Deze studie werd uitgevoerd aan de afdeling Restauratieve Tandheelkunde, Faculteit Tandheelkunde, Marmara Universiteit, Istanbul, Turkije. Er waren geen menselijke of dierlijke proefpersonen betrokken; Daarom was institutionele ethische goedkeuring niet vereist. De reagentia en apparatuur die in deze studie zijn gebruikt, staan vermeld in de Materiaallijst. Figuur 1 illustreert de experimentele workflow die in deze studie werd gebruikt. Monstervoorbereiding werd eerst uitgevoerd om schijfvormige composietmonsters te vervaardigen (8 mm × 2 mm). Daarna werden basiskleurmetingen verkregen vóór de kleuring. Alle exemplaren werden vervolgens 12 dagen in een koffieoplossing ondergedompeld om verkleuring te veroorzaken, gevolgd door kleurmetingen na het kleuren. Na de kleuring werden de monsters verdeeld in experimentele groepen, waarin vijf verschillende oplossingen (waaronder gedestilleerd water [DW] als controle) werden toegepast met een orale irrigator of door directe onderdompeling voor een gelijkwaardige gesimuleerde klinische duur. Ten slotte werden na de behandeling kleurmetingen uitgevoerd om de algehele kleurverandering te evalueren.

Figuur 1: Experimentele workflow voor kleurstabiliteitsevaluatie. Stroomdiagram dat de experimentele procedure illustreert, inclusief monstervoorbereiding, basiskleurmeting (T0), koffiekleuring (12 dagen), kleurmeting na het kleuren (T1) en mondspoeling met statische onderdompeling of orale irrigator-ondersteunde toediening. Definitieve kleurmetingen (T2) werden verkregen om kleurveranderingen te berekenen (ΔE₁, ΔE₂ en ΔE₃). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Monstervoorbereiding
In deze studie werden twee nanohybride, enkelkleurige resincomposieten gebruikt: Charisma Diamond One (DO) en Vittra APS Unique (VU). De materiaalspecificaties worden gepresenteerd in Tabel 1.
| Harscomposiet | Fabrikant | Type | Harsmatrix | Samenstelling / Grootte van de filler | Vulinhoud (wt% / vol%) | Lotnummer |
| Charisma Diamond One (DO) | Kulzer, Duitsland | Nanohybride | UDMA; TCD-DI-HEA; TEGDMA | B₂O₃–F–Al₂O₃–SiO₂; silica; TiO₂; fluorescentie- en metaaloxiden; organische pigmenten (5–20 μm) | 81 / 64 | N010209 |
| Vittra APS Uniek (VU) | VGV, Brazilië | Nanohybride | UDMA; TEGDMA | Zirkonia en silica-vulstoffen (200 nm) | 82 / 72 | 230921 |
Tabel 1: Samenstelling en eigenschappen van de harscomposieten die in deze studie zijn gebruikt. Materiaaltype, fabrikant, samenstelling van de harsmatrix, vullereigenschappen, vulinhoud (gewichtspercentage / vol%) en lotnummers van de enkelkleurige nanohybride harscomposieten geëvalueerd. Afkortingen: UDMA = urethaandimethacrylaat; TEGDMA = triethyleenglycoldimethacrylaat; TCD-DI-HEA = tricyclodecaandimethanoldiacrylaat; TiO₂ = titaniumdioxide; YbF₃ = ytterbiumtrifluoride; B₂O₃–F–Al₂O₃–SiO₂ = boro-fluoro-aluminosilicaat.
