Een continu kweek millifluidisch apparaat voor de studie van Escherichia coli onder lage en fluctuerende voedingsomstandigheden

Samenvatting

We presenteren een protocol voor het millifluidische continue kweekapparaat (MCCD), waarmee bacteriële populaties onder constante omstandigheden met weinig nutriënten (tot honderden nanomolaire concentraties) of temporele nutriëntenfluctuaties op een minimale tijdschaal kunnen worden gekweekt.

Samenvatting

Microbiële habitats in de natuur worden vaak gekenmerkt door lage concentraties van gemengde voedingsstoffen, ruimtelijke heterogeniteit en temporele fluctuaties. Traditionele laboratoriumkweekmethoden slagen er echter niet in deze omstandigheden na te bootsen. Batchculturen kunnen de groei niet in omgevingen met weinig voedingsstoffen behouden, terwijl chemostaten een stabiele groei behouden met één beperkende voedingsstof, maar het is lastig te implementeren wanneer het doel is om gedefinieerde lage concentraties van voedingsmengsels te behouden of snelle schommelingen te introduceren. Microfluidische systemen genereren dynamische omgevingen, maar leveren onvoldoende biomassa op voor populatieniveau omische analyses. Om deze beperkingen aan te pakken, introduceren we het millifluidic continuous culture device (MCCD), een veelzijdig platform voor het bestuderen van microbiële reacties op stabiele en fluctuerende voedingsstoffen. De MCCD huisvest bacteriële populaties in een Sterivex-filter (0,45 μm polyvinylidienfluoride [PVDF] poreus filtermembraan), waar een continue stroom van media stabiele kweekomstandigheden in stand houdt en tegelijkertijd nutriëntenverlies voorkomt. Een drieweg-solenoïdevenfunctiesysteem, aangestuurd via aangepaste Matlab-software, maakt precieze, minutieuze voedingsfluctuaties mogelijk. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het bedienen van de MCCD in twee modi: (1) constante laag-nutriëntencondities en (2) fluctuatie-nutriëntencondities. Met dit systeem groeide Escherichia coli exponentieel in een mengsel van aminozuren en nucleobasen die aanwezig waren bij tientallen tot honderden nanomolaire concentraties, en bereikte celwaarden van ongeveer 10,9 cellen/mL. Door belangrijke kenmerken van natuurlijke microbiële habitats te recreëren, maakt de MCCD het mogelijk om bacteriële groei en fysiologie te bestuderen onder gecontroleerde maar ecologisch relevante omstandigheden bij E. coli en andere microbiële soorten.

Inleiding

Bacteriën in natuurlijke habitats komen een nutriëntenlandschap tegen dat vaak varieert in zowel samenstelling als concentratie en kan fluctueren over een breed scala aan tijdschalen: 1,2,3,4. In omgevingen zoals de oceaan⁵, bodem³ en darm⁶ wordt microbiële groei vaak beperkt door een of meer essentiële voedingsstoffen, en kan de beschikbaarheid van nutriënten veranderen door fysieke, chemische en biologische processen⁴. Deze voedingsstoffen en hun fluctuaties sturen microbiële strategieën voor overleving en groei, en vormen reacties over verschillende niveaus van biologische organisatie⁴.

Microbiële aanpassingen aan nutriëntendynamiek vinden plaats op gemeenschaps-, populatie- en enkelcellig niveau. Op gemeenschapsniveau kunnen fluctuaties het samenleven^{van soorten bevorderen 7}, de samenstelling van de gemeenschap en metabole activiteit coördineren met temporele variatie⁸, en kansen creëren voor nieuwe soorten om te koloniseren⁹. Op populatieniveau kunnen veranderende nutriëntencondities evolutie versnellen door te selecteren op genetische veranderingen¹⁰ of fenotypische variabiliteit induceren, inclusief bet-hedgingstrategieën¹¹, die de overleving onder onvoorspelbare omstandigheden verbeteren. Op enkelcellig niveau passen bacteriën hun fysiologie aan als reactie op de voedingsomgeving ^12,13. Een recent gerapporteerd voorbeeld is een specifieke fysiologie die bacteriën een groeivoordeel geeft onder schommelende omstandigheden¹⁴. Omdat bacteriën vaak te maken hebben met nutriëntenbeperkingen, is het bestuderen van hoe ze reageren op lage en variabele nutriëntencondities—zowel als individuele cellen als binnen populaties of gemeenschappen—essentieel om hun gedrag in hun natuurlijke omgeving te begrijpen.

Chemostaten zijn goed geschikt om groei te bestuderen onder beperking door één enkele voedingsstof, maar zijn moeilijk te gebruiken wanneer het doel is om de concentraties van meerdere voedingsstoffen in laaggeconcentreerde mengsels te beheersen. Chemostaten zijn waardevolle hulpmiddelen geweest voor het bestuderen van bacteriële aanpassing aan nutriëntenbeperking door een goed gecontroleerde, stabiele omgeving te bieden. Hun werking beperkt ze echter inherent tot omstandigheden waarin de groei wordt beperkt door één essentieel voedingselement. Bij een chemostaat wordt de verdunningssnelheid aangepast zodat de cellulaire groei de aanvoer van één beperkende voedingsstof in balans brengt, waardoor de groeisnelheid wordt vastgesteld in plaats van de concentraties van individuele voedingsstoffen¹⁵. Dit kader generaliseert zich niet gemakkelijk naar omgevingen met mengsels van vervangbare voedingsstoffen—zoals meerdere koolstofbronnen—omdat de verdunningssnelheid alleen de totale groeisnelheid bepaalt, niet de concentraties van elk bestanddeel in het medium^16,17. Als gevolg hiervan ontstaan de concentraties van individuele voedingsstoffen en hun co-benuttingspatronen uit microbiële benutting in plaats van extern voorgeschreven^{te worden 16,17}.

