Ontwikkeling van een rat caudaal interlichaamfusiemodel: een pilothaalbaarheidsstudie

Samenvatting

Deze studie toonde de technische haalbaarheid aan van een pilotrat-caudaal interlichaamfusiemodel met behulp van posterieure kooi en plaatfixatie. Histomorfometrische analyse na 12 weken bevestigde continue botbruggen en duidelijke patronen van intra-kooi botrijping. Dit technische model dient als voorlopige basis voor toekomstige grootschalige studies.

Samenvatting

Ratten-staartwervels worden veel gebruikt bij botregeneratie en ruggenmergfusieonderzoek als handige locaties voor het testen van bottransplantatiematerialen en implantaten. Eerdere modellen van rattenstaartfusie hebben intervertebrale fusie bereikt door schijfverwijdering en bottransplantatie, of met externe fixatieapparaten. Toch is er geen enkel model voor kleine dieren ontwikkeld dat een interbody fusiekooi gebruikt die analoog is aan die klinisch gebruikt. Er werd verondersteld dat een waardevolle botfusieomgeving kon worden opgezet zonder neurologische complicaties door een achterste kooi-inbreng uit te voeren die klinische procedures nabootst, aangevuld met plaatfixatie, in de rat-caudale wervels. Deze voorlopige pilotstudie (n = 1) was bedoeld om de technische haalbaarheid te evalueren. Er werd een chirurgische methode ontwikkeld waarbij een miniaturiseerde titanium kooi precies werd ingebracht in de geresecte schijfruimte tussen de aangrenzende staartwervels, wat nauw overeenkwam met de menselijke chirurgische procedure. Titanium werd geselecteerd voor de kooi vanwege het brede klinische gebruik en de biocompatibiliteit. De eerste resultaten toonden de technische haalbaarheid van deze aanpak aan. De geïmplanteerde kooi behield de hoogte van de tussenwerpschijf en de uitlijning van de wervelkolom. Er werd progressieve botgroei door de kooi waargenomen, met als hoogtepunt een bevestigde continue botbrug over de tussenwervelruimte na 12 weken postoperatief. De aanwezigheid van een continue trabeculaire structuur en het ontbreken van tussenliggend vezelig weefsel werden radiologisch en histologisch bevestigd. Al met al biedt dit kooi-gebaseerde ratstaartfusiemodel een veelbelovend platform voor het evalueren van nieuwe biomaterialen en het onderzoeken van mechanismen van intervertebrale botfusie. Het ontbreken van een controlegroep en statistische analyse, door het ontwerp voor één subject, beperkt echter de generaliseerbaarheid van deze bevindingen en vereist verdere validatie.

Inleiding

Interlichaamfusie is een gevestigde chirurgische behandeling voor diverse wervelkolomaandoeningen, waaronder instabiliteit, spondylolisthesisen en degeneratieve ziekten; Opmerkelijk is dat het zich in ongeveer 70 jaar heeft ontwikkeld als standaardprocedure ^1,2. De procedure omvat het verwijderen van de tussenwervelschijf en het plaatsen van een kooi of bottransplantatie om een solide fusie tussen aangrenzende wervels ^3,4 te bevorderen. Bovendien vermindert het toevoegen van posterior instrumentatie met kooien de pseudarthrose-frequentie en vergroot het de klinische indicaties⁵. Desalniettemin blijven complicaties zoals pseudarthrose en kooiverzakking aanzienlijke klinische uitdagingen, wat betrouwbare preklinische modelontwikkeling vereist om nieuwe materialen en fusiebevorderende factoren^te evalueren ^6,7.

Ratten worden veel gebruikt in onderzoek naar wervelkolomfusie vanwege hun economische haalbaarheid, snelle voortplanting, snelle genezing en gebruiksgemak ^8,9. Desalniettemin vertonen de bestaande ratten-interbody fusiemodellen aanzienlijke beperkingen. Specifiek vereist de anterior lumbale interbody fusie (ALIF) benadering bij ratten grote ambulance van de buikvaten en orgaan, wat resulteert in een hoge chirurgische invasieve invasieve en aanzienlijke complicatierisico's^10,11. De posterior lumbale interbody fusie (PLIF) benadering brengt een onvermijdelijk risico op neurologisch letsel met zich mee vanwege de extreem kleine wervelkolomkanalen en neurale elementen, waardoor neurale retractie vrijwel onmogelijk is¹². Daarom zijn de meeste rattenstudies beperkt gebleven tot posterolaterale fusie (PLF), die structureel niet de mechanismen van botfusie binnen de kooi onderzoekt, een cruciaal aspect in klinische omgevingen¹³. Bovendien bestaan er caudale modellen, maar ze missen een evaluatiesysteem dat een klinisch-achtige interlichaamkooi integreert met fixatie van posterieure plaat.

