Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Multi-locus sequencing voor stamtypering van Toxoplasma gondii

266 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70645

⸱

26 mei 2026

 , 
1Department of Biosciences, Durham University, 2Department of Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, New Valley University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om Toxoplasma gondii-stammen snel te identificeren en te genotypen met behulp van draagbare nanopore-sequencing van geselecteerde genetische markers, waardoor schaalbare, gerichte stamidentificatie in laboratoriumonderhouden isolaten mogelijk is met mogelijke toekomstige toepassing in surveillance-omgevingen.

Samenvatting

Toxoplasma gondii is een wereldwijd verspreide apicomplexan-parasiet die wordt gekenmerkt door aanzienlijke genetische diversiteit, wat nauwkeurige moleculaire benaderingen voor stamdiscriminatie noodzakelijk maakt. Het doel van dit protocol is het opzetten van een reproduceerbare workflow voor gerichte multi-locus genotypering van gekweekte T. gondii-isolaten . De procedure omvat in vitro propagatie van representatieve Type I (RH) en Type II (ME49) stammen, extractie van genomisch DNA, locus-specifieke amplificatie van de SAG2 - en SAG3-genen , en sequencing-gebaseerde analyses om single-nucleotide polymorfismen (SNP's) en insertion/deletion (INDEL) gebeurtenissen te detecteren. Sequencinggegevens worden verwerkt om consensussequenties met hoge betrouwbaarheid te genereren en om vergelijkende uitlijning uit te voeren voor de identificatie van rek-specifieke polymorfismen. De toepassing van deze workflow op archetypische stammen toonde een hoge kaartefficiëntie, consistente leesdiepte over doelloci en nauwkeurig herstel van verwachte amplicongroottes, wat een betrouwbare detectie van genetische variatie op locusniveau bevestigde. Hoewel een uitgebreide genotypetoewijzing de opname van extra gestandaardiseerde markers vereist, biedt dit protocol een schaalbaar en reproduceerbaar kader voor gerichte genetische karakterisering van laboratoriumonderhouden T. gondii-isolaten en ondersteunt het consistente multi-locus sequentieanalyse.

Inleiding

Toxoplasma gondii is een wereldwijd verspreide apicomplexan-parasiet en een grote voedsel- en watergedragen zoönotische bedreiging, die vrijwel alle warmbloedige dieren kan infecteren, waarbij feliden de definitievegastheren vormen. Infectie bij mensen en dieren vindt vaak plaats door het innemen van weefselcysten of gesporuleerde oöcysten, en het vermogen van de parasiet om af te wisselen tussen tachyzoiet- en bradyzoietstadia maakt langdurige persistatie in neurale en spierweefsels mogelijk, wat bijdraagt aan zowel vleesgedragen als omgevingsoverdracht 2,3.

Hoewel drie klonale lijnen (Types I, II en III) domineren in Europa en Noord-Amerika, is uitgebreide genetische diversiteit, inclusief atypische en recombinante stammen, wereldwijd gedocumenteerd, vooral in regio's met rijke wildreservoirs4. Nauwkeurige discriminatie van stammen is daarom essentieel om transmissiedynamieken te verduidelijken, uitbraken te onderzoeken en regionale epidemiologie te begrijpen. Traditionele genotyperingsbenaderingen zoals PCR-RFLP, Sanger-gebaseerde multi-locus sequence typering (MLST) en microsatellietanalyse hebben aanzienlijk bijgedragen aan ons begrip van de populatiestructuur van T. gondii, maar zijn beperkt in resolutie, doorvoer en hun vermogen om intra-genotype variatie te detecteren. Deze benaderingen vereisen vaak meerdere afzonderlijke reacties en kunnen er niet in slagen inserties, deleties of complexe haplotypes binnen polymorfe loci1 te detecteren. Short-read next-generation sequencing (NGS) heeft de detectie van zeldzame varianten verbeterd, maar blijft beperkt in het identificeren van complexe structurele veranderingen4.