Schijfvormige monsters (8 mm in diameter en 2 mm in dikte) werden vervaardigd met gestandaardiseerde voorgefabriceerde siliconenmallen. Het resincomposiet werd in één stap in de mal geplaatst met een plat plastic vulinstrument en aangepast tegen de malwanden om volledige vulling te garanderen en de vorming van de opening te minimaliseren. Transparante polyesterstroken werden zowel op de boven- als onderzijde geplaatst, en het materiaal werd tussen glasplaten (cementglas) geperst om vlakke en gladde oppervlakken te verkrijgen en een gestandaardiseerde dikte te garanderen. De uiteindelijke dikte van elk monster werd gemeten met een digitale remklauw (nauwkeurigheid: ±0,01 mm), en monsters die afweken van de doeldikte (2,00 ± 0,05 mm) werden weggegooid en opnieuw gemaakt. Monsters werden onderzocht onder een stereomicroscoop met 20× vergroting onder gestandaardiseerde verlichtingsomstandigheden. Het gehele bovenoppervlak van elk exemplaar werd systematisch gescand op oppervlaktedefecten, waaronder luchtholtes, porositeiten of onregelmatigheden. Exemplaren met enige detecteerbare defecten bij deze vergroting werden uitgesloten en vervangen.
Polymerisatie werd uitgevoerd met een lichtuithardingsunit die werkte op 1000 mW/cm² met een golflengtebereik van 385–515 nm. De uitgangsintensiteit van het apparaat werd gecontroleerd met een radiometer voorafgaand aan de preparat. De lichtuithardingsunit werd gepositioneerd met een ondersteuningsopstelling om de uithardingstip direct in contact te houden met de polyesterstrook en loodrecht (90°) op het oppervlak van het monster, waardoor een consistente positionering gedurende het hele uithardingsproces werd gegarandeerd. Elk exemplaar werd 20 seconden vanaf het bovenoppervlak lichtgeprepareerd, gevolgd door 20 seconden vanaf het onderoppervlak onder dezelfde omstandigheden.
Na polymerisatie werden de monsteroppervlakken 10 seconden onder een waterspuit van de tandheelkundige eenheid afgespoeld onder een waterspuit van de tandheelkundige eenheid. De spray werd onder een loodrechte hoek (90°) op het oppervlak van het monster aangebracht met behulp van een steun-gebaseerde positioneringsopstelling, waarbij het monster en de spuittip op één lijn lagen. De afstand tussen de spuittip en het oppervlak van het monster werd ingesteld op 5 cm en geregeld met een meetinstrument. De monsters werden vervolgens afzonderlijk opgeslagen in gesloten glazen containers met DW op 23°C ± 1°C gedurende 24 uur voorafgaand aan afwerking en polijsten. De containers werden gesloten gehouden om verdamping te voorkomen en in een kast geplaatst om lichtblootstelling te minimaliseren. Afwerking en polijsten werden uitgevoerd op beide oppervlakken van elk monster met aluminiumoxide schuurschijven (grof, medium, fijn en superfijn) in opeenvolgende volgorde, met een handstuk met lage snelheid die werkte op 10.000 tpm. Elke schijf werd 20 seconden lang aangebracht met een consistente rotatiebeweging over het hele oppervlak om een uniforme behandeling te garanderen. Alle afwerkings- en polijstprocedures werden door dezelfde operator uitgevoerd om de variabiliteit door de operator te minimaliseren. Het laatste polijsten werd uitgevoerd met een diamantpolijstsysteem onder dezelfde operationele omstandigheden (10.000 rpm) gedurende 20 seconden per stap, volgens hetzelfde bewegingspatroon. Alle monsters werden vervolgens nog eens 24 uur in DW opgeslagen bij 23°C ± 1°C voorafgaand aan de kleuring, om stabilisatie na het uitharden mogelijk te maken, inclusief diffusie van niet-gereageerde componenten en evenwicht onder gestandaardiseerde omstandigheden.
De steekproefgrootte werd bepaald met behulp van vermogensanalyse uitgevoerd met G*Power, met een significantieniveau (α) van 0,05, een macht van 95% en een effectgrootte (f) van 0,401, gebaseerd op eerder gepubliceerde gegevens21. De minimaal vereiste totale steekproefgrootte werd berekend op 160 exemplaren, wat overeenkomt met 8 per subgroep. Om rekening te houden met het gebruik van robuuste statistische methoden met getrimde gemiddelden, die de effectieve steekproefgrootte verminderen door een deel van extreme waarden uit te sluiten, en om mogelijk monsterverlies tijdens voorbereiding en analyse te compenseren, werd de steekproefgrootte per subgroep vergroot tot 10, wat resulteerde in een totaal van 200 monsters.