Bovendien kunnen voedingsfluctuaties worden opgewekt bij chemostaten, maar snelle fluctuaties of enkele verschuivingen op een minuutschaal zijn moeilijk te bereiken vanwege de doorgaans grote kweekvolumes. Microfluidische apparaten zijn uitgegroeid tot krachtige hulpmiddelen voor het creëren van precieze, laaggeconcentratie- en fluctuerende voedingsomgevingen¹⁴. In combinatie met videomicroscopie maken ze het meten van de groei van enkele cellen mogelijk. Hoewel microfluïdische systemen kwantificatie van de expressie van geselecteerde eiwitten mogelijk maken met behulp van fluorescerende reporters, zijn typische microfluïdische apparaten, in tegenstelling tot chemostaten, te klein om de biomassa te produceren die nodig is voor omische analyses, bijvoorbeeld om het proteoom van een bacteriële populatie te bestuderen. Om deze kloof te overbruggen, ontwikkelden we het millifluidische continue kweekapparaat (MCCD).

De MCCD maakt bacteriële groei mogelijk onder gecontroleerde nutriëntencondities, waaronder constante voedingsarme condities met minimale of geen uitputting, evenals fluctuerende nutriëntencondities, met behulp van een continu stroomkweeksysteem dat voldoende biomassa kan genereren voor downstream analyses. De MCCD gebruikt een 0,45 μm PVDF-filter als kweekvat, waarin het medium continu wordt aangevuld door een peristaltische pomp die vers medium uit een reservoir levert (Figuur 1A). Het poreuze membraan van het filter houdt bacteriën vast terwijl het een voorgeschreven voedingsstroom toelaat, wat uitputting van voedingsstoffen voorkomt, zelfs bij lage nutriëntenconcentraties (honderden nanomolairen tot micromolairen). Omdat biomassa wordt behouden terwijl het verse medium continu door het apparaat stroomt, vertoont de MCCD overeenkomsten met retentostaten¹⁸, waarbij cellen worden behouden terwijl het medium wordt vernieuwd. De MCCD verschilt echter van klassieke retentostaten in zijn architectuur en manier van voedingsstoffentoevoer. De retentozet functioneert doorgaans als een geroerde bulkreactor, waarbij cellen worden opgehangen in een goed gemengde cultuurvolume. Onder dergelijke omstandigheden hangt de beschikbaarheid van nutriënten af van de balans tussen menging, diffusie en cellulaire opname, en lokale uitputting of gradiënten kunnen ontstaan, vooral bij lage nutriëntenconcentraties en hoge celdichtheden. Daarentegen assembleren cellen zich in de MCCD direct op het membraan binnen de kleinvolume-Sterivex-cartridge, waarbij lagen van slechts enkele cellen dik worden gevormd die continu worden blootgesteld aan stromend medium. Er wordt geen actieve menging in de cartridge opgelegd; in plaats daarvan wordt het medium stroomopwaarts gehomogeniseerd en geleverd door continue stroming. Voedingsstoffen worden geleverd door convectief transport door de dunne cellagen, en omdat de diffusieafstand klein is en de debiet hoog is, worden lokale nutriëntengradiënten geminimaliseerd. Als gevolg hiervan worden de voedingsomstandigheden die de populatie ervaart voornamelijk bepaald door de samenstelling van het binnenkomende medium, wat zorgt voor consistentere en goed gedefinieerde laag-nutriëntenarme omstandigheden dan in geroerde retentiesystemen.

Figuur 1: Het millifluidische continue kweekapparaat (MCCD) voor bacteriële kweek onder laagconcentratie- of fluctuerende voedingsomstandigheden. (A) Schema van de MCCD voor constante voedingscondities. Een peristaltische pomp stuurt de stroom van vers medium uit een reservoir door een 0,45 μm PVDF-filter met bacteriële cellen. Het poreuze membraan in het filter houdt de bacteriën vast terwijl het medium doorlaat. Continue mediumstroom handhaaft constante nutriëntencondities binnen het filter, zelfs bij zeer lage nutriëntenconcentraties. (B) Schema van de MCCD voor fluctuerende voedingsomstandigheden. Een softwaregestuurde drieweg-solenoïdeklep stroomopwaarts van de peristaltische pomp wisselt de middelmatige instroom tussen twee reservoirs af (bijvoorbeeld hoge nutriëntenconcentratie, C_hoog, en lage nutriëntenconcentratie, C_laag). De software regelt de positie van de zuiger om de actieve instroombron te bepalen. (C) Fluidische assemblage voor constante voedingscondities. Een dop met drie siliconenbuizen die erdoorheen lopen, sluit de fles met vers medium af. Eén buis is verbonden met een ventilatiefilter voor beluchting, terwijl de andere twee medium naar de filters brengen. Barb-to-Male Luer-koppelingen verbinden deze buizen met de peristaltische buis en verbinden elke peristaltische buis met een eenrichtingsterugslagklep, die dient als ingangspunt voor het filter. De filteruitlaat is ook voorzien van een eenrichtingsterugslagklep. De afbeelding toont twee monsters, elk opgenomen in één filter. (D) Fluidische assemblage voor fluctuerende voedingsomstandigheden. Het metalen platform huisvest de microcontroller en elektronische componenten die twee solenoïdekleppen aansturen via aangepaste MATLAB-software. Geschroefde aansluitingen verbinden zowel de in- als uitgangen van de solenoïdekleppen met de slang. Elke klep heeft twee inlaten voor de twee alternatieve media, hier een medium met hoge nutriëntenconcentratie, C_High, roodgelabelde buizen, en een medium met lage nutriëntenconcentratie, C_Low, blauw gelabelde buizen. Het medium bevindt zich in afgesloten flessen met een ventilatiefilter, zoals in (C). De uitgangen van de solenoïdekleppen zijn via peristaltische buizen verbonden met de filters, zoals bij de stationaire assemblage (C). De afbeelding toont twee monsters, elk opgenomen in één filter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Daarnaast maakt de integratie van een softwaregestuurde, drieweg-solenoïdeklep stroomopwaarts van het Sterivex-filter het mogelijk dat de gebruiker de mediastroom kan schakelen tussen twee media in verschillende reservoirs (Figuur 1B). Als gevolg hiervan kan het apparaat worden gebruikt om de reactie van bacteriën te bestuderen op een stabiele omgeving bij een constante (inclusief lage concentratie) voedingsconditie of op voedingsfluctuaties, met fluctuatietijdschalen van enkele minuten of langer.