Long-read sequencingplatforms, met name Oxford Nanopore Technologies, bieden nu de mogelijkheid om continue, hoognauwkeurige lezingen te genereren die geschikt zijn voor het oplossen van structurele varianten en sterk polymorfe loci5. Hun draagbaarheid, realtime analysemogelijkheden en compatibiliteit met amplicon-gebaseerde workflows maken hen veelbelovende tools voor veldtoepassingen en uitbraakonderzoeken6. Ondanks deze voordelen blijven gestandaardiseerde multi-locus long-read workflows voor routinematige T. gondii-genotypering beperkt.

Om deze kloof te dichten, hebben we een schaalbare long-read amplicon sequencing-workflow opgezet die zich richt op twee polymorfe loci (Figuur 1). In combinatie met een consensus-polishing en variant-calling pijplijn maakt deze aanpak nauwkeurige detectie van SNP's en INDELs mogelijk, wat discriminatie op spanningsniveau ondersteunt. Het protocol is geschikt voor laboratoria die zijn uitgerust voor PCR-amplificatie en long-read sequencing en is gevalideerd met gekweekte isolaten. Hoewel aanpassing aan primaire klinische of omgevingsmonsters mogelijk mogelijk is, vereisen dergelijke toepassingen extra optimalisatie en validatie. Over het geheel genomen biedt deze workflow een gestructureerd kader voor gerichte moleculaire karakterisering en kan epidemiologisch onderzoek ondersteunen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie gebruikte gevestigde laboratoriumparasietenstammen en commercieel verkregen menselijke fibroblastencellijnen. Er waren geen mensen of dieren direct betrokken.

OPMERKING: Tenzij anders vermeld, worden buffers en reagentia die in dit protocol worden gebruikt geleverd binnen de commerciële kits die in de Materiaaltabel zijn vermeld.

1. Biomarkerselectie

  1. Download genomische sequenties van SAG2 en SAG3 in FASTA-formaat uit de ToxoDB (https://toxodb.org/toxo/app) genoomdatabase.
  2. Voer paargewijze sequentie-uitlijningen uit met EMBOSS Water (https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/psa/emboss_water).
  3. Selecteer amplicongebieden ≤1.600 basenparen (bp) om de sequencingtijd te minimaliseren en efficiënte PCR-versterking te garanderen.
  4. Zorg ervoor dat elk gebied informatieve SNP's of INDEL-polymorfismen bevat voor rekdifferentiatie.

2. Kweek en oogst van Toxoplasma gondii tachyzoieten

  1. Behoud van gastheercelculturen
    1. Verkrijg menselijke voorhuidfibroblasten (HFF's) van een gecertificeerde commerciële bron en kweek deze in een compleet groeimedium bestaande uit Dulbecco's Modified Eagle Medium, aangevuld met 10% foetaal rundserum en 1% penicilline-streptomycine.
    2. Incubeer culturen bij 37 °C met 5% CO₂ in een bevochtigde broedmachine.
  2. Onderhoud en uitbreiding van parasietlijnen.
    1. Infecteer fibroblastenmonolagen bij 80–90% confluentie met tachyzoïeten bij een infectiemultipliciteit van 1–3 parasieten per gastheercel. Voor een T25-fles met ongeveer 1 × 106 fibroblasten, voeg je 1–3 × 106 tachyzoïeten toe.
    2. Onderzoek culturen dagelijks met een omgekeerde lichtmicroscoop op 20× of 40× vergroting. Identificeer cellyse van gastheer door wijdverspreide monolaagverstoring te observeren.
      OPMERKING: Gebruik geen fibroblastkweken na passage 20 om kweekgerelateerde artefacten te vermijden.
    3. Oogsten van tachyzoieten.
      1. Verzamel culturen wanneer ≥90% gastheercellysis zichtbaar is.
      2. Centrifugeer op 1.300 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
      3. Sussen de pellet opnieuw in 10 mL steriele, fosfaatgebuffte zoutoplossing door zacht pipetteren, en centrifugeer opnieuw bij 1.300 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Herhaal nog een keer hier.