Koffiekleuringsprocedure
Een koffiekleuringsoplossing werd bereid door 3 g oploskoffiepoeder op te lossen in 50 mL DW, verwarmd tot 100°C. De oplossing werd 30 seconden geroerd totdat volledige oplossing was bereikt om concentratie-uniformiteit te waarborgen. De oplossing werd vervolgens overgebracht naar een gesloten container, geplaatst in een gecontroleerde ruimte (23°C ± 1°C) en voorafgaand aan gebruik tot de gewenste temperatuur laten afkoelen. Elk monster werd individueel ondergedompeld in 5 mL koffieoplossing in gesloten cilindrische glazen flesjes (binnendiameter: ongeveer 15 mm; hoogte: ongeveer 40 mm) om een consistente verhouding tussen monster en oplossing en volledige onderdompeling te garanderen. Het volume van 5 mL per monster werd gekozen om de blootstellingsomstandigheden te standaardiseren en ervoor te zorgen dat alle monsters volledig bedekt waren met de kleuringsoplossing zonder contact met de containerwanden. Alle exemplaren werden gedurende de 12 dagen onderdompelingsperiode opgeslagen bij 23°C ± 1°C in een temperatuurgecontroleerde ruimte. De flesjes werden stevig gesloten gehouden om verdamping te voorkomen en in een gesloten kast geplaatst om lichtblootstelling en externe besmetting te minimaliseren. Dit onderdompelingsprotocol is veel gebruikt en een onderdompelingsperiode van 12 dagen is gerapporteerd als ongeveer één jaar klinische kleuring onder in vitro omstandigheden3. Om consistente kleuringscondities te behouden en microbiële groei te minimaliseren, werd de koffieoplossing met vaste intervallen van 24 uur vernieuwd. Elke dag op hetzelfde tijdstip werden de monsters met schone pincetten uit de flesjes gehaald, voorzichtig afgespoeld met DW gedurende 5 seconden, en overgebracht naar een vers bereide koffieoplossing in nieuwe, schone flesjes met 5 ml oplossing. De containers werden gedurende de hele procedure gesloten gehouden en alle stappen werden onder consistente laboratoriumomstandigheden voor alle monsters uitgevoerd.
Mondspoeling
Alle exemplaren werden voorafgaand aan de koffiekleuring voorzien van unieke identificatienummers om het bijhouden van de metingen mogelijk te maken. Na de kleuringsprocedure werden de monsters willekeurig toegewezen aan de experimentele groepen met behulp van een computergegenereerde randomisatiesequentie die in Microsoft Excel was gemaakt, waarbij de monsters willekeurig werden gerangschikt en vervolgens gelijkmatig verdeeld over de groepen. Elk exemplaar werd individueel behandeld tijdens de aangifteprocedures. Vier commercieel verkrijgbare mondspoeloplossingen werden in de studie opgenomen: Colgate Plax Whitening + Charcoal (CP), Crest 3D White (CW), Listerine Fresh Burst (LF) en Sensodyne Pronamel (SP), samen met DW als controleoplossing. Deze werden respectievelijk afgekort als CP, CW, LF, SP en DW. De samenstelling en werkzame ingrediënten van de mondspoeloplossingen worden weergegeven in Tabel 2.