Dit protocol beschrijft de assemblage en werking van de MCCD voor het bestuderen van bacteriën onder zowel omstandigheden met lage als met fluctuerende voedingsstoffen. Als voorbeeld biedt dit protocol een stapsgewijze handleiding voor het uitvoeren van een groeiexperiment met Escherichia coli NCM3722 in twee bedrijfsstanden van de MCCD: constante lage nutriëntencondities en fluctuerende nutriëntencondities. De MCCD-opstelling kan gemakkelijk worden aangepast aan andere voedingsomstandigheden en microbiële soorten, waardoor het een veelzijdig platform is voor het bestuderen van bacteriële fysiologie onder nutriëntenomgevingen die typisch zijn voor die in de natuur.

Protocol

1. Bacteriële groei onder constante nutriëntomstandigheden

OPMERKING: Dit protocol beschrijft de procedure voor het uitvoeren van een groeicurve van E. coli NCM3722 in een zeer verdunde Rich-Defined Medium ("low RDM") conditie. Deze groeicurve duurt 12 uur, waarbij elke 2 uur één monster wordt verzameld (in totaal 6 tijdstippen). Het kernprincipe van dit protocol is dat elk tijdstip overeenkomt met één Sterivex-filter (hierna aangeduid als een 0,45 μm PVDF-filter). Om een monster te verzamelen, wordt de cultuur in het filter gehaald door deze ondersteboven te centrifugeren, wordt het celnummer gekwantificeerd en wordt het filter weggegooid. Elk 0,45 μm PVDF-filter levert slechts één monster op. De voorbereiding van het experiment vereist de definitie van drie belangrijke experimentele parameters: de debiet van de peristaltische pomp, de duur van het experiment en het gewenste aantal monsters (d.w.z. het aantal 0,45 μm PVDF-filters). Stel de initiële debiet in op 2 mL/min. Pas deze parameter aan indien nodig (bijvoorbeeld het debiet verhogen om de aanvoer van een zeer verdunde voedingsstof te behouden).

1. Bereiding van medium en materialen
   OPMERKING: Aangezien elk filter overeenkomt met een enkel tijdpuntmonster, varieert de experimentele looptijd van elk 0,45 μm PVDF-filter afhankelijk van de verzameltijd (bijv. 2 uur voor het eerste tijdstip, 4 uur voor het tweede tijdspunt, enzovoort).
   1. Schat het benodigde kweekmediumvolume met behulp van de formule
      ,
      waarbij n het aantal monsters is (0,45 μm PVDF-filters), Q de debiet (in mL/min), en t_i de experimentele looptijd (in minuten) voor elk monster.
   2. Vermenigvuldig met 1,2 om een extra volume van 20% toe te voegen om rekening te houden met variatie in de stroomsnelheid. Voor dit voorbeeld, bereken
      