De staartwervelkolom van ratten biedt unieke voordelen bij interlichaamfusieonderzoek. Staartschijven vertonen sterke geometrische, samenstellende en mechanische overeenkomsten met de menselijke lumbale schijven, waardoor ze steeds populairder worden in schijfonderzoek^14,15. Daarnaast biedt caudale wervelkolomchirurgie gemakkelijke chirurgische toegang, kosteneffectiviteit en een snelle postoperatieve herstel vergeleken met lumbale benaderingen¹⁶. Tot op heden hebben echter geen studies succesvolle inzetting van de achterste kooi in de staartwervelkolom van de ratten gerapporteerd, met een gedetailleerde histologische evaluatie van botvorming binnen en rond de kooi.

Histologische beoordeling, met name van niet-gedecalcificeerde bothistomorfometrie, blijft de gouden standaard voor het evalueren van osseointegratie en botfusie^17,18. Specifiek maakt het kwantitatieve analyse mogelijk van kritieke botvormingsparameters, waaronder botvolume/weefselvolume (BV/TV), trabeculair aantal en trabeculaire dikte, terwijl het kwalitatieve beoordeling van botrijpheid mogelijk maakt door onderscheid te maken tussen lamellair bot^19,20. Zo'n gedetailleerde histomorfometrische evaluatie kan de ruimtelijke en temporele osteoconductiepatronen binnen de kooi en bij de kooi-wervelinterfaces^{onthullen 21,22}. Desalniettemin ontbreekt een uitgebreide histomorfometrische evaluatie van kooiosteoconductie in rattenmodellen.

Deze studie had als doel een pilot-rat-caudaal interlichaamfusiemodel te ontwikkelen met behulp van posterieure kooi-inbrenging en aanvullende plaatfixatie om de technische haalbaarheid aan te tonen. Deze studie presenteert een gedetailleerde chirurgische techniek en een uitgebreide histologische evaluatie van botvorming binnen de kooi en aan de grensvlakken van de wervels. Er werd verondersteld dat een waardevolle botfusieomgeving kon worden opgezet zonder neurologische complicaties door een achterste kooi-inbreng uit te voeren die klinische procedures nabootst, aangevuld met plaatfixatie, in de rat-caudale wervels. Dit model biedt een efficiënt platform voor het evalueren van interlichaamfusiematerialen en vertegenwoordigt in de bestaande literatuur een initiële technische verkenning van succesvolle plaatsing van posterieure kooien met behulp van histomorfometrische osteoconductiebeoordeling in een rattenmodel.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de protocollen goedgekeurd door het Jikei University Animal Care and Use Committee (goedkeuringsnummer 2023–034C1). Deze studie was opgezet als een pilothaalbaarheidsstudie. Om de technische haalbaarheid van deze zeer kwetsbare en nieuwe achterste kooi-inzetting in de staartwervelkolom van de rat te beoordelen vóór grootschalige validatie, werd volgens ethische richtlijnen één dier (n = 1) gebruikt om het gebruik van dieren tijdens de initiële technische evaluatie te minimaliseren. Mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten werden geselecteerd als standaardstam voor onderzoek naar spinale fusie. De inclusiecriteria waren gezonde mannen van 8–10 weken oud, met een gewicht tussen 200–250 g, om te garanderen dat de hoogte van de tussenwervelschijf (1,8–2,2 mm) compatibel is met de kooi van 2 mm. Dieren die > 10% gewichtsverlies vertoonden tijdens de acclimatisatieperiode, verminderde activiteit of zichtbare staartmisvormingen werden uitgesloten. Voor deze studie was een mannelijke Sprague–Dawley-rat (8 weken oud, 221,8 g; Japan SLC, Shizuoka, Japan) werd gebruikt. Het dier werd gehuisvest in een gecontroleerde omgeving bij 25°C en een relatieve luchtvochtigheid van 50% (toegestane schaal 30–70%) met een licht/donkercyclus van 12 uur en kreeg ad libitum toegang tot water en een standaard knaagdierdieet. Ratten werden gehuisvest in kooien met een vaste bodem, voorzien van nestmaterialen en kauwstokken voor milieuverrijking. Voorafgaand aan de chirurgische ingreep werd een acclimatisatieperiode van 3 dagen ingevoerd. Om te voorkomen dat kooigenoten aan de staartimplantaten zouden knabbelen, werd de rat gedurende het hele onderzoek onder enkelhuisomstandigheden gehouden, wat een cruciale factor was in dit experimentele ontwerp.