| Mondspoeltype | Afkorting | Fabrikant | Actieve Ingrediënten |
| Mondspoeling met alcohol | LF | Johnson & Johnson, VK | Alcohol, menthol, eucalyptol, thymol, methylsalicylaat, benzoëzuur, poloxameer 407, natriumbenzoaat, sorbitoloplossing, water, smaak |
| Mondspoeling met houtskool | CP | Colgate-Palmolive, VS | Water, sorbitol, propyleenglycol, PEG-40 gehydrogeneerde ricinusolie, aroma, natriumsaccharine, menthol, eugenol, natriumfluoride, houtskoolpoeder |
| Waterstofperoxide-gebaseerde mondspoeling | CW | Procter & Gamble, VS | Water, glycerine, waterstofperoxide, propyleenglycol, natriumhexametafosfaat, poloxameer 407, natriumcitraat, smaakstof, natriumsaccharine, citroenzuur |
| Mondspoeling met fluoride | SP | GSK, VK | Water, sorbitol, propyleenglycol, kaliumnitraat, PEG-60 gehydrogeneerde ricusenolie, poloxameer 407, aroma, natriumfluoride, citroenzuur, natriumsaccharine |
| Gedestilleerd water (controle) | DW | N.v.t. | N.v.t. |
Tabel 2: Samenstelling van mondspoelingsoplossingen die in de studie zijn gebruikt. Soorten mondspoelingen, afkortingen, fabrikanten en belangrijkste werkzame bestanddelen van de oplossingen die worden geëvalueerd. Gedestilleerd water diende als controleconditie. Afkortingen: LF = mondspoelmiddel met alcohol; CP = mondspoelmiddel met houtskool; CW = mondspoeling op basis van waterstofperoxide; SP = fluoridehoudende mondspoeling; DW = gedestilleerd water.
Het experimentele ontwerp omvatte drie onafhankelijke variabelen: composiettype (DO en VU), mondspoeltype (CP, CW, LF, SP en DW) en toepassingsmethode (directe onderdompeling en met irrigator-ondersteunde toepassing). Het achtervoegsel "-D" duidt op directe onderdompeling, terwijl "-I" op een door irrigator-ondersteunde toepassing staat. Dienovereenkomstig werd elke subgroep gedefinieerd door een combinatie van oplossingstype en toepassingsmethode (bijv. CP-D en CP-I). De verdeling van experimentele groepen wordt samengevat in Tabel 3.
| Composiettype | Groep nr. | Irrigatorgroep | Directe Immersiegroep |
| DO | 1 | CP-I | CP-D |
| 2 | CW-I | CW-D |
| 3 | SP-I | SP-D |
| 4 | LF-I | LF-D |
| 5 | DW-I | DW-D |
| VU | 6 | CP-I | CP-D |
| 7 | CW-I | CW-D |
| 8 | SP-I | SP-D |
| 9 | LF-I | LF-D |
| 10 | DW-I | DW-D |
Tabel 3: Groeperen van monsters op basis van samengestelde type, mondspoeling en toepassingsmethode. Experimentele groepen werden gedefinieerd op basis van het samengestelde type (DO en VU), mondspoeltype en toepassingsmethode (orale irrigator of directe onderdompeling). Afkortingen: DO = samengesteld materiaal DO; VU = composietmateriaal VU; CP = mondspoelmiddel met houtskool; CW = mondspoeling op basis van waterstofperoxide; SP = fluoridehoudende mondspoeling; LF = mondspoelmiddel met alcohol; DW = gedestilleerd water; I = toepassing van orale irrigatie; D = directe onderdompeling.