   3. Rond het berekende volume omhoog (bijvoorbeeld bereid 6.200 mL voor in dit voorbeeld).
   4. Bereid materiaal voor voor sterilisatie (zie Tabel 1).
      OPMERKING: Bereid de materialen voor en steriliseer het de dag voor het experiment om gereedheid te waarborgen en vertragingen te minimaliseren. Autoclave-deze materialen, behalve de eenrichtings-Luer-kleppen; Steriliseer de kleppen met 70% ethanol.
      1. Verbind beide uiteinden van zes siliconen peristaltische buizen met "Male Luer to Barb" plastic fittingen door het Barb-uiteinde van de fitting in de buis te steken. Bedek de uiteinden van de mannelijke Luer met aluminiumfolie om besmetting te voorkomen.
         OPMERKING: Zes peristaltische buizen zijn voorbereid omdat het experiment zes 0,45 μm PVDF-filters gebruikt. Alle buizen worden later op dezelfde peristaltische pompkop gemonteerd, zodat alle filters identieke stroom ontvangen.
      2. Plaats de slang in een gesloten, steriliseerbare container.
      3. Plaats de ventilatiefilters in een gesloten, steriliseerbare container.
      4. Plaats de buisdoppen met siliconen slang die door de doppen lopen in een gesloten, steriliseerbare container.
         OPMERKING: De buisvormige flesdoppen die in dit protocol worden gebruikt, zijn uitgerust met drie buizen die de doppen doorkruisen: twee buizen met gelijke diameter voor het afleveren van medium tot de 0,45 μm PVDF-filters, en een derde buis met een bredere diameter. Deze buizen zijn stevig aan de doppen bevestigd en kunnen niet worden verwijderd.
      5. Doe 12 eenrichtings-Luer terugslagkleppen onder in een oplossing van 70% ethanol en laat ze een nacht steriliseren.
         OPMERKING: (PAUZEPUNT) Gesteriliseerde materialen kunnen ondergedompeld en tot 24 uur voor het experiment op kamertemperatuur worden afgesloten. Verwijder voor gebruik de kleppen uit de ethanol en spoel met steriel ultrazuiver water om restanten van ethanol te verwijderen. Als alternatief kunnen terugslagkleppen worden 3D-geprint met autoclavbare materialen om sterilisatie mogelijk te maken door autoclaven in plaats van ethanolbehandeling.
   5. Autoclave: de peristaltieke slang, ventilatiefilters, flesdoppen, gegradueerde cilinder en flessen met standaard labware-instellingen.
   6. Bereid 6.200 mL low rich-defined media (RDM; zie Tabel van Materialen) voor door de reagentia te mengen die in Tabel 2 zijn vermeld.
      OPMERKING: Bereid het medium voor op de dag van het experiment, tijdens de ongeveer 5 uur wachttijd na het starten van de pre-cultuur (zie stap 1.2.1). Dit behoudt de gemiddelde versheid en minimaliseert het risico op besmetting.
2. Bereiding van een bacteriële precultuur
   OPMERKING: Gebruik een pre-cultuur in de exponentiële fase om het experiment te starten. Tijdens deze fase groeien bacteriën in een constant tempo, waarbij ze celbestanddelen op een gebalanceerde manier synthetiseren en zich delen met een gedefinieerde celmassa. Gebruik exponentiële fasecellen om variabiliteit te minimaliseren en de beginfysiologische toestand te standaardiseren.
   1. De dag voor het experiment bereid je een nachtkweek (ON) als volgt voor: Inoculeer 3 ml volledige RDM met een bevroren glycerolvoorraad van E. coli NCM3722 in een steriele 15 mL kweekbuis. Breng de cultuur een nacht uit (~16 uur) bij 37 °C met schudden bij 200 rpm in een schudbare broedmachine.
      OPMERKING: (PAUZEPUNT) Zodra de ON-cultuur in de broedmachine zit, worden er op deze dag geen verdere stappen gevolgd. Hervat het protocol de volgende dag door stap 1.2.2 te volgen.
   2. Bereid op de dag van het experiment de pre-cultuur als volgt voor: Voeg 6 μL ON-kweek toe aan 6 mL volledige RDM. Verdeel ze gelijk in twee 15 mL kweekbuizen en label de buizen als A en B. Incubeer beide buizen bij 37 °C met schudden bij 200 tpm.
      OPMERKING: De pre-cultuur duurt doorgaans ongeveer 5 uur om de exponentiële fase te bereiken (OD₆₀₀ ≈ 0,5). Gebruik deze periode om het verse medium te bereiden (zie stap 1.1.6). Ga niet door naar stap 1.2.3 totdat OD₆₀₀ ongeveer 0,5 bereikt.
   3. Monitor de optische dichtheid (OD) op 600 nm met buis B. Ga verder met het experiment wanneer OD₆₀₀ ongeveer 0,5 bereikt, wat wijst op exponentiële groei van volledige RDM voor E. coli NCM3722 (zie sectie 1.4).
      OPMERKING: Begin het experiment met exponentiële fasecellen om reproduceerbaarheid te verbeteren en de startvoorwaarden te standaardiseren.
3. Voorbereiding van een experiment in de MCCD met constante nutriëntcondities
   OPMERKING: Voer stappen 1.3.1 tot 1.3.5 uit in een steriele bioveiligheidskast direct nadat de pre-cultuur begint te groeien.
   1. Verdeel het totale medium volume per fles.
      OPMERKING: Gebruik de flessen als medium reservoirs. Gebruik flesdoppen die zijn uitgerust met twee buizen met medium toediening, waarbij elke buis medium tot één 0,45 μm PVDF-filter levert. Verdeel het totale medium volume (bereid in stap 1.1.6) onder de flessen op basis van de hoeveelheid die per tijdpuntmonster (d.w.z. elk 0,45 μm PVDF-filter) gedurende het experiment nodig heeft.
      1. Gebruik de formule uit stap 1.1.1 om het volume medium te bepalen dat nodig is voor elk 0,45 μm PVDF-filter. Bijvoorbeeld, met de volgende termen:
         