3. Extractie van genomisch DNA en amplicongeneratie

  1. Extraheer genomisch DNA met behulp van een op silicakolom gebaseerde genomische DNA-zuiveringskit7. Eluteer DNA in een 50 μL elutionbuffer.
  2. Meet de DNA-concentratie met een microvolumespectrofotometer.
  3. Bewaar DNA bij 4 °C voor korte termijn of −20 °C voor langdurige opslag.
  4. Bereid PCR-reacties voor met behulp van een high-fidelity DNA-polymerase mastermix, locus-specifieke primers (Aanvullende Tabel 1) en nucleasevrij water.
  5. Voer PCR-versterking uit met een gekalibreerde thermische cycler onder de volgende cyclische condities: (a) initiële denaturatie bij 98 °C gedurende 30 s, (b) 35 cycli van 98 °C gedurende 10 s; locus-specifieke annealing: 60 °C voor SAG2, 68 °C voor SAG3, 30 s; 72 °C gedurende 20 s, (c) Laatste verlenging: 72 °C voor 2 minuten.
  6. Controleer PCR-producten door elektroforese op een 1,5% agarosegel.
  7. Zuiver PCR-producten met een kolomgebaseerd PCR- en gelextractie-zuiveringssysteem volgens de instructies van de fabrikant8. Eluteer DNA in 15–20 μL elutionbuffer.
    OPMERKING: PCR-efficiëntie en opbrengst kunnen worden verminderd door lage kwaliteit en concentratie van DNA-templates of suboptimale reactieomstandigheden. Als de ampliconopbrengst laag is, controleer dan de integriteit van het DNA-sjabloon met behulp van agarosegelelektroforese en concentratie en zuiverheid met een spectrofotometer. De temperaturen en concentraties van PCR-annealing moeten ook worden geoptimaliseerd voor de gebruikte primerparen, en het PCR-cyclusnummer moet indien nodig worden verhoogd.