Voor de statische onderdompelingsmethode werd elk monster individueel ondergedompeld in 5 mL van de toegewezen mondspoelingsoplossing in gesloten cilindrische glazen flesjes van consistente grootte om gestandaardiseerde blootstellingsomstandigheden te waarborgen. Het geselecteerde volume zorgde voor volledige onderdompeling van elk exemplaar zonder contact met de containerwanden. Alle exemplaren werden opgeslagen bij 23°C ± 1°C in een temperatuurgecontroleerde ruimte voor een totale duur van 12 uur. Deze duur werd gekozen om het cumulatieve effect van routinematig mondspoelgebruik weer te geven, overeenkomend met tweemaal daagse blootstelling aan mondspoeling gedurende 1 minuut per aangifte, en is gerapporteerd op ongeveer één jaar klinisch gebruik onder in vitro omstandigheden17. Omdat deze methode passieve onderdompeling vereiste, was geen toepassing op de debietsnelheid of door het apparaat gedefinieerde uitgangsinstelling; Standaardisatie werd gewaarborgd door het behouden van identiek volume van de oplossing (5 mL), afmetingen van de container en de blootstellingscondities voor alle monsters. Alle monsters werden onder dezelfde laboratoriumomstandigheden en tijdschema's verwerkt om variabiliteit tussen groepen te minimaliseren. Voor de toepassing van de orale irrigator werd een orale irrigator gemonteerd in een aangepaste ondersteuningsopstelling gebruikt om de parameters van het monster te positioneren en te irrigeren. Het orale irrigatorapparaat werd in de opstelling bevestigd om een loodrechte oriëntatie ten opzichte van het monsteroppervlak te behouden. Elk exemplaar werd geplaatst en gestabiliseerd in een houder die was ontworpen om beweging tijdens irrigatie te voorkomen. Deze opstelling werd gebruikt om een vaste ruimtelijke relatie tussen de irrigatortip en het monster te behouden gedurende elke toepassing. De irrigatortip bleef bij elke toepassing in een vaste en stationaire positie ten opzichte van het oppervlak van het monster, zonder laterale of sweepende beweging. De houder van het monster en de irrigatortip waren uitgelijnd op parallelle assen, en de afstand tussen de irrigatortip en het oppervlak van het monster werd met een digitale remklauw, op 2 mm gezet. Deze configuratie zorgde voor consistente positionering, oriëntatie en afstand voor alle exemplaren. De irrigator werd bediend op de middeldrukstand die overeenkomt met niveau 3 op het apparaat, wat een door de fabrikant gedefinieerde drukbereik van ongeveer 55–65 psi oplevert. Voor elk gebruik werd de apparaatinstelling gecontroleerd om consistente werking op dit niveau te garanderen. Omdat het apparaat geen directe kwantitatieve debietsnelheid biedt, werd de uitgang gestandaardiseerd door dezelfde apparaatinstelling, vaste puntafstand (2 mm), loodrechte oriëntatie en consistente bedrijfsomstandigheden te behouden gedurende alle procedures. De oplossingsstroom bleef gedurende de hele procedure constant door het reservoir gevuld te houden met de testoplossing. Tijdens de irrigatie werd het reservoir regelmatig geïnspecteerd en indien nodig opnieuw gevuld om een continue en ononderbroken stroming te waarborgen, zodat alle monsters consistente blootstellingsomstandigheden konden garanderen.
Elk exemplaar werd 10 minuten lang continu blootgesteld aan de irrigator op vaste intervallen van 7 dagen, één keer per week gedurende in totaal 4 opeenvolgende weken. Alle toepassingen werden op hetzelfde tijdstip uitgevoerd om consistentie te waarborgen. Dit blootstellingsprotocol is ontworpen om routinematig gebruik van orale irrigatoren te vertegenwoordigen, wat overeenkomt met tweemaal daagse toepassing voor ongeveer 3 seconden per oppervlak, en is gerapporteerd dat het ongeveer één jaar klinisch gebruik onder in vitro omstandigheden18 jaar is. Na elke toepassing werden de monsters 10 seconden met DW afgespoeld met een tandheelkundige lucht-waterspuit. De spray werd onder een loodrechte hoek (90°) op het oppervlak van het monster aangebracht met behulp van een steunopstelling, waarbij de spuittip en het monster op parallelle assen waren uitgelijnd. De afstand tussen de spuittip en het oppervlak van het monster werd ingesteld op 5 cm en geregeld met een meetinstrument. Tussen de toepassingssessies door werden de monsters afzonderlijk opgeslagen in gesloten glazen containers gevuld met DW bij 23°C ± 1°C. De containers werden gesloten gehouden om verdamping te voorkomen en in een kast geplaatst om lichtblootstelling te minimaliseren. De opslagoplossing werd elke dag op vaste 24-uursintervallen op hetzelfde tijdstip vernieuwd.