         De totale middelgrote volumes die voor elk tijdstip nodig zijn, in chronologische volgorde, zijn 288, 576, 864, 1152, 1440 en 1728 mL.
      2. Verdeel de berekende mediumvolumes over flessen, waarbij de benodigde volumes voor twee tijdstippen in één fles worden gegroepeerd. Bijvoorbeeld: ~900 mL in één 1 L fles (voor tijdpunten 1 en 2), ~2.100 mL in één 2,5 L fles (voor tijdspunten 3 en 4), ~3200 mL van het medium in één 4 L fles (voor tijdspunten 5 en 6).
   2. Sluit elke fles af met de buisdoppen (Figuur 1C). Draai de doppen stevig vast om lekkages te voorkomen.
   3. Verbind een 0,2 μm ventilatiefilter op de breedste siliconen buis die uit de buis van de flesdop steekt (Figuur 1C). Dit maakt steriele luchtuitwisseling tijdens het experiment mogelijk.
   4. Bevestig één uiteinde van elke peristaltische buis (met bevestigde fittingen; zie sectie 1.1.4 over materiaalvoorbereiding) aan de kleinere siliconenbuizen die uit de buisvormige flesdoppen steken (Figuur 1C). Zorg voor veilige verbindingen om de steriliteit te behouden. Laat de aluminiumfoliekap op de vrije mannelijke Luer-slotbevestiging zitten totdat het experiment begint om besmetting te voorkomen.
   5. Plaats de flessen met hun samengestelde slang en de peristaltische pomp in een broedmachine die op 37 °C is ingesteld. Bevestig de slang in de kanalen van de peristaltische pompkop.
      OPMERKING: Alle peristaltische buizen zijn gemonteerd op dezelfde pompkop van een enkele peristaltische pomp, zodat alle 0,45 μm PVDF-filters medium van dezelfde pomp ontvangen. Het gebruik van één pomp zorgt ervoor dat de debiet identiek is tussen de filters en voorkomt variabiliteit die kan ontstaan door verschillen tussen de pompen.
4. Protocol van een experiment in de MCCD met constante nutriëntcondities
   1. Verdun de pre-cultuur (OD = 0,5) 1:10 door 600 μL pre-cultuur toe te voegen aan 5,4 mL verse lage RDM.
   2. Met een pipet van 1 mL wordt 1 mL van de verdunde voorcultuur in elk van de zes 0,45 μm PVDF-filters geïntroduceerd.
   3. Spoel de eenrichtingskleppen met autoclaved ultrazuiver water en bevestig er één aan elk uiteinde van elk 0,45 μm PVDF-filter.
   4. Verwijder de aluminiumfoliekappen van de peristaltische buiskoppelingen.
   5. Verbind elk van de zes 0,45 μm PVDF-filters op een mannelijke luer-aansluiting op de peristaltische buis (Figuur 1C).
   6. Stel de debiet in op 2 mL/min op de peristaltische pomp en start de doorstroming. Definieer dit moment als tijd 0.
   7. Plaats een afvalcontainer onder de 0,45 μm PVDF-filters om de afvoer op te vangen.
      OPMERKING: Figuur 2A toont de volledige assemblage van het experiment in de broedmachinebox.
5. Monsterverzameling
   1. Na 2 uur koppel je een van de twee 0,45 μm PVDF-filters los die op de 1 L fles zijn aangesloten.
   2. Schroef de eenrichtingsterugslagkleppen los en plaats het 0,45 μm PVDF-filter in een 50 mL centrifugebuis met de inlaat naar beneden gericht.
   3. Centrifugeer de centrifugebuis met het 0,45 μm PVDF-filter op 2.000 × g gedurende 2 minuten.
   4. Met een pijpsnijder oefent je zachte druk uit op de plastic behuizing aan het uiteinde dat het dichtst bij de uitlaat ligt om het 0,45 μm PVDF-filter te openen.
      OPMERKING: Desinfecteer de pijpsnijder vóór gebruik (bijvoorbeeld door te vegen met 70% ethanol) om besmetting te voorkomen bij het openen van het 0,45 μm PVDF-filter.
   5. Laat de binnenste cilinder los met het poreuze membraan en gooi het deel van het filter dat het membraan vasthoudt weg.
   6. Spoel de binnenwanden van de 0,45 μm PVDF-filterbehuizing (die loodrecht op de stromingsrichting) met het kweekmedium dat in de centrifugebuis is verzameld.
      OPMERKING: Deze stap zorgt ervoor dat alle cellen die tijdens centrifugatie aan de wanden zijn vastgehouden, worden verzameld.
   7. Meet het totale verzamelde volume met een 5 mL serologische pipet.
   8. Op volgende tijdstippen (4 uur, 6 uur, 8 uur, 10 uur en 12 uur) koppel u de overeenkomstige 0,45 μm PVDF-filters en herhaal stappen 1.5.2–1.5.6. Volg deze specifieke volgorde:
      1. Bij 4 uur koppel je het tweede 0,45 μm PVDF-filter dat op de 1 L fles is aangesloten.
      2. Bij 6 uur en 8 uur trek je de 0,45 μm PVDF-filters los die op de 2,5 L fles zijn aangesloten.
      3. Bij 10 uur en 12 uur trek je de 0,45 μm PVDF-filters die op de 4 L fles zijn aangesloten, los.
         OPMERKING: Volg deze volgorde om steekproeftijdpunten te koppelen aan de mediumvolumes die in stap 1.3.1 zijn verdeeld.
6. Downstream-analyses
   1. Neem drie 100 μL aliquoten uit elk monster en fixeer met glutaraldehyde tot een eindconcentratie van 1,5%.
      VOORZICHTIG: Glutaraldehyde is giftig, een sterke irriterende stof en een potentiële sensibilisator. Hanteer het in een chemische dampkap terwijl je de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen draagt (labjas, nitrilhandschoenen en veiligheidsbril). Vermijd huidcontact en inademing. Verwijder glutaraldehydehoudend afval volgens de institutionele regelgeving voor gevaarlijk chemisch afval.
   2. Gebruik de vaste monsters om het aantal cellen per microliter te tellen met flowcytometrie na labeling met een fluorescerend DNA-kleurstof.
      WAARSCHUWING: Fluorescerende DNA-kleurstoffen kunnen mutageen zijn. Draag handschoenen en voer afval met kleurstoffen af volgens de institutionele bioveiligheidsvoorschriften.
      OPMERKING: Als alternatief voor DNA-kleuring en flowcytometrie kunnen celdichtheden worden geschat door een klein volume van het monster te plateren op rijke-medium agarplaten (bijv. LB agar) en kolonievormende eenheden (CFU's) te tellen.
   3. Vermenigvuldig het celaantal per microliter met het totale volume gemeten in stap 1.5.7 om het totale aantal cellen binnen het 0,45 μm PVDF-filter te berekenen.
   4. Centrifugeer het resterende volume in 1,5-mL microcentrifugebuizen van 10.000 × g gedurende 4 minuten.
   5. Verwijder het supernatant.
   6. Bewaar de pellets van cellen bij -80 °C voor toekomstige analyses (bijv. transcriptomics).