Voorbereiding van schroeven en platen

Interne fixatiematerialen werden voorbereid voorafgaand aan de operatie. Commercieel verkrijgbare roestvrijstalen schroeven (originele diameter: 1,2 mm, lengte: 14 mm) werden met een draadsnijder tot een precieze lengte van 6 mm gesneden (Figuur 1A). Deze schroeven werden gesteriliseerd met standaard stoomautoclaven bij 121 °C gedurende 20 minuten. In een polyoxymethyleen (POM) interne fixatieplaat (18 mm lengte, 3 mm breedte, 1 mm dikte) werden schroefgaten met een diameter van 1,2 mm met een handboor om 12 mm geboord (Figuur 1B–D). Vervolgens werden de hoeken van de POM-platen afgerond met een draadknipper om irritatie van het omliggende zachte weefsel te minimaliseren (Figuur 1E). De platen werden gesteriliseerd met ethyleenoxide (EtO) gas of waterstofperoxidegasplasma, gezien de thermische gevoeligheid van het polymeer. De titanium kooi heeft een onderling verbonden roosterstructuur met longitudinale kanalen van 300–500 μm in diameter. Het oppervlak werd voorbereid met behulp van Lamellar 3D Titanium Technology om een micro-oppervlakteruwheid van 3–5 μm te bereiken, wat directe botgroei vergemakkelijkt.

Anesthesie en chirurgische ingreep

Er werd geen preoperatief vasten uitgevoerd om onnodige metabole stress te voorkomen. De anesthesie werd geïnduceerd via een drievoudig anesthesiummengsel bestaande uit medetomidine (0,15 mg/kg), midazolam (2 mg/kg) en butorphanol (2,5 mg/kg), toegediend via subcutane injectie in de dorsum met een 25-gauge naald²³. Elke 15 minuten werd een adequate chirurgische anesthesielaag beoordeeld door het verlies van de pedaalterugtrekkingsreflex (teenknijpen) te bevestigen, roze slijmvliezen te behouden en de ademhalingsfrequentie te monitoren (70–110 ademhalingen/min). Vervolgens werd de chirurgische procedure voor interlichaamsfusie van de staartwervels uitgevoerd. Het dier werd in de buikligging gelegd (Figuur 2A), en de hele staart werd ontsmeten na een drieronden-afwisselend scrubprotocol (70% ethanol, povidon-jodiumscrub en 70% ethanol) om een steriel veld te garanderen. Om de doelwervels te identificeren, werd handmatig palpatie uitgevoerd vanaf het heiligbeen distale. De eerste mobiele verbinding werd geïdentificeerd als de sacrum-Co1-overgang, en het direct distale segment werd aangeduid als Co2, waarmee de Co2–Co3-doellocatie werd gedefinieerd. Er werd een lengtesnit van ongeveer 2 cm gemaakt aan de dorsale zijde, die zich uitstrekt van de tweede tot de derde staartwervel (Co2–Co3) (Figuur 2B), om het achterste oppervlak van elke wervel bloot te leggen. Tijdens de blootstelling werd zorgvuldig geacht om schade aan de dorsale caudale vena te identificeren en te voorkomen; Stomp dissectie en bipolaire elektrocauterisatie werden gebruikt om kleine bloedingen te beheersen. Om de fusieplaats voor te bereiden, werd de annulus fibrosus tussen de Co2- en Co3-wervels met een scalpel ingesneden (Figuur 2C). De annulus fibrosus en nucleus pulposus werden vervolgens zorgvuldig verwijderd via curettage met een curette en kleine pincetten (Figuur 2D). Deze stap werd uitgevoerd onder een chirurgische vergroting met hoog vermogen (≥3,5x). De volledigheid van verwijdering werd objectief bepaald door de visuele bevestiging van punctate bloeding (het "bloedige eindplaat"-teken) en de volledige afwezigheid van restweefsel. Onaanvaardbare eindplaatschade werd gedefinieerd als diepe erosies waarbij > 25% van het totale oppervlak of penetratie in het afstotende bot > 0,5 mm omvatte. Een titanium kooi (2 × 2 mm doorsnede, 2 mm hoogte) (Figuur 2E) werd vervolgens diep in de tussenwervelruimte geplaatst totdat een fysieke stop werd bereikt en het contact met beide eindplaten visueel werd bevestigd, wat een stevige interferentiepasvorm creëerde (Figuur 2F, 2G).