4. Bibliotheekvoorbereiding voor langlezing

  1. Eindreparatie en dA-tailing
    1. Ontdooi alle reagentia en meng grondig via vortex. Verdun het DNA-controlemonster met 10,5 μL eluatiebuffer alleen bij het eerste gebruik en houd het op ijs.
      OPMERKING: Draai altijd de magnetische kralen grondig in vortex voor elk gebruik.
      VOORZICHTIG: Draai de eindvoorbereidingsenzymmix niet in vortex; Meng voorzichtig door te pipetteren.
    2. Pipetteer 200 fmol (~130 ng voor een fragment van 1 kb) van elk DNA-monster in 0,2 mL PCR-buizen en pas het volume aan naar 11,5 μL met nucleasevrij water.
    3. Voeg 1 μL verdund DNA-controlemonster per buis toe en meng door 10–20 keer te pipetten.
    4. Bereid per monster een eindvoorbereidings-master mix voor met 1,75 μL reactiebuffer en 0,75 μL enzymmix (inclusief 5% overschot).
    5. Voeg 2,5 μL mastermix toe aan elk monster, mix zachtjes en draai kort weer omlaag.
    6. Incubeer in een thermische cycler bij 20 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 65 °C gedurende 5 minuten.
  2. Zuivering van eindvoorbereid DNA
    1. Breng de 15 μL-reactie over in een 1,5 mL microcentrifugebuis met lage DNA-binding.
    2. Voeg 15 μL heropgehangen magnetische kralen toe, meng voorzichtig en draai kort.
    3. Incubeer monsters op een rotatormixer gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
    4. Bereid verse 80% ethanol voor om te wassen.
    5. Plaats buizen op een magnetisch rek totdat de kralen korrel zijn en verwijder het supernatant voorzichtig.
    6. Was de pareltjes twee keer met 200 μL 80% ethanol.
      OPMERKING: Laat de kralen volledig pelleten en verwijder dan voorzichtig de ethanol.
    7. Luchtdroge kralen voor ~30 s; Vermijd te veel droog om scheuren te voorkomen.
    8. Susselt de pareltjes opnieuw in 10 μL nucleasevrij water en incubeer 2 minuten bij kamertemperatuur.
    9. Plaats buizen op een magnetisch rek en breng 10 μL eluaat over in een schoone, laag-DNA-bindende microcentrifugebuis.
    10. Meet de DNA-concentratie met 1 μL op een spectrofotometer.
  3. Native streepjescoderen
    1. Ontdooien van stomp/TA ligase master mix, EDTA, korte fragmentbuffer (SFB) en native barcodes (NB01–NB24).
    2. Wijs individuele barcodes toe aan monsters 1–24.
    3. Stel de barcode-reactie samen met 7,5 μL end-prepped DNA, 2,5 μL Native Barcode en 10 μL Blunt/TA Ligase Master Mix
    4. Meng grondig door 10–20 keer te pipetten.
    5. Incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur en beëindig de reactie met 4 μL EDTA, meng grondig door te pipetteren en draai kort af.
    6. Monsters met barcodes in een 1,5 mL laag-DNA-bindende microcentrifugebuis worden gepoold. Voeg magnetische kralen toe bij 0,4× het totale gepoolde monstervolume (bijvoorbeeld 230 μL kralen toevoegen aan 575 μL gepoold DNA). Meng grondig door te pipetteren en incubeer dan 10 minuten op een rotatormixer op kamertemperatuur.
    7. Was de kralen met 700 μL Short Fragment Buffer (SFB). Knip de kralen om ze weer te suspenderen, draai ze naar beneden, en breng het monster terug naar het magnetische rek zodat de kralen kunnen pelleten. Verwijder de buffer met een pipet en gooi hem dan weg.
    8. Herhaal de vorige stap.
    9. Draai naar beneden en plaats de buis terug op het magnetische rek. Pipetteer eventuele resterende buffer af.
    10. Verwijder de buis van het magnetische rek en suspendeer de pellet opnieuw in 35 μL nucleasevrij water door voorzichtig te klikken.
    11. Incubeer bij 37 °C gedurende 10 minuten met intermitterende menging, en breng het eluaat vervolgens over in een schone microcentrifugebuis met weinig DNA-binding.
  4. Adapterligatie en bibliotheekopschoning
    1. Stel ligatiereactie samen met 30 μL gepoold barcode-DNA, 5 μL Native Adapter, 10 μL Ligatiebuffer (5×) en 5 μL T4 DNA-ligase.
    2. Meng de reactie grondig door zachtjes te pipetten en kort naar beneden te draaien. Incubeer de reactie 20 minuten op kamertemperatuur.
    3. Voeg 20 μL hersuspendeerde magnetische kralen toe aan de reactie en meng door te pipetteren. Incubeer op een rotatormixer gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.
    4. Draai het monster en de pellet op het magnetische rek. Houd de buis op de magneet en pipette van het supernatant af.
    5. Was de kralen door 125 μL Short Fragment Buffer (SFB) toe te voegen. Knip de kralen om weer te hangen, draai naar beneden, en zet de buis dan terug in het magnetische rek en laat de kralen pelleten. Verwijder het supernatant met een pipet, en gooi het daarna weg.
    6. Herhaal de vorige stap.
    7. Draai naar beneden en plaats de buis terug op de magneet. Pipette eventuele restanten van supernatant af. Verwijder de buis van het magnetische rek en hang de pellet opnieuw in een 15 μL Elution Buffer (EB).
    8. Draai naar beneden en breng 10 minuten uit bij 37°C. Beweeg het monster elke 2 minuten door voorzichtig 10 seconden te knippen om DNA-eluatie te stimuleren.
    9. Pellet de kralen op een magneet totdat het eluaat helder en kleurloos is, minstens 1 minuut.
    10. Verwijder en bewaar 15 μL eluaat met de DNA-bibliotheek in een schone 1,5 mL laag-DNA-bindende microcentrifugebuis.
    11. Kwantificeer de uiteindelijke bibliotheek met een spectrofotometer.

