Individuele cellen uit vroege embryo's van Xenopus isoleren en sorteren op grootte

Samenvatting

We beschrijven een methode om losse cellen uit vroege embryo's van Xenopus laevis te isoleren en deze te sorteren op celgrootte.

Samenvatting

Vroege embryogenese vereist een exponentiële afname van de celgrootte, terwijl het embryo in de vroegste ontwikkelingsstadia constant van grootte blijft. Het functionele belang en de mechanismen waarmee celgrootte de embryoontwikkeling beïnvloedt, zijn nog grotendeels onderbelicht. Het vroege Xenopus-embryo biedt een uniek systeem om deze grote hiaten aan te pakken. In vergelijking met andere modelorganismen is het vroege Xenopus-embryo extreem groot en bevat het een celgroottegradiënt, van kleine cellen bij de dierlijke pool tot grote cellen bij de plantaardige pool, over het hele embryo in stadia rond de midden-blastula-overgang. Hier beschrijven we een protocol voor het dissociëren van losse cellen van vroege embryo's van Xenopus en het sorteren op grootte met behulp van celstrainers met verschillende poriegroottes van het gaas. Zoals bepaald door beeldvorming en groottemetingen, bevinden de gesorteerde cellen zich binnen het verwachte groottebereik en kunnen ze worden gebruikt voor live-celanalyse of sequencing, of worden vastgesteld voor beeldvorming. Dit systeem zal nieuw licht werpen op het onthullen van grootte-afhankelijke reguleringsmechanismen tijdens de vroege ontwikkeling.

Inleiding

Verandering in celgrootte is een veelvoorkomend kenmerk van vroege embryogenese, wanneer de bevruchte eicel meerdere rondes van splijting ondergaat, waardoor een toenemend aantal cellen ontstaat. Hoewel er veel bekend is over de rol van celgrootte als belangrijke parameter die cellulaire functies ^{beheerst 1,2,3}, is het minder bekend hoe celgrootte de vroege ontwikkeling beïnvloedt. Recent onderzoek in verschillende modelembryonale systemen suggereert dat celgrootte de zygotische genoomactivatie (ZGA)⁴ en celfatespecificatie⁵ reguleert, wat een belangrijke rol voor celgrootte ondersteunt bij ontwikkelingsbeslissingen ^6,7.

Het vroege Xenopus-embryo is een belangrijk model voor het bestuderen van door celgrootte gereguleerde ontwikkelingsbeslissingen. Omdat het vroege Xenopus-embryo groot is (~1,2 mm in diameter), is het gemakkelijk fysiek te manipuleren met de grootte, wat het nuttig maakt voor het beoordelen van de directe gevolgen van verandering in celgrootte. Zo kunnen mini-embryo's van verschillende groottes worden gegenereerd door samentrekking van 1-cel embryo's met haarlussen ^4,8, waarmee dose-afhankelijke ZGA⁴ wordt aangetoond. Bovendien bevat het vroege embryo van Xenopus een gradiënt van celgroottes langs de dier-plantaardige as, met de kleinste cellen aan de dierlijke pool en de grootste cellen aan de plantaardige pool, wat een verschil van meer dan 100 keer in volume⁴ aantoont. Belangrijk is dat we, door direct beginnende transcripten in individuele cellen van hele mount-embryo's te visualiseren en te kwantificeren, een celgroottedrempel hebben geïdentificeerd die ZGA⁴ reguleert. Bovendien bevestigde isolatie van individuele cellen uit vroege embryo's van Xenopus en het sorteren op grootte het belang van de celgrootte-drempel ZGA⁴.

Hier beschrijven we de gedetailleerde procedures voor het isoleren van losse cellen uit vroege embryo's van Xenopus laevis en het sorteren ervan op grootte. Vroege embryo's van Xenopus kunnen worden gedissocieerd in individuele cellen door ze te incuberen in Ca²⁺, Mg²⁺-vrij medium (CMFM)⁹, en deze losse cellen kunnen verder worden gesorteerd met behulp van celszeven met verschillende poriegroottes van het gaas. De gesorteerde cellen kunnen worden gezuiverd en in verschillende toepassingen worden gebruikt, waaronder live celanalyse, sequencing of beeldvormende assays.

Protocol

Het hier beschreven dierenwerk is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of South Carolina.

1. Oplossingsvoorbereiding

OPMERKING: Bereid de volgende oplossingen voor voordat je het protocol start.

1. Bereid 20× MMR voor: Meng 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl₂ en 40 mM CaCl₂. Stel de pH in op 7,8 met NaOH. Autoclaaf en bewaren op kamertemperatuur.
2. Bereid Ca²⁺, Mg²⁺-vrij medium (CMFM): Mix 50,3 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 9,2 mM Na₂HPO₄, 0,9 mM KH₂PO₄, 2,4 mM NaHCO₃ en 1,0 mM EDTA. Stel de pH indien nodig aan naar 7,4. Autoclaaf en bewaren op kamertemperatuur.
3. Bereid een 1,5% agarosegel voor in een 60 mm petrischaal: Voeg 0,75 g agarose toe aan 50 mL CMFM. Verhit om de agarose op te lossen in een magnetron. Voeg 5-10 ml agarosegel toe om een dunne laag te bedekken in een petrischaal van 60 mm.
4. Bereid een 15% dichtheidsgradiënt medium (wt/vol)/CMFM voor: Voeg langzaam 15 g dichtheidsgradiënt medium toe aan 100 mL CMFM. Om het oplossen te vergemakkelijken, verhit en roer je op een bord totdat het dichtheidsgradiëntmedium volledig is opgelost. Houd de oplossing op 4 °C tot gebruik.
5. Bereid 4% PFA/1 voor× MEM: Meng 1 buisje (10 mL) van 16% paraformaldehydevoorraad en 4 mL van 10× MEM (1000 mM MOPS pH 7,4, 20 mM EGTA en 10 mM MgSO₄). Voeg ultrazuiver water toe aan 40 mL.
   OPMERKING: Om Xenopus-embryo's te verkrijgen, volg een standaardprotocol voor het uitvoeren van in-vitrofertilisatie (IVF) (zie bijvoorbeeld Sive et al., 2007)¹⁰. Het embryo zou in 0,1× MMR klaar moeten zijn voor gebruik.