Fixatie en wondsluiting

Om plaatfixatie te vergemakkelijken, werd het botoppervlak rond de aangewezen gaten in de Co2- en Co3-wervels afgevlakt met een elektrische handrouter die werkte op 7.800 toeren per minuut, uitgerust met een 2,0 mm bolvormige vijlbraam (Figuur 2H). Botgaten werden afzonderlijk geboord op intervallen die overeenkwamen met de schroefgaten van de plastic interne bevestigingsplaat met een handboor uitgerust met een boor van 1,2 mm diameter (Figuur 2I). Twee 6 mm roestvrijstalen schroeven werden vervolgens vooraf in de gaten gezet. van de plastic plaat (Figuur 2J). Schroeven werden onder een hoek van 90° geplaatst tot een gestandaardiseerde diepte van 5 mm met een afstand van 12 mm tussen het midden (Figuur 2K). Ten slotte werd de huidincisie gesloten met 4-0 nylon hechtingen en werd de staart opnieuw gedesinfecteerd met 70% ethanol om de procedure te voltooien.

Postoperatief beheer en euthanasie

Tijdens de directe herstelfase (Dag 0) werd het dier elke 15 minuten gemonitord en werd de rectale temperatuur ondersteund totdat het volledige sternale ligstand en doelgerichte beweging bereikte. Voor langetermijnbeoordeling (weken 1–12) werd een dagelijks scoresysteem geïmplementeerd op basis van Body Condition Score (BCS), verzorgingsstatus en algemene activiteit, naast dagelijkse monitoring van de chirurgische locatie op infectie of dehiscentie. Vochtig voer werd tijdens de eerste 48 uur op de vloer van de kooi geserveerd. Het lichaamsgewicht werd wekelijks gemeten. Humane eindpunten voor vroege euthanasie werden strikt gedefinieerd als: gewichtsverlies ≥20%, BCS ≤2,0, aanhoudend onvermogen om voedsel/water te bereiken > 12 uur, tekenen van hevige pijn/dyspneu, of ernstige complicaties op de chirurgische plaats (bijv. necrose). Dieren die aan deze criteria voldeden, werden binnen 24 uur op humane wijze geëuthanaseerd. Postoperatieve zorg omvatte de toediening van cefalexine (15 mg/kg) direct na de operatie intramusculair en postoperatief na 24 uur om infectie te voorkomen. Bij pijnstilling werd carprofen (2 mg/kg) direct na de operatie subcutaan toegediend en postoperatief om 12, 24 en 48 uur, in totaal vier doses. Twaalf weken na de implantatie werd de rat geëuthanaseerd via een isoflurane-overdosis. Het segment van de tweede tot de derde staartwervel werd vervolgens in één blok geoogst en vastgezet in 70% ethanol.

Trainingsaanbevelingen, probleemoplossing en steekproefgrootte. Om de succesvolle invoering van dit veeleisende protocol te vergemakkelijken, moeten nieuwe operators 3–5 oefenprocedures uitvoeren op rattenkadavers, waarbij ze bekwaamheid bereiken wanneer drie opeenvolgende plaatsingen geen radiografische mispositionering vertonen. Veelvoorkomende probleemoplossing omvat het vooraf meten van de schijfhoogte via röntgenfoto om de kooigrootte te optimaliseren en het opnieuw verifiëren van de dorsale botvlakheid om migratie van de kooi te voorkomen. Als de schroefaanslag onvoldoende is, wordt het aanbevolen om lagere boortoestellen te gebruiken. Voor toekomstige validatiestudies wordt een minimale steekproefgrootte van n = 6 tot 10 per groep aanbevolen (met een extra 10–20% voor uitval) om voldoende statistische kracht te bereiken. Bovendien moeten toekomstige studies controlegroepen (bijv. lege kooi of autograft) bevatten om de prestaties van het biomateriaal te valideren.