5. Flowcelvoorbereiding en nanoporesequencing

  1. Voorbereiding van flowcel
    1. Inspecteer de flowcel en bevestig ≥80 actieve poriën.
    2. Bereid het primingmengsel voor door 117 μL spoeloplossing te combineren met 3 μL tetheroplossing in een microcentrifugebuis voor een totaalvolume van 120 μL. Meng voorzichtig door te pipetteren om het inbrengen van luchtbellen te voorkomen. Laad langzaam het volledige 120 μL primingmengsel in de primingpoort van de flowcell, zodat er tijdens het laden geen luchtbellen worden toegevoegd.
  2. Bibliotheekladen en sequencing
    1. Bereid de sequencingmix voor door 15 μL Sequencing Buffer (SB), 10 μL Library Beads (LIB) en 5 μL DNA-bibliotheek te combineren. Meng voorzichtig door 3–5 keer op en neer te pipetteren om bellen te voorkomen. De resulterende 30 μL sequencingmix is klaar om te laden of kan indien nodig worden aangepast naar 45 μL.
    2. Laad langzaam 30–45 μL van het sequencingmengsel in de flow cell monsterpoort door de oplossing dropwise te doseren.
      VOORZICHTIG: Vermijd het introduceren van luchtbellen en laat de pipettip het membraan niet raken. Sluit de laadpoort na het uitdelen stevig.
    3. Begin met sequencing met realtime basisroepen ingeschakeld en monitor porieactiviteit.
    4. Blijf sequencen totdat ≥500× dekking per amplicon is bereikt (aanbevolen ≥1000×), om voldoende leesdiepte te garanderen voor nauwkeurige basiscalling, betrouwbare consensussequentiegeneratie en betrouwbare detectie van laagfrequente varianten.
      OPMERKING: Als er een lage sequencing-dekking is, zorg dan voor hoogwaardige ampliconinvoer in de vereiste concentratie, voldoende actieve flowcellporiën en verleng de sequencing om de aanbevolen dekking te bereiken.

