrijke beperkingen²¹. De mechanistische interpretatie die hier wordt gepresenteerd, is dat verschillen in oliesamenstelling de eigenschappen van het bilayer en de gevoeligheid voor elektromechanische herstructurering veranderen, wat op zijn beurt de geleiding van gramicidin A^moduleert 22,23,25. Deze interpretatie wordt ondersteund door de eerdere studie, die direct de viscoelasticiteit van het membraan, de interfaciale spanning en dynamische veranderingen in de membraandikte onder deze membraancondities en stimulatie^mat. In het huidige werk werden deze materiaaleigenschappen echter niet gelijktijdig gemeten in elk experiment en worden ze hier gebruikt om de verschillende structurele en mechanische reacties op elektrische stimulatie van membranen in C16- en C12/C16-omgevingen te ondersteunen, in plaats van onafhankelijk de mechanistische interpretatie van de data vast te stellen. Daarnaast kunnen ensemblestroom en flux zowel veranderingen in enkelkanaalgeleiding als veranderingen in het aantal geleidende kanalen weerspiegelen, wat kan variëren met membraanoppervlakte, peptidediffusie en dimerisatie onder niet-evenwichtsomstandigheden 17,18,22,23. De omringende oliefase kan tijdens stimulatie ook dynamisch infiltreren of terugtrekken uit de dubbellaagkern, wat bijdraagt aan baseline drift bij single-channel opnames en geleidelijke veranderingen in membraansamenstelling in de tijd 13,21,25. Samen beperken deze factoren het gebruik van langdurige constante-spanningsopnames voor het definiëren van statische membraaneigenschappen en benadrukken ze dat DIB's zich gedragen als open, dynamische systemen in plaats van gesloten evenwichtsmembranen 13,21,25. Dus, hoewel het huidige protocol stimulatieafhankelijke, plasticiteitsachtige veranderingen in geleiding over de beoogde experimentele tijdschalen^{vastlegt, zullen} toekomstige studies die directe mechanische metingen combineren met gelijktijdige elektrische en optische opnames, mogelijk naast fluorescentie-gebaseerde enkelmolecuulbeeldvorming, nodig zijn om de respectievelijke bijdragen van membraanherstructurering, kanaalconductantie en kanaalpopulatie volledig te kunnen oplossen^21,25.

Veelvoorkomende faalmodi zijn onstabiele druppelhechting, onvolledige druppelzakking, voortijdige druppelcoalescentie tijdens de vorming van de dubbellaag, en een slechte optische definitie van de dubbellaagrand tijdens gebiedsanalyse. Onstabiele druppelhechting wordt vaak veroorzaakt door onregelmatige zilveren bolgeometrie of een ongelijke agarosecoating en kan worden verminderd door de balsymmetrie te controleren en een gladde agaroseschil te behouden. Elektrodebelasting vereist ook handmatige deponering van waterige druppels ter grootte van nanoliter op een submilimeter-elektrodekop, wat aanzienlijke hand-oogcoördinatie en dieptewaarneming vereist over media met verschillende brekingsindices (lucht versus olie). Hierdoor kan de pipettip onbedoeld contact maken met de agaroseschaal of de elektrodekop missen tijdens het doseren. Stabiliteitsversterkende technieken zoals polsbracing, langzame pipetbeweging in olie en ademhouden, samen met herhaalde oefening, kunnen de laadvaardigheid verbeteren. Bovendien kan onvolledige doorzakking of vertraagde monolaagvorming het gevolg zijn van heterogeniteit van blaasjes, temperatuurvariatie of agarosetopografie en kan worden verbeterd door de wachttijd na druppelafzetting 15,20,35 te verlengen. Coalescentie tijdens de vorming van de dubbellaag wordt vaak geassocieerd met een overmatig contactoppervlak of te agressieve elektrische stimulatie (> ± 200 mV) en kan worden verminderd door kleinere initiële druppelcontactoppervlakken te gebruiken, wat extra tijd biedt voor monolaagstabilisatie en het verifiëren van de laag-amplitude driehoeksgolf-capaciteitsrespons vóór het pulsen^van 25,35,38.