Radiologische en histologische analyse

Micro-computertomografie (CT) scanning en digitale radiografie werden uitgevoerd met een micro-CT scansysteem met een buisspanning van 80 kV en een stroom van 0,1 mA. Tijdens de aanschaf werd een aluminiumfilter van 1,0 mm dik gebruikt om de balkverhardingsartefacten veroorzaakt door het titaniumimplantaat te minimaliseren. Voor longitudinale beoordeling werd in vivo beeldvorming uitgevoerd na 1 en 4 weken postoperatief met een voxelgrootte van 120 μm. Ex vivo beeldvorming werd uitgevoerd na 12 weken postoperatief met een 24 mm monsterhouder met een voxelgrootte van 24 μm. CT-gegevens en radiografische beelden werden gereconstrueerd met een standaard gefilterd backprojectie-algoritme en geanalyseerd met een DICOM-viewer. Kwantitatieve criteria werden vastgesteld om botverbondenheid te beoordelen. Radiologisch werd succesvolle fusie bevestigd toen een continue trabeculaire structuur die de hersen- en caudale eindplaten van de wervels overbleef, werd waargenomen over ten minste drie opeenvolgende sneden op micro-CT. Tijdens beeldsegmentatie werd een globale drempel van 700 Hounsfield-eenheden (HU) toegepast. Histomorfometrisch werd een BV/TV-verhouding van 70% of meer binnen de kooi beschouwd als de drempel voor fysieke ruimtelijke vervulling en fusie. Histologisch werd botvereniging gedefinieerd door volledige botoverbrugging van de kraniale naar de caudale zijde zonder het inwisselen van vezelig weefsel. Voor histologische analyse werd sequentiële fluorochroomlabeling uitgevoerd door subcutane injectie van calceïne (8 mg/kg) twee dagen voor euthanasie om de ruimtelijke verdeling van actieve mineralisatie op het terminale 12-wekentijdstip te bepalen. De verwijderde staartwervels werden 7 dagen vastgezet in 70% ethanol en en bloc gekleurd met Villanueva botkleuring. Monsters werden gedehydrateerd door stijgende niveaus van ethanol, ingebed in methylmethacrylaathars, en midden-sagitaal gesneden in het precieze geometrische midden van de kooi, zoals bepaald door voorafsnijdende Micro-CT-geleiding met behulp van een diamantzaagmicrotoom. Ongedecalcificeerde grondmonsters (5 μm dikte) werden voorbereid bij het Ito Bone Histomorphometry Institute (Niigata, Japan). Beelden werden gemaakt met een brightfieldmicroscoop en een confocale laserscanningsmicroscoop voor fluorescentie-samensmelting. Verder onderzoek werd uitgevoerd onder een gepolariseerde lichtmicroscoop en de histomorfometrische analyse werd uitgevoerd met een computergestuurde beeldanalyzer. De Region van Belang (ROI) werd gedefinieerd als het totale interne volume van de kooi, exclusief de metalen stangen, en werd onderverdeeld in Cranial en Caudal Intracage ROIs. Het botweefsel werd geïdentificeerd aan de paars/magenta kleur onder Villanueva kleuring. Lameljar bot (Lm.V) werd gekenmerkt door zijn sterk georganiseerde, parallel-lamellaire structuur onder gepolariseerd licht, terwijl geweven bot (Wo.V) ongeorganiseerde vezelpatronen vertoonde.

Resultaten

Lichaamsgewicht (Tabel 1)

Het lichaamsgewicht werd tot 12 weken postoperatief gemeten, wat een gestage toename aantoonde (van 221,8 g naar 346,8 g), wat wijst op fysiologische homeostase en indirect de afwezigheid van ernstige chronische stress ondersteunt. Dit werd bevestigd door dagelijkse multimodale beoordelingen die normale activiteit en ongecompliceerde wondgenezing bevestigden.