6. Dataverwerking en variantanalyse

  1. Basis-oproep en demultiplexing
    1. Voer hogenauwkeurige basisoproepen uit met behulp van platform-gerelateerde basiscallsoftware met standaard hoognauwkeurige instellingen om per sample FASTQ-bestanden te genereren. Demultiplex leest via barcode en behoudt alleen leesstoffen die door kwaliteitscontrolefilters komen.
  2. Read mapping en BAM-verwerking
    1. Download de Toxoplasma gondii referentiegenoomassemblage GCF_000006565.2 (TGA4) uit de genoomdatabase van het National Center for Biotechnology Information (NCBI). Extract chromosoom VIII (NC_031476.1) voor SAG2-analyse en chromosoom XII (NC_031480.1) voor SAG3-analyse . Indexeer de referentiesequenties met SAMtools en genereer een uitlijningsindex met een long-read alignment index builder.
    2. Map leest naar het geïndexeerde referentiegenoom met behulp van een long-read alignment-algoritme dat is geoptimaliseerd voor nanopore-sequencinggegevens (bijv. preset voor long-read mapping; -ax map-ont).
    3. Zet uitlijningsuitvoer om naar BAM-formaat, sorteer en indexeer BAM-bestanden met SAMtools. Voeg leesgroepinformatie toe aan elk BAM-bestand met behulp van Picard-tools. Bereken de gemiddelde dekking per locus met dieptestatistieken en genereer kaartstatistieken met flagstat-metrics.
  3. Consensussequentiegeneratie
    1. Genereer consensussequenties per amplicon met behulp van een neuraal netwerk-gebaseerd consensus polishing-algoritme met standaardparameters. Exporteer consensussequenties in FASTA-formaat voor downstream analyse.
    2. Voer referentiegebaseerde uitlijning en vergelijkende sequentieanalyse uit met behulp van publiek beschikbare genomische databases. Visualiseer, lees-uitlijningen en polymorfe posities met behulp van genoomvisualisatiesoftware.
  4. Variant calling
    1. Voer variantdetectie uit met behulp van een consensus-gebaseerd variant-aanroepalgoritme. Afzonderlijke polymorfismen (SNP's) en insertion/deletion events (INDELs) met behulp van variantselectietools (Supplementary File 1).
    2. Pas kwaliteitsfilterdrempels toe. Voor SNP's filtervarianten met bijvoorbeeld QD < 2.0, FS > 60.0, of MQ < 40.0. Voor INDEL's, filtervarianten met bijvoorbeeld QD < 2.0 of FS > 200.0.
    3. Comprimeren en indexeren gefilterde VCF-bestanden met standaard VCF-verwerkingstools. Genereer variantstatistieken met behulp van VCF-samenvattingshulpmiddelen.
  5. Genotype-toewijzing
    1. Extraheer locus-specifieke varianten uit de SAG2 - en SAG3-regio's en vergelijk polymorfe profielen met referentiestammensequenties om T. gondii-genotypen toe te wijzen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het genomische DNA van Toxoplasma gondii werd met succes geamplifiseerd door polymerasekettingreactie (PCR) gericht op twee genetische markers: SAG2 en SAG3 (Figuur 2). Na zuivering leverden de PCR-producten duidelijke banden op van de verwachte groottes bij agarosegelelektroforese, overeenkomend met 639 bp (SAG2) en 1158 bp (SAG3). De helderheid en consistentie van deze banden bevestigden succesvolle amplificatie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie toont het nut aan van Oxford Nanopore long-read sequencing gecombineerd met een gerichte multi-locus benadering voor snelle en betrouwbare genotypering van Toxoplasma gondii. Door te focussen op twee goed gekarakteriseerde oppervlakte-antigeenloci, SAG2 en SAG3, stellen we proof-of-concept vast voor Oxford Nanopore-gebaseerde multi-locus sequencing via vergelijkende analyses van de RH (Type I) en ME49 (Type II) stammen, waarmee het platform het verm...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door het Egyptische Ministerie van Hoger Onderwijs en Wetenschappelijk Onderzoek, vertegenwoordigd door het Egyptian Bureau for Cultural & Educational Affairs in Londen, en UKRI MRC (MR/X502947/1). Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agarose poederThermo Fisher Scientific16500100Voor gelelektroforese
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995065Celcultuurmedium
epi2me-labs/wf-amplicon Nextflow workflow (v1.2.1)Oxford Nanopore Technologies, UKN/ANextflow workflow voor het verwerken en analyseren van nanopore amplicon sequencing data; versie 1.2.1 werd gebruikt voor reproduceerbare analyse van MinION data.
epi2me-labs/wf-alignment Nextflow workflow (v1.2.3)Oxford Nanopore Technologies, UKN/ANextflow workflow voor het uitlijnen van nanopore sequencing reads op referentiesequenties en geïntegreerde visualisatie met behulp van IGV; versie 1.2.3 werd gebruikt voor reproduceerbare analyse van MinION data.
Ethyl alcohol, puurMerck Life Science51976-500ML-FVoor bead cleanup
Foetaal bovien serum (FBS)Sigma-AldrichMFCD00132239Aanvulling voor celcultuur
Flow Cell Wash KitOxford Nanopore TechnologiesEXP-WSH004Flow cell wassen
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (10 kb)Thermo Fisher ScientificSM1331Bevestiging van de grootte
HFF-1 menselijke voorhuid fibroblast cel lijnAmerican Type Culture Collection (ATCC)SCRC-1041Menselijke dermale fibroblasten geïsoleerd uit neonatale voorhuid; gebruikt voor parasiet propagatie
MinION Flow Cell (R10.4.1)Oxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN114Flow cell voor sequencing
MinION Mk1B Sequencing DeviceOxford Nanopore Technologies, UKMIN-101BNanopore sequencer; sequencing uitgevoerd met behulp van MinKNOW software (v25.09.16) voor apparaatcontrole en real-time base calling.
MinKNOW SoftwareOxford Nanopore Technologies, UKN/ASoftware gebruikt voor MinION Mk1B apparaatcontrole, real-time sequencing, en base calling; versie 25.09.16.
Native Barcoding Kit 24 V14Oxford Nanopore TechnologiesSQK-NBD114.24Barcoding voor multiplexed samples
NEB Blunt/TA Ligase Master MixNew England BiolabsM0367DNA ligatie
NEBNext Quick Ligation ModuleNew England BiolabsE6056Adapter ligatie
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5×)New England BiolabsB6058Gebruikt in DNA ligatie
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing ModuleNew England BiolabsE7546Bibliotheekvoorbereiding
Nuclease-vrij waterThermo Fisher ScientificR0581Moleculair biologie kwaliteit
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up KitMacherey-Nagel740609.5PCR product zuivering
Penicilline–Streptomycine (1%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)15140-122Antibioticum mengsel
Fosfaat-gebufferd zout (PBS)Thermo Fisher Scientific (Gibco)10010023Wasbuffer
Q5 High-Fidelity 2× Master MixNew England BiolabsM0492SHoge nauwkeurigheid polymerase
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen69504DNA extractie
Quick T4 DNA LigaseNew England BiolabsM2200Adapter ligatie enzym
SYBR Safe DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102DNA kleuring kleurstof
TriTrack DNA Loading Dye (6×)Thermo Fisher ScientificR1161Belasting van monsters in gel
Trypsine–EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)25200056Voor het passeren van HFFs
1× TAE of 1× TBE buffer——Lopende buffer
2× PCR premix——Klaar voor gebruik mix voor PCR