Kleurmeting
Metingen werden verricht met een spectrofotometer uitgerust met een contact-type probe (5 mm in diameter) en een interne LED-lichtbron. Het apparaat werd in herstelmodus bediend, volgens de instructies van de fabrikant, om consistente, reproduceerbare metingen te garanderen. Het werd vóór elke meetsessie gekalibreerd met behulp van het standaard witte kalibratieblok van de fabrikant. De kalibratieprocedure werd uitgevoerd door de probetip direct in contact te brengen met het kalibratieblok en de kalibratiemodus te starten via de apparaatinterface. De kalibratie werd herhaald totdat een geldige meting was verkregen vóór de meting van het monster.
Alle kleurmetingen werden uitgevoerd tegen een gestandaardiseerde neutraalgrijze achtergrond (Munsell N5), bestaande uit een matte, niet-reflecterende kalibratiekaart om achtergrondlichtinterferentie te minimaliseren. De achtergrond kwam overeen met CIE Lab*-waarden van ongeveer L* = 50,0, a* = 0,0 en b* = 0,0, wat een achromatische midden-grijsreferentie vertegenwoordigt. Om gestandaardiseerde en reproduceerbare positionering van de probe te waarborgen, werd een op maat gemaakte positioneringsmal gebruikt om zowel het monster als de spectrofotometerprobe te stabiliseren. Deze opstelling zorgde ervoor dat de probepunt in een vaste loodrechte oriëntatie (90°) ten opzichte van het monsteroppervlak werd gehouden, met consistente contactdruk gedurende alle metingen. De meetlocatie werd gestandaardiseerd door het exacte midden van elk monster te markeren met een digitale remklauw tijdens de preparat. Alle metingen werden genomen vanaf dit vooraf gedefinieerde centrale referentiepunt om positionele variabiliteit te elimineren. Voor herhaalde metingen werd de sonde volledig herpositioneerd tussen elke meting. Specifiek werd de sonde volledig van het oppervlak getild en opnieuw uitgelijnd met behulp van de positioneringsjig voor elke meting om rekening te houden met mogelijke plaatsingsvariabiliteit. Drie opeenvolgende metingen werden verkregen van hetzelfde vooraf gedefinieerde centrale punt onder identieke omstandigheden en gemiddeld voor analyse.
De gemiddelde L*-, a*- en b*-waarden werden gebruikt om kleurverandering te berekenen met behulp van de CIEDE2000 (ΔE00)-formule. De ΔE00-waarden werden berekend met behulp van een aangepaste implementatie van het CIEDE2000-algoritme in Microsoft Excel, gebaseerd op CIELAB-kleurruimtecoördinaten (Vergelijking 1):
(1)
Hier vertegenwoordigen ΔL′, ΔC′ en ΔH′ respectievelijk de verschillen in lichtheid, chroma en tint; SL, SC en SH zijn de overeenkomstige wegingsfuncties; kL, kC en kH zijn parametrische correctiefactoren (in deze studie op 1 gezet); en R T is een rotatietermdie de interactie tussen verschillen in chroma en tint verklaart. De kleurverandering werd berekend met behulp van de CIEDE2000 (ΔE00) formule, gebaseerd op de L*-, a*- en b*-coördinaten die op elk meettijdstip werden verkregen. Specifiek werd ΔE1 berekend met behulp van de kleurcoördinaten gemeten bij baseline (T0) en na koffiekleuring (T1), ΔE₂ met de coördinaten verkregen bij T1 en na mondspoeling (T2), en ΔE₃ met behulp van de coördinaten gemeten bij T0 en T2. Dus elke ΔE-waarde vertegenwoordigt een paargewijze vergelijking van L*-, a*- en b*-waarden tussen de overeenkomstige meettijdpunten9.