Figuur 2: Experimentele assemblage van de MCCD. (A) Foto van de MCCD-opstelling voor constante voedingsomstandigheden. De opstelling is ondergebracht in een incubatorbox om een constante temperatuur te behouden, met een afvalcontainer die het doorstroommedium opvangt. (B) Foto van de MCCD-opstelling voor fluctuerende voedingsomstandigheden. De fles met rode tape gelabeld bevat een medium met een hoge voedingsconcentratie (C_High), terwijl de fles met blauw tape een laag voedingsstoffengehaltemedium bevat (C_Laag). Het metalen platform in het midden ondersteunt de componenten die voedingsfluctuaties reguleren, overeenkomend met die beschreven in Figuur 1D. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Bacteriële groei onder schommelende voedingsstoffen

1. Assemblage van een regelaar voor een solenoïdeklep
   OPMERKING: Bedien de drieweg-solenoïdeklep met een op microcontroller gebaseerde schakelschakeling die is aangesloten op een computer met een aangepaste grafische gebruikersinterface (GUI) ontwikkeld in MATLAB.
   1. Assembleer het spoelklepregelcircuit (Figuur 3A).
      1. Verbind een digitale uitgangspin van de microcontroller met de basis van een NPN-transistor via een weerstand van 1 kΩ.
      2. Verbind de collector van de transistor met de negatieve pool van de magnetodemaan.
      3. Verbind de emitter van de transistor met de aarde.
      4. Verbind de positieve pool van de solenoïdeklep met een externe gelijkstroomvoorziening die compatibel is met de klepspanning.
      5. Plaats een diode over de solenoïde-terminals. Verbind de gestreepte zijde van de diode met de positieve voedingslijn.
         OPMERKING: De diode onderdrukt spanningspieken die ontstaan wanneer de solenoïde wordt uitgeschakeld.
   2. Bevestig plastic "Threaded to Hose Barb" koppelingen aan de solenoïdekleppen, zodat het uiteinde van de Barb naar buiten uitsteekt.
   3. Installeer MATLAB R2022b of later op een computer met USB-verbinding.
   4. Installeer het MATLAB-ondersteuningspakket dat nodig is voor seriële communicatie met microcontrollerhardware.
   5. Verbind de microcontrollerkaart met een USB-kabel op de computer om seriële communicatie tot stand te brengen.
   6. Open de MATLAB-gebaseerde GUI die wordt gebruikt om fluctuerende voedingsomstandigheden in de MCCD te genereren (beschikbaar via de link https://github.com/juanitaLara/MCCD).
   7. Controleer de verbinding tussen de solenodemieven en het MATLAB GUI-platform:
      1. Open het GUI-platform in Matlab en klik op de Connect-knop (Figuur 3B). Wacht tot het bericht 'Controller heeft succesvol verbonden' in het commandovenster verschijnt.
      2. Voer een waarde in voor de tijdstap (bijv. 5 s voor de hoge en lage fasen) onder het geautomatiseerde bedieningspaneel .
      3. Let op de solenoïdekleppen en luister naar het klikgeluid dat ze maken tijdens het schakelen tussen de twee media.
      4. Controleer met een horloge of de solenoïdekleppen precies op het opgegeven interval schakelen (bijvoorbeeld elke 5 seconden).
         OPMERKING: Voer deze verificatie uit vóór elk experiment om communicatie en correcte klepwisseling te bevestigen. (PAUZEPUNT) Na verificatie van de werking van de solenoïdeklep kan het systeem enkele uren in de incubator blijven zitten voordat het experiment begint.
2. Voorbereiding van media en materialen
   OPMERKING: Dit protocol houdt in dat voedingsomstandigheden worden afwisselend tussen lage en hoge RDM met een periode van 1 uur (30 minuten bij hoge RDM gevolgd door 30 minuten bij lage RDM). Het experiment loopt drie uur fluctuaties, met twee monsters verzameld: (1) Na 3 uur en 1 minuut (hoge RDM-fase, direct na de overgang van laag naar hoog), en (2) na 3 uur en 31 minuten (lage RDM-fase, direct na de overschakeling van hoog naar laag).
   1. Schat de benodigde kweekmediavolumes per experimentele fasen.
      1. Bereken eerst de benodigde volumes voor de eerste 3 uur (drie volledige fluctuatieperioden):
         laag RDM-volume = 1,2 × 2[mL/min] × 90[min] × 2[0,45 μm PVDF-filters] = 432[mL]
         hoog RDM-volume = 1,2 × 2[mL/min] × 90[min] × 2[0,45 μm PVDF-filters] = 432[mL]
      2. Bereken het volume dat nodig is voor de laatste 30 minuten fase:
         hoog RDM-volume = 1,2 × 2[mL/min] × 30[min] × 1[0,45 μm PVDF-filters] = 72[mL]
      3. Rond de volumes af op handige waarden (bijv. 500 mL lage RDM en 600 mL hoge RDM).
   2. Bereid materialen voor voor autoclaafsterilisatie (zie Tabel 3) door stappen 1.1.4 –1.1.5 te volgen.
      OPMERKING: Bereid de materialen voor en steriliseer het materiaal de dag voor het experiment om gereedheid te waarborgen en vertragingen op de proefdag te minimaliseren (stappen 2.2.3 en 2.2.4). Deze opstelling vereist, in vergelijking met de constante-nutriëntenexperimenten, extra slangen om mediaflessen direct aan het solenoodemleppen te verbinden (Figuur 1B,D). Deze buizen vereisen slechts één "Barb to Male Luer"-koppeling, omdat de solenoïdeklepkoppelingen vooraf zijn gemonteerd. Bedek de uiteinden van deze buizen met aluminiumfolie voordat je autoclaveert.
   3. Steriliseer de voorbereide peristaltische slang, ventilatiefilters, doppen, gegradueerde cilinder en flessen in een autoclave.
   4. Doe 4 eenrichtings-Luer terugslagkleppen in een 70% ethanoloplossing en laat ze een nacht steriliseren.
      OPMERKING: (PAUZEPUNT) Gesteriliseerde terugslagkleppen kunnen een nacht in ethanol blijven en tot 24 uur op kamertemperatuur worden bewaard. Spoel de kleppen voor gebruik met steriel Milli-Q water.
   5. Maak de solenoïdekleppen schoon en steriliseer ze door ze 3–5 keer door te spoelen met 70% ethanol, gevolgd door ultrazuiver water 3–5 keer.
   6. Op de dag van het experiment, tijdens de ongeveer 5 uur durende wachttijd na pre-kweekvoorbereiding (zie stap 2.3), bereid 500 mL low RDM en 600 mL high RDM door de reagentia te mengen die in tabel 4 zijn vermeld.
      OPMERKING: Het bereiden van het medium op de dag van het experiment zorgt voor versheid en minimaliseert het risico op besmetting.
3. Bereiding van een bacteriële precultuur
   1. Volg de stappen die in stap 1.2 zijn beschreven.
4. Voorbereiding van een experiment in de MCCD met fluctuatie-nutriëntencondities
   OPMERKING: Voer stappen 2.4.1–2.4.4 uit in een steriele bioveiligheidskast direct nadat de pre-cultuur begint te groeien.
   1. Doe elk medium in een fles van 1 liter.
   2. Sluit de flessen af met de vooraf gemonteerde doppen die zijn voorzien van drie poorten en vooraf geïnstalleerde siliconen slangen. Draai de doppen stevig vast om lekkages te voorkomen.
   3. Sluit een 0,2 μm ventilatiefilter aan op de brede siliconen buis die uit een van de poorten op elke flesdop loopt.
   4. Verbind de "inlaatbuis" (getoond in Figuur 1D) met de siliconen buizen die uit de buisdoppen lopen voordat je hem aansluit op de solenoïdekleppen:
      1. Bevestig één uiteinde van de siliconen buis (met slechts één bevestigde fitting) aan de slang die uitsteekt vanaf de dop van de lage RDM-fles.
      2. Laat het aluminiumfoliedeksel op de vrije Male Luer lockfitting zitten totdat de flessen naar de broedmachine worden gebracht om besmetting te voorkomen.
      3. Herhaal stap 2.4.4.1 voor de fles met hoge RDM.
   5. Plaats de flessen met hun samengestelde "inlaatbuis", de peristaltische pomp en de solenoïdekleppen met de controller in een broedmachine die op 37 °C is ingesteld.
   6. Verbind de "inlaatbuis" (bevestigd in stap 2.4.4) op de inlaten van de solenoïdekleppen op de volgende manier:
      1. Verbind de twee buizen van de low RDM-fles met een van de twee inlaten in elke solenoïdeklep (buisjes gelabeld met blauw tape in Figuur 1D).
      2. Verbind de twee buizen van de hoge RDM-fles met een van de twee inlaten in elke solenoïdeklep (buizen gelabeld met rode tape in Figuur 1D).
   7. Verbind een siliconenbuis compatibel met de peristaltische pomp (met slechts één fitting) op de uitlaat van elke solenoïdeklep (Figuur 1D). Laat de aluminiumfoliekap op de vrije Male Luer lockfitting zitten totdat het experiment de steriliteit begint te behouden.
5. Protocol van een experiment in de MCCD met fluctuatierende voedingsstoffen
   1. Controleer de verbinding tussen de solenoïdekleppen en de Matlab-software door stap 2.1.7 uit te voeren.
   2. Voer de gewenste tijdstappenwaarden voor de fluctuaties in het Matlab GUI-platform: voer tijdstappen in van 1800 s in High RDM (30 min) en 1800s in Low RDM (30 min).
   3. Selecteer Low onder het Start van-menu om te beginnen in de Low RDM-conditie (Figuur 3).
   4. Seed de twee 0,45 μm PVDF-filters zoals beschreven in stap 1.4.
   5. Begin het experiment.
      OPMERKING: Figuur 2B toont de volledige fluidische assemblage voor dit experiment.
6. Monsterverzameling
   1. Verzamel monsters zoals in stap 1.5. Oogst het eerste 0,45 μm PVDF-filter na 3 uur en 1 minuut en het tweede na 3 uur en 31 minuten.
      OPMERKING: Koppel eerst een van beide filters los; Beide filters worden gevoed door hetzelfde medium.
7. Downstream-analyses
   1. Volg de stappen beschreven in stap 1.6 om het aantal cellen te tellen via flowcytometrie en om monsters te verwerken en op te slaan voor downstream analyses (bijv. transcriptomics).