2. Het dissociëren van vroege embryo's in enkele cellen

1. Voeg ~15 mL CMFM toe aan een nieuwe 60 mm petrischaal bedekt met 1,5% agarosegel. Gebruik een plastic transferpipet om 10-100 embryo's (afhankelijk van de experimentele behoeften) in de schaal te plaatsen. Leg de schotel onder een stereomicroscoop.
2. Gebruik een pincet in beide handen om het vitrolinemembraan voorzichtig te verwijderen door het met één pincet op het oppervlak van de embryo's te vangen en met het andere af te pellen. Voorkom dat de embryo's beschadigd raken tijdens het proces.
3. Incubeer de devitellined embryo's in de CMFM gedurende ~1 uur bij kamertemperatuur. Schud het gerecht heel voorzichtig elke 5 minuten om de dissociatie van cellen te bevorderen. Controleer regelmatig totdat er geen stapels blastomeren meer worden gezien (Figuur 1).

3. Het sorteren van de gedissocieerde cellen op grootte

1. Tijdens de blastomeerdissociatie dompel je de celkleurstoffen (40 μm, 70 μm en 100 μm) onder in individuele petrischalen gevuld met CMFM (Figuur 2). Plaats de gerechten in de volgorde van links naar rechts zoals aangegeven. Voeg ook twee extra CMFM-gevulde schalen tussen de groepen toe voor een korte afname van celkleurstoffen tijdens elke sortering.
2. Draai het gerecht met de geïsoleerde enkele blastomeren voorzichtig om ze in het midden van het gerecht te verrijken. Breng de blastomeren voorzichtig over in de 40 μm kleuring in CMFM.
3. Schud het zeef voorzichtig een paar keer zodat de blastomeren < 40 μm door de zeef kunnen zakken. Vervolgens snel de 40 μm zeef naar de met CMFM gevulde schaal voor een korte wasbeurt. Breng de blastomeren in de 40 μm zef, die > 40 μm zijn, over in de 70 μm zef.
4. Herhaal de stappen totdat de blastomeren in de 100 μm zeef zijn gesorteerd.
5. Draai elk gerecht voorzichtig met gesorteerde blastomeren om het in het midden van het gerecht te verrijken. Breng de blastomeren (~4 mL) zorgvuldig over op de bovenkant van 0,5 mL van een 15% dichtheidsgradiëntmedium in een fluorescentie-geactiveerde celsorteerbuis (FACS) (Figuur 3). Vermijd het mengen.
6. Laat de buis 10 minuten staan. De intacte blastomeren zullen door de zwaartekracht naar de bodem zakken, waarbij ze zich tijdens het sorteren en overdragen scheiden van de dooierklodders van de gebarsten blastomeren (Figuur 3).
7. Afhankelijk van het doel van downstream experimenten, ga je door met live celanalyse, vries de blastomeren in vloeibare stikstof voor RNA-werk, of fixeer je de blastomeren voor immunokleuring (Figuur 3).

Resultaten

Xenopus laevis-embryo's (n = 50) in stadium 9 werden geïncubeerd in het CMFM-medium om te dissociëren in enkele blastomeren volgens dit protocol (zie een voorbeeld in Figuur 1). De gedissocieerde enkele blastomeren werden sequentieel gesorteerd met behulp van de hierboven beschreven 40 μm, 70 μm en 100 μm celstrainers. De ongesorteerde controlemix en hij sorteerde enkele blastomeren werden vastgesteld in 4% paraformaldehyde en onder een bright-field...

Discussie

Celgrootte is fundamenteel belangrijk voor cellulaire functies³, en de impact ervan op de vroege ontwikkeling vereist meer aandacht in modelembryonale systemen. Hier hebben we de details beschreven voor het isoleren van losse cellen uit vroege embryo's van Xenopus laevis en het sorteren van de cellen op grootte met behulp van celfilters, mogelijk toepasbaar voor celgroottestudies. Deze methode heeft ons in staat gesteld direct bewijs te leveren van groott...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
16% Paraformaldehyde (PFA)	EMS	15710-S	Voor het maken van de fixeervloeistof
60 mm Wegwerp Petri-schotels	VWR	25384-092	Voor het incuberen van embryo's
ACCU-SCOPE 3075 Zoom Stereomicroscopen	VWR	470351-130	Voor het visualiseren van embryo's
Agarose	Sigma-Aldrich	A-9414	Voor het coaten van petrischalen
Celzeef, 100 µm	VWR	76327-102	Voor het sorteren van cellen op grootte
Celzeef, 40 µm	VWR	76327-098	Voor het sorteren van cellen op grootte
Celzeef, 70 µm	VWR	76327-100	Voor het sorteren van cellen op grootte
Wegwerp overdrachtspipetten	VWR	414004-035	Voor het overbrengen van embryo's
Dumont Pincet, Stijl 5	Electron Microscopy Sciences	72701-D	Voor het verwijderen van het vitelline membraan
Glazen Petri-schaal, 60 × 15 mm	VWR	75845-542	Voor het incuberen van embryo's