Oppervlaktemorfologieanalyse
Representatieve exemplaren (n = 16) werden geselecteerd voor oppervlaktemorfologie-evaluatie met behulp van een vooraf gedefinieerd, reproduceerbaar selectieprotocol om selectiebias te minimaliseren. De selectie van het monster werd uitgevoerd met behulp van een computergegenereerde randomisatieprocedure uit de beschikbare pool in elke experimentele fase. In totaal werden 16 exemplaren geanalyseerd, verdeeld als volgt: T0 (n = 4), T1 (n = 4) en T2 (n = 8). Voor T0 enT 1 werden monsters willekeurig geselecteerd zonder subgroepdifferentiatie, omdat er geen experimentele groepering aanwezig was vóór de mondspoelingfase. Voor T2 werden monsters willekeurig geselecteerd om de verschillende experimentele omstandigheden te vertegenwoordigen, waarbij monsters van elk oplossingstype en toepassingsmethode werden opgenomen.
Voorafgaand aan de beeldvorming werden alle exemplaren gesputter-coated met een goud-palladiumlaag onder gecontroleerde vacuümomstandigheden (~0,05 mbar) om de oppervlaktegeleidbaarheid te waarborgen. De coatingdikte werd gehandhaafd op 10 nm om voldoende geleidbaarheid te bieden terwijl de oppervlaktetopografie behouden bleef. Oppervlakteanalyses werden uitgevoerd met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM) met een omgevingsscanning-elektronenmicroscoop die in laagvacuümmodus werd bediend bij een kamerdruk van 110 Pa, met een versnellingsspanning van 10,0 kV. Laagvacuümomstandigheden werden gekozen om laadeffecten te minimaliseren en stabiele beeldvorming van harsgebaseerde materialen mogelijk te maken zonder extra geleidende artefacten. Monsters werden op aluminium stompjes gemonteerd met dubbelzijdig geleidend koolstoflint en zo geplaatst dat het oppervlak van het monster loodrecht op de elektronenbundel was gepositioneerd. Alle monsters werden gemonteerd volgens een gestandaardiseerd protocol om consistente beeldvormingsgeometrie te garanderen. Beeldvormingscondities werden gedefinieerd door de versnellingsspanning (10,0 kV) en de werkafstand (constant gehouden gedurende alle metingen), terwijl de instelling van de spotgrootte (3,0, instrumentspecifiek) gedurende het hele onderzoek constant bleef.
Microfoto's werden gemaakt van een gestandaardiseerd centraal gebied van elk monster. De beeldlocatie werd gedefinieerd als het geometrische centrum van het monsteroppervlak, bepaald tijdens de preparatie met een digitale remklauw en consistent gebruikt voor alle metingen. De SEM-bundel werd uitgelijnd met dit vooraf gedefinieerde referentiepunt voor alle beeldverwervingen. Beelden werden gemaakt met vergrotingen van ×2500, ×5000 en ×10000, met één beeld per vergroting, om de morfologische veranderingen van het oppervlak te evalueren die samenhangen met koffiekleuring en mondspoeling.
Statistische analyse
Alle statistische analyses werden uitgevoerd met R-software met het WRS2-pakket. De gegevensverdeling werd beoordeeld met behulp van de Shapiro–Wilk-test. Omdat verschillende variabelen niet voldeden aan een normale verdeling, werden robuuste statistische methoden toegepast. Voor de algehele analyse werden oppervlakteruwheid en kleurwaarden geëvalueerd met behulp van een robuuste ANOVA in drie richtingen om de effecten van composiettype, groep en periode te beoordelen. Voor kleurveranderingsuitkomsten werden ΔE1, ΔE2 en ΔE3 waarden afzonderlijk geanalyseerd met behulp van een robuuste ANOVA in drie richtingen, waarbij het composiettype, mondspoeling en toepassingsmethode onafhankelijke factoren waren. Wanneer significante effecten werden vastgesteld, werden post-hoc meervoudige vergelijkingen uitgevoerd met Bonferroni-aanpassing. De resultaten worden uitgedrukt als getrimde gemiddelde ± standaardfout, waarbij standaardfouten worden gescat binnen het robuuste getrimde-gemiddelde kader dat in het WRS2-pakket is geïmplementeerd. Het significantieniveau werd vastgesteld op p < 0,05.