Figuur 3: Regelaar van de solenoïdekleppen om voedingsfluctuaties op te wekken. (A) Draadschema van het elektronische circuit dat wordt gebruikt om de magnetoïdeklep te bedienen. Het circuit bestaat uit een microcontrollerprintplaat, een transistor die als schakelelement wordt gebruikt, een weerstand die is aangesloten op de transistorbasis, en een flybackdiode die over de solenoïdeklep is geplaatst om het circuit te beschermen tegen spanningspieken die ontstaan tijdens het schakelen van de buis. De microcontroller bestuurt de transistor, die op zijn beurt de stroom naar de solenoïdeklep schakelt. Aangepast met toestemming uit ref. ²⁰ . (B) Nadat de microcontrollerkaart is aangesloten op zowel de computer die de GUI draait als een stroombron met de spanning die door de magnetodemleppen vereist is, wordt communicatie tot stand gebracht door op de Connect-knop te klikken. De kleppen kunnen handmatig worden bediend met het Manual Operator-paneel , waar de gebruiker het medium selecteert dat wordt gelaten (bijvoorbeeld "Hoog" of "Laag"). Alternatief stelt het paneel Geautomatiseerde Operatie de gebruiker in staat het initiële medium en de tijdsstappen (in seconden) voor elke fase (Hoog en Laag) te specificeren, en de bewerking te starten door op de Startknop te klikken. De Real-time Monitor toont een stapfunctie (0 = Laag, 1 = Hoog) over de tijd, die aangeeft welk medium in de voorgaande seconden door de solenoïdekleppen naar de filters stroomde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

In deze studie gebruikten we de MCCD om de groeisnelheid van E. coli NCM3722 te kwantificeren onder constante laag-nutriëntencondities bij drie RDM-concentraties. Deze concentraties zijn afgeleid van de rich-defined medium (RDM)-formule beschreven door Neidhardt¹⁹, waarbij de aminozuur- en nucleobasensupplementen verdund werden tot respectievelijk 0,5%, 0,25% en 0,01% van de oorspronkelijke formulering.