Referenties

  1. Uzelac, A., Djurkovic-Djakovic, O. Isolation, genotyping and phenotyping Toxoplasma gondii in Europe - A critical perspective. Food Waterborne Parasitol. 40, e00279(2025).
  2. Yaman, Y., Bay, V., Kişi, Y. E. Discovery of host genetic factors through multi-locus GWAS against toxoplasmosis in sheep: addressing one health perspectives. BMC Veterinary Research. 21 (1), 263(2025).
  3. Khedr, A. A., et al. Exploring the role of chitosan and curcumin-loaded chitosan nanoparticles against chronic Toxoplasma infection in experimental mice. Scientific Reports. 15 (1), 41765(2025).
  4. Joeres, M., et al. Genotyping of European Toxoplasma gondii strains by a new high-resolution next-generation sequencing-based method. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 43 (2), 355-371 (2024).
  5. Gohar, Y., et al. Intra-strain genetic heterogeneity in Toxoplasma gondii ME49: Oxford Nanopore long-read sequencing reveals copy number variation in the ROP8-ROP2A locus. BMC Genomics. 26 (1), 1094(2025).
  6. Koutsogiannis, Z., Denny, P. W. Rapid genotyping of Toxoplasma gondii isolates via Nanopore-based multi-locus sequencing. AMB Express. 14 (1), 68(2024).
  7. DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook. , QIAGEN. (2023).
  8. User manual PCR clean-up and Gel extraction. , MACHEREY-NAGEL. (2024).
  9. Karst, S. M., et al. High-accuracy long-read amplicon sequences using unique molecular identifiers with Nanopore or PacBio sequencing. Nature Methods. 18 (2), 165-169 (2021).
  10. Yu, P. -L., et al. Next-generation fungal identification using target enrichment and Nanopore sequencing. BMC Genomics. 24 (1), 581(2023).
  11. Vilares, A., et al. Towards a rapid sequencing-based molecular surveillance and mosaicism investigation of Toxoplasma gondii. Parasitology Research. 119 (2), 587-599 (2020).
  12. Fazaeli, A., Ebrahimzadeh, A. A new perspective on and re-assessment of SAG2 locus as the tool for genetic analysis of Toxoplasma gondii isolates. Parasitology Research. 101 (1), 99-104 (2007).
  13. Targa, L. S., et al. Toxoplasma gondii SAG2, SAG3 and GRA6 alleles and single nucleotide polymorphism in congenital infections with known parasite load and clinical outcome. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 65, e8(2023).
  14. Rico-Torres, C. P., et al. Can cloning and sequencing help to genotype positive Toxoplasma gondii clinical samples? Results and validation using SAG3 as a model. Infect Genet Evol. 101, 105283(2022).
  15. Sanchez, S. G., Besteiro, S. The pathogenicity and virulence of Toxoplasma gondii. Virulence. 12 (1), 3095-3114 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Genotyperingsworkflowextractie van genomisch DNAlocus-specifieke amplificatieSAG2-genSAG3-genenkelvoudig nucleotidepolymorfismesequentie-alignement
Multi-locus sequencing voor stamtypering van Toxoplasma gondii
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.