Ondanks deze beperkingen is het DIB-platform zeer afstelbaar, schaalbaar en reproduceerbaar 14,15,20,21,25,35,38,40, en het vult eiwitcentrische elektrofysiologie aan door de bijdrage van lipidemechanica aan geleiding te isoleren 22,23,25. Door ensemble- en single-channel metingen in één systeem te verenigen, biedt dit protocol een praktische manier om te analyseren hoe elektrische werking en membraanviscoelasticiteit samenwerken om synaptisch-achtig geleidend gedrag (STP-achtig, LTP-achtig en LTD-achtig respons) te produceren in een beheersbaar, bottom-up model 25,29,30,31,32,33,33,38. Als zodanig biedt de methodologie een basis voor systematische verkenning van samenstellingsafhankelijke leerregels in membranen en voor het kwantificeren van hoe mechanische en elektrische krachten membraaneiwitten koppelen aan hun gastdubbellaag over temporele en ruimtelijke schalen 21,22,23,25. Gezamenlijk positioneren deze capaciteiten DIB's als een krachtig kader om complexe neurobiologische gedragingen te deconstrueren in hanteerbare, testbare biofysische mechanismen 10,11,25,38.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)	Avanti Polar Lipids	850356P/850356C	Purchased as lyophilized powder (P) or in chloroform (C)
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Agarose (0.5g Agarose Tablets)	Benchmark	A2501	You can either use the powder form or the tablets
Agilent Technologies 33522A waveform generator	Keysight	–	You can use any waveform generator with BNC cable outputs
Argon (Ar) gas	Airgas	AR UHP300; 72-402221259-1	Argon Compressed; Ultra High Purity
Analytical balance	Mettler Toledo	Model: MS304S/03	Any lab-grade analytical balance with precision of 0.0001 g
Axopatch 200B Amplifier	Molecular Devices	–
BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator	Digi-Key	BK4017B-ND
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Clampex pCLAMP 11 Software Suite	Molecular Devices	–
DigiData 1550B system	Molecular Devices	–	This includes a mini-extruder, 2 syringes, 100 PC membranes, 100 filter supports, and 1 holder/heating block
Dodecane, 99%	Sigma-Aldrich	112-40-3
Extruder Set With Holder/Heating Block	Avanti Polar Lipids	610000
Fiji software	ImageJ	–
Freezer (-80 °C)	Fisher Scientific	Isotemp; Model: 8964; S/N: 828278-21
Glassware	VWR International	–
Gramicidin-A	Millipore Sigma	368020
Hexadecane, 99%	Sigma-Aldrich	544-76-3
Hum Bug Noise Eliminator (60Hz)	A-M Systems	726300
Inverted Microscope System (Nikon Ti2-A)	Nikon	–	Any inverted or upright microscope may be used
Isopropyl Alcohol	VWR International	BDH1133-4LP
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MEH1S
Micromanipulators	Sutter Instrument	MP-285	Manual manipulators may be used
Microscope Camera	Olympus	DP74
Microsoft Excel	Microsoft	–
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
NIS-Elements Microscope Camera Software	Nikon	–	Camera capture software with live-view and/or video capability may be used. Live-view and simultaneous screen recording may be used to substitute for video capture.
Parafilm M All-Purpose Laboratory Film	Parafilm	PM999
Petri Dish	-	-	The dish must be transparent on the bottom and ideally the side wall too
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves	VWR International	CA89-38-272
Refrigirator (4 °C)	Fisher Scientific	CAT NO: 97-938-1; Model NO: 3556FS
Silver wire	GoodFellow	147-346-94
Stirring Hot Plate	Thermo Scientific	SP131325