Replicate groeiexperimen...

Discussie

Bacteriële kweekmethoden die de voedingscomplexiteit van natuurlijke omgevingen vastleggen, zijn essentieel om de studie van microbiële fysiologie verder te brengen dan vereenvoudigde laboratoriumomstandigheden. Natuurlijke ecosystemen bevatten mengsels van voedingsstoffen over een breed concentratiebereik, die vaak geen maximale groeisnelheden ondersteunen^van 1,3,4,21,22,23.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1K Ohm Weerstand	BC Robotics	ELC-021	Vermogenswaarde: 1/6 W
1N4001 Diode	BC Robotics	ELC-001	DC Reverse Voltage: 50 V; Gemiddelde Gelijkrichter Stroom: 1 A
3-stop platina-geharde siliconen peristaltische slang	Innofluid	SE-TUB-SIL-SSS-2.4*0.8	Binnendiameter 0,8 mm; buitendiameter 2,4 mm; compatibel met gebruikte peristaltiekpomp
3-weg Solenoid kleppen	Emerson Electric Co.	0055A301L0T00F3	12 V DC, 1 W
Aluminiumfolie			Geschikt voor autoclaven
Arduino Uno Rev4	Arduino	SKU ABX00173
Autoclaaf	Systec	D-200	Of een andere bedrijf
Dopdop met drie poorten – voor flessen van 1 en 2 L	Nalgene	2162-0531	Of een andere bedrijf (zorg ervoor dat ze passen bij de geselecteerde flessen)
Dopdop met drie poorten – voor 4 L fles	Nalgene	2162-0830	Of een andere bedrijf (zorg ervoor dat ze passen bij de geselecteerde flessen)
Celdichtheidsmeter CO8000	WPA biowave		OD meter
Centrifuge	Eppendorf	5804R	Centrifuge die past op 50 mL Falcon tubes
Centrifuge	Eppendorf	5424R	Centrifuge die past op 1,5 en 2 mL eppendorf tubes
Conische centrifugebuis - 50 mL	Fischer Scientific	10788561	Falcon buis
Kweekbuisjes (14 mL, steriel)	Greiner bio-one		Kweekbuisjes
Ethanol	Sigma Aldrich	493511	Verdunnen tot 70%
Flow cytometer	Beckman	C09756	CYTOFlex
Glutaraldehyde 25%	Sigma Aldrich	G5882	Of een andere bedrijf
Gradueerde cilinder - 500 mL	Nalgene	3662-0500	Of een andere bedrijf
Incubatorkast			Op maat gemaakte incubatorkast – neem contact op met de corresponderende auteurs voor constructiedetails
LabV1 Intelligent Low Flow Rate Peristaltic Pump	Innofluid	SE-LABV1-AMC12(10)	Beschikbaar bij Darwin Microfluidics
Mannelijke Luer-naar-barbed fitting	Aldrich	Z277142	Mannelijke Luer-naar-barbed adapter compatibel met 0,8 mm ID slang (zie figuur 1C)
Mannelijke Luer-naar-schroefdraad fitting	Aldrich	Z277142	Wordt gebruikt om de solenoidklep te verbinden met de "inlaatslang" (zie figuur 1D)
Matlab	Mathworks	R2022b of later	Software om de op maat gemaakte software voor de solenoidkleppen uit te voeren
MOPS EZ Rich Defined Medium Kit	Teknova	M2105	MOPS medium voor Enterobacteriën
Eenrichtings Luer klep	Masterflex	30505-92	Voorkomt terugstroming in medium reservoirs
Pijpsnijder - 0-37 mm	KS Tools	2222051	Of een andere bedrijf
Pipetset	Fisher Scientific	05-403-151	Of een andere bedrijf
Platinageharde siliconen slang - 1/16 inch	Nalgene	8060-0020	Binnendiameter 1/16 inch (1,6 mm); gebruikt voor experimenten met fluctuerende voedingsstoffen
Platinageharde siliconen slang - 1/8 inch	Nalgene	8060-0030	Binnendiameter 1/8 inch (3,2 mm); gebruikt voor experimenten met fluctuerende voedingsstoffen
Polypropyleencopolymeer fles - 1 L	Nalgene	2126-1000	Of een andere bedrijf
Polypropyleencopolymeer fles - 2 L	Nalgene	2126-2000	Of een andere bedrijf
Polypropyleencopolymeer fles - 4 L	Nalgene	2126-4000	Of een andere bedrijf
Serologische pipet - 5 mL	Corning	CLS4487	Of een andere bedrijf
Solderloos Breadboard	BC Robotics	PROTO-001
Sterivex-HV filter - 0,45 µm PVDF	Millipore	SVHV01015
SYBR Green I Nucleïnezuur Gel Stain	Invitrogen	S7563	Nucleïnezuurkleuring voor celtelling in flow cytometer
TIP120 Darlington Transistor	BC Robotics	TRN-005
Buisjes - 1,5 mL	Eppendorf	3810X	Buisjes voor het centrifugeren van celculturen en het opslaan van pellets
Ventfilter	Millex	SLFG05000	0,2 µm hydrofoob ventfilter
Afvalbak			Het volumecapaciteit moet minimaal gelijk zijn aan het totale mediavolume dat in het experiment wordt gebruikt