Wond (Figuur 3

Discussie

Hier werd een nieuw interlichaamfusiemodel van de rat-caudale wervelkolom ontwikkeld. Dit model houdt in dat een titanium kooi wordt ingebracht via een posterieure benadering, aangevuld met plaat-en-schroeffixatie. Vervolgens werd de botvorming binnen de kooi geëvalueerd met behulp van gedetailleerde histomorfometrische analyse. De onderscheidende kenmerken van dit model zijn drieledig: 1) het bootst nauwkeurig klinische posterieure lumbale interlichaamfusie of transforaminale lumbale in...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4-0 nylon sutures	Natsume	ER-25-30N2
Bright-field microscope	Keyence. (Osaka, Japan)	BZ-X800
Butorphanol	FUJIFILM	021-19001
Calcein	FUJIFILM	76082
Carprofen	FUJIFILM	037-19761
Cefalexin	FUJIFILM	036-11051
Computerized image analyzer	System Supply Co. (Nagano, Japan)	Histometry RT CSS-840
Confocal laser-scanning microscope for fluorescence merging	Carl Zeiss. (Jena, Germany)	LSM 980
Curette	Natsume	E-8-00
Diamond saw microtome	Leica. (Wetzlar, Germany)	SP1600
Electric drill	TAMIYA	N/A	https://www.amazon.co.jp /%E3%82%BF%E3%83% 9F%E3%83%A4-%E3% 82%AF%E3%83%A1% E3%83%84%E3%83%89%E3% 83%AB%E7%94%A8%E5% %B7%A5%E5%85%B7/dp/B 01LZ05WWY/ref=sr_1_2?ad grpid=54785347873&dib=eyJ 2IjoiMSJ9.f61YHQv80N0nxws VOdlrIFtTsQoJICvSb4t4rVt97 FEBWkOo4ilX5O2lZH-5vADU HT9CRXO308QpVFqdBNli0C osd4iBSfSzEcKxP9HMX4DhiI S-Qko5ix33W7FjPQqpgTWbj3 CV_vBytnvfqvSyoGN9IB8445o 5Kc0pjeKPG-SRR3Ixpqr2-FT_ ZgUyWstoyQVFTcv_Rq_K4-E OWnuT41BBYtBh757EOAoBe z2lkCd6Psz99wZxfUuvzRUAH Ecq9QV6EmiT9LAY8dYYq08k aLt7Klqx2k-MdV8XbWRxgKk. 7TWzXBGA1PeNmB4me_Cz4 mMFAKBAv5H3YXAw_HPuLd E&dib_tag=se&hvadid=651687 588880&hvdev=c&hvexpln=0& hvlocphy=1009309&hvnetw=g& hvocijid=5538300633798619650 --&hvqmt=e&hvrand=55383006 33798619650&hvtargid=kwd-33 4267191534&hydadcr=4289_13 319726&jp-ad-ap=0&keywords= %E3%82%BF%E3%83%9F%E3 %83%A4+%E9%9B%BB%E5% 8B%95%E3%83%8F%E3%83% B3%E3%83%87%E3%82%A3% E3%83%89%E3%83%AB&mcid=6b8ff8c984ba3d45 be477b407ef2d1ba&qid=1767395 580&sr=8-2
hand drill	VEAGIA	N/A	https://www.amazon.co.jp/dp/B0D2 9B4W18/ref=sspa_dk_detail_5?pd _rd_i=B0D29B4W18&pd_rd_w=xe kNz&content-id=amzn1.sym.f293b e60-50b7-49bc-95e8-931faf86ed1e &pf_rd_p=f293be60-50b7-49bc-95e8 -931faf86ed1e&pf_rd_r=HPW6B367R QC0VPB7WTTS&pd_rd_wg=E8mAS &pd_rd_r=dbeb0aa7-1bea-4f40-99dd -38bcb05c8234&sp_csd=d2lkZ2V0T mFtZT1zcF9kZXRhaWw&th=1
Medetomidine	FUJIFILM	135-17473
Midazolam	FUJIFILM	135-13791
Pin vise	ANEX	N/A	https://www.amazon.co.jp/%E3%82% A2%E3%83%8D%E3%83%83%E3% 82%AF%E3%82%B9-ANEX-%E3% 83%A9%E3%83%90%E3%83%BC %E3%82%B0%E3%83%AA%E3% 83%83%E3%83%94%E3%83% 83%B3%E3%83%90%E3%83% 82%A4%E3%82%B9%E5%8F% 8E%E7%B4%8D%E5%BC%8F -No-98-R/dp/B000T4D0XQ/ ref=pd_bxgy_thbs_d_sccl_1/3 55-1353338-1511720?pd_rd_w =pnGb2&content-id=amzn1.sy m.fb3df7da-4601-4c73-b94b-e2 75cd0eb364&pf_rd_p=fb3df7da -4601-